與綠豆抗豆象基因VrPGIP共分離的分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供與綠豆抗豆象基因VrPGIP共分離的分子標(biāo)記，所述綠豆抗豆象基因VrPGIP位于綠豆第5號染色體第5.558Mb和5.625Mb區(qū)域內(nèi)，與基因VrPGIP共分離的分子標(biāo)記包括SSR標(biāo)記Vr05?5590和Vr05?5597，它們與綠豆抗豆象基因VrPGIP的物理距離分別為1.5kb和850bp。本發(fā)明還提供所述分子標(biāo)記在綠豆抗豆象基因定位或綠豆遺傳育種中的應(yīng)用。本發(fā)明通過精細定位綠豆抗豆象基因VrPGIP，發(fā)現(xiàn)了兩個與綠豆抗豆象基因共分離的SSR標(biāo)記，該分子標(biāo)記的開發(fā)為綠豆抗豆象分子輔助育種提供了一條可行途徑。
【專利說明】
與綠豆抗豆象基因 VrPG IP共分離的分子標(biāo)記及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程、分子生物學(xué)及遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及與綠豆抗 豆象基因 VrPGIP共分離的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 綠豆(Vigna radiata)是一種豆科、蝶形花亞科5工豆屬植物，中國是綠豆的發(fā)源地 之一，擁有類型繁多的綠豆品種資源。中國、緬甸等國是主要的綠豆出口國。由于其生育期 短、適應(yīng)性廣，且具有較好的固氮能力，因此是種植業(yè)資源合理配置、倒茬輪作、間作套種、 減災(zāi)救災(zāi)不可缺少的糧食作物及重要的經(jīng)濟作物；同時綠豆富含蛋白質(zhì)、維生素、多種礦物 質(zhì)及人體必需的氨基酸，還具有清熱解毒、降血壓和膽固醇、防止動脈粥樣硬化等功效，具 有較高的營養(yǎng)保健和經(jīng)濟價值，在國際市場上備受青睞。近年來，國際市場對綠豆的需求量 和全世界綠豆的生產(chǎn)量均有所增加，目前中國的綠豆年出口量在20-30萬噸，出口價格一般 400-500美元。綠豆的社會經(jīng)濟價值不容忽視。然而，豆象是危害綠豆最嚴重的倉儲害蟲，豆 象分布范圍廣，在任何種植和儲藏食用豆的地方都可發(fā)生綠豆象危害。在一個生活周期內(nèi)， 因綠豆象危害一般損失產(chǎn)量30%-56%，可導(dǎo)致整倉綠豆被破壞。在我國，綠豆象每年可繁 殖4-11代，除危害綠豆外，還可危害小豆、豇豆、豌豆、蠶豆、菜豆、扁豆等。國內(nèi)外對綠豆豆 象的研究還相當(dāng)滯后，分子水平的研究更顯薄弱。
[0003] 從20世紀(jì)80年代開始，日本、泰國、澳大利亞等國家的食用豆類遺傳育種學(xué)家致力 于抗豆象的研究。目前為止，報道的高抗豆象綠豆資源主要有馬達加斯加野生種TC1966和 澳大利亞野生種ACC41，經(jīng)驗證TC1966和ACC41抗豆象表型均為Brl基因控制。Kaga等（1998) 用RFLP標(biāo)記Bngl43和Bngl 10將Br 1基因定位于第9連鎖群。程須珍等（2005)篩選出一個與 Brl基因緊密連鎖的RAH)標(biāo)記。梅麗等(2007)將Brl基因定位于RFLP標(biāo)記mgM213~VrCS161 之間，還發(fā)現(xiàn)Brl基因與一個控制種子重量的QTLXhen等(2013)證明Brl基因與控制綠豆黃 花葉印度病毒(MYMIV)的主效QTL連鎖。孫蕾等（2008)利用抗豆象栽培綠豆V2709與感豆象 推廣品種中綠1號(VC1973A)配制F2雜交組合，利用抗、感親本和抗、感池篩選63個RAPD引物 和113對SSR/STS引物。將該抗豆象基因初步定位在一個RAH)標(biāo)記和一個STS標(biāo)記之間，遺傳 距離分別為11 .OcM和5.8cM。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供與綠豆抗豆象基因 VrPGIP共分離的分子標(biāo)記。
[0005] 本發(fā)明的另一目的是提供所述分子標(biāo)記在綠豆抗豆象基因定位或綠豆遺傳育種 中的應(yīng)用。
[0006] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的與綠豆抗豆象基因 VrPGIP共分離的分子標(biāo) 記，所述綠豆抗豆象基因 VrPGIP位于綠豆第5號染色體5.558Mb和5.625Mb區(qū)域內(nèi)，與基因 VrPGIP共分離的分子標(biāo)記包括SSR標(biāo)記Vr05-5590和Vr05-5597，它們與綠豆抗豆象基因 VrPGIP的物理距離分別為1.5kb和850bp;上述物理位置參考已測序綠豆種VC1973A。
[0007] 用于PCR擴增標(biāo)記Vr05-5590的正向引物和反向引物序列分別為SEQ ID N0:1和2。
[0008] 用于PCR擴增標(biāo)記Vr05-5597的正向引物和反向引物序列分別為SEQ ID NO: 3和4。
[0009] 綠豆抗豆象基因 VrPGIP為：
[0010] i)SEQIDN0:9所示的核苷酸序列；或
[0011] ii)SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個核苷酸且 表達相同功能蛋白質(zhì)的核昔酸序列;或
[0012] iii)在嚴格條件下與SEQ ID N0:9所示序列雜交且表達相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸 序列，所述嚴格條件為在含〇. 1 % SDS的0.1 X SSPE或含0.1 % SDS的0.1 X SSC溶液中，在65°C 下雜交，并用該溶液洗膜;或
[0013] iv)與i)、ii)或m)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表達相同功能蛋白質(zhì)的 核苷酸序列。
[0014] 利用SEQ ID N0:1和2在抗豆象綠豆品種TC1966、VC6089A、中綠3號、中綠6號、中綠 7號和蘇綠2號中可擴增出大小為145bp的特征條帶，擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果如SEQ ID N0:5所 示，在綠豆感豆象品種中綠1號、中綠5號和中綠10號中可擴增出大小為108bp的特征條帶， 擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果如SEQ ID N0:6所示;利用SEQ ID N0:3和4在抗豆象綠豆品種TC1966、 VC6089A、中綠3號、中綠6號、中綠7號和蘇綠2號中可擴增出大小為241bp的特征條帶，擴增 產(chǎn)物的測序結(jié)果如SEQ ID N0:7所示，在綠豆感豆象品種中綠1號、中綠5號和中綠10號中可 擴增出大小為246bp的特征條帶，其中，擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果如SEQ ID N0:8所示。
[0015] 本發(fā)明還提供所述分子標(biāo)記在鑒定綠豆抗豆象基因 VrPGIP中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明還提供所述分子標(biāo)記在篩選或鑒定綠豆抗豆象資源和品種中的應(yīng)用。
[0017] 包括如下步驟：
[0018] 1)提取待測植株的基因組DNA;
[0019] 2)以待測植株的基因組DNA為模板，利用擴增所述分子標(biāo)記的引物，進行PCR擴增 反應(yīng)；
[0020] 3)檢測PCR擴增產(chǎn)物。如用引物SEQ ID N0:1和2能夠擴增出145bp大小的目的片段 (SEQIDN0:5)，和/或用引物SEQIDN0 :3和4能夠擴增出241bp大小的目的片段（SEQID N0:7)，則標(biāo)志著該綠豆品種抗豆象基因 VrPGIP的存在。
[0021] 優(yōu)選地，步驟3)中采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴增產(chǎn)物，銀染法EB染 色。
[0022] 本發(fā)明還提供所述分子標(biāo)記在綠豆分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
[0023] 本發(fā)明還提供用于篩選或鑒定綠豆抗豆象資源的特異性PCR引物，包括擴增所述 分子標(biāo)記Vr05-5590的引物（SEQ ID N0:1和2)，和/或擴增分子標(biāo)記Vr05-5597的引物（SEQ ID N0:3和4)。
[0024] 本發(fā)明還提供用于篩選或鑒定綠豆抗豆象資源的PCR檢測試劑盒，所述試劑盒包 含上述引物。
[0025]本發(fā)明還提供所述分子標(biāo)記在開發(fā)與綠豆抗豆象基因 VrPGIP共分離的分子標(biāo)記 中的應(yīng)用。
[0026]本發(fā)明進一步提供利用所述分子標(biāo)記開發(fā)的與綠豆抗豆象基因 VrPGIP共分離的 分子標(biāo)記。
[0027] 本發(fā)明通過精細定位綠豆抗豆象基因 VrPGIP，發(fā)現(xiàn)了與綠豆抗豆象基因共分離的 SSR分子標(biāo)記Vr05_5590和Vr05_5597，所述分子標(biāo)記的開發(fā)為綠抗S象分子輔助育種提 供了一條可行途徑。本發(fā)明的分子標(biāo)記可以簡便、快速、高通量地應(yīng)用于綠豆育種實踐和資 源及品種鑒定。本方法方便、快捷、準(zhǔn)確且成本低廉，為綠豆抗豆象分子標(biāo)記的篩選提供了 新思路。
【附圖說明】
[0028] 圖1為本發(fā)明實施例3中利用F2群體定位綠豆抗豆象基因 VrPGIP的遺傳圖譜。
[0029] 圖2為本發(fā)明實施例4中與抗豆象基因 VrPGIP共分離的分子標(biāo)記Vr05-5590在抗豆 象品種中綠3號、中綠6號、中綠7號、V2802、V2709、V1128和抗豆象野生種TC1966中的PAGE電 泳檢測結(jié)果。
[0030] 圖3為本發(fā)明實施例4中與抗豆象基因 VrPGIP共分離的分子標(biāo)記Vr05-5597在抗豆 象品種中綠3號、中綠6號、中綠7號、V2802、V2709、V1128和抗豆象野生種TC1966中的PAGE電 泳檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0031] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例 均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning:a laboratory manual ,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。 [0032] 實施例1TC1966/中綠1號F1和F2群體構(gòu)建及表型鑒定
[0033] 以抗豆象綠豆野生資源TC1966為父本，以感豆象綠豆品種中綠1號為母本，配制雜 種，構(gòu)建了包含150個單株的TC1966/中綠1號分離群體，每個F2單株通過自交獲得相應(yīng)的 TC1966/中綠1號F2:3家系，進行抗蟲鑒定。具體方法如下：
[0034] 每份材料隨機選取30粒健康種子，包括2份感豆象中綠1號、抗豆象TC1966對照，置 于抗豆象鑒定室塑料箱內(nèi)，溫度保持在25°C-29°C之間，濕度控制在70%-80 %之間。每個塑 料箱內(nèi)放入400-500頭剛羽化1-3天的綠豆象成蟲，讓其隨機產(chǎn)卵，當(dāng)每粒種子落卵量在5個 以上時，除去成蟲。40-45天后調(diào)查抗蟲種子粒數(shù)及抗蟲率，參照程須珍等（2001)的方法對 每個單株進行抗性評價。達到中抗以上材料進行重復(fù)鑒定，設(shè)3次重復(fù)?？苟瓜箬b定分級標(biāo) 準(zhǔn)見表1。
[0035] 表1綠豆抗豆象特性分級標(biāo)準(zhǔn)
[0037] 抗豆象鑒定結(jié)果顯示，TC1966、中綠1號以及TC1966/中綠1號雜交獲得的F1種子全 抗，表明TC1966抗豆象特性由顯性基因控制。150個TC1966/中綠1號F2:3家系對豆象的抗性 級別頻率分布呈連續(xù)分布，根據(jù)對豆象的抗蟲級別將F2:3家系分為抗豆象、抗感分離和感 豆象三種表現(xiàn)型，而相應(yīng)的F2單株的基因型則分別為記為RR(純合抗蟲）、Rr(雜合抗蟲）和 rr (純合感蟲)三種。F2群體對豆象的抗感分離比符合1: 2:1的比例，說明抗豆象基因由顯性 基因 VrPGIP控制。
[0038] 實施例2與綠豆抗豆象基因 VrPGIP連鎖的SSR分子標(biāo)記的開發(fā) [0039] 綠豆抗豆象基因 VrPGIP的獲得:利用抗豆象親本TC1966與感豆象親本中綠1號雜 交的F2分離群體和抗、感池篩選出多態(tài)性SSR標(biāo)記。將該抗豆象基因初步定位于綠豆第5號 染色體上。根據(jù)NCBI已公布的綠豆基因組序列（GenBank登錄號：JJM000000000)，用軟件 Primer3.0進行引物設(shè)計，在綠豆第5號染色體共產(chǎn)生3143對SSR引物。提取綠豆葉片DNA，進 行引物成功率檢測，結(jié)果表明，共有1254對SSR引物在100-300bp檢測到清晰條帶，表明引物 設(shè)計成功率較高。
[0040] 實施例3綠豆抗豆象基因 VrPGIP的精細定位
[00411用改良CTAB法提取親本和F2群體各株系的DNA，經(jīng)紫外分光光度計測定濃度后稀 釋標(biāo)定到25ngAxL，置于-20°C冰箱備用。
[0042] 參照Chen等(2015)的方法，以綠豆基因組DNA為模板，進行PCR反應(yīng)。10μ1 PCR反應(yīng) 體系包括:40ng DNA，lXTaq酶緩沖液（lOmmol L-^Tris-HClpHS.SdOmmol L-kCMOmmol L-HN^hSOul.Smmol L-WgChJ.l^Triton X-100)，lmmol L-MNTPs，上、下游引物各 0.25μπιο1 L-1和1U Taq DNA聚合酶，ddH20補至10μ1。反應(yīng)程序:95°C預(yù)變性5min;95°C變性 30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，32~35個循環(huán)；最后72°C延伸5min。整個反應(yīng)在東勝EDC-810PCR擴增儀上進行。用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴增產(chǎn)物，銀染法染色。擴增 的D N A條帶在熒光燈箱內(nèi)觀察，獲取F 2群體基因型信息。根據(jù)連鎖交換規(guī)律，利用 MAPMARKER/EXP3.0軟件對各個分子標(biāo)記的群體基因型信息構(gòu)建綠豆的遺傳連鎖圖譜。共獲 得13個SSR標(biāo)記，圖譜長度為63cM(圖1)。
[0043] 進一步通過精細定位，將抗豆象基因定位于綠豆第5號染色體5.558Mb和5.625Mb 區(qū)域內(nèi)，SSR標(biāo)記Vr05-5590和Vr05-5597之間，它們與綠豆抗豆象基因 VrPGIP的物理距離分 別為1.5kb和850bp(上述物理位置參考已測序綠豆種VC1973A)，通過測序發(fā)現(xiàn)此區(qū)間僅包 括一個基因（基因 PGIP)編碼多聚半乳糖醛酸酶抑制劑，基因 PGIP的DNA序列如SEQ ID N0:9 所示，在抗、感蟲材料中存在堿基變異，并引起其編碼蛋白的氨基酸序列變化，從而為綠豆 資源抗豆象的分子育種提供新的基因資源。
[0044] 擴增各分子標(biāo)記的引物如下：用于PCR擴增標(biāo)記Vr05-5590的正向引物和反向引物 序列分別為SEQ ID N0:1和2;用于PCR擴增標(biāo)記Vr05-5597的正向引物和反向引物序列分別 為SEQIDN0:3和4。
[0045] 實施例4標(biāo)記Vr05-5590和Vr05-5597在鑒定綠豆抗豆象資源中的應(yīng)用 [0046] 用引物SEQ ID N0:1和2能夠擴增出145bp大小的目的片段（SEQ ID N0:5)，和/或 用引物SEQ ID N0:3和4能夠擴增出246bp大小的目的片段(SEQ ID N0:6)，則標(biāo)志著該綠豆 品種抗豆象基因 VrPGIP的存在。其中，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同實施例3所述。采用8%非 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴增產(chǎn)物，銀染法染色。
[0047] 利用上述兩個標(biāo)記Vr05-5590和Vr05-5597對我國主要綠豆推廣品種如中綠1號、 中綠3號、中綠5號、中綠6號、中綠7號、中綠10號，國外綠豆品種如VC6089A、V1128、V2802和 V2709,國外綠豆野生種TC1966進行抗豆象基因鑒定，結(jié)果表明這2個標(biāo)記的鑒定效率均達 到99.5%以上。
[0048] 通過上述分子標(biāo)記鑒定綠豆抗豆象基因 VrPGIP來預(yù)測綠豆植株抗蟲性，可提高我 國綠豆抗豆象品種的育種進程。
[0049] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
[0050] 參考文獻
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【主權(quán)項】
1. 與綠豆抗豆象基因 VrPGIP共分離的分子標(biāo)記，其特征在于，所述綠豆抗豆象基因 VrPGIP位于綠豆第5號染色體5.558Mb和5.625Mb區(qū)域內(nèi)，與基因 VrPGIP共分離的分子標(biāo)記 包括SSR標(biāo)記Vr05-5590和Vr05-5597,它們與綠豆抗豆象基因 VrPGIP的物理距離分別為 1.5kb和850bp;上述物理位置參考已測序綠豆種VC1973A; 用于PCR擴增標(biāo)記Vr05-5590的正向引物和反向引物序列分別為SEQ ID NO: 1和2; 用于PCR擴增標(biāo)記Vr05-5597的正向引物和反向引物序列分別為SEQ ID N0:3和4; 其中，綠豆抗豆象基因 VrPGIP為： i) SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；或 ii) SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個核苷酸且表達 相同功能蛋白質(zhì)的核昔酸序列;或 iii) 在嚴格條件下與SEQ ID N0:9所示序列雜交且表達相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序 列，所述嚴格條件為在含〇. 1 % SDS的0.1 X SSPE或含0.1 % SDS的0.1 X SSC溶液中，在65 °C下 雜交，并用該溶液洗膜;或 iv) 與i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表達相同功能蛋白質(zhì)的核苷 酸序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記，其特征在于，利用SEQ ID NO: 1和2在抗豆象綠豆品 種TC1966、VC6089A、中綠3號、中綠6號、中綠7號和蘇綠2號中可擴增出大小為145bp的特征 條帶，在綠豆感豆象品種中綠1號、中綠5號和中綠10號中可擴增出大小為IOSbp的特征條 帶；利用SEQ ID NO:3和4在抗豆象綠豆品種TC1966、VC6089A、中綠3號、中綠6號、中綠7號和 蘇綠2號中可擴增出大小為241bp的特征條帶，在綠豆感豆象品種中綠1號、中綠5號和中綠 10號中可擴增出大小為246bp的特征條帶。3. 權(quán)利要求1或2所述分子標(biāo)記在鑒定綠豆抗豆象基因 VrPGIP中的應(yīng)用；其中，綠豆抗 豆象基因 VrPGIP的定義同權(quán)利要求1所述。4. 權(quán)利要求1或2所述分子標(biāo)記在篩選或鑒定綠豆抗豆象資源中的應(yīng)用。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，包括如下步驟： 1) 提取待測植株的基因組DNA; 2) 以待測植株的基因組DNA為模板，利用擴增權(quán)利要求1或2所述分子標(biāo)記的引物，進行 PCR擴增反應(yīng)； 3) 檢測PCR擴增產(chǎn)物； 其中，SSR標(biāo)記Vr05-5590和Vr05-5597的正向引物和反向引物序列同權(quán)利要求1所述。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟3)中采用8 %非變性聚丙烯酰胺凝膠 電泳分離擴增產(chǎn)物，銀染法染色。7. 權(quán)利要求1或2所述分子標(biāo)記在綠豆分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。8. 用于篩選或鑒定綠豆抗豆象資源的特異性PCR引物，其特征在于，包括擴增權(quán)利要求 1或2所述分子標(biāo)記的引物;其中，SSR標(biāo)記Vr05-5590和Vr05-5597的正向引物和反向引物序 列同權(quán)利要求1所述。9. 用于篩選或鑒定綠豆抗豆象資源的PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權(quán) 利要求8所述引物。10. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述分子標(biāo)記開發(fā)的與綠豆抗豆象基因共分離的分子標(biāo)記；其 中，綠豆抗豆象基因 VrPGIP的定義同權(quán)利要求1所述。
【文檔編號】C12Q1/68GK105950736SQ201610362607
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月26日
【發(fā)明人】陳紅霖, 程須珍, 王麗俠, 王素華
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所