轉(zhuǎn)化的植物細胞的取得方法【專利摘要】本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)化的植物細胞的取得方法。本發(fā)明包含以下的步驟：(a)將所期望的DNA和第一標記基因在植物細胞中進行共轉(zhuǎn)化的步驟；及(b)從步驟(a)中得到的轉(zhuǎn)化的植物細胞中選擇在其染色體中導(dǎo)入所期望的DNA、且沒有導(dǎo)入第一標記基因的轉(zhuǎn)化細胞的步驟，但是，所述方法不包含通過使用所述第一標記基因的陽性選擇而除去僅將所期望的DNA導(dǎo)入染色體的轉(zhuǎn)化細胞的步驟。【專利說明】轉(zhuǎn)化的植物細胞的取得方法
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001]本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)化的植物細胞的取得方法及轉(zhuǎn)化植物的制備方法?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]植物的轉(zhuǎn)化[0003]在將植物進行轉(zhuǎn)化時，可利用向植物細胞導(dǎo)入DNA的技術(shù)，所述技術(shù)能夠在稔實種子的后代或營養(yǎng)繁殖體中使外來基因維持并表達?？梢允褂迷摷夹g(shù)實際地轉(zhuǎn)化許多單子葉植物、雙子葉植物。[0004]在植物生理學(xué)、植物分子生物學(xué)的領(lǐng)域中，擬南芥(Arabidopsisthaliana)、稻、短柄草屬(Brachypodium)等的轉(zhuǎn)化體經(jīng)常用于基礎(chǔ)研究。在作物中，玉米、稻、小麥、大麥、高梁、大豆、油菜籽、向日葵、棉、馬鈴薯、番茄等不用說，即使水果類或其它蔬菜類，也可制備轉(zhuǎn)化體。另外，可以通過轉(zhuǎn)化賦予高附加價值的特性，因此，對商業(yè)用途存在強烈的興趣，目前，轉(zhuǎn)化的玉米、大豆、油菜籽、棉正在廣泛地進行商業(yè)生產(chǎn)。[0005]但是，制備轉(zhuǎn)化植物時，在研究方面及商業(yè)利用方面這兩者中存在重要的問題。其為制備的轉(zhuǎn)化體大多保持多拷貝的目標DNA的情況。在多拷貝數(shù)導(dǎo)入有目標DNA的轉(zhuǎn)化植物中，導(dǎo)入基因的表達量在植物間較大變化，導(dǎo)入基因的表達受到強烈抑制(一種被稱為同源性依賴性基因沉默的現(xiàn)象）的植物的情況不少。另一方面，僅以單拷貝保持目標DNA的轉(zhuǎn)化體與基因組上的插入位置沒有關(guān)系，顯示穩(wěn)定的基因表達(Nagayaetal.，2005)。在同源性依賴性基因沉默中存在轉(zhuǎn)錄后型(PTGS)和轉(zhuǎn)錄型（TGS)這2種，兩者均介由雙鏈RNA而產(chǎn)生，但PTGS在多拷貝的目標DNA相互沿正向或反向連接而導(dǎo)入的情況、或在部分缺失的目標DNA-起被導(dǎo)入的情況下容易產(chǎn)生。TGS因表遺傳學(xué)而被發(fā)動，一般而言伴隨通過與基因上游的啟動子區(qū)域同源的小RNA的DNA甲基化。該甲基化即使經(jīng)過體細胞分裂或減數(shù)分裂也被維持，結(jié)果，沉默遺傳給后代(Eamensetal.，2008)。[0006]另外，由于拷貝數(shù)較高，目標DNA對基因組的整合方面變得復(fù)雜且更難以分析。因此，對于大多數(shù)轉(zhuǎn)化目的，如在1)在轉(zhuǎn)化體中以表達水平評價導(dǎo)入基因的效果、2)在轉(zhuǎn)化體中評價啟動子或轉(zhuǎn)錄因子的特性、3)制備T-DNA標簽庫、4)以商業(yè)化為目標制備轉(zhuǎn)化植物的目的，優(yōu)選以1-2拷貝導(dǎo)入目標DNA，最優(yōu)選以單拷貝導(dǎo)入。[0007]在植物的轉(zhuǎn)化方法中，已知有粒子槍法、電穿孔法、電注射法、聚乙二醇法、須晶法等物理化學(xué)的方法(DNA的直接導(dǎo)入法）和利用土壤桿菌屬細菌具有的功能的生物學(xué)方法(DNA的間接導(dǎo)入法）。在直接導(dǎo)入法中，目標DNA被片段化而被導(dǎo)入、以高拷貝數(shù)（多的時候達到100拷貝）被導(dǎo)入的現(xiàn)象以高頻率產(chǎn)生(Butayeetal.，2005)。另外，多拷貝導(dǎo)入目標DNA時，各拷貝經(jīng)常彼此連接而被整合到相同的基因座(Kohlietal.，1998;Klein，2010)。因此，顯示目的基因未得到表達的基因沉默現(xiàn)象的轉(zhuǎn)化體以高頻率出現(xiàn)（Registeretal·，1994)〇[0008]在土壤桿菌法中，通過Ti或Ri質(zhì)粒的毒力區(qū)域(vir區(qū)域）中的基因簇的表達控制而導(dǎo)入目標DNA。目標DNA通過vir基因所編碼的蛋白質(zhì)簇的作用，經(jīng)過植物細胞和細菌的相互作用的識別和信號傳遞、vir基因的表達誘導(dǎo)、類型IV分泌路徑的形成、T-DNA邊界重復(fù)序列的認識、T-DNA鏈的形成、將T-DNA鏈轉(zhuǎn)移到植物細胞和然后到核、和T-DNA對植物核基因組的整合等的許多過程而被導(dǎo)入。因此，與直接導(dǎo)入法相比時，更低保持目標DNA的導(dǎo)入拷貝數(shù)(低于10拷貝），被片段化而被導(dǎo)入的情況也少（Shouetal.，2004;Butayeetal.，2005)。土壤桿菌法與DNA的直接導(dǎo)入法相比，為優(yōu)異的轉(zhuǎn)化方法，盡管如此，不能充分地控制向基因組導(dǎo)入的DNA的拷貝數(shù)。另外，多拷貝的DNA向相同基因座導(dǎo)入也并不罕見(WangandWaterhouse，2000)。因此，在目的基因的表達量上產(chǎn)生某種程度的植物間差異，有時產(chǎn)生伴有同源性依賴性基因沉默的植物(Butayeetal.，2005;Nagayaetal.，2005)。[0009]控制導(dǎo)入DNA的拷貝數(shù)的嘗試[0010]由于此類【
背景技術(shù)：
】，以低拷貝導(dǎo)入目標DNA的方法也報道有數(shù)件。這些方法之一為使用位點特異性重組系統(tǒng)的方法。首先，將在具有選擇標記的所期望的DNA的兩側(cè)沿反向方向有位點特異性重組酶的識別序列（lox)的DNA片段導(dǎo)入植物。另外，預(yù)先將Cre表達盒導(dǎo)入另一個植物。接著，將導(dǎo)入有多個連接的目標DNA拷貝的T0植物和表達Cre的T0植物進行雜交。在得到的F1植物中表達Cre時，從導(dǎo)入多個連接拷貝的DNA區(qū)域僅將由DNA區(qū)內(nèi)的正向lox序列之間夾持的DNA區(qū)域全部切出。其結(jié)果，保留在DNA中的兩個末端彼此連接，可得到僅具有單拷貝的目標DNA的細胞。通過該細胞分化為生殖細胞，可以得到以單拷貝或單拷貝純合含有目標DNA的F2植物（Srivastavaetal.，1999;DeBucket&1.，2007)。但是，雜交的方法存在著得到目的植物之前花費長時間的缺點。另外，在引起表遺傳性的TGS的情況下，即使通過Cre-lox反應(yīng)而降低拷貝數(shù)，所期望的DNA的表達仍受到抑制。[0011]另外，作為類似使用位點特異性重組系統(tǒng)的方法，也報道有將上述的目標DNA片段和具有Cre基因的DNA片段進行共轉(zhuǎn)化的方法(Srivastavaand0w，2001)。共轉(zhuǎn)化的Cre表達時，從導(dǎo)入多個連接的目標DNA拷貝的區(qū)域切出由lox序列間所夾持的區(qū)域，并且可以在T0世代得到目標DNA單拷貝的植物。但是，在共轉(zhuǎn)化法中，如果Cre基因自身進行多拷貝導(dǎo)入，則有時由于表達抑制而不起作用。根據(jù)Butaye等(2005)的評論，使用位點特異性重組系統(tǒng)的拷貝數(shù)減少方法理論上可行，但成功例的報道少，并且轉(zhuǎn)化效率也較低。順便說一下，在該方法中，也指出夾持于2個導(dǎo)入DNA拷貝之間的野生型的基因組區(qū)域被切出并且缺失的問題（Butayeetal.，2005)。[0012]這些方法中的第二個為在土壤桿菌法中使用毛根土壤桿菌（Agrobacteriumrhizogenes)的oriRi作為具有目標DNA的T-DNA的載體的復(fù)制起點的方法。Ye等(2011)通過使用oriRi起作用的二元載體和作為IncPRK2型復(fù)制起點的oriV起作用的二元載體比較植物頻率，在所述植物中以單拷貝導(dǎo)入有目標DNA，而不包含對應(yīng)于得到的轉(zhuǎn)化體中的T-DNA外側(cè)的載體的骨架序列。通過使用oriRi載體獲得的單拷貝導(dǎo)入植物的頻率在轉(zhuǎn)化的大豆植物中是38%-40%，這與通過使用oriV載體獲得的頻率相比是加倍的，在轉(zhuǎn)化的油菜籽植物中是51%，這高1.5倍，并且在轉(zhuǎn)化的玉米植物中是58%，這高1.4倍。另一方面，轉(zhuǎn)化效率減少，將oriV載體的情況設(shè)為100%時，在大豆中顯示45%-68%，在油菜籽中顯示80%，在玉米中顯示58%(Yeetal.，2011)。考慮通過使用oriRi載體得到的無骨架單拷貝轉(zhuǎn)化體的制備頻率以及轉(zhuǎn)化效率獲得的每個測試材料的制備效率與通過使用oriV載體獲得的效率相比時，在大豆中高0.96-1.36倍，在油菜籽中高1.2倍，在玉米中高0.82倍?？梢哉f，即使每測試材料的制備效率較低，只要整體上操作效率或成本效率較高，oriRi二元載體可以認為是有用的。就轉(zhuǎn)化體的分析而言，在DNA的提取和拷貝數(shù)的分析中需要大量的成本和勞動力，因此，認為oriRi二元載體有益于改善整體效率。[0013]這些方法中的第三個為使T-DNA保持在土壤桿菌的染色體上、進行植物的轉(zhuǎn)化的方法。01tmanns等(2010)向土壤桿菌的GV3101菌株及EHA101菌株的染色體上的picA區(qū)域以同源重組整合含有T-DNA的DNA區(qū)域，將所得物用于玉米的轉(zhuǎn)化。而且，研究了得到的轉(zhuǎn)化體中的單拷貝導(dǎo)入植物的頻率。其結(jié)果，玉米轉(zhuǎn)化體中的單拷貝導(dǎo)入植物的頻率在使用有EHA101的情況下為64%，在使用有GV3101的情況下為58%，顯示非常高的值(Oltmannsetal.，2010)。但是，使T-DNA保持在該土壤桿菌的染色體上的方法存在轉(zhuǎn)化效率低的根本的問題，就玉米的轉(zhuǎn)化效率而言，EHA101菌株、GV3101菌株均為1%左右(Oltmannsetal·，2010)。因此，使用作為現(xiàn)有法的二元載體的土壤桿菌菌株引起的轉(zhuǎn)化效率在EHA101菌株中顯示9-12%，在GV3101菌株中顯示5-8%。使T-DNA保持在土壤桿菌的染色體上的該方法似乎僅在使用GV3101菌株的擬南芥的花序浸漬法時是相當(dāng)有效的。轉(zhuǎn)化效率相對于現(xiàn)有法的1.6-2.1%為0.9%，沒有大幅度降低，就單拷貝導(dǎo)入植物的頻率而言，現(xiàn)有法為16-35%，與此相對，其為80%，非常高(Oltmannsetal.，2010)。但是，當(dāng)該方法應(yīng)用于染色體背景相同的EHA101菌株時，轉(zhuǎn)化效率會是0.1%左右，是常規(guī)方法獲得的轉(zhuǎn)化頻率的1/10左右(Oltmannsetal.，2010)。如上所述，進行了使導(dǎo)入DNA的拷貝數(shù)減少的嘗試，但這些方法分別存在問題，不能作為有效方法廣泛利用。[0014]共轉(zhuǎn)化[0015]植物中的外來DNA的共轉(zhuǎn)化通常用于得到僅導(dǎo)入有目標DNA的轉(zhuǎn)化體。選擇標記基因和選擇藥劑是用于從主要由非轉(zhuǎn)化細胞構(gòu)成的植物組織中得到轉(zhuǎn)化細胞的非常有用的工具，但得到轉(zhuǎn)化體之后基本上不需要。在土壤桿菌法中，共轉(zhuǎn)化主要以在下一世代除去選擇標記基因的目的而進行。即，將目標外來DNA和選擇標記基因分別插入于各自的T-DNA上，經(jīng)由土壤桿菌而同時導(dǎo)入植物細胞。使選擇藥劑中所選擇的細胞塊再生時，可得到與選擇標記基因同時導(dǎo)入有目標DNA的轉(zhuǎn)化體。如果目標DNA和選擇標記基因被導(dǎo)入各自的染色體，則通過遺傳性分離，在下一世代可以得到具有目標DNA、但排除了選擇標記基因的植物(YauandStewart，2013)。另外，通過土壤桿菌的共轉(zhuǎn)化法有如下4種類型:兩個T-DNA分別位于一個菌株中的兩個二元載體上的類型;兩個T-DNA位于一個菌株中的一個二元載體上的類型;兩個T-DNA分別位于兩個菌株的二元載體上并且混合接種菌株的類型，和兩個右側(cè)邊界序列位于一個菌株的一個二元載體上的類型(YauandStewart，2013)。[0016]另外，共轉(zhuǎn)化法在DNA的直接導(dǎo)入法中，不是排除選擇標記基因的目的，而是為了在基因?qū)胫笆÷赃B接目標DNA和選擇標記基因的預(yù)先操作而使用。這是因為，如上所述，DNA的直接導(dǎo)入法的多個外來DNA容易整合于相同的基因座。實際上在DNA的直接導(dǎo)入法中，即使以排除選擇標記基因的目的使用共轉(zhuǎn)化法，在下一世代能夠除去選擇標記基因的效率也非常低（YauandStewart，2013)。[0017]利用共轉(zhuǎn)化的情況下，通過例如潮霉素抗性基因等陽性選擇標記基因的表達選擇T0植物之后，在T1世代用陽性選擇標記進行選擇時，通過遺傳性分離而僅導(dǎo)入有出現(xiàn)的目標DNA的T1植物因潮霉素而枯死，因此不能選擇。因此，不在整個植物中，而是在葉區(qū)段中測定藥劑抗性的方法和/或通過PCR檢測導(dǎo)入的DNA的方法是必需的。但是，在這些檢測中花費勞動力。為了減少該勞動力，使用陽性-陰性選擇的方法是有效的。作為選擇標記，與陽性選擇標記基因同時將陰性選擇標記基因定位于相同的T-DNA上，在TO世代通過陽性選擇獲得轉(zhuǎn)化體之后，在T1世代進行陰性選擇，由此可以使導(dǎo)入有選擇標記基因的T1植物枯死。在殘存的T1植物中不再含有選擇標記基因，可以僅通過PCR或基因表達辨別目標DNA的有無而完成（YauandStewart，2013)。[0018]也使用通過土壤桿菌的共轉(zhuǎn)化法、進行了對營養(yǎng)繁殖性的作物而言價值高、且在T0世代排除選擇標記基因的嘗試。用于導(dǎo)入的T-DNA為"所期望的DNA"和"陽性選擇標記基因-陰性選擇標記基因"這2種。報道例有2次報道，但效率低，二者都為通過同樣的步驟的方法（Duttetal.，2008;RamanaRaoand\^1111:11&11113；[，2010)。即，共培養(yǎng)后，所期望的0嫩和選擇標記還沒有被整合于染色體，陽性選擇標記瞬時表達的階段進行利用藥劑的陽性選擇，謀求細胞的選擇。在該過程中，含有所期望的DNA、不含有選擇標記基因的細胞被除去，但在所選擇的細胞中，包含所期望的DNA也一起被導(dǎo)入的物質(zhì)的細胞。其后，將得到的組織重新移至沒有選擇藥劑的培養(yǎng)基時，可得到所期望的DNA被整合于染色體、但選擇標記沒有被整合于染色體的細胞塊。另一方面，在染色體中整合有選擇標記基因的細胞其后通過陰性選擇標記的表達而致死。通過使得到的僅具有所期望的DNA的細胞塊進行再分化，可得到目標植物體。[0019]通過上述的方法，Dutt等(2008)將許多（沒有顯示具體的數(shù)字)葡萄的體細胞胚用于材料，得到僅導(dǎo)入有作為所期望的DNA的egfp(增強型綠色熒光蛋白）的5植物的植物。Dutt等(2008)通過實時PCR的分析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)入五個植物之每個中的egfp基因的拷貝數(shù)是三個植物中的單拷貝，一個植物中的兩拷貝，和一個植物中的六拷貝。報道有：由于以單拷貝導(dǎo)入的植物的比例為60%，因此，以效率高的方式可看到，但相同的研究組用通常的轉(zhuǎn)化方法得到的葡萄轉(zhuǎn)化體中的單拷貝轉(zhuǎn)化體的比率也為60%(Lietal.，2006)。就RamanaRaoandVe1uthambi(2010)進行的煙草中的結(jié)果而言，得到的114植物中的僅5植物具有所期望的DNA的nptll(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II)。這些方法的最重要的步驟為瞬時表達的階段中的陽性選擇。如果在不經(jīng)過該步驟的情況下，則不能濃縮兩種基因都被導(dǎo)入并且瞬時表達的細胞，所得的組織處于主要由無一被導(dǎo)入的細胞占據(jù)的嵌合狀態(tài)，因此得到目標植物變得非常困難。[0020]現(xiàn)有技術(shù)文獻[0021]專利文獻[0022]專利文獻1:W02007/148819A1[0023]非專利文獻[0024]非專利文獻1:Burgess，D.G.，Ralston，E.J.，Hanson，W.G.，Heckert，M.，Ηο，Μ·，Jenq，T.，Palys，J.M.，Tang，K.，andGutterson,N.(2002).Anovel,two-componentsystemforcellethalityanditsuseinengineeringnuclearmale-sterilityinplants.PlantJ31,113-125.[0025]非專利文獻2:Butaye，K·Μ·J·，Cammue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發(fā)明內(nèi)容】[0050]發(fā)明所要解決的技術(shù)問題[0051]在多拷貝導(dǎo)入有目標外來基因的轉(zhuǎn)化植物中，經(jīng)常產(chǎn)生較強地抑制導(dǎo)入的基因的表達的被稱為基因沉默的現(xiàn)象。另外，就目標DNA整合于基因組的方面而言，如果為多拷貝，則某種程度上變得復(fù)雜，其分析變得困難。轉(zhuǎn)化以如下目的而進行：1)在轉(zhuǎn)化體中以表達水平評價導(dǎo)入基因的效果、2)在轉(zhuǎn)化體中評價啟動子或轉(zhuǎn)錄因子的特性、3)制備T-DNA標簽庫、4)以商業(yè)化為目標制備基因重組植物，但任一種情況均優(yōu)選以1-2拷貝導(dǎo)入目標DNA。最優(yōu)選的是以單拷貝被導(dǎo)入。[0052]因此，本發(fā)明的目的在于，提供一種轉(zhuǎn)化的植物細胞的取得方法，其中，每植物細胞所導(dǎo)入的所期望的DNA的拷貝數(shù)較小。[0053]用于解決技術(shù)問題的方案[0054]本發(fā)明包括但不限于以下的實施方案。[0055][實施方案1][0056]-種轉(zhuǎn)化的植物細胞的取得方法，其包含以下的步驟：[0057](a)將所期望的DNA和第一標記基因在植物細胞中進行共轉(zhuǎn)化的步驟;及[0058](b)從步驟(a)中得到的轉(zhuǎn)化植物細胞中選擇在染色體中導(dǎo)入了所期望的DNA、且沒有導(dǎo)入第一標記基因的轉(zhuǎn)化細胞的步驟，[0059]但是，所述方法不包含通過使用所述第一標記基因的陽性選擇而除去僅將所期望的DNA導(dǎo)入了染色體的轉(zhuǎn)化細胞的步驟。[0060][實施方案2][0061]如實施方案1所述的方法，其中，第一標記基因為陰性選擇標記基因。[0062][實施方案3][0063]如實施方案1或2中任一項所述的方法，其中，在步驟(a)中用于共轉(zhuǎn)化的所期望的DNA和第一標記基因的混合比率為3:1-1:5。[0064][實施方案4][0065]如實施方案1-3中任一項所述的方法，其中，在用于步驟(a)的所期望的DNA上連接有作為第二標記基因的陽性選擇標記基因，[0066]通過使用第二標記基因的陽性選擇而進行在步驟(b)的染色體中導(dǎo)入有所期望的DNA的轉(zhuǎn)化細胞的選擇。[0067][實施方案5][0068]如實施方案1-4中任一項所述的方法，其中，步驟(a)通過選自由土壤桿菌法、粒子槍法、電穿孔法、電注射法、聚乙二醇法及須晶法構(gòu)成的組中的轉(zhuǎn)化方法而進行。[0069][實施方案6][0070]-種轉(zhuǎn)化植物的制備方法，其包含:用實施方案1-5中任一項所述的方法取得轉(zhuǎn)化的植物細胞；[0071]將所述植物細胞進行培養(yǎng)而得到植物體。[0072][實施方案7][0073]-種植物的轉(zhuǎn)化方法，其包含以下的步驟：[0074](a)將所期望的DNA和第一標記基因在植物細胞中進行共轉(zhuǎn)化的步驟;及[0075](b)從步驟(a)中得到的轉(zhuǎn)化植物細胞中選擇在染色體中導(dǎo)入了所期望的DNA、且沒有導(dǎo)入第一標記基因的轉(zhuǎn)化細胞的步驟，[0076]但是，所述方法不包含通過使用所述第一標記基因的陽性選擇而除去僅將所期望的DNA導(dǎo)入了染色體的轉(zhuǎn)化細胞的步驟。[0077]發(fā)明效果[0078]本發(fā)明的方法為可以在轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的初期排除多拷貝導(dǎo)入有目標DNA的細胞的技術(shù)。使用本發(fā)明時，優(yōu)選可以以現(xiàn)有技術(shù)的1.3倍以上的頻率獲得僅單拷貝導(dǎo)入有目標DNA的轉(zhuǎn)化植物。另外，優(yōu)選可以將3拷貝以上導(dǎo)入的轉(zhuǎn)化體的頻率減少至現(xiàn)有技術(shù)的1/2以下。通過將本發(fā)明的技術(shù)適用于公知的植物轉(zhuǎn)化技術(shù)，可以減少得到的轉(zhuǎn)化植物中的目標DNA的拷貝數(shù)。進而，與減少拷貝數(shù)的現(xiàn)有的方法同時使用本發(fā)明的方法時，可以進一步以高頻率獲得僅單拷貝導(dǎo)入的轉(zhuǎn)化植物。【附圖說明】[0079]圖1是用于多拷貝轉(zhuǎn)基因細胞排除技術(shù)的、利用土壤桿菌法的共轉(zhuǎn)化法的示意圖。a.:1菌株1載體法、LBA4404(pLC41GUS-HPT共轉(zhuǎn)化（cotra.Barnase)·芽抱桿菌RNA酶）、b.:2菌株混合法、1^44404(?1^：41(；1]3-冊1')+1^44404(?1^：41芽孢桿菌1?祖酶）、(3.:1菌株2載體法(三元載體系統(tǒng)）、LBA4404(pLC41⑶S-HPT::pGW芽孢桿菌RNA酶）、⑶S-HPT:具有內(nèi)含子介導(dǎo)的⑶S基因和HPT基因的T-DNA、芽孢桿菌RNA酶:具有內(nèi)含子介導(dǎo)的芽孢桿菌RNA酶基因的T-DNA、Vir:毒力區(qū)域、pAL4404:卸甲型Ti質(zhì)粒[0080]圖2是表達載體pLC41GUS-HPT的示意圖。[0081]圖3是表達載體pLC41的示意圖。[0082]圖4是表達載體pLC41芽孢桿菌RNA酶的示意圖。[0083]圖5是表達載體pLC41GUS-HPT共轉(zhuǎn)化芽孢桿菌RNA酶的示意圖。[0084]圖6是pGW的示意圖。[0085]圖7是pGW芽孢桿菌RNA酶的示意圖。[0086]圖8是導(dǎo)入的2種T-DNA的示意圖。a.:pLC41GUS-HPT共轉(zhuǎn)化芽孢桿菌RNA酶及pLC41⑶S-HPT中共同的T-DNA區(qū)域、b.:pLC41GUS-HPT::pGW芽孢桿菌RNA酶、pLC41芽孢桿菌RNA酶及pGW芽孢桿菌RNA酶中共同的T-DNA區(qū)域[0087]圖9是表示Southern分析的結(jié)果所推定的GUS-HPT片段的導(dǎo)入拷貝數(shù)的圖。對照：LBA4404(pLC41GUS-HPT)1菌株1載體:LBA4404(pLC41⑶S-HPT共轉(zhuǎn)化芽孢桿菌RNA酶），2菌株混合：LBA4404(pLC41⑶S-HPT)+LBA4404(pLC41芽孢桿菌RNA酶），1菌株2載體：LBA4404(PLC41GUS-HPT::pGW芽孢桿菌RNA酶）[0088]圖10是表示利用定量實時PCR法所推定的煙草轉(zhuǎn)化體中的GUS-HPT片段的導(dǎo)入拷貝數(shù)的圖。對照：LBA4404(pLC41⑶S-HPT)和試驗（2菌株混合）：LBA4404(pLC41GUS-HPT)+LBA4404(pLC41芽孢桿菌RNA酶）[0089]圖11是表示利用定量實時PCR法所推定的玉米轉(zhuǎn)化體中的GUS-bar片段的導(dǎo)入拷貝數(shù)的圖。對照：LBA4404(pSB131)和試驗（2菌株混合）：LBA4404(pSB131)+LBA4404(pLC41芽孢桿菌RNA酶：：pVGW9)【具體實施方式】[0090]以下，對用于實施本發(fā)明的優(yōu)選實施方案進行說明。[0091]本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)化的植物細胞的取得方法。本發(fā)明的方法包含以下的步驟：[0092](a)將所期望的DNA和第一標記基因在植物細胞中進行共轉(zhuǎn)化的步驟;及[0093](b)從步驟(a)中得到的轉(zhuǎn)化植物細胞中選擇在染色體中導(dǎo)入了所期望的DNA、且沒有導(dǎo)入第一標記基因的轉(zhuǎn)化細胞的步驟，[0094]但是，所述方法不包含通過使用所述第一標記基因的陽性選擇而除去僅將所期望的DNA導(dǎo)入了染色體的轉(zhuǎn)化細胞的步驟。[0095]膽[0096]成為本發(fā)明的方法的對象的植物沒有特別限定，包含藻類、被子植物、裸子植物等任意的植物，可以為單子葉植物或雙子葉植物。供試于轉(zhuǎn)化的組織可以根據(jù)植物的種類或使用的轉(zhuǎn)化方法而適當(dāng)選擇。[0097]標記基因[0098]本發(fā)明包含將所期望的DNA和第一標記基因在植物細胞中進行共轉(zhuǎn)化的步驟(a)。本說明書中的"標記基因"是指:具有起指標作用的特性的基因，所述指標用于選擇導(dǎo)入了該基因的細胞或沒有導(dǎo)入該基因的細胞。[0099]不希望限于理論，在將所期望的DNA和第一標記基因進行共轉(zhuǎn)化時，認為將所期望的DNA和第一標記基因隨機導(dǎo)入基因組中，期間混合存在于細胞核中。這種轉(zhuǎn)化的結(jié)果，產(chǎn)生"低拷貝數(shù)導(dǎo)入有基因的細胞"和"多拷貝數(shù)導(dǎo)入有基因的細胞"，但在后者中，產(chǎn)生"多拷貝數(shù)導(dǎo)入有僅所期望的DNA的細胞"的可能性較低，但是后者細胞中的許多成為"包含所期望的DNA和標記基因兩者的多拷貝導(dǎo)入細胞"。因此，通過從得到的轉(zhuǎn)化細胞群中選擇"導(dǎo)入所期望的DNA、且沒有導(dǎo)入標記基因的細胞"，可以大幅度減少"多拷貝導(dǎo)入有所期望的DNA的細胞"。[0100]因此，本發(fā)明的"第一標記基因"指與所期望的DNA不同的基因、且具有在細胞中進行表達時可以除去標記基因表達細胞的性質(zhì)即可。即，它可以為根據(jù)已經(jīng)作為選擇指標導(dǎo)入的可容易地檢測的基因表達有無而除去表達標記基因的細胞（"標記基因表達細胞"）的基因。本發(fā)明中陰性選擇是指選擇性地除去標記基因表達的細胞。因此，換句話說，第一標記基因只要具有可進行陰性選擇的性質(zhì)即可。[0101]標記基因表達細胞和沒有導(dǎo)入標記基因的細胞視覺上可以識別的情況下，可以從細胞群中人為地、例如在顯微鏡下使用鑷子或手術(shù)刀等器具等除去該細胞。作為這種標記基因的實例，可列舉:綠色焚光蛋白質(zhì)(GFP)、紅色焚光蛋白質(zhì)(DsRed)、螢光素酶基因等焚光蛋白質(zhì)基因、lacZ基因等催化呈色反應(yīng)的酶的基因等。[0102]另外，潮霉素抗性基因、慶大霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氨芐西林抗性基因、壯觀霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因、雙丙氨磷抗性基因、草甘膦抗性基因等藥劑抗性基因也可以作為這種標記基因使用。在藥劑選擇步驟中將添加于選擇培養(yǎng)基的藥劑濃度控制為未導(dǎo)入藥劑抗性基因的細胞不死亡的程度時，未導(dǎo)入藥劑抗性基因的細胞雖然沒有完全滅絕，但幾乎不增殖，與正常的細胞在外觀上產(chǎn)生不同，因此，可以與藥劑抗性基因?qū)爰毎M行識別。[0103]以上，可以進行細胞的視覺識別的基因、例如催化呈色反應(yīng)的酶的基因、藥劑抗性基因也具有可進行陰性選擇的性質(zhì)，可以作為本發(fā)明的第一標記基因利用。[0104]另外，作為本發(fā)明的"第一標記基因"，可以優(yōu)選使用陰性選擇標記基因。在本說明書中，將具有表達時選擇性除去含有基因的細胞自身的性質(zhì)的標記基因稱為陰性選擇標記基因。予以說明，還包括下述基因，在對植物細胞或培養(yǎng)基添加特定物質(zhì)的情況下，其選擇性消除含有基因的細胞自身的特性發(fā)揮功能。另外，陰性選擇標記基因不一定限定于結(jié)構(gòu)基因，可以使用編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因以外的非結(jié)構(gòu)基因、例如非編碼RNA的表達序列等。陰性選擇標記基因在該基因被整合于植物基因組中并且從基因?qū)胩幚砗笾林参矬w的再生期間進行表達，由此誘導(dǎo)細胞死亡、細胞的生長停止、或異常的組織形成。使用細胞死亡誘導(dǎo)型的陰性選擇標記基因作為標記基因的情況下，標記基因表達細胞滅絕，因此，不需要除去標記基因表達細胞的操作，操作效率大幅度提高。[0105]在再生的植物體中，優(yōu)選不殘存陰性選擇標記基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)選擇這種陰性選擇標記基因。另外，陰性選擇標記基因的表達優(yōu)選為在瞬時表達的階段不誘導(dǎo)細胞死亡的水平。在本發(fā)明的共轉(zhuǎn)化步驟中，可以產(chǎn)生僅目標DNA被整合于基因組且陰性選擇標記基因進行瞬時表達的細胞，但這種細胞的一部分得到培養(yǎng)而成為僅含有目標DNA的細胞。因此，從防止轉(zhuǎn)化效率的降低的觀點出發(fā)，優(yōu)選通過陰性選擇標記基因的瞬時表達而不使這種細胞滅絕。例如陰性選擇標記的毒性強的情況下，優(yōu)選適用減少該標記基因的表達的啟動子等而抑制毒性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于公知的技術(shù)適當(dāng)進行這種表達調(diào)節(jié)。予以說明，并不受限定，在本申請實施例中，記載有在使用芽孢桿菌RNA酶基因作為陰性選擇標記基因的情況下，使用nos啟動子是適當(dāng)?shù)?。[0106]植物中最廣泛使用的陰性選擇標記基因為源自大腸桿菌的C〇dA基因（YauandStewart，2013)。codA基因編碼胞嘧啶脫氨酶，將沒有毒性的5-氟胞嘧啶(5-FC)變換為有毒性的5-氟尿嘧啶(5-FU)。大腸桿菌的鳥氨酸脫乙?；富虻腶rgE將植物中沒有毒性的N-乙?；蒌@膦(N-乙?；?PPT)變換為具有除草劑活性的草銨膦(PPT)。細菌的細胞色素P450sui將非毒性的除草劑R4702前體變換為細胞有毒性的除草劑R4702。白喉毒素片段A(DT-A)在植物細胞中顯示毒性，但在大腸桿菌或土壤桿菌中沒有毒性(Teradaetal.，2002)。另外，由于在DT-A基因中沒有附加poly-A信號，因此，瞬時表達的mRNA立即被分解，在整合于基因組的情況下，利用附近的poly-Α信號而持續(xù)地表達。芽孢桿菌RNA酶為源自解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的核糖核酸酶。它對原核生物及真核生物均具有強的毒性，但通過使內(nèi)含子插入基因中，可以抑制對原核生物的毒性（Burgessetal.，2002)。并不受限定，在本發(fā)明的方法中，可以將這些基因作為陰性選擇標記基因優(yōu)選使用。[0107]予以說明，在本申請發(fā)明的步驟中，不包含通過使用第一標記基因的陽性選擇而除去僅將所期望的DNA導(dǎo)入染色體的轉(zhuǎn)化細胞的步驟。陽性選擇的定義在"第二標記基因"的項中進行詳述，如果使用第一標記基因進行陽性選擇情況下，會除去僅將所期望的DNA導(dǎo)入染色體的轉(zhuǎn)化細胞，因此無法得到本申請發(fā)明的效果。[0108]在本發(fā)明的方法中，對使用的第一標記基因的數(shù)量沒有限定?？梢詢?yōu)選使用1~2種標記基因。[0109]所期望的DNA[0110]"所期望的DNA"為進行向細胞的導(dǎo)入的任意的DNA，沒有特別限定。所期望的DNA為導(dǎo)入植物細胞的染色體(基因組）的DNA，不一定限定于結(jié)構(gòu)基因，可以使用編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因以外的非結(jié)構(gòu)基因?？梢栽?所期望的DNA"上連接所期望的啟動子及終止子。"所期望的DNA"可以使用與所使用的轉(zhuǎn)化方法相應(yīng)的任意長度的DNA。例如，使用土壤桿菌法的情況下，優(yōu)選〇.lkb-50kb的長度的DNA，這不限制本發(fā)明。[0111]對供于共轉(zhuǎn)化的所期望的DNA和第一標記基因的混合比率沒有特別限定，但優(yōu)選3:1~1:5之間，更優(yōu)選2:1~1:3之間。[0112]轉(zhuǎn)化方法[0113]本發(fā)明中轉(zhuǎn)化方法只要是可以轉(zhuǎn)化植物的方法，就沒有特別限定，可以根據(jù)植物的種類而適當(dāng)選擇。例如可以優(yōu)選使用粒子槍法、電穿孔法、電注射法、聚乙二醇法、須晶法等物理化學(xué)的方法(DNA的直接導(dǎo)入法)或土壤桿菌法等生物學(xué)的方法(DNA的間接導(dǎo)入法）。[0114]共轉(zhuǎn)化[0115]在本說明書中，將源自外源性遺傳物質(zhì)(外源性DNA)的導(dǎo)入、整合(及表達)的細胞的遺傳修飾稱為轉(zhuǎn)化。另外，該術(shù)語也用于指為了修飾而進行的步驟(工藝）。而且，將獨立的兩個以上的外源性遺傳物質(zhì)同時進行轉(zhuǎn)化稱為共轉(zhuǎn)化。同樣地，該術(shù)語也用于指進行它的步驟。予以說明，"獨立的"意指兩個以上的外源遺傳材料不是作為整體的DNA，而是作為分別能夠獨立運行的DNA導(dǎo)入細胞中。[0116]在通過土壤桿菌的共轉(zhuǎn)化法中，有如下4種類型：多個T-DNA分別位于一個菌株中的多個二元載體上的類型（1菌株多載體法）、兩個T-DNA位于一個菌株中的一個二元載體上的類型（1菌株1載體法）、兩個T-DNA分別位于兩個菌株的二元載體上并且混合接種菌株的類型(2菌株法）、和含有通過使用兩個右側(cè)邊界序列獲得的兩個基因的一個T-DNA位于一個菌株的一個二元載體上(YauandStewart，2013)。在本發(fā)明中，任一種類型的方法均可以優(yōu)選實施。關(guān)于2菌株法，菌株的數(shù)目沒有特別限定于2個菌株，而是多個T-DNA可以分別位于要混合接種的多個菌株的二元載體上。[0117]予以說明，第四類是利用雙右側(cè)邊界方法的方法。其為用土壤桿菌法進行轉(zhuǎn)化時的選擇標記除去方法之一(YauandStewart，2013)。即，在此方法中，以成為"RB(右邊界序列)_陽性選擇標記-RB-所期望的DNA-LB(左邊界序列)"的順序的方式構(gòu)成T-DNA，將"RB-陽性選擇標記-RB-所期望的DNA-LB"和"RB-所期望的DNA-LB"導(dǎo)入植物的各自的染色體，從而使它們在下一代分離。通過應(yīng)用該方法，以成為"RB-陰性選擇標記-RB-陽性選擇標記-所期望的DNA-LB"（或"RB-陰性選擇標記-RB-所期望的DNA-陽性選擇標記-LB"）的方式構(gòu)成T-DNA并用于轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生"RB-陰性選擇標記-RB-所期望的DNA-陽性選擇標記-LB"和"RB-所期望的DNA-陽性選擇標記-LB"，成為與進行2種T-DNA的共轉(zhuǎn)化的情況相同的狀況。因此，即使在該情況下通過將此方法應(yīng)用于本發(fā)明的方法，由此可以排除多拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化細胞。在本說明書中，使用此類T-DNA的轉(zhuǎn)化也包含在共轉(zhuǎn)化中。[0118]粒子槍法為將在金或鎢等金屬的微粒上涂敷有DNA的物質(zhì)作為子彈、以高速射出而在細胞內(nèi)導(dǎo)入DNA的方法。也被稱為生物射彈法、顆粒轟擊法、或微粒法。就子彈而言，從為高比重且向細胞內(nèi)的貫通力高、并且化學(xué)上為惰性、對生物體不易帶來傷害的理由出發(fā)，優(yōu)選金微粒。在金屬微粒的射出中主要使用氦等高壓氣體?？梢愿鶕?jù)氣體的壓力或金屬粒子和試樣間的距離等調(diào)節(jié)金屬微粒的射出強度，可以通過此方法向各種各樣的細胞導(dǎo)入DNA。在粒子槍法中，可以通過將2種以上的DNA涂敷于金屬的微粒、作為子彈在細胞內(nèi)導(dǎo)入DNA而進行共轉(zhuǎn)化。[0119]電穿孔法為通過對細胞懸浮液施加電脈沖而在細胞膜中打開微小的孔、將細胞懸浮液中的DNA送入至細胞內(nèi)部而進行轉(zhuǎn)化的方法。在將植物細胞設(shè)為材料的情況下，一般使用分解除去了細胞壁的原生質(zhì)體。但是，也可以使用具有細胞壁的細胞進行轉(zhuǎn)化，其被稱為電注射法。在電穿孔法或電注射法中，可以通過將2種以上的DNA溶解于懸浮液中、在植物細胞存在下施加電脈沖而進行共轉(zhuǎn)化。[0120]聚乙二醇法為使聚乙二醇(PEG)與原生質(zhì)體作用、使DNA摻入植物細胞內(nèi)部。該DNA摻入的機制還不清楚。[0121]須晶法為使用被稱為須晶的針狀的物質(zhì)刺穿植物細胞，從而使DNA摻入細胞內(nèi)的方法。在須晶中可使用碳化硅或硼酸鋁等。[0122]另外，關(guān)于所期望的DNA和標記基因的轉(zhuǎn)化，雙方既可以使用相同的轉(zhuǎn)化方法，也可以使用不同的轉(zhuǎn)化方法，但使用相同的轉(zhuǎn)化方法進行共轉(zhuǎn)化是有效的，更優(yōu)選。[0123]第二標記基因[0124]另外，可以在所期望的DNA上連接作為第二標記基因的陽性選擇標記基因。特別是所期望的DNA不能用作確定轉(zhuǎn)化成功與否的指標的情況，即所期望的DNA不具有作為標記基因的性質(zhì)的情況下，優(yōu)選在該DNA上連接陽性選擇標記基因。[0125]本說明書中"陽性選擇"是指選擇性地選擇標記標記基因表達的細胞，將可在陽性選擇中使用的標記基因稱為陽性選擇標記基因。[0126]視覺上可以識別標記基因表達細胞和沒有導(dǎo)入標記基因的細胞的情況下，可以從細胞群中人為地、例如在顯微鏡下使用鑷子或手術(shù)刀等器具除去選擇標記基因表達細胞。因此，可以將具有對細胞賦予熒光等視覺上可識別的性質(zhì)的特征的基因作為陽性選擇標記基因使用。作為這樣的標記基因的實例，可列舉：綠色熒光蛋白質(zhì)（GFP)、紅色熒光蛋白質(zhì)(DsRed)、螢光素酶基因等焚光蛋白質(zhì)基因、lacZ基因等催化呈色反應(yīng)的酶的基因等。[0127]另外，作為陽性選擇標記基因，可以優(yōu)選使用下述基因，所述基因在從基因轉(zhuǎn)移過程直至植物再生的期間在植物染色體基因組中整合和表達時防止細胞死亡、細胞生長停滯或異常組織形成等細胞現(xiàn)象。通過設(shè)定為表達這種陽性選擇標記基因的細胞能夠存活、但是不表達該陽性選擇標記基因的細胞不能存活的條件，可以有效地進行陽性選擇。并不受限定，作為陽性選擇標記基因的實例，可列舉:潮霉素抗性基因、慶大霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氨芐西林抗性基因、壯觀霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因等抗生素抗性基因、雙丙氨磷抗性基因、草甘膦抗性基因等除草劑抗性基因、磷酸甘露糖異構(gòu)酶(phosphormannoseisomerase:PMI)基因、2-脫氧葡萄糖-6-磷酸酶基因或木糖異構(gòu)酶基因等對植物賦予新的糖代謝能力的基因。[0128]予以說明，抗生素或除草劑對植物的非轉(zhuǎn)化細胞而言具有有害的作用，但甘露糖或木糖之類的糖雖然對植物而言為不能進行代謝的碳源，但是沒有有害性。在此，將植物本來不能代謝的碳源作為選擇藥劑，并與能將這些碳源變換為植物可以代謝的碳源的酶基因作為選擇標記組合，構(gòu)建對非轉(zhuǎn)化細胞不產(chǎn)生有害的影響的選擇系統(tǒng)。將該系統(tǒng)稱為(狹義的）陽性選擇系統(tǒng)，有時將該選擇標記稱為（狹義的）陽性選擇標記基因（Upadhyayaetal.，2010)。但是，如上所述，本發(fā)明中陽性選擇是指選擇性地選擇標記基因表達的細胞，將可在陽性選擇中使用的標記基因稱為陽性選擇標記基因，并且這些術(shù)語不限定于狹義的內(nèi)容。[0129]因此，本申請發(fā)明也包含如下實施方案：[0130]在用于步驟(a)的所期望的DNA上連接作為第二標記基因的陽性選擇標記基因，[0131]通過使用第二標記基因的陽性選擇而進行在步驟(b)中對染色體中導(dǎo)入有所期望的DNA的轉(zhuǎn)化細胞的選擇。[0132]"在所期望的DNA上連接作為第二標記基因的陽性選擇標記基因"是指:所期望的DNA和第二標記基因彼此連接，在轉(zhuǎn)化中兩者同時運行。因此，在通過轉(zhuǎn)化將所期望的DNA整合于植物細胞的染色體的情況下，第二標記基因也被整合。另一方面，在轉(zhuǎn)化失敗、所期望的DNA沒有被整合于植物細胞的染色體的情況下，第二標記基因也沒有被整合。該點，第二標記基因與第一標記基因在轉(zhuǎn)化的位置上不同，所述第一標記基因作為與所期望的DNA分開并且獨立于所期望的DNA的DNA共轉(zhuǎn)化并且不同運行。[0133]例如，通過兩個T-DNA位于一個菌株中的一個二元載體上的土壤桿菌法類型（1菌株1載體法)進行共轉(zhuǎn)化時，所期望的DNA和第二標記基因彼此進行連接，以被夾持于"RB"和"LB"之間。例如，"RB-第二標記基因-所期望的DNA-LB"。另一方面，第一標記基因夾持于與夾持所期望的DNA的"RB"和"LB"不同的"RB"和"LB"之間。例如，序列參照本申請的圖5?；蛘?，采用雙右邊界法的情況下，例如，可以以成為"RB-陰性選擇標記-RB-陽性選擇標記-所期望的DNA-LB"（或"RB-陰性選擇標記-RB-所期望的DNA-陽性選擇標記-LB"）的方式構(gòu)成T-DNA〇[0134]轉(zhuǎn)化細胞的選擇[0135]在本說明書中，轉(zhuǎn)化細胞是指外來基因經(jīng)過轉(zhuǎn)化過程而被整合于染色體基因組的細胞或其后代。[0136]在本發(fā)明的步驟(b)中，從步驟(a)中得到的轉(zhuǎn)化植物細胞中選擇在染色體中導(dǎo)入所期望的DNA、且沒有導(dǎo)入第一標記基因的轉(zhuǎn)化細胞。[0137]對這些選擇的順序沒有特別限定。具體而言，可以為如下任一種方案：[0138]1)除去含有第一標記基因的轉(zhuǎn)化細胞，并且對剩余的細胞選擇含有所期望的DNA的轉(zhuǎn)化細胞；[0139]2)選擇含有所期望的DNA的轉(zhuǎn)化細胞，并且對剩余的細胞除去含有第一標記基因的轉(zhuǎn)化細胞;或者[0140]3)同時進行含有第一標記基因的轉(zhuǎn)化細胞的除去和含有所期望的DNA的轉(zhuǎn)化細胞的選擇。[0141]"除去含有標記基因的轉(zhuǎn)化細胞"例如在第一標記基因為陰性選擇標記基因的實施方案中，在該基因被導(dǎo)入染色體的細胞中陰性選擇標記基因表達的情況下，通過引起細胞死亡、細胞的增殖停止、或異常的組織形成等的陰性選擇，可以除去含有標記基因的轉(zhuǎn)化細胞。[0142]"含有所期望的DNA的轉(zhuǎn)化細胞的選擇"也在所期望的基因為標記基因的情況下，僅選擇具有基于標記基因的表達的性質(zhì)的細胞。所期望的DNA不能用作確定轉(zhuǎn)化成功與否的指標的情況、即所期望的DNA不是標記基因的情況下，優(yōu)選在該DNA上連接陽性選擇標記基因。僅選擇具有基于該陽性選擇標記基因的表達的性質(zhì)的細胞。[0143]所期望的DNA、第一標記基因、第二標記基因的各基因的表達可以為組成性的，也可以為誘導(dǎo)性。在表達為誘導(dǎo)性的情況下，例如可以利用后述的從外部給予的特定化合物誘導(dǎo)基因表達。誘導(dǎo)性表達除從外部給予的特定化合物以外，可以通過高溫處理、低溫處理等應(yīng)力處理而進行。[0144]予以說明，在轉(zhuǎn)化細胞的選擇中，不包含使轉(zhuǎn)化植物雜交而得到的轉(zhuǎn)化植物后代中利用選擇標記的選擇。[0145]利用特定化合物的基因表達誘導(dǎo)系統(tǒng)[0146]有利用從外部給予的化合物誘導(dǎo)基因表達的方法。在本發(fā)明的方法中，可以使用利用這種特定化合物的基因表達誘導(dǎo)系統(tǒng)控制選擇標記基因的表達時間。特別是使用在瞬時表達水平上誘導(dǎo)細胞死亡或細胞生長停滯的強陰性選擇標記基因作為第一標記基因的情況下，從轉(zhuǎn)化效率的觀點出發(fā)，優(yōu)選將標記基因的表達時期推遲到標記基因被整合于染色體基因組。這種情況下，可以使用利用下述的特定化合物的基因表達誘導(dǎo)系統(tǒng)控制表達時間。[0147]作為這種基因表達誘導(dǎo)系統(tǒng)的條件，可列舉：（1)特定化合物作為誘導(dǎo)劑或活化劑對于控制反式轉(zhuǎn)錄因子的活性是必需的，并且此類化合物在植物的生命周期中自身不能合成，并且具有接觸植物的低可能性的條件；（2)植物不含控制轉(zhuǎn)錄的啟動子的順式元件的條件。例如，利用進化上遠緣的細菌等的順式元件時，植物自身本來具有的反式轉(zhuǎn)錄因子與其順式元件相互作用的可能性較低。為了滿足上述的條件，合成嵌合/反式轉(zhuǎn)錄因子，其中將與源自細菌的順式序列連接的域的氨基酸序列、與用于控制轉(zhuǎn)錄因子的活性的特定化合物連接的區(qū)的氨基酸序列、及與轉(zhuǎn)錄活化域的氨基酸序列的三個區(qū)域進行了融合。目前，正在開發(fā)利用四環(huán)素或雌二醇等的基因表達誘導(dǎo)系統(tǒng)。[0148](i)四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng):存在于大腸桿菌的轉(zhuǎn)座子TnlO的四環(huán)素抗性操縱子(tet操縱子）的表達由作為阻遏物的TetR(氨基酸序列）和作為操縱基因的tet0(5'_TCCCTATCAGTGATAGAGAA-3'）負控制。在缺乏四環(huán)素的情況下，TetR與tetO連接而抑制轉(zhuǎn)錄，但在四環(huán)素存在下從tetO中解離。即，四環(huán)素為tet操縱子的誘導(dǎo)劑。因此，與植物中組成性表達的基因的啟動子下游連接的TetR的tetR基因與多個與另一個啟動子下游連接的tetO組合，期望表達的基因與所述另一個啟動子的下游連接。通過將四環(huán)素作為誘導(dǎo)劑進行給藥而誘導(dǎo)tetO下游的基因。予以說明，作為誘導(dǎo)劑，與四環(huán)素相比，多西環(huán)素的誘導(dǎo)性高。[0149](ii)雌二醇誘導(dǎo)系統(tǒng):這是一種轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)系統(tǒng)，其含有合成的轉(zhuǎn)錄活化物XVE(氨基酸序列）并且將作為最初與LexA連接的操縱基因的S0S盒(δ'-ΤΑΠ?ΤΑΤΑΤΑΤΑΤΑΟΑΟΤΑ-Β'）作為與XVE連接的順式序列在CaMV35S最小啟動子的TATA盒的上游定位，所述合成的轉(zhuǎn)錄活化物XVE通過融合LexA(即，大腸桿菌的S0S調(diào)節(jié)子(代8111〇11)的阻遏物）的位置1-87的氨基酸殘基、源自單純皰疹病毒(HSV)的VP16(氨基酸序列）的轉(zhuǎn)錄活性位點（第403-479位氨基酸殘基）、人雌激素受體的調(diào)節(jié)域（282-595位氨基酸殘基）獲得。在缺乏雌二醇時，CaMV35S最小啟動子幾乎沒有轉(zhuǎn)錄活性。但是，XVE與雌二醇彼此結(jié)合時，XVE與SOSbox結(jié)合而強力地誘導(dǎo)下游的CaMV35S最小啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。即，這為正調(diào)節(jié)系統(tǒng)。[0150]轉(zhuǎn)化植物的制備方法[0151]本發(fā)明進而涉及一種轉(zhuǎn)化植物的制備方法。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物的制備方法包含：通過取得本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的植物細胞的方法，取得轉(zhuǎn)化的植物細胞;將所述植物細胞進行培養(yǎng)而得到植物體。[0152]在本發(fā)明的方法中，將轉(zhuǎn)化細胞進行培養(yǎng)。將轉(zhuǎn)化細胞進行培養(yǎng)而得到植物體的步驟可以使用與植物的種類相應(yīng)的任意的方法。[0153]作為培養(yǎng)基，可列舉例如以LS無機鹽類或N6無機鹽類為基本的培養(yǎng)基、例如具體而言為LSZ培養(yǎng)基等。培養(yǎng)基可以含有選擇藥劑。本步驟中的"培養(yǎng)"是指:在固化的培養(yǎng)基上或液體培養(yǎng)基中放置植物細胞或植物組織，以在適當(dāng)?shù)臏囟?、明暗條件下培養(yǎng)適當(dāng)?shù)臅r間段。在本發(fā)明中，就培養(yǎng)基的方案而言，只要是將培養(yǎng)基成分充分供給至植物組織，就沒有特別限定。培養(yǎng)基的固化可以通過例如瓊脂糖等來進行。本步驟中的培養(yǎng)溫度可以適當(dāng)選擇，并且在優(yōu)選20°C-35°C、進一步優(yōu)選25°C下進行。另外，本步驟的培養(yǎng)在優(yōu)選16-24小時/天的光照條件下進行，但并不限定于此。本步驟的培養(yǎng)期間也可以適當(dāng)選擇，優(yōu)選為7天-21天，更優(yōu)選為14天。[0154]植物的轉(zhuǎn)化方法[0155]本發(fā)明還涉及植物的轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明的方法包含以下的步驟：[0156](a)將所期望的DNA和第一標記基因在植物細胞中進行共轉(zhuǎn)化的步驟;及[0157](b)從步驟(a)中得到的轉(zhuǎn)化植物細胞中選擇在染色體中導(dǎo)入了所期望的DNA、且沒有導(dǎo)入第一標記基因的轉(zhuǎn)化細胞的步驟，[0158]但是，所述方法不包含通過使用所述第一標記基因的陽性選擇而除去僅將所期望的DNA導(dǎo)入了染色體的轉(zhuǎn)化細胞的步驟。[0159]實施例[0160]以下，基于實施例，詳細地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于這些實施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于本說明書的記載容易地對本發(fā)明加以修飾、變更，這些也包含在本發(fā)明的技術(shù)的范圍。[0161]實施例1共轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建[0162]1)目標DNA及陽性選擇標記基因[0163]使用蓖麻過氧化氫酶基因的第一個內(nèi)含子介導(dǎo)的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因作為目標DNA，使用潮霉素抗性(ΗΡΤ)基因作為陽性選擇標記基因。GUS基因由35S啟動子控制，終止子使用nosAPT基因由玉米泛素(Ubi)基因的啟動子控制，終止子使用nos。予以說明，在HPT翻譯區(qū)域的上游定位有玉米的泛素基因的第一個內(nèi)含子。[0164]2)陰性選擇標記基因[0165]陰性選擇標記基因使用解淀粉芽孢桿菌的芽孢桿菌RNA酶基因。表達由nos啟動子控制，終止子使用35S。另外，由于芽孢桿菌RNA酶的表達會使大腸桿菌或土壤桿菌死亡，因此，使稻Rf-Ι基因的第5ge內(nèi)含子介入芽孢桿菌RNA酶基因（Pnos-芽孢桿菌RNA酶-T35S)。由此，此標志物可以被改變?yōu)閮H在植物細胞內(nèi)表達的陰性選擇標記。將稻Rf-Ι基因的第5個內(nèi)含子介入了使用的解淀粉芽孢桿菌的芽孢桿菌RNA酶基因中的序列示于序列號1，將解淀粉芽孢桿菌的芽孢桿菌RNA酶基因的序列示于序列號2,將稻Rf-Ι基因的第5個內(nèi)含子的序列示于序列號3。序列號1的堿基180-288的堿基序列相當(dāng)于序列號3的稻Rf-1基因的第5個內(nèi)含子的堿基序列。[0166]3)二元載體pLC41GUS-HPT(圖2)的構(gòu)建[0167]國際申請公開W02007/148819A1中所記載的國際載體pLCleo(別名pLC41GWH)為具有復(fù)制起點oriV的IncP質(zhì)粒。oriV在大腸桿菌及土壤桿菌這兩者中起作用。通過將PLC41GWH的EcoRI-Pmel片段及具有多克隆位點的pSBll(Komarietal.，1996)的EcoRI-Pmel片段連接，得到在T-DNA上僅具有多克隆位點的二元載體pLC41(圖3)。[0168]pLC41⑶S-HPT載體的構(gòu)建按照以下的步驟進行。首先，進行將GUS-HPT片段擴增的PCR。將pSB34(HieiandKomari，2006)作為模板，使用引物⑶S-HPTinpSB34F(其含有位于⑶S下游的Tnos的3'部分和位于下游的編碼Spel的序列）、和引物⑶S-HPTinpSB34R(其位于HPT下游的Tons的3'部分和位于下游的編碼Kpnl的序列）進行PCR。將得到的GUS-HPT片段用Spel和ΚρηΙ進行雙重消化，在預(yù)先用Xbal和ΚρηΙ進行了雙重消化的pLC41載體上進行連接，由此得到載體PLC41⑶S-HPT。將該載體用電穿孔法導(dǎo)入土壤桿菌LBA4404,得到LBA4404(pLC41GUS-HPT)(圖Ι-b左）。[0169][表1][0170]表l:pLC41⑶S+HPT相關(guān)引物[0171][0172]4)二元載體pLC41芽孢桿菌RNA酶(圖4)的構(gòu)建[0173]載體pLC41芽孢桿菌RNA酶的構(gòu)建按照以下的步驟進行。首先，對Pnos-芽孢桿菌RNA酶-T35S片段（以下，芽孢桿菌RNA酶片段)進行合成，在pUC57載體的EcoRV位點進行克隆(芽孢桿菌RNA酶/pUC57)。接著，進行擴增芽孢桿菌RNA酶片段的PCR。使用芽孢桿菌RNA酶/PUC57作為模板，并且使用編碼M13測序引物區(qū)域的M13/pUC24mer、和在pUC57的多克隆位點的3'部分加入編碼AvrII的序列的pUC57476(ArII)longR作為引物。其結(jié)果，得到1120bp的PCR產(chǎn)物。將該芽孢桿菌RNA酶片段在載體pCR4T0P0(InVitr〇gen公司制備）上進行TA克隆，得到PCR4T0P0/芽孢桿菌RNA酶。[0174]接著，在PLC41的RB-LB間的多克隆位點插入芽孢桿菌RNA酶片段。具體而言，將PLC41用Xbal消化后，進行脫磷酸化，與預(yù)先進行了Spel消化的pCR4T0P0/芽孢桿菌RNA酶的芽孢桿菌RNA酶片段進行連接，得到pLC41芽孢桿菌RNA酶（圖4)。將該載體用電穿孔法導(dǎo)入土壤桿菌LBA4404，得到LBA4404(pLC41芽孢桿菌RNA酶）（圖1-b右）。[0175][表2][0176]表2:pLC41芽孢桿菌RNA酶相關(guān)引物[0177][0178]5)雙重T-DNA二元載體pLC41GUS-HPT共轉(zhuǎn)化芽孢桿菌RNA酶（圖5)的制備[0179]接著，將pLC41芽孢桿菌RNA酶作為模板，進行擴增從RB上游的約330bp至LB下游的約520bp的RB-芽孢桿菌RNA酶-LB的PCR，另外，將pLC41GUS-HPT作為模板，進行擴增從KorB至ori的pLC41⑶S-HPTKorBtooriT的PCR。在用于RB-芽孢桿菌RNA酶-LB的PCR反應(yīng)中，使用由編碼RB的約330bp上游部分的序列構(gòu)成的5'末端磷酸化引物(pLC41330bp-RBF+P)和由編碼LB的約520bp下游部分的序列構(gòu)成的5'末端磷酸化引物(pLC41LB-520bpR+P)。在用于pLC41GUS-HPTKorBtooriT的PCR反應(yīng)中，使用由在下游方向編碼oriT-IncC間的部分的序列構(gòu)成的引物pLC41oriT-IncCF及由在上游方向編碼oriT-IncC間的部分的序列構(gòu)成的引物pLC41oriT-IncCR。其結(jié)果，在RB-芽孢桿菌RNA酶-LB片段中得到約2280bp的PCR產(chǎn)物，在pLC41GUS-HPTKorBtooriT片段中得到約17000bp的PCR產(chǎn)物。[0180]將RB-芽孢桿菌RNA酶-LB片段和pLC41GUS-HPTKorBtooriT片段進行連接，得到載體pLC41GUS-HPT共轉(zhuǎn)化芽孢桿菌RNA酶(圖5)。[0181]將該載體用電穿孔法導(dǎo)入土壤桿菌LBA4404,得到LBA4404(pLC41⑶S-HPT共轉(zhuǎn)化芽孢桿菌RNA酶)（圖1-a)。[0182][表3][0183]表3:pLC41GUS-HPT共轉(zhuǎn)化芽孢桿菌RNA酶相關(guān)引物[0184][0185]6)三元載體pGW芽孢桿菌RNA酶（圖7)的制備[0186]在專利文獻W02007/148819A1中公開一種在土壤桿菌中能夠與二元載體pLC41(IncP型）共存、且具有源自pTiBo542的virGN54D的pVGW2(IncW型）載體。在本實施例中，將載體PVGW2通過從中除去virGN54D而修飾為更簡單的載體pGW(圖6)。具體而言，以pVGW2為模板，通過pSa5'EcT22I和M13(-20)Fw的引物集進行PCR，使得到的片段自身連接，以獲得用作三元載體的新克隆載體pGW(圖6)。載體pGW可以與第二載體(二元載體)pLC41同時作為第三載體(三元載體)在相同土壤桿菌中保持，并且在各自的載體上可以分別地定位T-DNA。因此，可以僅使用1種土壤桿菌將連接有陽性選擇標記基因的目標DNA和陰性選擇標記基因進行共轉(zhuǎn)化（圖1-c)。以pLC41芽孢桿菌RNA酶為模板，進行用于在RB-芽孢桿菌RNA酶-LB盒的兩端之每個添加Spel位點的PCR。在PCR反應(yīng)中，使用由在RB上游的330bp添加有Spel位點的序列構(gòu)成的引物pLC41330bp-RB+SpeIF(10pmol/ul)及由在LB下游的520bp添加有Spel位點的序列構(gòu)成的引物pLC41520bp-LB+SpeIR。其結(jié)果，得到作為2300bp的PCR產(chǎn)物的RB-芽孢桿菌RNA酶-LB的Spel片段。將該片段在預(yù)先用Xbal進行了消化的pGW上進行連接，得到在正向方向插入有RB-芽孢桿菌RNA酶-LB片段的pGW芽孢桿菌RNA酶。[0187]將完成的pGW芽孢桿菌RNA酶與pLC41GUS-HPT同時利用電穿孔法導(dǎo)入土壤桿菌LBA4404,得到LBA4404(pLC41GUS-HPT::pGW芽孢桿菌RNA酶）（圖1-c)。[0188][表4][0189]表4:pGW芽孢桿菌RNA酶相關(guān)引物[0190][0191]實施例2使用共轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)的稻轉(zhuǎn)化[0192]材料及方法[0193]1)供試土壤桿菌菌株及載體[0194]在下述的3種用于消除多拷貝細胞的共轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)中進行連接有陽性選擇標記基因的目標DNA和陰性選擇標記基因的共轉(zhuǎn)化。[0195]a.l菌株1載體型:LBA4404(pLC41GUS-HPT共轉(zhuǎn)化芽孢桿菌RNA酶）（圖1-a)[0196]b.2菌株混合型：LBA4404(pLC41GUS-HPT)+LBA4404(pLC41芽孢桿菌RNA酶）（圖1-b)[0197]c.l菌株2載體型:LBA4404(pLC41GUS-HPT::pGW芽孢桿菌RNA酶）（三元載體系統(tǒng)）(圖卜c)[0198]2)稻的轉(zhuǎn)化方法[0199]在水稻品種中使用雪光(Yukihikari)。在開花后第10天左右采集在溫室內(nèi)栽培的稻的穗。將用鑷子除去了穎片的未熟種子進行殺菌之后，在實體顯微鏡下采集1.3-1.8mm長的未熟胚。對這些未熟胚以20，000xg的離心加速度進行10分鐘的離心處理。土壤桿菌在含有與菌株的藥劑抗性相應(yīng)的選擇藥劑的AB培養(yǎng)基(Chiltonetal.，1974)上、在28°C黑暗下培養(yǎng)3天后，懸浮于1.0ml的AA-inf培養(yǎng)基(AA主要為無機鹽類、B5微量無機鹽類、B5維生素、AA氨基酸、O.lmM乙酰丁香酮、20g/l蔗糖、10g/l葡萄糖、0.5g/l維生素檢測酪蛋白氨基酸、pH5.2)中。懸浮濃度以660nm的0D值計調(diào)整為約1.0。予以說明，將2菌株混合接種的情況下，2菌株均以0D值計調(diào)整為約1.0之后，進行混合并接種。接著，將未熟胚在共培養(yǎng)用的N6-As培養(yǎng)基(N6無機鹽類及維生素、lmg/1的2,4-D、0.5mg/l的6BA、20g/l鹿糖、10g/l葡萄糖、〇.5g/l脯氨酸、0.5g/l維生素檢測酪蛋白氨基酸、8g/l瓊脂糖I型、O.lmM乙酰丁香酮、PH5.2)上使盾片面朝上放置未熟胚，滴加土壤桿菌的懸浮液。共培養(yǎng)在25°C黑暗下進行7天。[0200]共培養(yǎng)后，將每個未熟胚切成4-6個切片，使盾片朝上，置于nN6C培養(yǎng)基(N6無機鹽類及維生素、lmg/1的2,4-D、0.5mg/l的6BA、20g/l鹿糖、55g/l山梨醇、0.5g/l脯氨酸、0.5g/1維生素檢測酪蛋白氨基酸、58/1結(jié)冷膠(861]^]1811111)、25〇11^/1頭孢噻聘、1〇〇11^/1羧節(jié)西林、PH5.8)，在30°C、5,0001x光照條件下進行10天非選擇(靜息)培養(yǎng)。將未熟胚的每個切片進一步切成4-5個切片，置于nN6CH50(N6無機鹽類及維生素、lmg/1的2，4-D、0·5mg/l的6BA、20g/l鹿糖、55g/l山梨醇、0.5g/l脯氨酸、0.5g/l維生素檢測酪蛋白氨基酸、5g/l結(jié)冷膠、250mg/l頭孢噻肟、100mg/l羧芐西林、50mg/l潮霉素Β、ρΗ5·8)選擇培養(yǎng)基，在30°C、5,0001x光照條件下進行10-14天利用潮霉素的選擇培養(yǎng)。[0201]將增殖的愈合組織置于N6RH50再生培養(yǎng)基(N6微量無機鹽類及維生素、1/2濃度N6主要無機鹽類、AA氨基酸、0.5mg/l激動素、20g/l蔗糖、30g/l山梨醇、0.5g/l維生素檢測酪蛋白氨基酸、4g/l結(jié)冷膠、50mg/l潮霉素匕？!15.8)，在30°(：、5,00011光照條件下培養(yǎng)14天。置于再生培養(yǎng)基的愈合組織的數(shù)目是每未熟胚切片的單個部分為1個。由此，可以將在再生培養(yǎng)基上放置的各自的愈合組織作為獨立的轉(zhuǎn)化事件處理。將再生的幼苗移植于N6FH50生根培養(yǎng)基（N6微量無機鹽類及維生素、1/2濃度N6主要無機鹽類、AA氨基酸、20g/l蔗糖、0.5g/l維生素檢測酪蛋白氨基酸、4g/l結(jié)冷膠、50mg/l潮霉素Β、ρΗ5·8)，在30°C、5,0001x光照條件下培養(yǎng)10-14天。每個生根的植物體移植到盆，在溫室內(nèi)進行栽培。[0202]3)稻轉(zhuǎn)化體的Southern分析[0203]從在溫室內(nèi)進行了栽培的潮霉素耐性轉(zhuǎn)化體的葉中利用酚-氯仿提取法提取基因組DNA。將基因組DNA用ΚρηΙ消化后，使用TypeII瓊脂糖（SIGMA公司）在TAE緩沖液中進行瓊脂糖電泳。通過堿性印跡法進行對尼龍膜轉(zhuǎn)移后，將hpt作為探針進行Southern雜交（圖8-a)。另外，通過使用1菌株1載體型的LBA4404(pLC41GUS-HPT共轉(zhuǎn)化芽孢桿菌RNA酶）（圖1-a)得到的51稻轉(zhuǎn)化植物用Sail消化，然后進行以芽孢桿菌RNA酶為探針的Southern分析(圖8-b)〇[0204]結(jié)果及討論[0205]1)稻的轉(zhuǎn)化結(jié)果[0206]在任何實驗區(qū)中均可得到轉(zhuǎn)化體，但與僅導(dǎo)入有⑶S-HPT的對照區(qū)相比，在將芽孢桿菌RNA酶進行了共轉(zhuǎn)化的實驗區(qū)中，轉(zhuǎn)化效率更低(表5)。這是由于作為陰性選擇標記的芽孢桿菌RNA酶與GUS-HPT同時被整合于同一稻細胞的染色體，并且該細胞通過芽孢桿菌RNA酶的表達而致死。芽孢桿菌RNA酶引起的稻的細胞死亡以盾片表面上的細胞中部分引起的明顯褐變的形式出現(xiàn)。從接種土壤桿菌后10天-20天開始觀察到褐變。這先于選擇培養(yǎng)的開始，因此，褐變不是潮霉素導(dǎo)致的影響。另外，7天的共培養(yǎng)之后即刻，未熟胚的盾片細胞中的瞬時GUS活性沒有得到阻止，將作為底物的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸(X-Gluc)溶液進行處理時，對照以及3種實驗區(qū)中均顯示同等GUS活性。其顯示:芽孢桿菌RNA酶以瞬時表達的水平?jīng)]有使細胞致死。[0207]在使用1菌株1載體法的LBA4404(pLC41GUS-HPT共轉(zhuǎn)化芽孢桿菌RNA酶)時，可看到30%的效率降低(表5)。通過LBA4404(pLC41⑶S-HPT)和LBA4404(pLC41芽孢桿菌RNA酶）的2菌株混合接種法、以及LBA4404(pLC41GUS-HPT::pGW芽孢桿菌RNA酶）的1菌株2載體法獲得的轉(zhuǎn)化效率為同程度，二者都為90%以上(表5)。在1菌株1載體法中，顯示兩種T-DNA對同一細胞的導(dǎo)入效率高。這推測是因為，在1菌株1載體法中，與其它實驗區(qū)相比，2種T-DNA在基本上相同的時機被大量切除以轉(zhuǎn)移至植物細胞。另外，在芽孢桿菌RNA酶以瞬時表達水平誘導(dǎo)細胞死亡的情況下，預(yù)料轉(zhuǎn)化的效率非常低。由于沒有獲得這種結(jié)果，因此，認為通過nos啟動子適當(dāng)控制芽孢桿菌RNA酶的表達。[0208][表5][0209]雪光稻品種中的轉(zhuǎn)化效率[0212]*對照：LBA4404(pLC41GUS-HPT)[0213]1菌株1載體:LBA4404(pLC41GUS-HPT共轉(zhuǎn)化芽孢桿菌RNA酶）[0214]2菌株混合:LBA4404(pLC41GUS-HPT)+LBA4404(pLC41芽孢桿菌RNA酶）[0215]1菌株2載體:LBA4404(pLC41GUS-HPT::pGW芽孢桿菌RNA酶）[0216]2)利用Southern法的導(dǎo)入拷貝數(shù)的分析[0217]將使用hpt探針進行Southern雜交的結(jié)果示于圖9。由每種經(jīng)分析的轉(zhuǎn)化體檢測的至少一條帶具有6.7kb以上的大小。6.7kb以上的帶的檢測暗示GUS-HPT的整個T-DNA被導(dǎo)入。在對照的載體中，分析植物中的47%為單拷貝導(dǎo)入，與此相對，在1菌株1載體系統(tǒng)中，在2倍以上的89%的植物中為單拷貝導(dǎo)入。另外，殘余的11%的植物全部顯示2拷貝導(dǎo)入（圖9)。在2菌株混合系統(tǒng)和1菌株2載體系統(tǒng)中，在單拷貝植物的比例上幾乎沒有差異，分別為67%及65%，增加至對照的1.43倍及1.38倍（圖9)。這樣，在實驗區(qū)中，低拷貝導(dǎo)入植物的比例顯著地增加，其顯示:在共轉(zhuǎn)化中，在向同一細胞的染色體多拷貝導(dǎo)入GUS-HPT的情況下，用作陰性選擇標記的芽孢桿菌RNA酶基因趨于一起。WangandWaterhouse(2000)報道了：在用土壤桿菌法得到的許多稻轉(zhuǎn)化體植物中，彼此以正向或互相反向方向重復(fù)連接的Τ'-DNA被整合于相同基因座中。推測生成此類轉(zhuǎn)化植物的細胞在與陰性選擇標記基因的共轉(zhuǎn)化中被殺死。[021S]對使用1菌株1載體法的LBA4404(pLC41⑶S-HPT共轉(zhuǎn)化芽孢桿菌RNA酶)得到的51個稻轉(zhuǎn)化體植物實施使用芽孢桿菌RNA酶探針的Southern雜交。在全部的植物中，未檢測出與芽孢桿菌RNA酶基因雜交的信號。可知：為了誘導(dǎo)植物的細胞死亡，導(dǎo)入的Pnos-Int芽孢桿菌RNA酶-T35S是必需且充分表達的。推測為:芽孢桿菌RNA酶即使極少的表達量也誘導(dǎo)細胞死亡。[0219]3)結(jié)論[0220]可知:通過陰性選擇標記基因和含有陽性選擇標記基因的目標DNA的共轉(zhuǎn)化，可以在培養(yǎng)的初期排除多拷貝導(dǎo)入細胞。在實施例中，使用3種土壤桿菌的載體系統(tǒng)，但不限于該系統(tǒng)，容易地推測為可以使用一大批轉(zhuǎn)化系統(tǒng)?？紤]到機制，明顯的是:關(guān)于粒子槍等DNA的直接導(dǎo)入法也可以適用于共轉(zhuǎn)化。在直接導(dǎo)入法中，最初經(jīng)常發(fā)生多拷貝導(dǎo)入，因此，此方法非常有效用于減少拷貝數(shù)。[0221]實施例3:通過使用芽孢桿菌RNA酶的共轉(zhuǎn)化消除煙草的多拷貝轉(zhuǎn)化體[0222]材料及方法[0223]1)煙草的轉(zhuǎn)化[0224]利用安替佛民（antiformin)將煙草品種SR1的種子進行殺菌處理，無菌地播種于生根培養(yǎng)基（1/2濃度LS無機鹽、1/2濃度LS維生素、15g/l蔗糖、3g/l結(jié)冷膠、250mg/l頭孢噻肟、PH5.8)。播種后，在25°C光照條件下進行培養(yǎng)，培育至子葉完全展開。將通過用剪子切除完全展開的子葉的前端和基部而得到的長方形的子葉區(qū)段用于土壤桿菌的感染。土壤桿菌的接種通過將子葉區(qū)段收集到皿中的LSR液體培養(yǎng)基（LS無機鹽、LS維生素、30g/l蔗糖、0.5g/l的2-嗎啉代乙磺酸(MES)-水合物、pH5.8)上、將該液體培養(yǎng)基更換為土壤桿菌的懸浮液并浸漬其中的區(qū)段10分鐘來進行。土壤桿菌懸浮液通過在補充有50mg/l卡那霉素的AB培養(yǎng)基上在28°C黑暗下將土壤桿菌培養(yǎng)3天、懸浮于LSR液體培養(yǎng)基而制備。懸浮濃度以660nm的0D值計調(diào)整為1.0。在兩個實驗區(qū)中進行測試，即，在將LBA4404(pLC41⑶S-HPT)進行單獨接種的對照區(qū)以及將LBA4404(pLC41芽孢桿菌RNA酶)和LBA4404(pLC41⑶S-HPT)的2菌株進行混合接種的實驗區(qū)。[0225]接種土壤桿菌之后，將葉區(qū)段在使該區(qū)段的背側(cè)朝上的情況下置于補充有3g/L結(jié)冷膠的LSR固體培養(yǎng)基上，在25°C黑暗下進行2天共培養(yǎng)。共培養(yǎng)后，將葉區(qū)段移植到LS-S培養(yǎng)基(LS無機鹽、LS維生素、10mg/16-(γ，γ-二甲基稀丙基氨基)噪呤(2ip)、0.3mg/l吲噪-3-醋酸（IAA)、30g/l蔗糖、250mg/l頭孢噻肟、pH5.8)，在28°C光照條件下培養(yǎng)2~4天。接著，移植到補充有50mg/l潮霉素的LS-S培養(yǎng)基，進行潮霉素抗性細胞的選擇。從葉區(qū)段中切下由每個葉區(qū)段的切口端得到的潮霉素抗性芽，移植到含有50mg/l潮霉素和250mg/l頭孢噻肟的生根培養(yǎng)基。這樣得到的生根植物體移植到含有具有相同培養(yǎng)基組成的培養(yǎng)基的具有大容積的培養(yǎng)容器(77mm長度，77mm寬度:97_高度），培養(yǎng)至進行取樣。將這樣得到的潮霉素抗性植物體作為轉(zhuǎn)化體用于以下的分析。[0226]2)利用定量實時PCR法測量煙草轉(zhuǎn)化體植物中的導(dǎo)入DNA的拷貝數(shù)[0227]對于測量轉(zhuǎn)化的煙草植物中整合的T-DNA的拷貝數(shù)，使用定量實時PCR。采用多重PCR，其中將標靶DNA區(qū)域和內(nèi)部標準DNA區(qū)域在同一孔內(nèi)進行擴增。標靶DNA區(qū)域設(shè)為HPT基因內(nèi)。從各轉(zhuǎn)化體植物的葉中，使用E.Z.N.A.(注冊商標)SPPlantDNAKit(OmegaBi〇-tek公司）提取基因組DNA，制備成12.5ng/yl的濃度。使用AppliedBiosystems(注冊商標)7500實時PCR系統(tǒng)(LifeTechnologies公司），在96孔PCR板中反復(fù)進行實時PCR的三個循環(huán)，并且將此PCR實施2次。在PCR反應(yīng)液中含有25μ1PremiXEx.Taq(TaKaRa公司）和5μ1模板DNA和0·3-0·4μΜ的引物、及0·2-0·24μΜ的TaqManMGB探針（LifeTechnologies公司），總量設(shè)為δΟμΙαΡΟ?引物和TaqManMGB探針根據(jù)PrimerExpress(LifeTechnologies公司）而設(shè)計。所設(shè)計的引物和探針名稱如下所述，其序列示于表6。使用NtBWCl-5F及NtBWCl-5R作為內(nèi)部標準用引物，使用NtBWCl-5P作為內(nèi)部標準TaqManMGB探針。使用Hpt-2F及Hpt-2R作為標靶DNA用引物，使用Hpt-2P作為標靶DNA用TaqManMGB探針。全部的實時PCR實驗按照以下的程序?qū)嵤?。即，?5°C下30秒1次，接著是95°C5秒和60°C34秒的40次。熒光按照各循環(huán)中的60°(:的伸長步驟進行監(jiān)視。[0228]為了評估定量PCR分析的效率及相對定量，使用基于基因組DNA的5種濃度(36、18、9、4.5及2.25ngAU)的連續(xù)稀釋系列制備校準曲線。閾值線測定為0.06，基線測定為3-16個循環(huán)。利用Yang等(2005)的方法計算出拷貝數(shù)。[0229][表6][0230]表6:用于定量實時PCR的引物和TaqManMGB探針[0231][0232]結(jié)果及討論[0233]1)煙草的轉(zhuǎn)化結(jié)果[0234]與僅導(dǎo)入有GUS-HPT的對照區(qū)相比，在用2菌株混合法將芽孢桿菌RNA酶基因進行了共轉(zhuǎn)化的實驗區(qū)中，轉(zhuǎn)化效率降低至1/3左右(表7)。轉(zhuǎn)化效率的降低認為是作為陰性選擇標記的芽孢桿菌RNA酶基因與⑶S-HPT基因同時被整合于煙草的同一細胞的基因組，并且因此該細胞通過芽孢桿菌RNA酶的穩(wěn)定表達而致死。在實驗區(qū)中，在含有潮霉素的LS-S培養(yǎng)基中選擇的階段，從葉片形成潮霉素抗性芽的效率降低至1/3左右。因此，大大減少了將芽移植到生根培養(yǎng)基和制備生根培養(yǎng)基的勞動力。[0235]通過實施例2中的兩菌株混合法進行稻的共轉(zhuǎn)化，但轉(zhuǎn)化效率的降低極少，為10%左右。轉(zhuǎn)化效率在煙草中顯著地變低認為是因為，與稻相比，2種T-DNA被整合于相同的細胞的基因組的效率(即共轉(zhuǎn)化效率)更高。[0236][表7][0237]表7:煙草SR1的轉(zhuǎn)化結(jié)果[0238][0239]*:對照：LBA4404(pLC41GUS-HPT)[0240]林：測試（兩菌株混合）：LBA4404(pLC41GUS-HPT)+LBA4404(pLC41芽孢桿菌RNA酶）[0241]2)利用定量實時PCR法分析煙草轉(zhuǎn)化體植物中的導(dǎo)入DNA的拷貝數(shù)[0242]通過定量實時PCR法分析對煙草導(dǎo)入的DNA的拷貝數(shù)。結(jié)果示于圖10。在單獨接種LBA4404(pLC41⑶S-HPT)的對照區(qū)中，在分析植物中的10%中以單拷貝導(dǎo)入GUS-HPT，殘余的90%以多拷貝導(dǎo)入。與此相對，在用2菌株混合接種法將芽孢桿菌RNA酶基因進行了共轉(zhuǎn)化的實驗區(qū)中，在對照區(qū)的3倍以上的34%的植物中以單拷貝導(dǎo)入⑶S-HPT(圖10)。另一方面，3拷貝以上導(dǎo)入有⑶S-HPT的植物的比例大大減少（圖10)。這是因為，在向相同基因組以多拷貝導(dǎo)入作為目的基因的GUS-HPT的情況下，作為陰性選擇標記的芽孢桿菌RNA酶基因也容易一起被導(dǎo)入，因此這種細胞通過芽孢桿菌RNA酶的表達而在培養(yǎng)的早期階段被排除。[0243]如上所述，在實驗區(qū)中，以單拷貝具有目的基因的煙草轉(zhuǎn)化體植物的比例增加至3倍以上。另一方面，轉(zhuǎn)化效率降低至大約1/3。但是，由于多拷貝導(dǎo)入細胞可以在培養(yǎng)的早期階段排除，因此，可以大大減少培養(yǎng)操作的勞動力以及培養(yǎng)基制備的成本和勞動力。作為結(jié)論，確認:將陰性選擇標記進行共轉(zhuǎn)化的方法為總體上可以有效地獲得以單拷貝具有目的基因的轉(zhuǎn)化體的有用的技術(shù)。[0244]實施例4:通過使用芽孢桿菌RNA酶的共轉(zhuǎn)化消除玉米的多拷貝轉(zhuǎn)化體[0245]材料及方法[0246]1)玉米的轉(zhuǎn)化[0247]從進行了溫室栽培的植物中無菌地取出大小約1.2_的玉米未熟胚(品種:A188)，浸漬于液體培養(yǎng)基LS-inf(Ishidaetal.，2007)。在46°C、3分鐘的熱處理后，在液體培養(yǎng)基中將所得的未熟胚清洗1次之后，以20,000G進行10分鐘(4°C)的離心處理。土壤桿菌的接種通過將未熟胚浸漬于土壤桿菌懸浮液來進行。將附著有土壤桿菌的未熟胚置于LS-AS共培養(yǎng)培養(yǎng)基（Ishidaetal.，2007)上，在25°C黑暗下進行3天的培養(yǎng)。土壤桿菌懸浮液通過將土壤桿菌在YP培養(yǎng)基上、在28°C黑暗下培養(yǎng)2天之后，懸浮于含有O.lmM乙酰丁香酮的LS-inf-As液體培養(yǎng)基而制備。懸浮濃度以660nm的0D值計調(diào)整為1.0。在將LBA4404(pSB131)(Ishidaetal.，1996)進行單獨接種的對照區(qū)以及在混合接種通過將超三元載體pVGW9(專利文獻W02014157541A1)導(dǎo)入LBA4404(pLC41芽孢桿菌RNA酶）獲得的LBA4404(pLC41芽孢桿菌RNA酶：：pVGW9)和LBA4404(pSB131)的兩個菌株的實驗區(qū)中實施測試。pSB131為超二元載體，在T-DNA中具有35S啟動子控制的內(nèi)含子GUS基因和35S啟動子控制的bar基因。bar基因為膦絲菌素(PPT)抗性基因。[0248]共培養(yǎng)后，將未熟胚置于含5mg/lPPT的LSD1.5B選擇培養(yǎng)基（Ishidaetal.，2007)上，在25°C黑暗條件下進行初次選擇10天。將增殖的愈合組織直接移植到含10mg/1PPT的LSD1.5B選擇培養(yǎng)基，進行約3周的二次選擇。將通過二次選擇增殖的愈合組織制成小塊并切下，在相同組成的培養(yǎng)基進行約3周的三次選擇。將通過三次選擇增殖的愈合組織制成小塊并切下，置于含有5mg/lPPT的LSZ再生培養(yǎng)基（Ishidaetal.，2007)，在25°C光照條件下進行培養(yǎng)。2周后，將PPT抗性自生植物移植到含有5mg/lPPT的LSF生根培養(yǎng)基(Ishidaetal.，2007)，在相同條件下培養(yǎng)至進行取樣。將這樣得到的PPT抗性植物體作為轉(zhuǎn)化體用于以下的分析。[0249]2)通過定量實時PCR法測量玉米轉(zhuǎn)化體植物中的導(dǎo)入DNA的拷貝數(shù)[0250]為了測量轉(zhuǎn)化玉米植物中整合的T-DNA的拷貝數(shù)，使用定量實時PCR。采用多重PCR，其中將標靶DNA區(qū)域和內(nèi)部標準DNA區(qū)域在同一孔內(nèi)進行擴增。標靶DNA區(qū)域設(shè)為bar基因內(nèi)。從各轉(zhuǎn)化體的葉中，使用E.Z.N.A.(注冊商標)SPPlantDNAKit提取基因組DNA，制備成15.625ngAU的濃度。使用AppliedBiosystems(注冊商標)7500實時PCR系統(tǒng)，在96孔PCR板中反復(fù)進行實時PCR的三個循環(huán)，并且將此PCR實施2次。在PCR反應(yīng)液中含有25μ1PremixEx·Taq和5μ1模板DNA和0·3μΜ的引物、及0·2μΜ的TaqManMGB探針，總量設(shè)為50μ1。PCR引物和TaqManMGB探針由PrimerExpress而設(shè)計。所設(shè)計的引物和探針名稱如下所述，其序列示于表8。[0251][表8][0252]表8:用于定量實時PCR的引物和TaqManMGB探針[0253][0254]使用Hmg-2F及Hmg_2R作為內(nèi)部標準引物，使用Hmg_2P作為內(nèi)部標準TaqManMGB探針。使用Bar-1F及Bar-1R作為標靶DNA用引物，使用Bar-1P作為標靶DNA用TaqManMGB探針。全部的實時PCR實驗按照以下的程序?qū)嵤?。即，?5°C下30秒為1次，95°C5秒和60°C34秒為40次。熒光按照各循環(huán)中的60°C的伸長步驟進行監(jiān)視。為了評估定量PCR分析的效率及相對定量，使用基于基因組DNA的5種濃度(48、24、12、6及3即/^1)的連續(xù)稀釋系列制備校準曲線。利用Yang等(2005)的方法計算出拷貝數(shù)。[0255]結(jié)果及討論[0256]1)玉米的轉(zhuǎn)化結(jié)果[0257]與僅導(dǎo)入有GUS-bar的對照區(qū)相比，在用2菌株混合法將芽孢桿菌RNA酶基因進行共轉(zhuǎn)化的實驗區(qū)中，轉(zhuǎn)化效率降低至2/3左右(表9)。轉(zhuǎn)化效率的降低認為是作為陰性選擇標記的芽孢桿菌RNA酶基因與⑶S-bar基因同時被整合于玉米的同一細胞的基因組，并且因此該細胞通過芽孢桿菌RNA酶的穩(wěn)定表達而致死。在實驗區(qū)中，在二次選擇的結(jié)束時，產(chǎn)生PPT抗性愈合組織的未熟胚的比例降低至2/3左右。因此，切下愈合組織的小塊并移植到三次選擇培養(yǎng)基、或?qū)⑷芜x擇后的愈合組織的小塊移植到再生培養(yǎng)基、或?qū)⒃偕参镆浦驳缴囵B(yǎng)基的勞動力減少了1/3。在玉米的轉(zhuǎn)化中，這個期間的勞動力占整體的勞動力的85%，因此，減少了28%的勞動力。[0258][表9][0259]表9:玉米A188的轉(zhuǎn)化結(jié)果[0261]*:對照：LBA4404(pSB131)[0262]林：測試（兩菌株混合）：LBA4404(pSB131)+LBA4404(pLC41芽孢桿菌RNA酶：：pVGW9)[0263]2)通過定量實時PCR分析玉米轉(zhuǎn)化體植物中導(dǎo)入的DNA的拷貝數(shù)[0264]利用定量實時PCR法分析向玉米導(dǎo)入的DNA的拷貝數(shù)。結(jié)果示于圖11。在單獨接種LBA4404(pSB131)的對照區(qū)中，在分析植物的46%中以單拷貝導(dǎo)入GUS-bar，殘余的54%以多拷貝導(dǎo)入。與此相對，在用2菌株混合接種法將芽孢桿菌RNA酶基因進行了共轉(zhuǎn)化的實驗區(qū)中，在比對照區(qū)多17%的63%的植物中以單拷貝導(dǎo)入⑶S-bar(圖11)。另一方面，2拷貝以上導(dǎo)入有⑶S-HPT的植物的比例是37%，減少了17%(圖11)。這是因為，在向相同基因組以多拷貝導(dǎo)入作為目的基因的GUS-bar的情況下，陰性選擇標記的芽孢桿菌RNA酶基因也容易一起被導(dǎo)入，因此這種細胞通過芽孢桿菌RNA酶的表達而在培養(yǎng)的早期階段被排除。[0265]如上所述，在實驗區(qū)中，以單拷貝具有目的基因的玉米轉(zhuǎn)化體植物的比例增加至對照區(qū)的1.3倍以上。另一方面，轉(zhuǎn)化效率降低至大約2/3。但是，由于多拷貝導(dǎo)入細胞可以在培養(yǎng)的早期階段排除，因此，與實施例3的煙草的情況同樣地，在玉米中也可以大幅度減少培養(yǎng)操作的勞動力以及培養(yǎng)基制備的成本和勞動力。將陰性選擇標記進行共轉(zhuǎn)化的方法在玉米中也為總體上有效地獲得以單拷貝具有目的基因的轉(zhuǎn)化體的有用的技術(shù)。【主權(quán)項】1.轉(zhuǎn)化的植物細胞的取得方法，其包含以下的步驟：(a)將所期望的DNA和第一標記基因在植物細胞中進行共轉(zhuǎn)化的步驟;及(b)從步驟(a)中得到的轉(zhuǎn)化的植物細胞中選擇在其染色體中導(dǎo)入了所期望的DNA、且沒有導(dǎo)入第一標記基因的轉(zhuǎn)化的植物細胞的步驟，但是，所述方法不包含通過使用所述第一標記基因的陽性選擇而除去僅將所期望的DNA導(dǎo)入了染色體的轉(zhuǎn)化細胞的步驟。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，第一標記基因為陰性選擇標記基因。3.如權(quán)利要求1或2中任一項所述的方法，其中，在步驟(a)中用于共轉(zhuǎn)化的所期望的DNA和第一標記基因的混合比率為3:1-1:5。4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其中，在用于步驟(a)的所期望的DNA上連接作為第二標記基因的陽性選擇標記基因，通過使用第二標記基因的陽性選擇而進行在步驟(b)的染色體中導(dǎo)入有所期望的DNA的轉(zhuǎn)化細胞的選擇。5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其中，步驟(a)通過選自土壤桿菌法、粒子槍法、電穿孔法、電注射法、聚乙二醇法及須晶法中的轉(zhuǎn)化方法而進行。6.轉(zhuǎn)化植物的制備方法，其包含：用權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法取得轉(zhuǎn)化的植物細胞；將所述植物細胞進行培養(yǎng)而得到植物體。7.植物的轉(zhuǎn)化方法，其包含以下的步驟：(a)將所期望的DNA和第一標記基因在植物細胞中進行共轉(zhuǎn)化的步驟;及(b)從步驟(a)中得到的轉(zhuǎn)化的植物細胞中選擇在其染色體中導(dǎo)入了所期望的DNA、且沒有導(dǎo)入第一標記基因的轉(zhuǎn)化的植物細胞的步驟，但是，所述方法不包含通過使用所述第一標記基因的陽性選擇而除去僅將所期望的DNA導(dǎo)入了染色體的轉(zhuǎn)化細胞的步驟?！疚臋n編號】C12N15/09GK105960458SQ201580007421【公開日】2016年9月21日【申請日】2015年2月4日【發(fā)明人】樋江井佑弘,小鞠敏彥【申請人】日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會社