松墨天牛鋅指蛋白FRU B isoform基因全長序列及其克隆方法
【專利摘要】松墨天牛鋅指蛋白FRU B isoform基因全長序列及其克隆方法，涉及生物基因工程領域。所述克隆方法：提取松墨天牛成蟲總RNA，采取RACE擴增獲得基因3′端序列，與構建的cDNA文庫松墨天牛鋅指蛋白FRU B isoform基因5′端序列拼接獲得基因全長序列。該基因序列全長1838bp，基因開放閱讀框為1?1095bp，共編碼364個氨基酸。本發(fā)明補充了松墨天牛鋅指蛋白FRU類的基因，對研究松墨天牛松墨天牛性別決定及求偶行為的分子調控機理及預防松材線蟲萎蔫病的傳播提供了有利支持。本發(fā)明由國家自然科學基金(31470653)和廣東省自然科學基金(1414050001666)支持。
【專利說明】
松墨天牛鋅指蛋白FRU B isoform基因全長序列及其克隆 方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及生物基因工程領域，具體是涉及松墨天牛鋅指蛋白FRU B isoform基 因序列及其克隆方法。該基因編碼鋅指蛋白FRU B isoform，該基因與昆蟲性別及昆蟲求偶 行為的分子機理有密切關系。 技術背景
[0002] 鋅指蛋白FRU(fruitless zinc-finger)，研究表明其通過不同的剪切方式產生特 異性產物，利用這些產物來控制雌雄果蠅的求偶行為，它們的剪切方式是雌雄果蠅求偶行 為和性別決定所必需的。據(jù)此推測鋅指蛋白FRU與昆蟲性別決定及昆蟲求偶行為的分子機 理有密切關系。
[0003] 松墨天牛(Monochamus alternatus)，主要危害馬尾松、黑松、油松等針葉樹的樹 干和枝條的韌皮部和木質部，同時也是松材線蟲萎蔫病的主要傳播媒介。目前對于對于松 墨天牛鋅指蛋白FRU B isoform基因及其對松墨天牛性別決定及求偶行為的分子調控機理 尚無人研究。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供松松墨天牛鋅指蛋白FRU B isoform基因全長序列及其克 隆方法。
[0005] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術方案：
[0006] 1、總RNA的提取
[0007] 對松墨天牛成蟲活體樣品用液氮急凍處理，置于-8 0 °C備用。采用E . Z . N. A. T Μ Total RNA Kit II總RNA提取試劑盒提取松墨天牛成蟲總RNA。
[0008] 2、引物設計和3'RACE擴增
[0009] 根據(jù)本實驗構建的CDNA文庫中所獲得的松墨天牛鋅指蛋白FRU B isoform的5'端 序列，本發(fā)明在此基礎上進行3'RACE擴增，以獲得松墨天牛鋅指蛋白FRU B isoform基因全 長序列。
[0010] 3'RACE擴增的特異性引物為：
[0011] MB-NC0A7-37-Outer：CGAAACACCACCCATACCT
[0012] MB-NC0A7-37-Inner：GAGACGATGTGTTCTGTGTGG
[0013] 3、目的基因克隆及測序
[0014]套式PCR產物經(jīng)由1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的0財片段，與?1?)20-1'載體 連接，將連接產物轉化E. co 1 i DH5a感受態(tài)細胞，進行AMP抗性藍白斑篩選，挑選陽性菌落經(jīng) 菌落PCR鑒定后測序。
[0015] 4、序列拼接
[0016] 將測序結果正確的序列與構建的cDNA文庫松墨天牛鋅指蛋白FRU B isoform基因 5'端序列拼接，獲得松墨天牛鋅指蛋白FRU B isoform基因全長序列。 [0017] 松墨天牛鋅指蛋白FRUB isoform基因全長序列，該序列如下：
[0018]
[0019]序列中下劃線所標示的atg為初始密碼子，下劃線所標示的taa為終止密碼子。 [0020]根據(jù)松墨天牛鋅指蛋白FRU B isoform基因全長序列，得到其氨基酸序列。該序列 如下：

[0022]本發(fā)明利用基因克隆技術，對松墨天牛成蟲進行RNA提取，并以3'RACE技術擴增松 墨天牛鋅指蛋白FRU B isoform基因片段，在感受態(tài)細胞上進行目的基因克隆并測序，將測 序結果正確的序列與構建的cDNA文庫松墨天牛鋅指蛋白FRU B isoform基因 5'端序列拼 接，獲得松墨天牛鋅指蛋白FRU B isoform基因全長序列。對進一步研究松墨天牛性別決定 及求偶行為的分子機理以及預防松材線蟲萎蔫病的傳播提供了有利支持。
【具體實施方式】
[0023]以下實施例將本發(fā)明進一步說明。
[0024] 1、松墨天?？俁NA提取
[0025]松墨天牛成蟲采自廣州市從化馬尾松林。新鮮活蟲用液氮急凍后保存于50mL凍蟲 管中，置于_80°C冰箱內保存?zhèn)溆谩?br>[0026] 采用E.Z.N.A.TM Total RNA Kit II總RNA提取試劑盒提取松墨天牛成蟲總RNA， 具體方法如下：
[0027] 1)在經(jīng)液氮充分預冷的研缽中研磨樣品至粉末狀，取不多于O.lg樣品粉末放入 經(jīng)液氮充分預冷的1.5mL離心管中，待液氮完全蒸發(fā)完后，加入lmL RNA-Solv Reagent。
[0028] 2)將加入裂解液的樣品室溫放置2-3min，使得樣品完全裂解。
[0029] 3)加入200yL氯仿，禍旋15s，冰上孵化10min;4°C下12000rcf離心15min，出現(xiàn)上層 水相。
[0030] 4)轉移600yL上層水相至新的1.5mL離心管，加入200yL無水乙醇，劇烈震蕩15s，轉 移全部混合液到試劑盒提供的2mL Collecting tube，室溫下lOOOOrcf離心lmin。
[0031] 5)將收集管中液體再次轉移至吸附柱中，室溫下lOOOOrcf離心lmin。
[0032] 6)將吸附柱放入新的2mL Collecting tube，加入300yL RNA wash Bufferl，室溫 下1 OOOOrcf離心lmin，棄廢液。
[0033] 7)將吸附柱放回收集管中，加入400yL RNA wash Bufferl，室溫下lOOOOrcf離心 lmin，棄廢液。
[0034] 8)將吸附柱放回收集管中，加入500yL經(jīng)添加48mL無水乙醇稀釋的RNA wash Buff er2，室溫下1 OOOOrcf離心lmin，棄廢液。
[0035] 9)重復上一步驟。
[0036] 10)再次室溫下 13000rcf 離心 2min。
[0037] 11)將吸附柱放入干凈的1.5mL離心管中，在吸附膜中央懸空滴加40yL DEPC Water，室溫靜置2min，室溫下13000rcf離心lmin，將所得的RNA溶液置于-80°C冰箱保存。 [0038] 注意事項：用于RNA實驗的試劑，需使用干熱滅菌（180°C，60min)或使用上述方法 進行DEPC水處理滅菌后的玻璃容器盛裝(也可以使用RNA實驗用的一次性塑料容器），使用 的無菌水須用0.1 %的DEPC處理后再進行高溫高壓滅菌。RNA實驗使用的試劑盒無菌水都應 專用，避免混用后交叉污染。
[0039] 2、cDNA 3'末端擴增
[0040] 按照3'Full RACE Core Set Ver.2.0 kit試劑盒進行，具體操作步驟如下：
[0041] 1)反轉錄反應 [0042] 反應體系如下：
[0043] PCR 反應程序為:42 °C 反應 60min，70 °C 反應 15min。
[0044] 2)套式PCR擴增
[0045] a)0uter PCR擴增 反應體系如下：
[0046] PCR 反應程序為：94°C 預變性 3min，94°C30s，55 °C 30s，72 °C lmin，20 個循環(huán)，然后 72 °C延伸1 Omin。PCR產物用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果。
[0047] b)Inner PCR擴增 反應體系如下：
[0048] PCR 反應程序為：94°C 預變性 3min，94°C30s，55 °C 30s，72 °C lmin，30 個循環(huán)，然后 72 °C延伸1 Omin。PCR產物用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果。
[0049] 3、目的基因克隆及測序
[0050] 1)從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段
[0051] a)柱平衡步驟：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500yL平衡液BL，室溫 下，12000rcf離心lmin，棄廢液。
[0052] b)將單一目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠切下（盡量切除多余部分)放入干凈的1.5mL 離心管中，稱取重量。
[0053] c)向膠塊中加入等倍體積溶液PC(如果凝膠重為0. lg，其體積可視為100yL，則加 入100yL PC溶液），50°C水浴lOmin左右，期間不斷溫和地上下翻轉離心管，以確保膠塊充分 溶解。
[0054] d)將上一步所得溶液加入一個吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），12000rcf離 心lmin，棄廢液。
[0055] e)向吸附柱CB2中加入600yL漂洗液PW(使用前先加入60mL無水乙醇稀釋），靜置3_ 4min，12000rcf 離心 lmin，棄廢液。
[0056] f)重復上一步驟。
[0057] g)再次12000rcf離心2min，盡量除去漂洗液。室溫放置3min，徹底晾干。
[0058] h)將吸附柱CB2放入收集管中，向吸附膜中間懸空滴加40yL洗脫緩沖液EB，室溫放 置 2min，12000rcf 離心 2min。
[0059] i)將離心得到的溶液重新加回離心吸附柱中，室溫放置2min，12000rcf離心2min， 收集DNA溶液到200yL PCR管中，置于-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0060] 2)T載體連接
[0061 ] PCR管中依次加入：pMD20-T Vector lyL，回收的目標DNA片段產物3yL， Sterilized water lyL，加入5yL的Solution I至最終體積為10yL，4°C靜置過夜。
[0062] 3)轉化感受態(tài)細胞
[0063] a)從-80 °C冰箱取出感受態(tài)細胞放在冰上解凍，冰融后，輕柔混合，加入50yL感受 態(tài)細胞于1.5mL離心管中。
[0064] b)加入4yL T載體連接產物(連接產物的加入量不能超過感受態(tài)細胞體積的十分 之一），緩慢混均。
[0065] c)冰上孵化 30min。
[0066] d)置于42°C水浴鍋中，熱激45s。
[0067] e)冰上靜置lmin，加入S0C(事先從-20°C冰箱取出并置于37°C解凍)446yL定容至 500yL〇
[0068] f)37°C 下，225rpm 搖菌 lh。
[0069] g)震蕩后，每個培養(yǎng)基加入100此菌液，用無菌三角彎頭玻棒輕輕地將菌液均勻涂 開，用錫紙嚴實包裹平板，正面靜置2h后倒置平板，37 °C，培養(yǎng)12-16h。
[0070] 4)陽性重組子的鑒定及測序
[0071] a)在1.5mL離心管中加入600yL含氨芐的培養(yǎng)液，挑選白色菌落放入培養(yǎng)液中，37 。(:下，225rpm 培養(yǎng) 3h。
[0072] b)菌落 PCR 反應體系如下：
[0073] 反應條件為：94°(：預變性3111丨11;941€3〇8;55 1€3〇8 30個循環(huán)；72°(：1111丨11;721€ 10min。反應結束后取5yL反應產物，進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0074] c)將包含正確重組子的克隆送至生工生物進行測序。
[0075] 4、將測序正確的序列除去重疊部分，與構建的cDNA文庫松墨天牛鋅指蛋白FRU B isoform基因5'端序列拼接，獲得松墨天牛鋅指蛋白FRU B isoform基因全長序列。
【主權項】
1.一個松墨天牛鋒指蛋白FRU B isoform基因全長序列，其特征在于該序列由1838個 堿基對組成，此全長序列為：tgtaggacta ctctgtaaaa tactatttac tattgcatta ataatgcaaa tttccagttc 1800 cataattttg cctggaaatt ctctgcaaaa aaaaaaaa 1838 序列中下劃線標示的atg為初始密碼子，下劃線標示的taa為終止密碼子，所獲得的松 墨天牛鋒指蛋白F抓B isoform cDNA全長序列的編碼區(qū)從第1個核巧酸到1095個核巧酸。2.根據(jù)權利要求所述的松墨天牛鋒指蛋白F抓B isoform基因核巧酸序列，其表達的 蛋白為鋒指蛋白FRU B isoform，其特征在于，松墨天牛超氣口蛋白由364個氨基酸組成，其 氨基酸序列為：3. 如權利要求1所述松墨天牛鋒指蛋白FRU B isoform基因全長序列的克隆方法，其特 征在于其具體步驟如下： 提取松墨天牛成蟲總RNA，設計引物并進行y RACE擴增，將所獲得y端序列進行基因克 隆和測序，將測序正確的3/端序列與構建的eDNA文庫松墨天牛鋒指蛋白FRU B isoform基 因5/端序列拼接，獲得松墨天牛鋒指蛋白FRU B isoform基因全長序列。4. 如權利要求3所述松墨天牛鋒指蛋白FRU B isoform基因全長序列的克隆方法，其特 征在于所述擴增的特異性引物為： Ma-USP-3'-Outer:CGAAACACCACCCATACCT Ma-USP-3/-Inner:GAGACGATGTGTTCTGTGTGG。
【文檔編號】C12N15/10GK105969774SQ201610239737
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年4月11日
【發(fā)明人】劉琪司, 陳敬祥, 林同, 蔡紫玲, 吳華俊, 程杰, 黃衛(wèi)東
【申請人】華南農業(yè)大學