(2s,3s,4r,9e)-2-[(2′r)-2′-羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-1,3,4-三醇及其制備方法 ...的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種源于東洋參的新化合物(2S,3S,4R,9E)?2?[(2′R)?2′?羥基?二十九碳酰胺]?十八碳?1,3,4?三醇，其結(jié)構(gòu)式為該化合物對(duì)膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶具有選擇性抑制的作用，能夠有效用于預(yù)防和治療血脂、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等疾病，具有良好的研究開發(fā)和應(yīng)用前景；該化合物的制備方法步驟少及操作簡(jiǎn)便，得到的化合物天然無毒性。
【專利說明】
(2S, 3S,4R,9E)-2-[ (21234567 R)-21 -羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-1 ,3,4-二酵及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及中藥有效成分提取技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及源于東洋參的（2S，3S，4R，9E)-24(24)-2'-羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-1，3,4-三醇及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 東洋參藥材是比較名貴的一種中藥，可用于風(fēng)熱感冒、咳嗽痰多、麻疹風(fēng)疹、咽喉 腫痛等疾?。粬|洋參藥材中的對(duì)人體有益成分很多，但價(jià)格昂貴，且食療效果并不顯著，近 些年相關(guān)學(xué)者對(duì)東洋參進(jìn)行了大量的研究，研究表明東洋參藥材的提取物在心血管疾病中 發(fā)揮，具有調(diào)血脂、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、防治冠心病等作用，目前成功分離出的有效化合物 很少，因此，研究從東洋參藥材分離出藥效高且持久穩(wěn)定和價(jià)格低廉的藥物迫在眉睫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種源于東洋參的（SSJSJRJE)Kd)-羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-1，3,4-三醇的化合物，還提供了該化合物作為制備調(diào)血 月旨、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、防治冠心病方面藥物的用途，還提供了該化合物的制備方法。
[0004] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0005] (2S，3S，4R，9E)-2-[ (24)-2^羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-1，3,4-三醇的結(jié)構(gòu) 式為：
[0006] 本發(fā)明提供的（2S，3S，4R，9E)-2-[ (24)-2^羥基-二十九碳酰胺]-十八碳_1，3， 4-三醇的制備方法，包括如下步驟： 2 (a)將東洋參藥材飲片用乙醇浸泡，獲得東洋參乙醇溶液； 3 (b)將步驟(a)得到的東洋參乙醇溶液用水浴回流提取，提取2次，合并2次得到東 洋參提取液； 4 (C)對(duì)步驟(b)得到的東洋參提取液進(jìn)行減壓濃縮，回收乙醇，得到較純的東洋參 浸膏； 5 (d)向步驟(C)得到的東洋參浸膏中加入適量水混合分散，得到東洋參水溶液； 6 (e)將步驟⑷得到的東洋參水溶液依次用3倍體積的石油醚、3倍體積的氯仿、3倍 體積的乙酸乙酯、3倍體積的正丁醇進(jìn)行萃取提純，得到4個(gè)不同極性的萃取液； 7 (f)將步驟(e)中得到的乙酸乙酯萃取液，拌樣，上柱，采用硅膠柱色譜法分離，以 氯仿-甲醇（100: 〇-〇: 100)系統(tǒng)梯度洗脫，通過TLC檢測(cè)，將洗脫液為50:50時(shí)的相似餾分合 并后濃縮，得到濃縮液π，進(jìn)一步用Sepadex-LH20色譜柱分離，洗脫劑為15%的甲醇水溶 液，共得到3段餾分，將第1段經(jīng)減壓濃縮、重結(jié)晶方法得到白色粉末化合物I和化合物Π 的 混合物，即（2S，3S，4R，9E)-2-[ (2' IOl -羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-1，3，4-三醇和2-羥 基二十五烷酸。
[0014] 2-羥基二十五烷酸化合物的結(jié)構(gòu)式為：
[0015]
[0016]作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，步驟(a)中乙醇的濃度為90~95 %。
[0017]作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，步驟(b)中水浴的溫度為60°C~80°C，回流提取的時(shí)間為 5h ~8tu
[0018] 作為優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟(b)中水浴的溫度為70°C，回流提取的時(shí)間為6h。
[0019] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的（2S，3S，4R，9E)-2-[(2/R)-2/-羥基-二十九碳酰胺]-十八 碳-1，3,4-三醇和2-羥基二十五烷酸對(duì)ACAT具有選擇性抑制的作用，可以作為制備調(diào)血脂、 預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、防治冠心病的藥物。
[0020] 本發(fā)明提供的藥物組合物，該組合物含有治療有效量的（2S，3S，4R，9E)-2-[ (2' IO-2'-羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-1，3，4-三醇或2-羥基二十五烷酸化合物，以及它們藥 學(xué)上可接受的載體。
[0021] 本發(fā)明的有益效果：
[0022] 1，本發(fā)明成功從東洋參藥材中制備出了一種結(jié)構(gòu)新穎的（2S，3S，4R，9E)-2-[ (2' R)-〗'-羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-1，3,4_二醇化合物，并首次從東洋參藥材制備出2-輕 基二十五烷酸化合物。制備方法簡(jiǎn)單易行，可應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室、工業(yè)化并具有環(huán)保型的制備方 法;該制備方法步驟少及操作簡(jiǎn)便，得到的兩個(gè)化合物的產(chǎn)率高、天然無毒性。
[0023] 2,本發(fā)明提取的化合物(2S，3S，4R，9E)-2-[(2/R)-2 /-羥基-二十九碳酰胺]-十八 碳-1，3，4-三醇化合物和2-羥基二十五烷酸化合物具有抑制膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶的活性，能 夠有效用于預(yù)防和治療血脂、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等疾病，具有良好的研究開發(fā)和應(yīng)用前 景。
【附圖說明】
[0024]圖1為本發(fā)明化合物I和化合物Π 的ESI-MS(負(fù)極性)圖；
[0025]圖2為本發(fā)明化合物I和化合物Π 的ESI-MS(負(fù)極性)圖；
[0026]圖3為本發(fā)明化合物I和化合物Π 的ESI+MS(正極性）圖；
[0027] 圖4為本發(fā)明化合物I和化合物Π 的1H-NMR全圖；
[0028] 圖5為本發(fā)明化合物I和化合物Π 的1H-NMR局部放大圖；
[0029] 圖6為本發(fā)明化合物I和化合物Π 的13C-NMR全圖；
[0030] 圖7為本發(fā)明化合物I和化合物Π 的13C-NMR局部放大圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步說明。在此需要說明的是，對(duì)于 這些實(shí)施方式的說明用于幫助理解本發(fā)明，但并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限定。此外，下面所描述 的本發(fā)明各個(gè)實(shí)施方式中所涉及的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。
[0032] 實(shí)施例1
[0033] (2S，3S，4R，9E)-2-[ (2' R)-2'-羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-1，3，4-三醇和2-羥 基二十五烷酸的制備
[0034] 將東洋參藥材飲片20kg，用90 %乙醇浸泡，用60°C水浴回流提取8h，提取2次，合并 2次得到東洋參提取液;經(jīng)減壓濃縮，回收乙醇，得到較純的東洋參浸膏。加入適量水將浸膏 水混懸后；依次用3倍體積的石油醚、3倍體積的氯仿、3倍體積的乙酸乙酯、3倍體積的正丁 醇進(jìn)行萃取提純，得到4個(gè)不同極性部位的萃取液，經(jīng)減壓濃縮后，得到石油醚部位90g，氯 仿部位90g，乙酸乙酯部位78g，正丁醇部位290g。
[0035] 將乙酸乙酯部位，拌樣，上柱，采用硅膠柱色譜法分離，以氯仿-甲醇（100 : 0-0 : 100)系統(tǒng)梯度洗脫，通過TLC檢測(cè)，將洗脫液為50:50時(shí)的相似餾分合并后濃縮，得到濃縮液 Π ，進(jìn)一步用SepadeX-LH20色譜柱分離，洗脫劑為15%的甲醇水溶液，共得到3段餾分，將第 1段經(jīng)減壓濃縮、重結(jié)晶方法得到白色粉末化合物I和化合物Π 的混合物。
[0036] 實(shí)施例2
[0037] (2S，3S，4R，9E)-2-[ (2' R)-2'-羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-1，3，4-三醇和2-羥 基二十五烷酸的制備
[0038] 將東洋參藥材飲片20kg，用95 %乙醇浸泡，用70°C水浴回流提取6h，提取2次，合并 2次得到東洋參提取液;經(jīng)減壓濃縮，回收乙醇，得到較純的東洋參浸膏。加入適量水將浸膏 水混懸后；依次用3倍體積的石油醚、3倍體積的氯仿、3倍體積的乙酸乙酯、3倍體積的正丁 醇進(jìn)行萃取提純，得到4個(gè)不同極性部位的萃取液，經(jīng)減壓濃縮后，得到石油醚部位98g，氯 仿部位l〇〇g，乙酸乙酯部位80g，正丁醇部位300g。
[0039] 將乙酸乙酯部位，拌樣，上柱，采用硅膠柱色譜法分離，以氯仿-甲醇（100 : 0-0 : 100)系統(tǒng)梯度洗脫，通過TLC檢測(cè)，將洗脫液為50:50時(shí)的相似餾分合并后濃縮，得到濃縮液 Π ，進(jìn)一步用SepadeX-LH20色譜柱分離，洗脫劑為15%的甲醇水溶液，共得到3段餾分，將第 1段經(jīng)減壓濃縮、重結(jié)晶方法得到白色粉末化合物I和化合物Π 的混合物。
[0040] 實(shí)施例3
[0041 ] (2S，3S，4R，9E)-2-[ (2' R)-2'-羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-1，3，4-三醇和2-羥 基二十五烷酸的制備
[0042] 將東洋參藥材飲片20kg，用95 %乙醇浸泡，用80°C水浴回流提取5h，提取2次，合并 2次得到東洋參提取液;經(jīng)減壓濃縮，回收乙醇，得到較純的東洋參浸膏。加入適量水將浸膏 水混懸后；依次用3倍體積的石油醚、3倍體積的氯仿、3倍體積的乙酸乙酯、3倍體積的正丁 醇進(jìn)行萃取提純，得到4個(gè)不同極性部位的萃取液，經(jīng)減壓濃縮后，得到石油醚部位95g，氯 仿部位95g，乙酸乙酯部位80g，正丁醇部位296g。
[0043]將乙酸乙酯部位，拌樣，上柱，采用硅膠柱色譜法分離，以氯仿-甲醇（100 : 0-0 : 100)系統(tǒng)梯度洗脫，通過TLC檢測(cè)，將洗脫液為50:50時(shí)的相似餾分合并后濃縮，得到濃縮液 Π ，進(jìn)一步用SepadeX-LH20色譜柱分離，洗脫劑為15%的甲醇水溶液，共得到3段餾分，將第 1段經(jīng)減壓濃縮、重結(jié)晶方法得到白色粉末化合物I和化合物Π 的混合物。
[0044] 實(shí)施例4
[0045] 化合物I和化合物Π 的結(jié)構(gòu)表征 [0046] 化合物I的結(jié)構(gòu)確證：
[0047] 為白色無定形粉末(醋酸乙酯）。如圖1和圖2所示，ESI-MS給出m/z750.2[M-H] +的 準(zhǔn)分子離子峰，結(jié)合NMR的碳譜和氫譜數(shù)據(jù)，確定該化合物的相對(duì)分子質(zhì)量為751，分子式為 C47H93〇5N，不飽和度為2。依據(jù)其1H NMR和13C NMR圖譜特征，推測(cè)該化合物為神經(jīng)酰胺類化合 物。
[0048]如圖4和圖5所示，在1H NMR(C5D5N，600MHz)圖譜中，δ:8·58(1Η，(1，Ν-Η)，5·52(2Η, m,H-9,10),5.12(lH,m,H-2),4.61(ΙΗ,??,Η^7),4.51(lH,dd,Ha-1),4.42(lH,dd,Hb-I), 4.34(1!1，111，!1-3)，4.28(1!1，111，!1-4)，1.28(111，長(zhǎng)鏈(：!12)，0.84(6!1，^ = 6.6,〇13\2)。如圖6和 圖7所示，130匪以〇5〇5叱15冊(cè)抱）3:175.1((：-1 /)，，130.7((：-9)，130.6((：-10)，76.7((：-3)， 72.8(0-4),72.3(0-2 7),61.9(0-1),52.8(0-2),35.6(0-37),33.7(C-5),26.6(C-6),25.7 (C-f )，HJ(CH3)131H NMR譜中δ?. 22~1.36的強(qiáng)的質(zhì)子信號(hào)、δ〇. 84處的2個(gè)端甲基質(zhì)子信 號(hào)以及13C匪R譜中δ22.8~33.7的碳信號(hào)提示含兩個(gè)長(zhǎng)鏈脂肪烷基；信號(hào)68.58(1!1，(1，^ Η)、δ175· I(CONH2)、δ52·8((：Η-ΝΗ)和δ5.12( lH，m)以及四個(gè)連氧碳信號(hào)δ76·7、72·8、72.3、 61.9顯示有酰胺鍵和四個(gè)羥基存在。以上數(shù)據(jù)表明，該化合物為梢氨醇類的神經(jīng)酰胺，堿基 鏈部分為含有一個(gè)雙鍵的1，3，4-三羥基梢氨醇。分子式為C47H93O5N，扣除長(zhǎng)鏈堿部分，分子 的長(zhǎng)鏈酸應(yīng)為2-羥基二十九烷酸?？紤]到生源途徑和神經(jīng)酰胺類化合物的立體位阻，確定 絕對(duì)構(gòu)型為SSJSdRJl [0049] 化合物Π 的結(jié)構(gòu)確證：
[0050]白色粉末(醋酸乙酯）；白色粉末(醋酸乙酯）。如圖1、圖2和圖3所示，ESI-MS給出m/ z399.3[M+H] +、421.2[M+Na] +、397.2[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，結(jié)合NMR的碳譜和氫譜數(shù)據(jù)，確 定該化合物的相對(duì)分子質(zhì)量為398,分子式為C 25H5qO3,不飽和度為1。依據(jù)其1H NMR和13C NMR 圖譜特征，推測(cè)該化合物為長(zhǎng)鏈脂肪酸類化合物。
[0051 ]如圖4和圖5所示，在1H NMR(C5D5N，600MHz)圖譜中，δ: 1 · 29(m，長(zhǎng)鏈CH2)，0 · 84(3H， ^ = 7.2,013)。如圖6和圖7所示，130匪1?(〇5〇5115010^)3:178.1((：-1)，71.3((：-2)，35.4 (C-3) ,25.8(04) ,29.5~29.9(長(zhǎng)鏈CH2)，29.4(022) ,32.0(023) ,22.8(024) ,14.2 (CH3)131H匪R譜中δ?. 22~1.36的強(qiáng)的質(zhì)子信號(hào)、δ〇. 84處的1個(gè)端甲基質(zhì)子信號(hào)以及13C 匪R譜中δ22.8~33.7的碳信號(hào)提示該化合物為長(zhǎng)鏈脂肪酸類化合物，并含有一個(gè)羥基。因 13C NMR譜中除δ32.0(Ο23)外在δ35附近僅有一個(gè)碳信號(hào)，即35.4(C-3)。由此鑒定化合物為 2_羥基二十五烷酸。
[0052] 實(shí)施例5
[0053]化合物I和化合物Π 對(duì)ACAT影響的實(shí)驗(yàn)
[0054] ?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(ACAT)是細(xì)胞內(nèi)唯一合成膽固醇酯的酶，在細(xì)胞和 生物體膽固醇代謝平衡中起非常重要的作用。ACAT合成的膽固醇酯主要以脂滴形式儲(chǔ)存于 胞漿中。
[0055] RAW264.7細(xì)胞以細(xì)胞數(shù)2\105/孔鋪于24孔板，于37°(：、5%〇)2條件下過夜培養(yǎng)后， 換為無血清DMEM培養(yǎng)基（IOOyL/孔）。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組(不加 Ox-LDL和待測(cè)樣品）、模 型組（加入80yg · mL-1 的Ox-LDL和IOOyg · mL-1 的Ac-LDL)，加藥組（加入80yg · mL-1 的Ox-LDL 和IOOyg · ml/1的Ac-LDL以及待測(cè)化合物），細(xì)胞貼壁后，加入終濃度為80yg · ml/1的〇X-LDLlOOyg · mL-1的Ac-LDL到模型組和加藥組，作用24h后，裂解細(xì)胞，收集蛋白。BCA試劑盒 進(jìn)行蛋白定量。ACATl檢測(cè)試劑盒測(cè)定ACATl含量。ACATl含量=實(shí)測(cè)ACATl濃度/總蛋白含量 ACATl抑制率=(模型組含量-加藥組含量)/(模型組含量-空白組含量)*100%。
[0056]數(shù)據(jù)結(jié)果如下表所示：
[0058] 從上表中可以看出，（2S，3S，4R，9E)-2-[(2/R)-2/-羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-1，3,4_三醇化合物和2-羥基二十五烷酸化合物的混合物的細(xì)胞活性為119.13%，ACAT抑制 率為65.95 % ;結(jié)果表明，（2S，3S，4R，9E)-2-[ (2' 10-2'-羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-1，3， 4-三醇和2-羥基二十五烷酸的混合物對(duì)ACAT具有選擇性抑制的作用，能夠調(diào)血脂、預(yù)防動(dòng) 脈粥樣硬化、防治冠心病。
[0059]以上結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式作了詳細(xì)說明，但本發(fā)明不限于所描述的實(shí)施 方式。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，在不脫離本發(fā)明原理和精神的情況下，對(duì)這些實(shí)施方式 進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，仍落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. (2S，3S，4R，9E)-2-[ (2' 10-2'-羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-I，3，4-三醇的結(jié)構(gòu)式 為：2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的（2S，3S，4R，9E)-2-[(2/R)-2/-羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-1，3，4-三醇的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： (a) 將東洋參藥材飲片用乙醇浸泡，獲得東洋參乙醇溶液； (b) 將步驟(a)得到的東洋參乙醇溶液用水浴回流提取，提取2次，合并2次得到東洋參 提取液； (c) 對(duì)步驟(b)得到的東洋參提取液進(jìn)行減壓濃縮，回收乙醇，得到較純的東洋參浸膏； (d) 向步驟(c)得到的東洋參浸膏中加入適量水混合分散，得到東洋參水溶液； (e) 將步驟(d)得到的東洋參水溶液依次用3倍體積的石油醚、3倍體積的氯仿、3倍體積 的乙酸乙酯、3倍體積的正丁醇進(jìn)行萃取提純，得到4個(gè)不同極性的萃取液； (f) 將步驟(e)中得到的乙酸乙酯萃取液，拌樣，上柱，采用硅膠柱色譜法分離，以氯仿-甲醇（100:0-0:100)系統(tǒng)梯度洗脫，通過TLC檢測(cè)，將洗脫液為50:50時(shí)的相似餾分合并后 濃縮，得到濃縮液Π ，進(jìn)一步用SepadeX-LH20色譜柱分離，洗脫劑為15%的甲醇水溶液，共 得到3段餾分，將第1段經(jīng)減壓濃縮、重結(jié)晶方法得到白色粉末化合物IS P(2S，3S，4R，9E)-2-[(2'IO-2'-羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-1，3，4-三醇，同時(shí)和化合物Π 的混合物，和2-羥 基二十五烷酸。 2_羥基二十五烷酸化合物為：3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的（2S，3S，4R，9E)_2_[ (2' R)-2'-羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-1，3,4_三醇的制備方法，其特征在于，步驟(a)中所述乙醇的濃度為90~95%。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的（2S，3S，4R，9E)-2-[(2/R)-2/-羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-l，3,4-三醇的制備方法，其特征在于，步驟(b)中所述水浴的溫度為6(rC~8(rC，所述回流 提取的時(shí)間為5h~8h。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的（2S，3S，4R，9E)-2-[(2/R)-2/-羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-l，3,4-三醇的制備方法，其特征在于，步驟(b)中所述水浴的溫度為7(rC，所述回流提取的 時(shí)間為6h。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的（2S，3S，4R，9E)-2-[(2/R)-2/-羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-l，3,4-三醇和權(quán)利要求2所述的2-羥基二十五烷酸在制備調(diào)血脂、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、防治 冠心病的藥物中的應(yīng)用。7. -種藥物組合物，其特征在于，含有權(quán)利要求1所述的化合物和藥學(xué)上可接受的載 體。8. -種藥物組合物，其特征在于，含有權(quán)利要求2所述的2-羥基二十五烷酸和藥學(xué)上可 接受的載體。
【文檔編號(hào)】A61K31/164GK106008252SQ201610322020
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月12日
【發(fā)明人】韓彥弢, 王春波, 朱莉, 陳雪紅
【申請(qǐng)人】青島大學(xué)