人眼球結(jié)膜胬肉干細(xì)胞細(xì)胞株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了人眼球結(jié)膜胬肉干細(xì)胞細(xì)胞株，屬于細(xì)胞的體外培養(yǎng)領(lǐng)域。此細(xì)胞株采用人眼的胬肉組織，分離培養(yǎng)獲得的體外細(xì)胞株。本發(fā)明建立了一套分離、培養(yǎng)和鑒定人眼胬肉干細(xì)胞株的方法，通過H16的自發(fā)成球的干性鑒定、干細(xì)胞誘導(dǎo)成球?qū)嶒?yàn)、細(xì)胞免疫熒光染色分析、干細(xì)胞多向誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)和H16誘導(dǎo)前后干性標(biāo)志物表達(dá)量分析等方法鑒定人眼胬肉體外干細(xì)胞株的建立成功。人眼胬肉體外干細(xì)胞株的建立對(duì)相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及干細(xì)胞的生物學(xué)研究具有重要價(jià)值，在減少疾病的發(fā)生、減緩疾病的進(jìn)展、提高治療的安全性和有效性等方面具有廣泛的應(yīng)用潛能。CGMCC No.1179920151229
【專利說明】
人眼球結(jié)膜胬肉干細(xì)胞細(xì)胞株
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞的體外培養(yǎng)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種人眼球結(jié)膜胬肉來源的干細(xì)胞株的建立。
【背景技術(shù)】
[0002]胬肉(pterygium)又稱翼狀胬肉，是一種起始于邊緣不斷地向心生長，最終侵入角膜造成視力減退的眼部組織的異常增生。在胬肉的發(fā)生和發(fā)展的過程中伴隨著一系列的結(jié)膜表面的變化，如增生、炎癥發(fā)生、新血管生成以及基底膜的破壞等。胬肉發(fā)生的病因和發(fā)病機(jī)制尚不明了，研究報(bào)道胬肉的發(fā)生可能與中波紫外線照射、P53的異常表達(dá)和人類乳頭狀病毒的感染有關(guān)。
[0003]干細(xì)胞(stem cell)是一種來源于胚胎組織或是成體組織器官的尚未成熟且未充分分化的，具有一定的自我更新能力(self-renew)和多向分化(multipledifferentiat1n)潛能的細(xì)胞群體。根據(jù)干細(xì)胞所處的發(fā)育階段可以將其分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞，根據(jù)干細(xì)胞的分化潛能可以將其分為全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞和專能干細(xì)胞。干細(xì)胞存在于胚胎、骨、脂肪、血液、臍帶等多種組織器官。在體外可以誘導(dǎo)分化成為各種發(fā)育成熟的組織細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、橫紋肌及平滑肌細(xì)胞以及神經(jīng)和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等。干細(xì)胞存在范圍廣，易于獲得，增殖和分化能力強(qiáng)。目前，干細(xì)胞成為細(xì)胞工程和基因治療中理想的工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]基于此本專利提供了一種人眼球結(jié)膜胬肉干細(xì)胞株H16，現(xiàn)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)北辰北路I號(hào)院3號(hào)。保藏編號(hào):CGMCC N0.11799。保藏時(shí)間:2015年12月29號(hào)。
[0005]上述人眼球結(jié)膜胬肉干細(xì)胞株H16的構(gòu)建方法，按照下述步驟進(jìn)行:
(1)手術(shù)獲取人眼球結(jié)膜胬肉組織；
(2)H16細(xì)胞培養(yǎng):在無菌條件下取出胬肉組織，4°C預(yù)冷的PBS(phosphatebuffersaline，磷酸鹽緩沖液)沖洗3遍，去除胬肉組織中的血細(xì)胞。PBS中添加抗生素(青霉素、鏈霉素各100U/ml)后浸泡30min。利用眼科剪將胬肉組織剪成2*2*2mm3大小的組織塊。PBS沖洗3次后將上清連同組織一起轉(zhuǎn)移至離心管中，顛倒震蕩2min離心后棄上清，重復(fù)2到3次去除組織中的脂肪顆粒，提高組織的培養(yǎng)效率。DMEM/F_12(Dulbecco’s Modified EagleMedia: Nutrient Mixture F-12)完全培養(yǎng)基(DMEM/F-12完全培養(yǎng)液為DMEM/F-12培養(yǎng)液中含10%FBS(v/v)，青、鏈霉素lOOU/mL)重懸細(xì)胞，置于5%(v/v)C02、飽和濕度、37°C 二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
(3)H16細(xì)胞自發(fā)形成的干細(xì)胞球的免疫熒光干性鑒定:H16細(xì)胞傳至P5代后，在培養(yǎng)上清中出現(xiàn)大量的漂浮的細(xì)胞球，收集細(xì)胞球至24孔板中，待細(xì)胞球貼壁后，利用4%(w/v)4°C預(yù)冷的多聚甲醛固定細(xì)胞4 °C過夜，PBS洗滌I Omin/3次。5%(w/V) BSA ((Bovine SerumAlbumin，牛血清白蛋白)封閉和Triton-100(曲拉通，用于細(xì)胞膜打孔，促進(jìn)抗體與細(xì)胞內(nèi)的抗原結(jié)合)破膜打孔后與一抗4°C孵育過夜，PBS洗滌5min/3次，二抗37°C避光孵育lh，PBS洗滌5min/3次，DAPI (2-(4-Amidinophenyl )-6_indolecarbamidine dihydrochloride ,DAPI細(xì)胞核染料)室溫染核5min，PBS洗滌10min/3次。熒光顯微鏡下觀察干細(xì)胞標(biāo)志物S0X2、NESTIN、P63、V頂ENTIN和CD44的表達(dá)情況；
(4)H16細(xì)胞成球:H16細(xì)胞傳代后，更換干細(xì)胞成球培養(yǎng)基后顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化；
(5)H16細(xì)胞成球后免疫熒光染色:H16誘導(dǎo)形成細(xì)胞球后，輕輕的吸取細(xì)胞球，種植于24孔板中。4%(w/v)的預(yù)冷的多聚甲醛固定細(xì)胞4°C過夜，PBS洗滌10min/3次。5%(w/v)BSA封閉和Triton破膜打孔后與一抗4°C孵育過夜，PBS洗滌5min/3次，二抗37°C避光孵育lh，PBS洗滌5min/3次，DAPI室溫染核5min，PBS洗滌10min/3次。熒光顯微鏡下觀察干細(xì)胞標(biāo)志物S0X2(sex determining reg1n Y_box2，性別決定區(qū)域Y-2，胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物)、NESTIN(神經(jīng)巢蛋白，神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物)、Ρ63(上皮干細(xì)胞標(biāo)志物)、VnffiNTIN(波形蛋白，間質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物)和CD44(細(xì)胞粘附分子、干細(xì)胞巢受體，間質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物)的表達(dá)情況；
(6)免疫熒光染色:H16細(xì)胞鋪滿24孔板底后，4%(w/v)的預(yù)冷的多聚甲醛固定細(xì)胞4°C過夜，PBS洗滌10min/3次。5%(w/v)BSA封閉和Triton打孔后與一抗4°C孵育過夜，PBS洗滌5min/3次，二抗37°C避光孵育lh，PBS洗滌5min/3次，DAPI室溫染核5min，PBS洗滌10min/3次。熒光顯微鏡下觀察S0X2、NESTIN、P63、VnffiNTIN和CD44的表達(dá)情況；
(7)H16的多向誘導(dǎo)分化:H16細(xì)胞傳代貼壁后及時(shí)地去除上層未貼壁細(xì)胞同時(shí)更換誘導(dǎo)神經(jīng)和誘導(dǎo)骨組織的分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，免疫熒光染色或化學(xué)染色鑒定誘導(dǎo)效果；
(8)H16誘導(dǎo)前后干性標(biāo)志物表達(dá)量分析:H16細(xì)胞在誘導(dǎo)神經(jīng)和誘導(dǎo)骨組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天后，分別提取細(xì)胞的總蛋白，利用western blot(蛋白免疫印跡)檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)情況，以β-act iη(β肌動(dòng)蛋白，在細(xì)胞中表達(dá)穩(wěn)定)蛋白為內(nèi)參照；
在其中的一個(gè)實(shí)例中，步驟(2)中抗生素的應(yīng)用濃度為青霉素100U/ml和鏈霉素10U/
ml，
浸泡30min后I3BS洗滌3次后棄上清，利用眼科剪將胬肉組織剪成2*2*2mm3大小的組織塊。PBS沖洗3次后將上清連同組織一起轉(zhuǎn)移至離心管中，顛倒震蕩2min離心后棄上清，重復(fù)2到3次去除組織中的脂肪，提高組織的培養(yǎng)效率。DMEM/F-12完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，置于5%CO2、飽和濕度、37 °C 二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
在其中的一個(gè)實(shí)例中，步驟(2)中通過胬肉組織的原代培養(yǎng)得到了人眼球結(jié)膜胬肉來源的干細(xì)胞株H16;
在其中的一個(gè)實(shí)例中，步驟(4)中的成球誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成分是DMEM/F-12培養(yǎng)基、2%B27(v/v) N20ng/mlEGF(Epidermal Growth Factor 表皮生長因子)、20ng/mlbFGF(Basicfibroblast growth factor堿性成纖維細(xì)胞生長因子)。且EGF和bFGF每24小時(shí)添加一次，培養(yǎng)基每三天更換一次；
在其中的一個(gè)實(shí)例中，步驟(7)中的誘導(dǎo)神經(jīng)培養(yǎng)基成分是神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基(Neurobasol)、10% 胎牛血清、3.3μΜ 全反式維甲酸(ATRA)、500ηΜ 曲古抑菌素 A(TSA)、20ng/ml神經(jīng)生長因子(NGF)、2%B27和2mM谷氨酰胺； 在其中的一個(gè)實(shí)例中，步驟(7)中的誘導(dǎo)骨組織培養(yǎng)基的成分是:DMEM/F-12培養(yǎng)基、10%胎牛血清、ΙμΜ地塞米松(Dexamethasome)、ΙΟηιΜβ-甘油磷酸鈉和500mg/L維生素C;
在其中的一個(gè)實(shí)例中，步驟(3-8)通過H16的自發(fā)成球的干性鑒定、干細(xì)胞誘導(dǎo)成球?qū)嶒?yàn)、細(xì)胞免疫熒光染色分析、干細(xì)胞多向誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)和H16誘導(dǎo)前后干性標(biāo)志物表達(dá)量分析等方法鑒定H16干細(xì)胞株的建立是成功的。
[0006]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明屬于細(xì)胞的體外培養(yǎng)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種人眼球結(jié)膜胬肉來源的干細(xì)胞株的建立。首先，H16的發(fā)現(xiàn)和鑒定，對(duì)胬肉的臨床治療有顯著的指導(dǎo)意義，可以依據(jù)其干細(xì)包的特性采取一系列的治療措施，例如可以誘導(dǎo)其中的干細(xì)胞定向分化，降低細(xì)胞的增值能力來延緩胬肉的病程。同時(shí)，在胬肉手術(shù)后，減少其中殘留的干細(xì)胞數(shù)量，可以降低胬肉的復(fù)發(fā)機(jī)率。最后，由于胬肉中來源的干細(xì)胞的多向分化潛能和干細(xì)胞在組織損傷修復(fù)中發(fā)揮越來越重要的作用，H16干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)和鑒定，定能為其以后的應(yīng)用提供必要的理論基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0007]圖1為倒置相差顯微鏡觀察本發(fā)明培養(yǎng)的H16細(xì)胞(a、胬肉組織的原代培養(yǎng)。b、H16細(xì)胞的傳代培養(yǎng));
圖2為H16細(xì)胞自發(fā)形成的干細(xì)胞球中免疫熒光檢測(cè)干細(xì)標(biāo)志物的表達(dá)情況(a、sox2b、 nestin c 、p63 d 、vimentin e、 CD44)；
圖3為H16細(xì)胞誘導(dǎo)形成的干細(xì)胞球；
圖4為H16細(xì)胞誘導(dǎo)成球后免疫熒光檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)情況(a、sox2 b、nestin c 、p63 d 、vimentin e、 CD44)；
圖5為H16細(xì)胞中免疫熒光檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)情況(a、sox2 b、nestin c、p63d 、vimentin e、 CD44)；
圖6為H16細(xì)胞多向誘導(dǎo)分化后的免疫熒光和化學(xué)染色結(jié)果(A、神經(jīng)分化(神經(jīng)絲NF-200)B、骨分化茜素紅染色)；
圖7為H16細(xì)胞誘導(dǎo)前后干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)量變化結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0008]以下實(shí)例所使用的主要材料和來源分別如下；
新鮮的人眼結(jié)膜胬肉組織(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院眼科提供)；
H16培養(yǎng)試劑高糖DMEM/F-12、胎牛血清(Gibco公司產(chǎn)品)、胰蛋白酶(Sigma公司產(chǎn)品);
ant1-sox2、ant1-nestin、ant1-P63、ant1-vimentin、anti_CD44 抗體購自武漢博士德公司；
二氧化碳培養(yǎng)箱(Forma公司)，倒置顯微鏡，生物顯微鏡，超凈工作臺(tái)，臺(tái)式離心機(jī)，電熱恒溫水浴箱，凝膠成像分析系統(tǒng)(SYNGENE B1 IMAGING SYSTTEMS)，深低溫冰箱，液氮罐，全自動(dòng)消毒鍋FASC Calibar)；
實(shí)例I，對(duì)本發(fā)明具體實(shí)施步驟描述如下
(I)人眼球結(jié)膜胬肉組織培養(yǎng):手術(shù)室手術(shù)切取人眼胬肉組織，將人眼胬肉組織放入預(yù)冷的DMEM/F-12(含100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素)中轉(zhuǎn)移至無菌細(xì)胞操作臺(tái)中。在細(xì)胞操作臺(tái)里，用冷的TOS沖洗組織，去除組織中的血細(xì)胞。PBS中添加抗生素后浸泡30min，利用眼科剪在I3BS中將胬肉組織剪成2*2*2mm3大小的組織塊。PBS沖洗3次后將上清連同組織一起轉(zhuǎn)移至離心管中，顛倒震蕩2min離心后棄上清，重復(fù)2到3次去除組織中的脂肪顆粒，提高組織的培養(yǎng)效率。DMEM/F-12完全培養(yǎng)基(DMEM/F-12完全培養(yǎng)液為DMEM/F-12培養(yǎng)液中含10%FBS(v/v)，青、鏈霉素100U/mL)重懸細(xì)胞，置于5%(v/v)C02、飽和濕度、37°C 二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。5天后更換新鮮完全培養(yǎng)基，去除未貼壁細(xì)胞，以后每周換液2次。當(dāng)貼壁細(xì)胞形成融合層時(shí)，用0.25%(w/v)的胰蛋白酶消化，見細(xì)胞皺縮，加入與蛋白酶等量的完全培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打使貼壁的細(xì)胞脫落，收集蛋白酶消化后的細(xì)胞懸液至離心管，SOOrpm/5min。離心后添加適量的PBS重懸細(xì)胞，再次離心后，添加DMEM/F-12完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并按照適當(dāng)?shù)谋壤臃N傳代。倒置顯微鏡觀察記錄細(xì)胞形態(tài)和增殖情況。
[0009](2)H16細(xì)胞的自發(fā)成球:在H16細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞培養(yǎng)上清中存在大量的類似于干細(xì)胞球的細(xì)胞團(tuán)塊。
[0010](3)H16細(xì)胞的自發(fā)成球的干性鑒定:在培養(yǎng)上清中出現(xiàn)大量的漂浮的細(xì)胞球，收集細(xì)胞球至24孔板中，待細(xì)胞球剛剛貼壁后，利用4%(w/v)預(yù)冷的多聚甲醛固定細(xì)胞4°C過夜，PBS洗滌10min/3次。5%BSA封閉和Triton破膜打孔后與一抗4°C孵育過夜，PBS洗滌5min/3次，二抗37 0C避光孵育Ih，I3BS洗滌5min/3次，DAPI室溫染核5min，PBS洗滌10min/3次。熒光顯微鏡下觀察干細(xì)胞標(biāo)志物S0X2、NESTIN、P63、VMENTIN和CD44的表達(dá)情況;結(jié)果顯示:在H16細(xì)胞自發(fā)形成的細(xì)胞團(tuán)塊中，存在大量明顯表達(dá)S0X2、NESTIN、P63、VMENTIN和CD44干細(xì)胞標(biāo)志物的細(xì)胞，H16自發(fā)形成的團(tuán)塊是細(xì)胞中的干細(xì)胞自發(fā)形成的干細(xì)胞球。
[0011](4)H16細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn):H16細(xì)胞在貼壁更換誘導(dǎo)成球培養(yǎng)基3至5天后形成大量形態(tài)相似、大小不一的細(xì)胞球
(5)H16細(xì)胞的誘導(dǎo)成球的干性鑒定::H16誘導(dǎo)形成細(xì)胞球后，輕輕的吸取細(xì)胞球，種植于24孔板中。待細(xì)胞球剛剛貼壁后，利用4%(w/v)的預(yù)冷的多聚甲醛固定細(xì)胞4°C過夜，PBS洗滌10min/3次。5%(v/v)BSA封閉和Triton破膜打孔后與一抗4°C孵育過夜，PBS洗滌5min/3次，二抗37°C避光孵育lh，PBS洗滌5min/3次，DAPI室溫染核5min，PBS洗滌10min/3次。熒光顯微鏡下觀察干細(xì)胞標(biāo)志物S0X2、NESTIN、P63、VMENTIN和CD44的表達(dá)情況;結(jié)果顯示:在H16細(xì)胞誘導(dǎo)形成的細(xì)胞團(tuán)塊中，明顯表達(dá)S0X2、NESTIN、P63、VHffiNTIN和CD44干細(xì)胞標(biāo)志物。
[0012](6)免疫熒光染色::培養(yǎng)的H16細(xì)胞，4%(w/v)的預(yù)冷的多聚甲醛固定細(xì)胞4°C過夜，PBS洗滌10min/3次。5%(v/v)BSA封閉和Triton破膜打孔后與一抗4°C孵育過夜，PBS洗滌5min/3次，二抗37°C避光孵育lh，PBS洗滌5min/3次，DAPI室溫染核5min，PBS洗滌10min/3次。熒光顯微鏡下觀察;結(jié)果顯示:H16細(xì)胞S0X2、NESTIN、P63、VHffiNTIN和CD44干細(xì)胞標(biāo)志物呈陽性表達(dá)。
[0013](7)H16的多向誘導(dǎo)分化:H16細(xì)胞正常傳代培養(yǎng)貼壁后更換誘導(dǎo)神經(jīng)、誘導(dǎo)脂肪和誘導(dǎo)骨組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)誘導(dǎo)2周后，免疫熒光及化學(xué)染色結(jié)果顯示:誘導(dǎo)后的H16細(xì)胞NF-200有陽性表達(dá)、誘導(dǎo)骨組織的H16細(xì)胞茜素紅染色陽性。結(jié)果顯示:H16細(xì)胞具有向神經(jīng)組織和骨組織多向分化的潛能。
[0014](8)H16誘導(dǎo)前后干性標(biāo)志物表達(dá)量分析:嚴(yán)格按照試驗(yàn)要求及步驟提取細(xì)胞總蛋白，配置12%的聚丙烯酰胺凝膠。加樣后以80v恒壓電泳至目的蛋白到合適位置，350mA恒流轉(zhuǎn)膜2小時(shí)，使蛋白質(zhì)橫向轉(zhuǎn)移至PVDF(polyvinylidene fluoride聚偏二氟乙稀膜)膜上。5%(w/v)的脫脂牛奶封閉I小時(shí)后，4 0C孵育一抗過夜，TBST漂洗I Omin/3次。HRP標(biāo)記的二抗37°C孵育I小時(shí)后，TBST(Tris_buffered saline and Tween-20)漂洗 10min/3次后成像分析。結(jié)果顯示:干細(xì)胞的標(biāo)志物在Hl 6中的表達(dá)量高，但是在細(xì)胞被誘導(dǎo)后，干細(xì)胞的標(biāo)志物的表達(dá)量降低。
[0015]通過細(xì)胞H16的自發(fā)成球的干性鑒定、干細(xì)胞誘導(dǎo)成球?qū)嶒?yàn)、細(xì)胞免疫熒光染色分析、干細(xì)胞多向誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)和H16誘導(dǎo)前后干性標(biāo)志物表達(dá)量分析等方法鑒定人眼胬肉干細(xì)胞株H16細(xì)胞株的建立成功。
[0016]圖1為倒置相差顯微鏡觀察本發(fā)明培養(yǎng)的H16細(xì)胞(a、胬肉組織的原代培養(yǎng)。b、H16細(xì)胞的傳代培養(yǎng))；圖2為H16細(xì)胞自發(fā)形成的干細(xì)胞球中免疫熒光檢測(cè)干細(xì)標(biāo)志物的表達(dá)情況(a、sox2 b、nestin c、p63 d、vimentin e、CD44);圖3為H16細(xì)胞誘導(dǎo)形成的干細(xì)胞球；圖4為H16細(xì)胞誘導(dǎo)成球后免疫熒光檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)情況(a、sox2 b、nestin c、p63 d、vimentin e、CD44);圖5為H16細(xì)胞中免疫熒光檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)情況(a、sox2 b、nestin c、p63 d、vimentin e、0)44);圖6為H16細(xì)胞多向誘導(dǎo)分化后的免疫熒光和化學(xué)染色結(jié)果(A、神經(jīng)分化(神經(jīng)絲NF-200)B、骨分化茜素紅染色)；圖7為H16細(xì)胞誘導(dǎo)前后干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)量變化結(jié)果。
[0017]上述一種人眼球結(jié)膜胬肉干細(xì)胞株H16，現(xiàn)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)北辰北路I號(hào)院3號(hào)。保藏編號(hào):CGMCCN0.11799。保藏時(shí)間:2015年12月29號(hào)。
[0018]以上所述實(shí)例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方法，其描述較為具體和詳細(xì)，但不能因此理解為本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可做出若干的變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，對(duì)本發(fā)明的保護(hù)應(yīng)當(dāng)以權(quán)力保護(hù)書為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.人眼球結(jié)膜胬肉干細(xì)胞株，保藏編號(hào):CGMCCN0.11799。2.權(quán)利要求1所述的人眼胬肉干細(xì)胞株的構(gòu)建方法，包括以下步驟 (1)手術(shù)獲取人眼結(jié)膜胬肉組織； (2)H16細(xì)胞培養(yǎng):在無菌條件下取出胬肉組織，4°C預(yù)冷的PBS(phosphatebuffersaline，磷酸鹽緩沖液)沖洗3遍，去除胬肉組織中的血細(xì)胞； PBS中添加抗生素(青霉素、鏈霉素各100U/ml)后浸泡30min; 利用眼科剪將胬肉組織剪成2*2*2mm3大小的組織塊； PBS沖洗3次后將上清連同組織一起轉(zhuǎn)移至離心管中，顛倒震蕩2min離心后棄上清，重復(fù)2到3次去除組織中的脂肪，提高組織的培養(yǎng)效率； DMEM/F_12(Dulbecco’s Modified Eagle Media: Nutrient Mixture F-12)完全培養(yǎng)基(DMEM/F-12完全培養(yǎng)液為DMEM/F-12培養(yǎng)液中含10%FBS(v/v)，青、鏈霉素lOOU/mL)重懸細(xì)胞，置于5%( v/v)C02、飽和濕度、37 °C 二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)； (3)H16細(xì)胞自發(fā)形成的干細(xì)胞球的免疫熒光干性鑒定:H16細(xì)胞傳至P5代后，在培養(yǎng)上清中出現(xiàn)大量的漂浮的細(xì)胞球，收集細(xì)胞球至24孔板中，待細(xì)胞球貼壁后，利用4%(w/v)4°C預(yù)冷的多聚甲醛固定細(xì)胞4 °C過夜，PBS洗滌I Omin/3次； 5%(w/v)BSA( (Bovine Serum Albumin，牛血清白蛋白)封閉和Triton-100(曲拉通，用于細(xì)胞膜打孔，促進(jìn)抗體進(jìn)入細(xì)胞和抗原結(jié)合)破膜打孔后與一抗4°C孵育過夜，PBS洗滌5min/3次，二抗37°C避光孵育Ih，PBS洗滌5min/3次,DAPI (2-(4-Amidinophenyl )-6-1ndo lecarbamidine dihydrochloride ,DAPI 細(xì)胞核染料)室溫染核5min，PBS 洗滌 I Omin/3次； 熒光顯微鏡下觀察干細(xì)胞標(biāo)志物S0X2、NESTIN、P63、V頂ENTIN和CD44的表達(dá)情況； (4)H16細(xì)胞成球:H16細(xì)胞傳代后，更換干細(xì)胞成球培養(yǎng)基后顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化； (5 )H16細(xì)胞成球后免疫熒光染色:H16誘導(dǎo)形成細(xì)胞球后，輕輕的吸取細(xì)胞球，種植于24孔板中； 4%(w/v )的預(yù)冷的多聚甲醛固定細(xì)胞4 0C過夜，PBS洗滌10min/3次； 5%(w/v)BSA封閉和Triton破膜打孔后與一抗4°C孵育過夜，PBS洗滌5min/3次，二抗37°(:避光孵育卟，？83洗滌51^11/3次，04?1室溫染核51^11，？83洗滌101^11/3次； 熒光顯微鏡下觀察干細(xì)胞標(biāo)志物S0X2、NESTIN、P63、V頂ENTIN和CD44的表達(dá)情況； (6)免疫熒光染色:H16細(xì)胞鋪滿24孔板底后，4%(w/v)的預(yù)冷的多聚甲醛固定細(xì)胞4°C過夜，PBS洗滌I Omin/3次； 5%(w/v)BSA封閉和Triton打孔后與一抗4°C孵育過夜，PBS洗滌5min/3次，二抗37°C避光孵育lh，PBS洗滌5min/3次，DAPI室溫染核5min，PBS洗滌10min/3次； 熒光顯微鏡下觀察S0X2、NESTIN、P63、V頂ENTIN和CD44的表達(dá)情況； (7)H16的多向誘導(dǎo)分化:H16細(xì)胞傳代貼壁后及時(shí)地去除上層未貼壁細(xì)胞同時(shí)更換誘導(dǎo)神經(jīng)和誘導(dǎo)骨組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，免疫熒光染色或化學(xué)染色鑒定誘導(dǎo)效果； (8)H16誘導(dǎo)前后干性標(biāo)志物表達(dá)量分析:H16細(xì)胞在誘導(dǎo)神經(jīng)和誘導(dǎo)骨組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天后，分別提取細(xì)胞的總蛋白，利用western blot(蛋白免疫印跡)檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)情況，以β-act iη(β肌動(dòng)蛋白，在細(xì)胞中表達(dá)穩(wěn)定)蛋白為內(nèi)參照。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人眼胬肉干細(xì)胞株，其特征在于步驟(3-8)通過H16的自發(fā)成球的干性鑒定、干細(xì)胞誘導(dǎo)成球?qū)嶒?yàn)、細(xì)胞免疫熒光染色分析、干細(xì)胞多向誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)和H16誘導(dǎo)前后干性標(biāo)志物表達(dá)量分析等方法鑒定H16干細(xì)胞株的建立是成功的。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人眼胬肉干細(xì)胞株的構(gòu)建，其特征步驟在于步驟(2)中應(yīng)用得到的人眼胬肉組織制備成的2*2*2mm3大小的組織塊，，置于5%( v/v)C02、飽和濕度、37°C二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，得到的人眼胬肉來源的干細(xì)胞株H16。
【文檔編號(hào)】C12N5/079GK106011065SQ201610560526
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年7月15日
【發(fā)明人】胡新遠(yuǎn), 張志堅(jiān), 錢暉, 龔愛華, 陳京燕, 賈浩源
【申請(qǐng)人】江蘇大學(xué)