用于檢測碎片化dna目標區(qū)域的引物組合物及其應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于檢測碎片化DNA目標區(qū)域的引物組合物及其應用，其中該引物組合物包括：第一引物組，所述第一引物組包含第一通用引物和第二通用引物，所述第一通用引物和所述第二通用引物的靶點位于所述目標區(qū)域的兩端，分別用于構成測序文庫的5’端和3’端；以及第二引物組，所述第二引物組包括第一特異性引物組和第二特異性引物組。利用本發(fā)明的引物組合物對碎片化DNA的目標區(qū)域進行擴增富集，能夠顯著提高引物擴增的適應范圍和有效模板量，進而對富集產物進行測序檢測，能夠顯著提高碎片化DNA的檢測靈敏度。
【專利說明】
用于檢測碎片化DNA目標區(qū)域的引物組合物及其應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及碎片化DNA檢測技術領域，具體地，設及用于檢測碎片化DNA目標區(qū)域 的引物組合物及其應用。
【背景技術】
[0002] 科研人員進行生物學研究時，需要從各種類型的樣本中提取核酸(DNA，或RNA)。其 中，體液樣本含有碎片化的DNA，對該樣本中的DNA進行生物學檢測是重要的檢測步驟。例如 血漿DNA，是血液中細胞外的DNA，W核小體(DNA-蛋白質復合體)的形式存在。運類碎片化的 DNA長度在幾十至幾百堿基對(主峰為166bp)。運類碎片化DNA通常由少量調亡細胞釋放至 血液循環(huán)系統(tǒng)中，含量極低，現有PCR方法很難檢測到可靠信息。
[0003] 另外，化石在生物進化、遺傳、形態(tài)、分類等許多學科的研究中都具有獨特的價值。 由于DNA水平的進化在生物進化論中占有舉足輕重的地位，而化石DNA是直接了解DNA進化 過程的一個重要的也可能是唯一的途徑，因此該領域的研究將成為分子進化論的一個重要 方面。但是化石DNA在長時間的形成過程中，DNA已經降解至很小的片段，同時含量也極為稀 少，現有的檢測方法往往達不到科研人員的檢測要求。
[0004] 石蠟包埋(FFPE)樣本解決了新鮮樣本長期保存的問題，但是樣本經過福爾馬林固 定、石蠟包埋之后，DNA很容易形成交聯并碎片化，通常為幾十至幾千堿基對?？蒲腥藛T很難 從運類材料中獲得高質量的DNA用于高靈敏檢測。
[0005] 刑偵樣本是公安機關用于破案的重要證據，在破案過程中扮演著重要的角色。但 是，刑偵樣本因所處環(huán)境的不同，刑偵樣本DNA通常會有不同程度的降解。同時刑偵樣本DNA 往往不是純的單個個體的DNA，而是混有其他個體DNA的混合物，而且真正有意義的DNA的混 合比例有可能極低(0.1%)，但是，現有的檢測方法很難達到運么高的檢測靈敏度。
[0006] 因而，目前的碎片化DNA檢測方法仍有待改進。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的 在于提出一種DNA利用率高、靈敏度高尤其適于微量樣本的碎片化DNA檢測方法。
[000引需要說明的是，本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現和工作而完成的：
[0009] 對于碎片化DNA，傳統(tǒng)的檢測方法是對檢測區(qū)域設計一對面對面的引物(正向引物 和反向引物），通過PCR(聚合酶鏈式反應)對該區(qū)域進行指數放大，最后通過儀器對該擴增 產物進行檢測。傳統(tǒng)的PCR檢測技術的引物區(qū)內不能出現斷裂點的情況，否則，PCR實驗將 失敗。由于碎片化DNA的特點，勢必造成傳統(tǒng)PCR技術可利用模板的效率降低。
[0010] 具體地，發(fā)明人研究發(fā)現，傳統(tǒng)檢測碎片化DNA的方法主要通過對待檢測區(qū)域進行 PCR擴增進行檢測，因為PCR引物是設計在待檢測區(qū)域的兩側，因此要求待檢測區(qū)域保持完 整，但是碎片化DNA是隨機斷裂產生的，大多數碎片化DNA是不完整的，因此，能作為PCR模板 使用的碎片化DNA數量極少，PCR很難檢測到。進而，發(fā)明人創(chuàng)造性地使用同向特異性引物組 對碎片化DM進行富集，從而增加了引物擴增的適應范圍、有效模板量，并且使碎片化DM的 檢測靈敏度得到極大的提高，有效解決了目前的技術難題。
[0011] 進而，在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種用于檢測碎片化DNA目標區(qū)域的引 物組合物。根據本發(fā)明的實施例，該引物組合物包括：
[0012] 第一引物組，所述第一引物組包含第一通用引物和第二通用引物，所述第一通用 引物和所述第二通用引物的祀點位于所述目標區(qū)域的兩端，分別用于構成測序文庫的5'端 和3'端；W及
[0013] 第二引物組，所述第二引物組包括第一特異性引物組和第二特異性引物組，
[0014] 其中，
[0015] 所述第一特異性引物組和所述第二特異性引物組均包含η條目標區(qū)域特異性引 物，且所述第一特異性引物組和所述第二特異性引物組必須滿足下列條件：
[0016] (1)所述第一特異性引物組和所述第二特異性引物組的各特異性引物均同向延 伸，祀點均位于所述碎片化DNA目標區(qū)域的5 '端或3 '端；
[0017] (2)η=1-5的任意整數，Wn = 5為例，設所述第一特異性引物組的各特異性引物分 別為:Nl、N2、N3、N4、N5，所述第二特異性引物組的各特異性引物分別為:Ml、M2、M3、M4、M5，W特 異性引物的祀點與目標區(qū)域之間的距離為衡量標準，所述第一特異性引物組和所述第二特 異性引物組的各特異性引物之間的距離遠近關系為：
[001引化〉化〉化〉N4〉化；
[0019] Mi>M2>M3>M4>M5 ；
[0020] 化〉Ml;
[0021] 化〉M2;
[0022] 化〉M3;
[0023] N4〉M4;且
[0024] 化〉Μ己，
[0025] 其中，所述第一特異性引物組和所述第二特異性引物組的各特異性引物的祀點， 與所述第一通用引物的祀點分別位于所述目標區(qū)域的兩端，與所述第二通用引物的祀點位 于所述目標區(qū)域的同端。
[0026] 發(fā)明人驚奇地發(fā)現，本發(fā)明的引物組合物能夠有效用于檢測碎片化DNA目標區(qū)域。 具體地，利用本發(fā)明的引物組合物對碎片化DNA的目標區(qū)域進行擴增富集，能夠顯著提高引 物擴增的適應范圍和有效模板量，進而對富集產物進行測序檢測，能夠顯著提高碎片化DNA 的檢測靈敏度。從而，本發(fā)明的引物組合物尤其適于微量樣本的碎片化DNA檢測。
[0027] 在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種構建碎片化DNA的目標區(qū)域檢測文庫的 方法。根據本發(fā)明的實施例，該方法利用前面所述的引物組合物，通過PCR擴增富集所述碎 片化DNA目標區(qū)域的序列。
[0028] 根據本發(fā)明的實施例，利用該方法能夠有效構建碎片化DNA的目標區(qū)域檢測文庫。 并且，該方法利用前述的引物組合物對碎片化DNA的目標區(qū)域進行擴增富集，從而能夠顯著 提高引物擴增的適應范圍和有效模板量，獲得的富集產物即測序文庫用于高通量測序后， 目標區(qū)域測序結果準確可靠，碎片化DNA的檢測靈敏度高，且可重復性好。并且，該方法尤其 適于微量樣本的碎片化DNA的目標區(qū)域測序文庫構建。
[0029] 在本發(fā)明的第Ξ方面，本發(fā)明提出了一種確定碎片化DM目標區(qū)域序列信息的方 法。根據本發(fā)明的實施例，該方法包括：
[0030] 根據前面所述的構建碎片化DNA的目標區(qū)域檢測文庫的方法，構建所述碎片化DNA 的目標區(qū)域檢測文庫；
[0031] 對所述碎片化DNA的目標區(qū)域檢測文庫進行測序，W便獲得測序結果；W及
[0032] 基于所述測序結果，確定所述碎片化DNA目標區(qū)域的序列信息。
[0033] 發(fā)明人發(fā)現，利用該方法能夠有效確定碎片化DNA目標區(qū)域序列信息。并且，基于 前述利用本發(fā)明的引物組合物對碎片化DNA的目標區(qū)域進行擴增富集，從而顯著了提高引 物擴增的適應范圍和有效模板量，且有效提高了擴增效果擴增特異性，進而獲得的富集產 物用于高通量測序后，目標區(qū)域測序結果準確可靠，碎片化DNA的檢測靈敏度高，且可重復 性好。并且，該方法尤其適于微量樣本的碎片化DNA檢測，在科學研究及生產應用方面均意 義重大，適于推廣。
[0034] 在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種構建碎片化DNA目標區(qū)域檢測文庫的裝 置。根據本發(fā)明的實施例，該裝置設置有前面所述的引物組合物，所述裝置包括：
[0035] 第一 PCR擴增單元，所述第一 PCR擴增單元用于利用第一特異性引物組和第一通用 引物對所述碎片化DNA進行第一PCR擴增，W便獲得第一PCR擴增產物；
[0036] 第二PCR擴增單元，所述第二PCR擴增單元與所述第一 PCR擴增單元相連，用于利用 第二特異性引物組和第一通用引物對所述第一PCR擴增產物進行第二PCR擴增，W便獲得第 二PCR擴增產物；W及
[0037] 第SPCR擴增單元，所述第SPCR擴增單元與所述第二PCR擴增單元相連，用于利用 第一通用引物和第二通用引物對所述第二PCR擴增產物進行第SPCR擴增，W便獲得第Ξ PCR擴增產物，所述第SPCR擴增產物構成所述碎片化DNA的目標區(qū)域檢測文庫。
[0038] 根據本發(fā)明的實施例，該裝置利用前述的引物組合物對碎片化DNA的目標區(qū)域進 行擴增富集，從而能夠顯著提高引物擴增的適應范圍和有效模板量，獲得的富集產物即測 序文庫針對目標區(qū)域的特異性好，進而用于高通量測序后，目標區(qū)域測序結果準確可靠，碎 片化DNA的檢測靈敏度高，且可重復性好。并且，該裝置尤其適于微量樣本的碎片化DNA的目 標區(qū)域測序文庫構建。
[0039] 在本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提出了一種確定碎片化DNA目標區(qū)域序列信息的系 統(tǒng)。根據本發(fā)明的實施例，該系統(tǒng)包括：
[0040] 前面所述的構建碎片化DNA目標區(qū)域檢測文庫的裝置，用于構建所述碎片化DNA的 目標區(qū)域檢測文庫；
[0041] 測序裝置，所述測序裝置與所述構建碎片化DNA目標區(qū)域檢測文庫的裝置相連，用 于對所述碎片化DNA的目標區(qū)域檢測文庫進行測序，W便獲得測序結果；W及
[0042] 序列確定裝置，所述序列確定裝置與所述測序裝置相連，用于基于所述測序結果， 確定所述碎片化DNA目標區(qū)域的序列信息。
[0043] 發(fā)明人驚奇地發(fā)現，該系統(tǒng)利用本發(fā)明的引物組合物對碎片化DNA的目標區(qū)域進 行擴增富集，從而顯著了提高引物擴增的適應范圍和有效模板量，且有效提高了擴增效果 擴增特異性，進而獲得的富集產物用于高通量測序后，不僅能夠有效確定碎片化DNA目標區(qū) 域的序列信息，且測序結果準確可靠，檢測靈敏度高，可重復性好。并且，該系統(tǒng)尤其適于微 量樣本的碎片化DM檢測，在科學研究及生產應用方面均意義重大，適于推廣。
[0044] 本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變 得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。
【附圖說明】
[0045] 本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得 明顯和容易理解，其中：
[0046] 圖1顯示了本發(fā)明的同向延伸的特異性引物的設計原理示意圖；
[0047] 圖2顯示了本發(fā)明的引物組合物進行突變位點檢測的原理示意圖；
[0048] 圖3顯示了本發(fā)明的引物組合物進行基因融合檢測的原理示意圖；
[0049] 圖4顯示了根據本發(fā)明實施例的構建碎片化DNA目標區(qū)域檢測文庫的裝置的結構 示意圖；
[0050] 圖5顯示了根據本發(fā)明實施例的定碎片化DNA目標區(qū)域序列信息的系統(tǒng)的結構示 意圖；
[0051] 圖6顯示了實施例1的純化產物的電泳檢測結果；W及
[0052] 圖7顯示了實施例2的純化產物的電泳檢測結果。
【具體實施方式】
[0053] 下面詳細描述本發(fā)明的實施例。下面描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā) 明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0054] 引物組合物
[0055] 在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種用于檢測碎片化DNA目標區(qū)域的引物組 合物。根據本發(fā)明的實施例，該引物組合物包括：
[0056] 第一引物組，所述第一引物組包含第一通用引物和第二通用引物，所述第一通用 引物和所述第二通用引物的祀點位于所述目標區(qū)域的兩端，分別用于構成測序文庫的5'端 和3'端；W及
[0057] 第二引物組，所述第二引物組包括第一特異性引物組和第二特異性引物組，
[0化引 其中，
[0059] 所述第一特異性引物組和所述第二特異性引物組均包含η條目標區(qū)域特異性引 物，且所述第一特異性引物組和所述第二特異性引物組必須滿足下列條件：
[0060] (1)所述第一特異性引物組和所述第二特異性引物組的各特異性引物均同向延 伸，祀點均位于所述碎片化DNA目標區(qū)域的5 '端或3 '端；
[0061] (2)η=1-5的任意整數，Wn = 5為例，設所述第一特異性引物組的各特異性引物分 別為:Nl、N2、N3、N4、N5，所述第二特異性引物組的各特異性引物分別為:Ml、M2、M3、M4、M5，W特 異性引物的祀點與目標區(qū)域之間的距離為衡量標準，所述第一特異性引物組和所述第二特 異性引物組的各特異性引物之間的距離遠近關系為：
[0062] 化〉化〉化〉N4〉化；
[0063] Mi>M2>M3>M4>M5 ；
[0064] 化〉Ml;
[00化]化〉M2;
[0066] 化〉M3;
[0067] N4〉M4;且 [006引化〉Ms，
[0069] 其中，所述第一特異性引物組和所述第二特異性引物組的各特異性引物的祀點， 與所述第一通用引物的祀點分別位于所述目標區(qū)域的兩端，與所述第二通用引物的祀點位 于所述目標區(qū)域的同端。
[0070] 發(fā)明人驚奇地發(fā)現，本發(fā)明的引物組合物能夠有效用于檢測碎片化DNA目標區(qū)域。 具體地，利用本發(fā)明的引物組合物對碎片化DNA的目標區(qū)域進行擴增富集，能夠顯著提高引 物擴增的適應范圍和有效模板量，進而對富集產物進行測序檢測，能夠顯著提高碎片化DNA 的檢測靈敏度。從而，本發(fā)明的引物組合物尤其適于微量樣本的碎片化DNA檢測。
[0071 ]其中，利用本發(fā)明的引物組合物對碎片化DNA的目標區(qū)域進行擴增富集包括:利用 第一特異性引物組和第一通用引物對所述碎片化DNA進行第一PCR擴增，W便獲得第一PCR 擴增產物;利用第二特異性引物組和第一通用引物對所述第一 PCR擴增產物進行第二PCR擴 增，W便獲得第二PCR擴增產物；W及利用第一通用引物和第二通用引物對所述第二PCR擴 增產物進行第SPCR擴增，W便獲得第SPCR擴增產物，則該第SPCR擴增產物即為富集產 物，后續(xù)構成所述碎片化DNA的目標區(qū)域檢測文庫。
[0072] 為方便理解，現對本發(fā)明設及的原理進行解釋：
[0073] 針對本發(fā)明的特異性引物，簡而言之，本發(fā)明的特異性引物組是兩個同向延伸的 引物組。其中，圖1示出了本發(fā)明的設計原理:假設基因組均勻斷裂，※為待檢的點突變、插 入、缺失位點;a為傳統(tǒng)引物，可利用的模板為粗實線的碎片化DNA;b為本發(fā)明的引物，可利 用的模板為粗實線加細實線的碎片化DNA;由此可見，本發(fā)明設計的引物可利用的模板數遠 高于傳統(tǒng)方法。
[0074] 圖2示出了突變位點檢測原理。其中，bl為同向延伸的特異性引物，※為待檢的點 突變、插入、缺失位點，實線方框為通用接頭，b2為通用引物。由此可知，利用本發(fā)明的特異 性引物組進行PCR擴增，可W有效利用所有含有同向延伸引物的碎片化DNA作為模板，高于 傳統(tǒng)PCR。
[0075] 圖3示出了針對基因融合的檢測原理。其中，左側為A基因，右側為B基因，A基因與B 基因交接處為融合位點，bl為同向延伸的特異性引物，實線方框為通用接頭，b2為通用引 物。由此可知，利用本發(fā)明的特異性引物組進行PCR擴增，可W有效利用所有含有同向延伸 引物的碎片化DNA作為模板，高于傳統(tǒng)PCR。
[0076] 也即，利用本發(fā)明的特異性引物組進行PCR擴增，因為能夠顯著提高可利用的DNA 模板量，從而能夠提局檢測的靈敏度。
[0077] 根據本發(fā)明的實施例，針對每一個特異性引物組，其包含的各特異性引物基于基 因組位置上的順序依次間隔0-50對堿基對。由此，擴增效率高。
[0078] 根據本發(fā)明的實施例，化與化對應的基因組位置有重疊，化與M2對應的基因組位置 有重疊，N3與M3對應的基因組位置有重疊，N4與M4對應的基因組位置有重疊，化與Ms對應的基 因組位置有重疊，優(yōu)選重疊0-20個堿基對。由此，擴增效果好。
[0079] 根據本發(fā)明的實施例，各特異性引物的GC含量均為30%-70%，時1值為55-68°C。由 此，擴增效果好。
[0080]需要說明的是，通用引物的具體序列不受特別限制，可基于后續(xù)使用的測序平臺 選擇，也即采用與測序平臺配合使用的兩條測序引物即可(分別構成測序文庫的5'端和3' 端）。根據本發(fā)明的一些具體實施例，兩條通用引物分別為：
[0081 ]第一通用引物:CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID N0:1);
[0082]第二通用引物:AATGATACGGCGACCACCGA(SEQ ID N0:2)。
[00削根據本發(fā)明的實施例，所述碎片化DM目標區(qū)域為EGFR基因19號外顯子，且n = 2， 所述第一特異性引物組的各特異性引物分別為：
[0084]化：TGCCAGTTAACGTCTTCCTTC(沈Q ID N0:3)，
[00 化]化：4了46664(：1'(：了6641^〇：46(沈9 10側：4);且
[0086] 所述第二特異性引物組的各特異性引物分別為：
[0087] Mi:GTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAG(沈Q ID N0:5)
[008引 M2:TGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTA(SEQ ID N0:6)。由此，基于本發(fā)明的引物組合 物，能夠有效對碎片化DNA的EGFR基因19號外顯子區(qū)域進行擴增富集和測序檢測，且可利用 模板量大、擴增效率高、特異性好好。
[0089] 根據本發(fā)明的實施例，所述碎片化DNA目標區(qū)域為EGFR基因20號外顯子，且n = 2， 所述第一特異性引物組的各特異性引物分別為：
[0090] 化：CCAGGAAGCCTACGTGATGGC(沈Q ID N0:7)，
[0091] 化：了666〔41'押6〇：1^4〇：了〇：(沈9 10側：8);且
[0092] 所述第二特異性引物組的各特異性引物分別為：
[0093] Mi:GATGGCCAGCGTGGACAACCCCCA(沈Q ID N0:9)
[0094] ]?2:(：(：1'〔4(：(：1'此4此6了6〔46(：1'〔41'(569 10顯：10)。由此，基于本發(fā)明的引物組合 物，能夠有效對碎片化DM的EGFR基因20號外顯子區(qū)域進行擴增富集和測序檢測，且可利用 模板量大、擴增效率高、特異性好。
[0095] 根據本發(fā)明的實施例，碎片化DNA的樣本來源不受特別限制。根據本發(fā)明的一些具 體示例，所述碎片化DNA為選自血漿DNA、尿液DNA、汗液DNA、唾液DNA、精液DNA、胸水DNA、腹 水DNA、糞便DNA、化石DNA、石蠟包埋DNA和刑偵樣本DNA的至少之一。
[0096] 根據本發(fā)明的實施例，所述碎片化DNA的目標區(qū)域包含選自點突變、插入、缺失、基 因融合突變的至少之一。由此，利用本發(fā)明的引物組合物擴增富集目標區(qū)域的序列后，富集 產物能夠有效用于檢測碎片化DNA目標區(qū)域的點突變、插入、缺失、基因融合突變。
[0097] 引物組合物的應用
[0098] 在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種構建碎片化DNA的目標區(qū)域檢測文庫的 方法。根據本發(fā)明的實施例，該方法利用前面所述的引物組合物，通過PCR擴增富集所述碎 片化DNA目標區(qū)域的序列。
[0099] 根據本發(fā)明的實施例，利用該方法能夠有效構建碎片化DNA的目標區(qū)域檢測文庫。 并且，該方法利用前述的引物組合物對碎片化DNA的目標區(qū)域進行擴增富集，從而能夠顯著 提高引物擴增的適應范圍和有效模板量，獲得的富集產物即測序文庫用于高通量測序后， 目標區(qū)域測序結果準確可靠，碎片化DNA的檢測靈敏度高，且可重復性好。并且，該方法尤其 適于微量樣本的碎片化DNA的目標區(qū)域測序文庫構建。
[0100] 根據本發(fā)明的具體示例，所述方法包括W下步驟：
[0101] 利用第一特異性引物組和第一通用引物對所述碎片化DNA進行第一PCR擴增，W便 獲得第一 PCR擴增產物；
[0102] 利用第二特異性引物組和第一通用引物對所述第一 PCR擴增產物進行第二PCR擴 增，W便獲得第二PCR擴增產物；W及
[0103] 利用第一通用引物和第二通用引物對所述第二PCR擴增產物進行第SPCR擴增，W 便獲得第SPCR擴增產物，所述第SPCR擴增產物構成所述碎片化DNA的目標區(qū)域檢測文庫。 由此，能夠有效構建碎片化DNA的目標區(qū)域檢測文庫，且文庫質量好，用于測序檢測時靈敏 度高，獲得的測序結果準確可靠。
[0104] 根據本發(fā)明的實施例，在進行所述第一PCR擴增之前，進一步包括:對所述碎片化 DNA依次進行末端修復、3'端加多聚腺嚷嶺尾和接頭連接。
[0105] 根據本發(fā)明的實施例，進一步包括將每個步驟的產物進行純化。由此，獲得的文庫 質量好，有利于后續(xù)測序檢測的進行。
[0106] 根據本發(fā)明的實施例，利用AmpmaqGokl:"60PCR Master Mix進行所述第一PCR 擴增和所述第二PCR擴增。由此，擴增效果好。
[0107] 根據本發(fā)明的實施例，所述第一 PCR擴增的反應程序為:95°C10分鐘;20個循環(huán):95 °C 30秒，62 °C 30秒，72 °C 1分鐘;72 °C 7分鐘;4 °C保存。由此，擴增效果好。
[0108] 根據本發(fā)明的實施例，所述第二PCR擴增的反應程序為:95°C 10分鐘；15個循環(huán):95 °C 30秒，62 °C 30秒，72 °C 1分鐘;72 °C 7分鐘;4 °C保存。由此，擴增效果好。
[0109] 其中，碎片化DNA的樣本來源不受特別限制。根據本發(fā)明的一些實施例，所述碎片 化DNA為選自血漿DNA、尿液DNA、汗液DNA、唾液DNA、精液DNA、胸水DNA、腹水DNA、糞便DNA、化 石DNA、石蠟包埋DNA和刑偵樣本DNA的至少之一。
[0110] 根據本發(fā)明的實施例，所述碎片化DNA的目標區(qū)域包含選自點突變、插入、缺失、基 因融合突變的至少之一。由此，構建獲得的碎片化DNA目標區(qū)域測序文庫，能夠有效用于檢 測目標區(qū)域的點突變、插入、缺失、基因融合突變。
[0111] 在本發(fā)明的第Ξ方面，本發(fā)明提出了一種確定碎片化DNA目標區(qū)域序列信息的方 法。根據本發(fā)明的實施例，該方法包括：
[0112] 根據前面所述的構建碎片化DNA的目標區(qū)域檢測文庫的方法，構建所述碎片化DNA 的目標區(qū)域檢測文庫；
[0113] 對所述碎片化DNA的目標區(qū)域檢測文庫進行測序，W便獲得測序結果；W及
[0114] 基于所述測序結果，確定所述碎片化DNA目標區(qū)域的序列信息。
[0115] 發(fā)明人發(fā)現，利用該方法能夠有效確定碎片化DNA目標區(qū)域序列信息。并且，基于 前述利用本發(fā)明的引物組合物對碎片化DNA的目標區(qū)域進行擴增富集，從而顯著了提高引 物擴增的適應范圍和有效模板量，且有效提高了擴增效果擴增特異性，進而獲得的富集產 物用于高通量測序后，目標區(qū)域測序結果準確可靠，碎片化DNA的檢測靈敏度高，且可重復 性好。并且，該方法尤其適于微量樣本的碎片化DNA檢測，在科學研究及生產應用方面均意 義重大，適于推廣。
[0116] 在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種構建碎片化DNA目標區(qū)域檢測文庫的裝 置。根據本發(fā)明的實施例，該裝置利用前述的引物組合物對碎片化DNA的目標區(qū)域進行擴增 富集，從而能夠顯著提高引物擴增的適應范圍和有效模板量，獲得的富集產物即測序文庫 針對目標區(qū)域的特異性好，進而用于高通量測序后，目標區(qū)域測序結果準確可靠，碎片化 DNA的檢測靈敏度高，且可重復性好。并且，該裝置尤其適于微量樣本的碎片化DNA的目標區(qū) 域測序文庫構建。
[0117] 下面參照圖4,對本發(fā)明的構建碎片化DNA目標區(qū)域檢測文庫的裝置100進行詳細 解釋。
[0118] 根據本發(fā)明的實施例，該裝置設置有前面所述的引物組合物，參照圖4,所述裝置 100包括:第一 PCR擴增單元10、第二PCR擴增單元20和第SPCR擴增單元30。
[0119] 根據本發(fā)明的實施例，第一PCR擴增單元10用于利用第一特異性引物組和第一通 用引物對所述碎片化DNA進行第一PCR擴增，W便獲得第一PCR擴增產物;第二PCR擴增單元 20與第一 PCR擴增單元10相連，用于利用第二特異性引物組和第一通用引物對所述第一 PCR 擴增產物進行第二PCR擴增，W便獲得第二PCR擴增產物;第SPCR擴增單元30與第二PCR擴 增單元20相連，用于利用第一通用引物和第二通用引物對所述第二PCR擴增產物進行第Ξ PCR擴增，W便獲得第SPCR擴增產物，所述第SPCR擴增產物構成所述碎片化DNA的目標區(qū) 域檢測文庫。
[0120] 根據本發(fā)明的實施例，進一步包括預處理單元，所述預處理單元與所述第一 PCR擴 增單元相連，用于在進行所述第一 PCR擴增之前，對所述碎片化DNA依次進行末端修復、3 '端 加多聚腺嚷嶺尾和接頭連接。
[0121] 根據本發(fā)明的實施例，進一步包括多個純化單元，用于分別將前述每個單元得到 的產物進行純化。由此，獲得的文庫質量好，有利于用于測序檢測。
[0122] 根據本發(fā)明的實施例，第一PCR擴增單元10與第二PCR擴增單元20中均設置有 AmpliTaqGold?360PCR Master Mix,用于利用AmpliTaqGold@360PCR Master Mix分別進 行所述第一 PCR擴增和所述第二PCR擴增。
[0123] 根據本發(fā)明的實施例，第一PCR擴增單元10適于按照W下反應程序進行所述第一 PCR擴增:95 °C 10分鐘；20個循環(huán):95 °C 30秒，62 °C 30秒，72 °C 1分鐘；72 °C 7分鐘;4 °C保存。由 此，擴增效果好。
[0124] 根據本發(fā)明的實施例，第二PCR擴增單元20適于按照W下反應程序進行所述第二 PCR擴增:95 °C 10分鐘；15個循環(huán):95 °C 30秒，62 °C 30秒，72 °C 1分鐘；72 °C 7分鐘;4 °C保存。由 此，擴增效果好。
[0125] 根據本發(fā)明的實施例，碎片化DNA的樣本來源不受特別限制。根據本發(fā)明的一些實 施例，所述碎片化DNA為選自血漿DNA、尿液DNA、汗液DNA、唾液DNA、精液DNA、胸水DNA、腹水 DNA、糞便DNA、化石DNA、石蠟包埋DNA和刑偵樣本DNA的至少之一。
[0126] 根據本發(fā)明的實施例，所述碎片化DNA的目標區(qū)域包含選自點突變、插入、缺失、基 因融合突變的至少之一。由此，構建獲得的碎片化DNA目標區(qū)域測序文庫，能夠有效用于檢 測目標區(qū)域的點突變、插入、缺失、基因融合突變。
[0127] 在本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提出了一種確定碎片化DNA目標區(qū)域序列信息的系 統(tǒng)1000。根據本發(fā)明的實施例，參照圖5,該系統(tǒng)1000包括:構建碎片化DNA目標區(qū)域檢測文 庫的裝置100、測序裝置200和序列確定裝置300。
[0128] 發(fā)明人驚奇地發(fā)現，該系統(tǒng)利用本發(fā)明的引物組合物對碎片化DNA的目標區(qū)域進 行擴增富集，從而顯著了提高引物擴增的適應范圍和有效模板量，且有效提高了擴增效果 擴增特異性，進而獲得的富集產物用于高通量測序后，不僅能夠有效確定碎片化DNA目標區(qū) 域的序列信息，且測序結果準確可靠，檢測靈敏度高，可重復性好。并且，該系統(tǒng)尤其適于微 量樣本的碎片化DNA檢測，在科學研究及生產應用方面均意義重大，適于推廣。
[0129] 下面參照圖5,對本發(fā)明的確定碎片化DNA目標區(qū)域序列信息的系統(tǒng)1000進行詳細 解釋。
[0130] 根據本發(fā)明的實施例，構建碎片化DNA目標區(qū)域檢測文庫的裝置100，用于構建所 述碎片化DNA的目標區(qū)域檢測文庫;測序裝置200與構建碎片化DNA目標區(qū)域檢測文庫的裝 置100相連，用于對所述碎片化DNA的目標區(qū)域檢測文庫進行測序，W便獲得測序結果;序列 確定裝置300與測序裝置200相連，用于基于所述測序結果，確定所述碎片化DNA目標區(qū)域的 序列信息。
[0131] 下面將結合實施例對本發(fā)明的方案進行解釋。本領域技術人員將會理解，下面的 實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術或條 件的，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯 的《分子克隆實驗指南》，第Ξ版，科學出版社)或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器 未注明生產廠商者，均為可W通過市購獲得的常規(guī)產品，例如可W采購自Illumina公司。
[0132] 實施例1
[0133] 1.接頭設計
[0134] Pre1ib-ADT-S:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATIIIIIIIGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC TTCCGATCTQ 為 index區(qū)），
[0135] Pre1ib-ADT-AS:pGATCGGAAGAGC，
[0136] W上序列需要退火成雙鏈。
[0137] 連接后產物結構：
[0138] Top:5，-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATIIIIIIIGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA TCTAGATCGGAAGAGC-3'，
[0139] Bottom:5 '-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATIIIIIIIGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTC CGATCTAGATCGGAAGAGC-3'，
[0140] 針對EGFR的19號外顯子設計同向延伸特異性引物。
[0141 ] EGFR19號外顯子序列如下：
[0142] GGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAA AGCCAACAAGGAAATCCTCGAT(沈Q ID N0:11)，
[0143] EGFR19號外顯子及其上下游內含子區(qū)序列如下：
[0144] CAGCCCCCAGCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTCCACAGCCCCAGTGTCCCTCACCTTCGGGGTGCATCGCTGGTAA CATCCACCCAGATCACTGGGCAGCATGTGGCACCATCTCACAATTGCCAGTTAACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCAT AGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCG AAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGTGGGGGTCCATGGCTCTGAACCTCAGGCCCAC CTTTTCTCATGTCTGGCAGCTGCTCTGCTCTAGACCCTGCTCATCTCCACATCCTAAATGTTCACTTTCTATGTCTT TCCCTTTCTAGCTCTAGTGGGTAT(沈Q ID N0:12)，
[0145] 同向延伸特異性引物序列如下，其中，
[0146] 第一特異性引物組的各特異性引物分別為：
[0147] 化：TGCCAGTTAACGTCTTCCTTC(沈Q ID N0:3)，
[014引 化：ATAGGGACTCTGGATCCCAG(沈Q ID N0:4)，
[0149]第二特異性引物組的各特異性引物分別為：
[01 加 ]Mi:GTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAG(沈Q ID N0:5)
[0151] M2:TGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTA(沈Q ID N0:6)，
[0152] 通用引物序列如下：
[0153] 第一通用引物:CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID N0:1);
[0154] 第二通用引物:AATGATACGGCGACCACCGA(SEQ ID N0:2)。
[0巧日]2.取2ml正常人血漿，提取游離DM。
[0156] 3.游離DM末端修復
[0157] 配制如下反應：
[015引 表1
[0159]
[0160] PCR儀上20°C溫浴30分鐘。
[0161] 使用120μ1 Ampure XP beads進行純化，3化 1 Elution Buffer洗脫。
[0162] 4.3'端加多聚腺嚷嶺尾
[0163] 配制如下反應：
[0164] 表2 [01 化]
[0166] PCR儀上37°C溫浴30分鐘。
[0167] 使用60μ1 Ampure XP beads進行純化，10μ1 Elution Buffer洗脫。
[016引 5.連接接頭
[0169] 配制如下反應：
[0170] 表3
[0171]
[0172]
[0173] PCR儀上20°C溫浴15分鐘。
[0174] 使用60μ1 Ampure XP beads進行純化，2化 1 Elution Buffer洗脫。
[0175] 6.目標區(qū)域預富集(即第一PCR擴增）
[0176] 配制如下反應：
[0177] 表4
[0178] __
[0179] PCR程序如下：
[0180] a)95°C 10 分鐘；
[0181] b) 20循環(huán)程序如下：
[0182] 95°C 30秒
[0183] 62°C 30秒
[0184] 72°C 1 分鐘
[01 化]c)72°C 7分鐘
[0186] d)4°C 保存。
[0187] 使用60μ1 Ampure XP beads進行純化，2化 1 Elution Buffer洗脫。
[01則 7.目標區(qū)域特異性富集(即第二PCR擴增）
[0189] 配制如下反應：
[0190] 表5 「01011 L0192J PCR括巧如 h:
[0193] a)95°C 10 分鐘；
[0194] b) 15循環(huán)程序如下：
[0195] 95°C 30秒
[0196] 62°C 30秒
[0197] 72°C 1 分鐘
[019引 c)72°C 7分鐘
[0199] d)4°C 保存。
[0200] 使用60μ1 Ampure XP beads進行純化，20μ1 Elution Buffer洗脫。
[020。 8.通用引物擴增（即第SPCR擴增）
[0202] 配制如下反應：
[020；3]表 6 Γ02041
[0205] PCR程序如下：
[0206] e)98°C 45秒；
[0207] f) 10循環(huán)程序如下：
[020引 98°C 15秒
[0209] 60°C 30秒
[0210] 72°C 30秒 g)72°C 1 分鐘
[0212] h)4°C 保存。
[0213] 使用60μ1 Ampure XP beads進行純化，30μ1 Elution Buffer洗脫。
[0214] 取其中化1純化產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖6。
[021日]最終文庫經過巧光定量PCR質控后，進行Illumina公司化xtSeqSOO進行75bp雙端 測序。
[0216]將高通量測序下機數據經過質控過濾后，進行BWA比對，用于評估文庫的特異性， 分析結果見表7。
[0^7]表 7 [021 引
[0219] 結果表明，本發(fā)明的技術方案能夠成功地對碎片化DNA的目標區(qū)域進行特異性檢 測。
[0220] 實施例2
[0221] 1.接頭設計
[0222] Pre1ib-ADT-S:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATIIIIIIIGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC TTCCGATCTQ 為 index區(qū)），
[0223] Prelib-ADT-AS:pGATCGGAAGAGC，
[0224] W上序列需要退火成雙鏈。
[02巧]連接后產物結構：
[0226] Top:5 '-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATIIIIIIIGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA TCTAGATCGGAAGAGC-3'，
[0227] Bottom:5 '-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATIIIIIIIGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTC CGATCTAGATCGGAAGAGC-3'，
[022引針對EGFR的20號外顯子T790M點突變設計同向延伸特異性引物。
[0229] EGFR20號外顯子序列如下：
[0230]
[0233] 同向延伸特異性引物序列如下，其中，
[0234] 第一特異性引物組的各特異性引物分別為：
[0235] 化：CCAGGAAGCCTACGTGATGGC(沈Q ID N0:7)，
[0236] 化：TGGGCATCTGCCTCACCTCC(沈Q ID N0:8)，
[0237] 第二特異性引物組的各特異性引物分別為：
[0238] Mi:GATGGCCAGCGTGGACAACCCCCA(沈Q ID N0:9)
[0239] M2:CCTCACCTCCACCGTGCAGCTCAT(沈Q ID N0:10)，
[0240] 通用引物序列如下：
[0241] 第一通用引物:CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID N0:1);
[0242] 第二通用引物:AATGATACGGCGACCACCGA(沈Q ID N0:2)。
[0243] 2.樣本采集
[0244] 本實施例采用3個樣本，其中2個樣本(E20-l，E20-2)已經數字微滴PCR檢測在目標 區(qū)域含有不同比例的點突變T790M突變ΓΤ790Μ突變'表示:EGFR的20號外顯子第790氨基酸 位點由蘇氨酸Thr突變?yōu)榧琢虬彼酠et)，突變頻率分別為6.91 %和0.087 % ; 1個樣本化20- 3)在目標區(qū)域為野生型，即突變頻率為0。
[0245] 針對每個樣本，各取4ml血漿，且分別提取游離DNA2份，其中一份備用，用于對照組 實驗。
[0246] 3.游離DNA末端修復
[0247] 配制如下反應：
[024引 表8
[0249]
[02加 ]PCR儀上20°C溫浴30分鐘。
[0巧 1]使用120μ1 Ampure XP beads進行純化，3化 1 Elution Buffer洗脫。
[0252] 4.3'端加多聚腺嚷嶺尾
[0巧3] 配制如下反應：
[0巧4] 表9
[0 巧5]
[0256]~PCR 儀上 37 °C 溫浴 30 分鐘。
' '
[0巧7]使用60μ1 Ampure XP beads進行純化，10μ1 Elution Buffer洗脫。
[0258] 5.連接接頭
[0259] 配制如下反應：
[0260] 表10
[0261] 惦62] PCR儀上20°C溫浴15分鐘。
[0%3]使用60μ1 Ampure XP beads進行純化，2化 1 Elution Buffer洗脫。
[0264] 6.目標區(qū)域預富集(即第一PCR擴增）
[02化]配制如下反應：
[0%6]表11 Γη9Α7?
[0%引 PCR程序如下：
[0269] e)95°C 10 分鐘；
[0270] f) 20循環(huán)程序如下：
[0271] 95°C 30秒
[0272] 62°C 30秒
[0273] 72°C 1 分鐘
[0274] g)72°C 7分鐘
[0275] h)4°C 保存。
[0276] 使用60μ1 Ampure XP beads進行純化，2化 1 Elution Buffer洗脫。
[0277] 7.目標區(qū)域特異性富集(即第二PCR擴增）
[027引配制如下反應：
[0279] 表12
[0280]
[0281]
[0282] PCR程序如下：
[0283] i)95°C 10 分鐘；
[0284] j) 15循環(huán)程序如下：
[0285] 95°C 30秒
[0286] 62°C 30秒
[0287] 72°C 1 分鐘
[028引 k)72°C 7分鐘
[0289] 1)4°C 保存。
[0巧0]使用60μ1 Ampure XP beads進行純化，20μ1 Elution Buffer洗脫。 [02川 8.通用引物擴增（即第SPCR擴增）
[0292] 配制如下反應：
[0巧3] 表13
[0294]
[0295] ~PCR程序如下:
' '
[0巧6] m)98°C 45秒；
[0巧7] η) 10循環(huán)程序如下：
[029引 98°C 15秒
[0299] 60°C 30秒
[0300] 72°C 30秒
[030U o)72°C 1 分鐘
[0302] p)4°C 保存。
[0303] 使用60μ1 Ampure XP beads進行純化，30μ1 Elution Buffer洗脫。
[0304] 取其中化1純化產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖7。
[03化]最終文庫經過巧光定量PCR質控后，進行Illumina公司化xtSeqSOO進行75bp雙端 測序。
[0306] 將高通量測序下機數據經過質控過濾后，進行BWA比對，用于評估文庫的特異性， 分析結果見表14。
[0307] 表14
[030引
[0309]
[0310] 對目標區(qū)域數據進行進一步分析，評估T790M突變檢測的靈敏性，分析結果見表 15。
[0：311]表 15 [0312]
[0313] 9.對照組實驗--ARMS法檢測
[0314] 其中對照組使用北京蠢諾美迪基因檢測技術有限公司的EGFR基因突變檢測試劑 盒(PCR-巧光探針法），貨號：SMD-02-041，對3個樣本的另一份血漿DNA溶液的T790M的突變 情況進行檢測。檢測結果見表16。
[0315] 表16
[0316]
[0317] 表16的結果中，ACt《8定義為突變型，突變含量為l%-100%;ACt〉8定義為野生 型，或突變低于1 %。
[0318] 結果表明，本發(fā)明的技術方案相較于目前常用的DNA突變檢測方法及技術（例如 ARMS法)具有靈敏度更高的優(yōu)勢，在ARMS法僅僅能夠檢測高于1 %的突變的情況下，本發(fā)明 的技術方案能夠檢測突變頻率低至甚至低于0.1 %的碎片化DNA。
[0319] 在本說明書的描述中，參考術語"一個實施例"、"一些實施例"、"示例"、"具體示 例"、或"一些示例"等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特 點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不 一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可W在任何 的一個或多個實施例或示例中W合適的方式結合。
[0320] 盡管已經示出和描述了本發(fā)明的實施例，本領域的普通技術人員可W理解:在不 脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可W對運些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本 發(fā)明的范圍由權利要求及其等同物限定。
【主權項】
1. 一種用于檢測碎片化DNA目標區(qū)域的引物組合物，其特征在于，包括： 第一引物組，所述第一引物組包含第一通用引物和第二通用引物，所述第一通用引物 和所述第二通用引物的靶點位于所述目標區(qū)域的兩端，分別用于構成測序文庫的5'端和3' 端；以及 第二引物組，所述第二引物組包括第一特異性引物組和第二特異性引物組， 其中， 所述第一特異性引物組和所述第二特異性引物組均包含η條目標區(qū)域特異性引物，且 所述第一特異性引物組和所述第二特異性引物組必須滿足下列條件： (1) 所述第一特異性引物組和所述第二特異性引物組的各特異性引物均同向延伸，靶 點均位于所述碎片化DNA目標區(qū)域的5 '端或3 '端； (2) η = 1-5的任意整數，以η = 5為例，設所述第一特異性引物組的各特異性引物分別 為:N1、N2、N3、Ν4、N 5，所述第二特異性引物組的各特異性引物分別為:M1、M2、M3、Μ4、M 5，以特異 性引物的靶點與目標區(qū)域之間的距離為衡量標準，所述第一特異性引物組和所述第二特異 性引物組的各特異性引物之間的距離遠近關系為： Νι>Ν2>Ν3>Ν4>Ν5 ； Μι>Μ2>Μ3>Μ4>Μ5 ； Νι>Μι ； Ν2>Μ2 ； Ν3>Μ3 ； Ν4>Μ4;且 Ν5>Μ5， 其中，所述第一特異性引物組和所述第二特異性引物組的各特異性引物的靶點，與所 述第一通用引物的靶點分別位于所述目標區(qū)域的兩端，與所述第二通用引物的靶點位于所 述目標區(qū)域的同端。2. 根據權利要求1所述的引物組，其特征在于，針對每一個特異性引物組，其包含的各 特異性引物基于基因組位置上的順序依次間隔0-50對堿基對， 任選地，見與％對應的基因組位置有重疊，N2與M2對應的基因組位置有重疊，Ν3與M3對應 的基因組位置有重疊，Ν4與Μ4對應的基因組位置有重疊，他與此對應的基因組位置有重疊， 優(yōu)選重疊0-20個堿基對， 任選地，各特異性引物的GC含量均為30 % -70 %，Tm值為55-68 °C。3. 根據權利要求1所述的引物組，其特征在于，兩條通用引物分別為： 第一通用引物:CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID NO: 1); 第二通用引物:AATGATACGGCGACCACCGA(SEQ ID N0:2)， 任選地，所述碎片化DNA目標區(qū)域為EGFR基因19號外顯子，且η = 2，所述第一特異性引 物組的各特異性引物分別為： Ni：TGCCAGTTAACGTCTTCCTTC(SEQ ID N0：3), N2:ATAGGGACTCTGGATCCCAG(SEQIDN0:4);且 所述第二特異性引物組的各特異性引物分別為： Mi：GTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAG(SEQ ID NO：5) M2：TGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTA(SEQ ID NO:6), 任選地，所述碎片化DNA目標區(qū)域為EGFR基因20號外顯子，且n = 2，所述第一特異性引 物組的各特異性引物分別為： Ni：CCAGGAAGCCTACGTGATGGC(SEQ ID NO：7), N2:TGGGCATCTGCCTCACCTCC(SEQ ID N0:8);且 所述第二特異性引物組的各特異性引物分別為： Mi：GATGGCCAGCGTGGACAACCCCCA(SEQ ID NO：9) M2：CCTCACCTCCACCGTGCAGCTCAT(SEQ ID NO：10), 任選地，所述碎片化DNA為選自血漿DNA、尿液DNA、汗液DNA、唾液DNA、精液DNA、胸水 DNA、腹水DNA、糞便DNA、化石DNA、石蠟包埋DNA和刑偵樣本DNA的至少之一， 任選地，所述碎片化DNA的目標區(qū)域包含選自點突變、插入、缺失、基因融合突變的至少 之一。4. 一種構建碎片化DNA的目標區(qū)域檢測文庫的方法，其特征在于， 利用權利要求1-3任一項所述的引物組合物，通過PCR擴增富集所述碎片化DNA目標區(qū) 域的序列。5. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括： 利用第一特異性引物組和第一通用引物對所述碎片化DNA進行第一 PCR擴增，以便獲得 第一 PCR擴增產物； 利用第二特異性引物組和第一通用引物對所述第一 PCR擴增產物進行第二PCR擴增，以 便獲得第二PCR擴增產物；以及 利用第一通用引物和第二通用引物對所述第二PCR擴增產物進行第三PCR擴增，以便獲 得第三PCR擴增產物，所述第三PCR擴增產物構成所述碎片化DNA的目標區(qū)域檢測文庫， 任選地，在進行所述第一 PCR擴增之前，進一步包括： 對所述碎片化DNA依次進行末端修復、3 '端加多聚腺嘌呤尾和接頭連接， 任選地，進一步包括將每個步驟的產物進行純化， 任選地，利用AmpliTaqGold?360PCR Master Mix進行所述第一PCR擴增和所述第二PCR 擴增， 任選地，所述第一 PCR擴增的反應程序為： 95 °C 10 分鐘； 20 個循環(huán)：95 °C 30 秒，62 °C 30 秒，72 °C 1 分鐘； 72 °C 7分鐘； 4°C保存， 任選地，所述第二PCR擴增的反應程序為： 95 °C 10 分鐘； 15 個循環(huán):95 °C 30 秒，62 °C 30 秒，72 °C 1 分鐘； 72 °C 7分鐘； 4°C保存。6. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述碎片化DNA為選自血漿DNA、尿液DNA、 汗液DNA、唾液DNA、精液DNA、胸水DNA、腹水DNA、糞便DNA、化石DNA、石蠟包埋DNA和刑偵樣本 DNA的至少之一， 任選地，所述碎片化DNA的目標區(qū)域包含選自點突變、插入、缺失、基因融合突變的至少 之一。7. -種確定碎片化DNA目標區(qū)域序列信息的方法，其特征在于，包括： 根據權利要求4-6任一項所述的方法，構建所述碎片化DNA的目標區(qū)域檢測文庫； 對所述碎片化DNA的目標區(qū)域檢測文庫進行測序，以便獲得測序結果；以及 基于所述測序結果，確定所述碎片化DNA目標區(qū)域的序列信息。8. -種構建碎片化DNA目標區(qū)域檢測文庫的裝置，其特征在于，設置有權利要求1-3任 一項所述的引物組合物，所述裝置包括： 第一 PCR擴增單元，所述第一 PCR擴增單元用于利用第一特異性引物組和第一通用引物 對所述碎片化DNA進行第一PCR擴增，以便獲得第一PCR擴增產物； 第二PCR擴增單元，所述第二PCR擴增單元與所述第一 PCR擴增單元相連，用于利用第二 特異性引物組和第一通用引物對所述第一PCR擴增產物進行第二PCR擴增，以便獲得第二 PCR擴增產物；以及 第三PCR擴增單元，所述第三PCR擴增單元與所述第二PCR擴增單元相連，用于利用第一 通用引物和第二通用引物對所述第二PCR擴增產物進行第三PCR擴增，以便獲得第三PCR擴 增產物，所述第三PCR擴增產物構成所述碎片化DNA的目標區(qū)域檢測文庫。9. 根據權利要求8所述的裝置，其特征在于，進一步包括預處理單元，所述預處理單元 與所述第一 PCR擴增單元相連，用于在進行所述第一 PCR擴增之前，對所述碎片化DNA依次進 行末端修復、3 '端加多聚腺嘌呤尾和接頭連接， 任選地，進一步包括多個純化單元，用于分別將每個單元得到的產物進行純化， 任選地，所述第一 PCR擴增單元與所述第二PCR擴增單元中均設置有Ampl iTaqGold? 360PCR Master Mix，用于利用AmpliTaqGo丨d?360PCR Master Mix分別進行所述第一PCR 擴增和所述第二PCR擴增， 任選地，所述第一 PCR擴增單元適于按照以下反應程序進行所述第一 PCR擴增： 95 °C 10 分鐘； 20 個循環(huán)：95 °C 30 秒，62 °C 30 秒，72 °C 1 分鐘； 72 °C 7分鐘； 4°C保存， 任選地，所述第二PCR擴增單元適于按照以下反應程序進行所述第二PCR擴增： 95 °C 10 分鐘； 15 個循環(huán):95 °C 30 秒，62 °C 30 秒，72 °C 1 分鐘； 72 °C 7分鐘； 4°C保存， 任選地，所述碎片化DNA為選自血漿DNA、尿液DNA、汗液DNA、唾液DNA、精液DNA、胸水 DNA、腹水DNA、糞便DNA、化石DNA、石蠟包埋DNA和刑偵樣本DNA的至少之一， 任選地，所述碎片化DNA的目標區(qū)域包含選自點突變、插入、缺失、基因融合突變的至少 之一。10. -種確定碎片化DNA目標區(qū)域序列信息的系統(tǒng)，其特征在于，包括： 權利要求8或9所述的構建碎片化DNA目標區(qū)域檢測文庫的裝置，用于構建所述碎片化 DNA的目標區(qū)域檢測文庫； 測序裝置，所述測序裝置與所述構建碎片化DNA目標區(qū)域檢測文庫的裝置相連，用于對 所述碎片化DNA的目標區(qū)域檢測文庫進行測序，以便獲得測序結果；以及 序列確定裝置，所述序列確定裝置與所述測序裝置相連，用于基于所述測序結果，確定 所述碎片化DNA目標區(qū)域的序列信息。
【文檔編號】C12N15/11GK106011230SQ201610307184
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月10日
【發(fā)明人】王永利, 宋卓, 袁夢兮
【申請人】人和未來生物科技（長沙）有限公司