miR-489-3p在制備診斷和治療人骨質(zhì)疏松癥藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種miR?489?3p在制備診斷和治療人骨質(zhì)疏松癥藥物中的應(yīng)用。技術(shù)方案是檢測(cè)老齡骨質(zhì)疏松癥患者股骨組織樣本，發(fā)現(xiàn)miR?489?3p在人骨質(zhì)疏松骨組織樣本中低表達(dá)，可作為診斷骨質(zhì)疏松癥的標(biāo)志基因。通過設(shè)計(jì)制備miR?489?3p的模擬物及拮抗劑，轉(zhuǎn)染到小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3?E1中，進(jìn)行礦化?茜素紅s染色實(shí)驗(yàn)、ALP染色實(shí)驗(yàn)，經(jīng)qPCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：miR?489?3p促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，且miR?489?3p靶向調(diào)控非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶6(PTPN6)分子。表明miR?489?3p可調(diào)控PTPN6分子作為治療骨質(zhì)疏松等骨骼系統(tǒng)疾病藥物作用的靶點(diǎn)。
【專利說明】
miR-489-3p在制備診斷和治療人骨質(zhì)疏松癥藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種miR-489-化在制備診斷和治療 人骨質(zhì)疏松癥藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] MicroRNA(miRNAs)是一類長(zhǎng)約22~25個(gè)核巧酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，可 通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式結(jié)合祀基因的3'非編碼區(qū)（3 'UTR)，從而抑制翻譯或降解祀基因。 MicroRNA在進(jìn)化過程中高度保守，在生物體內(nèi)分布廣泛，并參與許多復(fù)雜的生物學(xué)過程，如 胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞調(diào)亡、脂肪代謝、骨形成等。但只有一小部分miRNAs的生物學(xué)功能 得到闡明。而成骨細(xì)胞是骨形成的主要功能細(xì)胞。隨著人年齡的增長(zhǎng)，骨的發(fā)育也發(fā)生著動(dòng) 態(tài)的變化，其中由成骨細(xì)胞引導(dǎo)的骨形成和由破骨細(xì)胞引導(dǎo)的骨吸收構(gòu)成了骨重建的動(dòng)態(tài) 平衡。當(dāng)成骨細(xì)胞分化異常時(shí)，會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)骨代謝疾病的發(fā)生，如骨質(zhì)疏松、股骨頭壞死、關(guān) 節(jié)退行性變、脊柱側(cè)彎等。其中，骨質(zhì)疏松癥是一種由骨骼礦物質(zhì)流失造成的骨量減少現(xiàn) 象，骨組織的微結(jié)構(gòu)退化導(dǎo)致骨骼內(nèi)空隙增大，骨骼結(jié)構(gòu)疏松變脆致使骨折易發(fā)。
[0003] 有研究表明：miRNAs通過調(diào)控成骨分化相關(guān)基因表達(dá)在骨形成中起關(guān)鍵作用，如 miR-216促進(jìn)人脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化、miR-494通過調(diào)節(jié)Runx2的表達(dá) 抑制成骨細(xì)胞分化等，但大多數(shù)研究?jī)H限于細(xì)胞水平。
[0004] 中國(guó)解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)肖建如等發(fā)明了巧sa-miR-489-3p在制備早期篩查或診 斷化achyu巧陽性腫瘤試劑或試劑盒中的應(yīng)用"，選取10例原發(fā)性/轉(zhuǎn)移性肺癌患者(經(jīng)免疫 組化檢測(cè)出4個(gè)化achyuiT陽性患者和6個(gè)化achyuiT陰性患者）夕F周血血漿標(biāo)本進(jìn)行qPCR擴(kuò) 增，與標(biāo)準(zhǔn)品比較后，發(fā)現(xiàn)miR-489-化在化achyuiT陽性的肺癌患者外周血中高表達(dá)，未見 動(dòng)物水平上的研究（肖建如，陳素，周振華.Hsa-miR-489-3p在制備早期篩查或診斷 Brachyu巧陽性腫瘤試劑或試劑盒中的應(yīng)用[P].上海:CN104878013A，20150902.)。
[0005] miR-489-3p作為一種microRNA，文獻(xiàn)叮ogin Patel. A novel double-negative feedback loop between miR-489-3p and the 肥R2-S冊(cè)2-MAPK signaling axis regulates breast cancer cell proliferation and tumor growth,0ncotarget.2016 (7): 18295-18308"報(bào)道了miR-489-3p通過祀向人表皮生長(zhǎng)因子受體2化ER2)分子，減弱 皿R2的下游信號(hào)的傳導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)。該文獻(xiàn)僅限于對(duì)miR-489- 化的一個(gè)祀分子的研究，未提及miR-489-化的其它祀分子。
[0006] 非受體型蛋白酪氨酸憐酸酶6(PTPN6)是蛋白酪氨酸憐酸酶家族成員，其家族作為 信號(hào)分子在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞分化、有絲分裂周期等方面發(fā)揮重要作用。本發(fā)明利用生物 信息學(xué)軟件分析、qPCR及Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了PTPN6是miR-489-化的祀分子之 一，并通過臨床骨質(zhì)疏松樣本檢測(cè)、體內(nèi)動(dòng)物水平實(shí)驗(yàn)、體外細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)miR-489- 化通過祀向PTPN6分子在制備人骨質(zhì)疏松癥的診斷和治療藥物中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明目的之一在于提供miR-489-3p(SEQ ID No.l)的特異性引物（SEQ ID No.2、3和4)作為人骨質(zhì)疏松癥等骨骼系統(tǒng)相關(guān)疾病的一個(gè)新的診斷工具。本發(fā)明另一目的 在于提供11111?-489-化模擬物（569 10齡.5和6)和括抗劑(569 10齡.7)用于制備診斷和治 療骨骼系統(tǒng)疾病的藥物及藥物組合物。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述第一個(gè)目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案如下：
[0009] (1)設(shè)計(jì)miR-489-化特異性引物序列，并合成制備W獲得miR-489-化特異性引物；
[0010] (2)miR-489-化特異性引物應(yīng)用：收集骨質(zhì)疏松患者骨組織樣本、建立老齡小鼠骨 質(zhì)疏松模型、后肢去負(fù)荷骨質(zhì)疏松小鼠模型檢測(cè)miR-489-化在骨組織中表達(dá)量，證實(shí)miR- 489-化不僅在小鼠骨質(zhì)疏松骨組織樣本中顯著低表達(dá)，在人骨質(zhì)疏松患者骨組織樣本中也 低表達(dá)。
[0011] 獲得的miR-489-3p特異性引物可作為診斷人骨質(zhì)疏松癥等骨骼系統(tǒng)相關(guān)疾病的 標(biāo)志基因，可應(yīng)用于制備檢測(cè)骨組織中miR-489-化表達(dá)水平的人骨骼系統(tǒng)疾病相關(guān)的檢測(cè) 試劑盒、試紙、忍片、RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、原位雜交、高通量測(cè)序平臺(tái)等。
[0012] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的另一目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案如下：
[0013] (1)設(shè)計(jì)、制備、并進(jìn)行化學(xué)修飾，獲得miR-489-化模擬物和括抗劑即agomi;r-489 (SEQIDNo.2和SEQIDNo.3)和antagomir-489(SEQIDNo.4和沈QIDNo.5);為提高 miR-489-化模擬物和括抗劑在體內(nèi)生物學(xué)效用，對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾是本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)之 一，包括產(chǎn)物進(jìn)行全鏈2'甲基化、前后2'-4'位點(diǎn)硫代憐酸化骨架修飾、5'兩個(gè)硫代憐酸位 點(diǎn)修飾、3'四個(gè)硫代憐酸位點(diǎn)修飾、W及3'末端膽固醇標(biāo)記；
[0014] (2 )miR-489-化模擬物和括抗劑應(yīng)用:利用體外轉(zhuǎn)染技術(shù)將其轉(zhuǎn)染到小鼠前成骨 細(xì)胞MC3T3-E1中，進(jìn)行ALP染色實(shí)驗(yàn)、礦化-茜素紅S染色實(shí)驗(yàn)。經(jīng)qPCR和Western Blot技術(shù) 檢測(cè)，證實(shí)本發(fā)明所述的miR-489-化通過祀向PTPN6調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化。
[0015] 獲得的miR-489-3p模擬物和括抗劑可用于制備診斷和治療骨骼系統(tǒng)疾病的藥物 及藥物組合物，包括人骨質(zhì)疏松、股骨頭壞死、關(guān)節(jié)退行性變、脊柱側(cè)彎W及其它骨骼系統(tǒng) 疾病。上述藥物及藥物組合物包括藥學(xué)上可接受的一種或多種載體，包括但不限于稀釋劑、 粘合劑、吸附載體、填充劑、崩解劑等;并可用不同添加劑制備藥物組合物，包括穩(wěn)定劑、殺 菌劑、緩沖劑、等滲劑、馨合劑、PH控制劑及表面活性劑等。
[0016] 本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明設(shè)計(jì)制備的miR-489-化特異性引物可作為人骨質(zhì)疏 松癥等骨骼系統(tǒng)疾病的一個(gè)方便快捷的診斷工具。本發(fā)明設(shè)計(jì)制備、并進(jìn)行化學(xué)修飾獲得 的miR-489-化模擬物和括抗劑，經(jīng)多種技術(shù)手段檢測(cè)表明其能對(duì)人骨質(zhì)疏松癥等骨骼系統(tǒng) 疾病產(chǎn)生治療效果，最終確定miR-489-化通過祀向PTPN6分子在制備藥物中的應(yīng)用，特別是 針對(duì)診斷和治療人骨質(zhì)疏松癥等骨骼系統(tǒng)疾病。
[0017] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明。
【附圖說明】
[0018] 圖1是本發(fā)明利用人miRNA表達(dá)譜忍片和qPCR技術(shù)檢測(cè)miR-489-3p在老年性骨質(zhì) 疏松患者骨組織樣本中低表達(dá)的結(jié)果圖。
[0019] 圖2是本發(fā)明利用qPCR技術(shù)檢測(cè)miR-489-化在老齡小鼠骨質(zhì)疏松模型的骨組織中 低表達(dá)的結(jié)果圖。（數(shù)值均值±標(biāo)準(zhǔn)差"表示，兩組間的顯著性采用students't檢驗(yàn)，*** P<0.001)
[0020] 圖3是本發(fā)明利用qPCR技術(shù)檢測(cè)miR-489-化在化U后肢去負(fù)荷骨質(zhì)疏松小鼠模型 骨組織中低表達(dá)的結(jié)果圖。（數(shù)值均值±標(biāo)準(zhǔn)差"表示，兩組間的顯著性采用students't 檢驗(yàn)，林沖<0.001)
[0021] 圖4是本發(fā)明應(yīng)用agomir-489可有效促進(jìn)miR-489-化在小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1 中的表達(dá)結(jié)果圖。（數(shù)值均值±標(biāo)準(zhǔn)差"表示，兩組間的顯著性采用students't檢驗(yàn)，*** P<0.001)
[0022] 圖5是本發(fā)明利用qPCR技術(shù)檢測(cè)agomir-489可有效促進(jìn)成骨分化標(biāo)志基因 ALP、 Runx2和0CN表達(dá)結(jié)果圖。（數(shù)值W "均值±標(biāo)準(zhǔn)差"表示，兩組間的顯著性采用StudentS ' t檢 驗(yàn)，沖<0.05，* 沖<0.01，** 沖<0.001)
[0023] 圖6是本發(fā)明利用ALP染色技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染agomir-489 W及agomir-489對(duì)小鼠前成 骨細(xì)胞MC3T3-E1礦化結(jié)節(jié)形成的促進(jìn)結(jié)果圖。
[0024] 圖7是本發(fā)明利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)PTPN6是miR-489-化的祀分子之一。
[00巧]圖8是本發(fā)明應(yīng)用antagomir-489發(fā)現(xiàn)miR-489-化與PTPN6有祀向作用關(guān)系，并且 antagomi;r-489促進(jìn)PTPN6表達(dá)的結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[00%] W下實(shí)施例參照?qǐng)D1-8。
[0027] 實(shí)施例1:利用人miRNA表達(dá)譜忍片和qPCR技術(shù)檢測(cè)miR-489-化在老年性骨質(zhì)疏松 患者骨組織樣本中低表達(dá)。
[0028] (1)設(shè)計(jì)并制備特異性引物hsa-miR-489-3p，序列見表1;
[0029] (2)老年性骨質(zhì)疏松患者骨組織樣本收集：
[0030] 收集老年性骨質(zhì)疏松患者骨組織樣本111例，立即于RNA保護(hù)劑中保存，并于-80°C 冰箱內(nèi)凍存。結(jié)合患者既往病史、治療史等信息，篩選獲得未患其他嚴(yán)重慢性疾病患者骨組 織樣本，分為90歲組和65歲組。
[0031 ] (3)提取老年性骨質(zhì)疏松患者骨組織樣本RNA:
[0032] 取骨組織樣品，將肌肉剝離干凈，用液氮研磨骨組織，待研磨充分后，轉(zhuǎn)移到1.5ml EP管，加入1ml TRIzoKlnvi化ogen公司），之后震蕩儀混勻。4°C，12000g離屯、20min。取上 清，轉(zhuǎn)移到新的1.5ml EP管。每1ml TRIzol加入20化1的氯仿，用手上下震蕩15s，室溫放置 2-3111111。41：，12000旨離屯、15111111。取出6?管，樣品分為^層，將上層的水相轉(zhuǎn)移到新的1.51111 EP管中。加入4°C預(yù)冷的異丙醇巧00化/1血TRIzo 1)，輕輕吹打混勻，沉淀RNAd-20°C冰箱靜 置30min，沉淀RNAe4°C，12000g離屯、lOmin。去除上清，緩慢沿管壁加入ImL 75%乙醇，小屯、 地吹打混勻。4°C，7500g離屯、lOmin。去除上清，室溫干燥沉淀10-20min，但不可完全干燥。加 入50μ1 RNase-free的水，吹打混勻，溶解RNA。（可放置在-80°C冰箱保存）用紫外分光光度 計(jì)檢測(cè)RNA在260nm和280nm處的吸光值。根據(jù)A260/A280比值檢測(cè)所得RNA的純度，純RNA的 A260/A280比值在2.0左右(一般實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)一比值最好控制在1.7 W上，2.1W下）。電泳，凝 膠成像儀上觀察結(jié)果:28S條帶與18S條帶之比應(yīng)接近2:1，5S條帶不亮。
[0033] (4)人miRNA表達(dá)譜忍片檢測(cè)miR-489-化在骨組織樣本中的表達(dá)趨勢(shì)。
[0034] (5)利用qPCR技術(shù)檢測(cè)miR-489-化在老年性骨質(zhì)疏松患者骨組織樣本中的表達(dá)變 化：
[0035] 使用TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，先將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄條件為：37°C 15min; 85°C 15s。取各組的cDNA為模板，WU6為內(nèi)參，采用qPCR檢測(cè)miR-489-化基因在老年 性骨質(zhì)疏松患者骨組織樣本中的表達(dá)量。qPCR反應(yīng)條件為:95°C30s，變性;95°C 10s ;60°C 30s，44個(gè)循環(huán)。所用has-miR-489-化與U6引物序列如下：
[0036] 表1 hsa-miR-489-化和U6引物序列
[0037]
[0038] 參照?qǐng)D1，結(jié)果表明miR-489-化在老年性骨質(zhì)疏松患者骨組織樣本中低表達(dá)，miR- 489-化可作為診斷骨質(zhì)疏松等骨骼系統(tǒng)相關(guān)疾病的標(biāo)志基因。
[0039] 實(shí)施例2:利用qPCR技術(shù)檢測(cè)miR-489-3p在老齡骨質(zhì)疏松小鼠模型骨組織中低表 達(dá)。
[0040] (1)設(shè)計(jì)并制備特異性引物mmu-miR-489-3p，序列見表2;
[0041] (2)建立老齡骨質(zhì)疏松小鼠模型：
[0042] 選用巧7BL/6實(shí)驗(yàn)小鼠，飼養(yǎng)至15月齡、17月齡、21月齡，處死小鼠，收集腔骨樣 本，-80°C冰箱凍存。
[0043] (3)提取小鼠腔骨樣本RNA，利用qPCR技術(shù)檢測(cè)miR-489-化在小鼠模型骨組織中的 表達(dá)量(步驟同上）。所用mmu-miR-489-3p引物序列如下：
[0044] 表2小鼠 miR-489-化引物序列
[0045]
[0046] 參照?qǐng)D2,結(jié)果表明miR-489-化在老齡骨質(zhì)疏松小鼠模型骨組織中低表達(dá)，進(jìn)一步 說明miR-489-化可作為診斷骨質(zhì)疏松等骨骼系統(tǒng)相關(guān)疾病的標(biāo)志基因。
[0047] 實(shí)施例3:利用qPCR技術(shù)檢測(cè)miR-489-化在化U后肢去負(fù)荷骨質(zhì)疏松小鼠模型骨組 織中低表達(dá)。
[0048] (1)建立HLU后肢去負(fù)荷骨質(zhì)疏松小鼠模型：
[0049] 選用巧7BL/6實(shí)驗(yàn)小鼠，用回形針將小鼠懸掛于尾懸吊裝置吊環(huán)上，小鼠脊柱與地 面呈30°進(jìn)行尾懸吊后肢去負(fù)荷。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水，28天后處死小鼠。
[0050] (2)提取小鼠腔骨樣本RNA，利用qPCR技術(shù)檢測(cè)miR-489-化在化U后肢去負(fù)荷骨質(zhì) 疏松小鼠模型骨組織中的表達(dá)量(步驟同上）。
[0051]參照?qǐng)D3,結(jié)果表明miR-489-化在化U后肢去負(fù)荷骨質(zhì)疏松小鼠模型的骨組織中低 表達(dá)，充分說明miR-489-化可作為診斷骨質(zhì)疏松等骨骼系統(tǒng)相關(guān)疾病的標(biāo)志基因。
[0052] 實(shí)施例4:agomir-489可有效促進(jìn)miR-489-化在小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1中的表 達(dá)。
[0053] (1)制備 miR-489-化模擬物 agomi;r-489及其對(duì)照 agomir-NC:
[0化4] 從miRBase獲得miR-489-化的核巧酸序列，根據(jù)miR-489-化的核巧酸序列合成寡 核巧酸單鏈W及互補(bǔ)的雙鏈，經(jīng)高效液相色譜法純化，并進(jìn)行全鏈甲基化、前后2'-4'位點(diǎn) 硫代憐酸化骨架修飾、W及3 '末端膽固醇標(biāo)記，最終獲得miR-489-化模擬物agomir-489。接 著，合成陰性對(duì)照agomir-NC。使用RNase free水將合成的寡核巧酸稀釋為20uM的存儲(chǔ)液， 分裝后于-80 °C凍存。agomi;r-489及agomir-NC序列如下所示：
[0055]表3 agomi;r-489及agomir-NC序列
[0化6]
[0057] (2)用agomir-489轉(zhuǎn)染小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1:
[0化引實(shí)驗(yàn)分組:轉(zhuǎn)染模擬物組:轉(zhuǎn)染agomir-489;模擬物對(duì)照組:轉(zhuǎn)染agomir-489-NC。 每孔的配置，取小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1，X 106/孔的細(xì)胞數(shù)接種于6孔板中，2mL含 10%FBS、100μg/ml鏈霉素與100μg/ml青霉素10%FBS，l%k谷氨酷胺的α-ΜΕΜ細(xì)胞培養(yǎng)基； 24小時(shí)內(nèi)細(xì)胞匯合達(dá)到70-90% ;在250μ1的α-ΜΕΜ無血清培養(yǎng)基加入20pmol antagomir 5ul柔和混勻；用25化1無血清的α-ΜΕΜ稀釋扣1 lipofectamin 2000試劑，輕輕混勻，室溫放 置5分鐘；用250μ1無血清的α-ΜΕΜ稀釋agomir，輕輕混勻，室溫放置5分鐘；將稀釋好的 agomir和lipofectamin 2000試劑混合，輕柔混勻，室溫放置20分鐘，W便形成agomir/ lipofectamin 2000復(fù)合物;將50化1復(fù)合物加到含有細(xì)胞的培養(yǎng)板孔內(nèi)，補(bǔ)加1.5ml的α- ΜΜ無血清培養(yǎng)基，來回輕柔搖晃細(xì)胞培養(yǎng)板。將細(xì)胞在C02培養(yǎng)箱中37 °C解育6小時(shí)后，更 換培養(yǎng)基，繼續(xù)解育。待4她后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的其它檢測(cè)步驟。
[0059] (3)提取轉(zhuǎn)染后小鼠 MC3T3-E1細(xì)胞的RNA:
[0060] 在含有轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)板每孔中加入TRIzoKlnvitrogen公司），待細(xì)胞充分裂解 后，轉(zhuǎn)移到新的1.5ml EP管，其余提取步驟同上。
[0061 ] (4)qPCR檢測(cè)miR-489-化表達(dá)量(步驟同上），所用序列同表2所示。
[0062] 參照?qǐng)D4,結(jié)果表明agomir-489可有效促進(jìn)miR-489-化在小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3- E1中的表達(dá)。
[0063] 實(shí)施例5:利用qPCR技術(shù)檢測(cè)agomir-489可有效促進(jìn)小鼠成骨分化標(biāo)志基因 ALP、 Runx2和0CN的表達(dá)。
[0064] 轉(zhuǎn)染及RNA提取參照實(shí)施例1，接著取各組的cDNA為模板，WGAPDH作為內(nèi)參，采用 qPCR檢測(cè)成骨分化標(biāo)志基因 ALP、Runx2和Ocn的表達(dá)。所用ALP、Runx2、0cn與GAP畑引物序列 如下：
[0065] 表4小鼠成骨標(biāo)志基因及內(nèi)參引物序列
[0066]
[0067] 參照?qǐng)D5,結(jié)果表明agomir-489可有效促進(jìn)小鼠成骨分化標(biāo)志基因 ALP、Runx2和 0CN的表達(dá)，說明miR-489-化可促進(jìn)小鼠成骨細(xì)胞分化。
[0068] 實(shí)施例6:轉(zhuǎn)染agomir-489進(jìn)行ALP染色和礦化-茜素紅S染色實(shí)驗(yàn)。
[0069] (l)ALP 染色實(shí)驗(yàn)：
[0070] 取小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1，W5 X 10^孔的細(xì)胞數(shù)接種于24孔板中，每組設(shè)3個(gè) 復(fù)孔，轉(zhuǎn)染4甜后(步驟同上），用PBS洗涂3次，每次5分鐘。采用10%中性甲醒固定細(xì)胞，室溫 15min，用PBS洗涂3次，每次5分鐘;去除洗涂液，加入適量BCIP/NBT染色工作液，確保能充分 覆蓋樣品；室溫避光解育24小時(shí)；去除BCIP/NBT染色工作液，用Ξ蒸水洗涂1-2次即可終止 顯色反應(yīng)，對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行掃描，觀察。
[0071] (2)礦化-茜素紅S染色實(shí)驗(yàn)：
[0072] 取小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1，W5 X 10^孔的細(xì)胞數(shù)接種于24孔板中，每組設(shè)3個(gè) 復(fù)孔，轉(zhuǎn)染4她后（步驟同上），將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為誘導(dǎo)成骨分化培養(yǎng)基(α-ΜΕΜ添加10% FBS、5化g/ml維生素 C與ΙΟπιΜβ甘油憐酸鋼，2化mol agomir每孔lul)誘導(dǎo)細(xì)胞成骨分化，每 2d更換培養(yǎng)基，誘導(dǎo)分化21加寸取出細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞，采用10%中性甲醒固定細(xì)胞，室溫 15min，PBS清洗細(xì)胞1次，加入0.5%茜素紅S染液(pH4.2)，室溫染色15min，使用自來水對(duì)細(xì) 胞震蕩清洗4次，5min/次，掃描儀對(duì)著色礦化結(jié)節(jié)進(jìn)行掃描獲取圖片分析。
[0073] 參照?qǐng)D6,結(jié)果表明轉(zhuǎn)染agomir-489可有效提高ALP活性，W及促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化 結(jié)節(jié)的形成，說明miR-489-化可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，提示miR-489-化可作為治療骨質(zhì)疏松 等骨骼系統(tǒng)相關(guān)疾病藥物作用的祀點(diǎn)。
[0074] 實(shí)施例7:利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)PTPN6是miR-489-化的祀分子。
[00對(duì)利用生物信息學(xué)，通過m i R B a S e和m i r a η d a數(shù)據(jù)庫(kù)分析（http:// WWW .microrna. org/microrna/getMrna. do?gene= 15170&utr = 4748&organism= 10090& ma1:ureName=mmu-miR-489#)，預(yù)測(cè)得到miR-489-化與勒1基因 PTPN6的結(jié)合位點(diǎn)。
[0076] 參照?qǐng)D7,利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)得到PTPN6是miR-489-化的祀分子之一。
[0077] 實(shí)施例8:利用qPCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染antagomi;r-489對(duì)PTPN6表達(dá)的 影響。
[0078] (1)制備 miR-489-化括抗劑 an1:agomi;r-489序列：
[0079] 從miRBase獲得miR-489-化成熟體的核巧酸序列，根據(jù)核巧酸序列合成寡核巧酸 單鏈，經(jīng)高效液相色譜法純化，并進(jìn)行全鏈2 '甲基化、5 '兩個(gè)硫代憐酸位點(diǎn)修飾、3 '四個(gè)硫 代憐酸位點(diǎn)修飾、W及3 '末端膽固醇標(biāo)記，獲得miR-489-化括抗劑an化gomi;r-489，序列為： GCUGCCAUAUAUGUGGUGUCAUU。
[0080] (2)設(shè)計(jì)并制備PTPN6引物，序列見表5;
[0081 ] (3) qPCR檢測(cè)PTPN6的表達(dá)（WGAPDH為內(nèi)參）：實(shí)驗(yàn)分組：轉(zhuǎn)染括抗劑組：轉(zhuǎn)染 antagomi;r-489;括抗劑對(duì)照組:轉(zhuǎn)染an1:agomi;r-NC。所用PTPN6引物序列如下：
[0082] 表5 mmu-PTPN6 引物序列
[0083]
[0084] (4)Weste;rn blot檢測(cè)：
[0085] 取小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1，W5 X 10^孔的細(xì)胞數(shù)接種于24孔板中，每組設(shè)3個(gè) 復(fù)孔，轉(zhuǎn)染72h后(步驟同上），采用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞、提取蛋白質(zhì)。采用BCA法檢測(cè)蛋白 濃度，之后加上樣緩沖液，105 °C加熱處理15min，冰上放置2min，使蛋白變性;采用SDS-PAGE 分離蛋白，其中5%濃縮膠，12%分離膠;將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，130V，化;5%脫脂奶粉封閉 20min;分別加入相應(yīng)一抗，4°C解育過夜;TBST洗膜3次，15min/次；加入二抗，室溫解育化； TBST洗膜3次，15min/次;然后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，并對(duì)X光片曝光，經(jīng)顯影定影處理后，進(jìn)行 成像分析。
[0086] 參照?qǐng)D8,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-489-化祀向PTPN6,并抑制PTPN6的表達(dá)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種miR-489-3p在制備診斷和治療人骨質(zhì)疏松癥藥物中的應(yīng)用，其特征在于包括以 下步驟： (1)設(shè)計(jì)miR-489-3p特異性引物序列，并合成制備miR-489-3p特異性引物； (2 )miR-489-3p特異性引物應(yīng)用：收集骨質(zhì)疏松患者骨組織樣本、建立老齡小鼠骨質(zhì)疏 松模型、后肢去負(fù)荷骨質(zhì)疏松小鼠模型檢測(cè)miR-489-3p在骨組織中表達(dá)量，證實(shí)miR-489-3p不僅在小鼠骨質(zhì)疏松骨組織樣本中顯著低表達(dá)，在人骨質(zhì)疏松患者骨組織樣本中也低表 達(dá)； 獲得的miR-489-3p特異性引物能夠作為診斷人骨質(zhì)疏松癥等骨骼系統(tǒng)相關(guān)疾病的標(biāo) 志基因，能夠應(yīng)用于制備檢測(cè)骨組織中miR-489-3p表達(dá)水平的人骨骼系統(tǒng)疾病相關(guān)的檢測(cè) 試劑盒、試紙、芯片、RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、原位雜交以及高通量測(cè)序平臺(tái)。2. -種miR-489-3p在制備診斷和治療人骨質(zhì)疏松癥藥物中的應(yīng)用，其特征在于包括以 下步驟： (1) 設(shè)計(jì)、制備并進(jìn)行化學(xué)修飾，獲得miR-489-3p模擬物和詰抗劑即agomir-489(SEQ IDNo·2和SEQIDNo·3)和antagomir-489(SEQIDNo·4和SEQIDNo·5) ;為提高miR-489-3p模擬物和拮抗劑在體內(nèi)生物學(xué)效用，對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾，包括產(chǎn)物進(jìn)行全鏈2 '甲基化、前 后2 ' -4 '位點(diǎn)硫代磷酸化骨架修飾、5 '兩個(gè)硫代磷酸位點(diǎn)修飾、3 '四個(gè)硫代磷酸位點(diǎn)修飾以 及3'末端膽固醇標(biāo)記； (2) miR-489-3p模擬物和拮抗劑應(yīng)用：利用體外轉(zhuǎn)染技術(shù)將其轉(zhuǎn)染到小鼠前成骨細(xì)胞 MC3T3-E1中，進(jìn)行ALP染色實(shí)驗(yàn)、礦化-茜素紅s染色實(shí)驗(yàn);經(jīng)qPCR和Western Blot技術(shù)檢測(cè)， 證實(shí)miR-489-3p通過靶向PTPN6調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化； 獲得的miR-489-3p模擬物和拮抗劑能夠用于制備診斷和治療骨骼系統(tǒng)疾病的藥物及 藥物組合物，包括人骨質(zhì)疏松、股骨頭壞死、關(guān)節(jié)退行性變以及脊柱側(cè)彎類骨骼系統(tǒng)疾??； 上述藥物及藥物組合物包括藥學(xué)上可接受的一種或多種載體，包括但不限于稀釋劑、粘合 劑、吸附載體、填充劑以及崩解劑;并能夠用不同添加劑制備藥物組合物，包括穩(wěn)定劑、殺菌 劑、緩沖劑、等滲劑、螯合劑、PH控制劑及表面活性劑。
【文檔編號(hào)】A61P19/10GK106011264SQ201610504743
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年6月30日
【發(fā)明人】騫愛榮, 胡麗芳, 印崇, 張琰, 馬劍華, 趙帆, 陳志浩, 李迪杰, 李思宇, 馬小莉, 仇伍霞, 楊超飛, 王牌, 蘇佩紅
【申請(qǐng)人】西北工業(yè)大學(xué)