人胃腸腫瘤中piezo2基因的檢測試劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了人胃腸腫瘤中PIEZO2基因的檢測試劑，該檢測試劑為一對(duì)特異性引物，其上游引物的核苷酸序列為GGAGTTAGGC GGGAGTATAG TAC，下游引物的核苷酸序列為：TTCTTCAAAA ATAACTAATA CCGAA；該檢測試劑針對(duì)人胃腸腫瘤中PIEZO2基因，PIEZO2基因目前與腫瘤的關(guān)系尚不清楚，但我們發(fā)現(xiàn)在胃腸腫瘤中，癌變組織與癌旁組織之間PIEZO2基因在熒光定量甲基化檢測中PIEZO2基因甲基化程度不同，癌變組織PIEZO2基因甲基化程度明顯高于癌旁組織，該檢測試劑具有檢測靈活快速，簡單方便，針對(duì)性強(qiáng)，準(zhǔn)確可靠、效率高，經(jīng)濟(jì)節(jié)約的優(yōu)點(diǎn)，有利于結(jié)直腸癌和胃癌的早期發(fā)現(xiàn)和及時(shí)治療。
【專利說明】
人胃腸腫瘤中P/fZ 口 2基因的檢測試劑
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及消化系統(tǒng)腫瘤的檢測試劑，具體設(shè)及人胃腸腫瘤中基因的 檢測試劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 消化系統(tǒng)腫瘤中主要是惡性胃癌和結(jié)直腸癌，在所有消化系統(tǒng)惡性腫瘤死亡病例 中，約有一半的患者死于胃癌，結(jié)直腸癌近年來的發(fā)病率有明顯上升趨勢?，F(xiàn)用于診斷消化 系統(tǒng)中惡性腫瘤的方法主要包括消化內(nèi)鏡檢查，影像學(xué)檢查，生化和免疫學(xué)檢查及基因診 斷。免疫學(xué)檢查中胃癌的標(biāo)記物主要有〔4199、〔64、〔4242、〔4125、4。？、肥5等，結(jié)直腸癌的標(biāo) 記物主要有CA19-9、CEA、P53、K-ras等?；蛟\斷是近年來興起的檢測技術(shù)，具有快速、特異 和靈敏的優(yōu)點(diǎn)，如授權(quán)公告號(hào)為CN102787174的發(fā)明專利，就公開了針對(duì)與胃腸腫瘤相關(guān)折 抑癌基因 CPG表觀突變的檢測試劑，其中用25對(duì)引物測序CPG基因的啟動(dòng)子區(qū)，基因啟動(dòng)子 區(qū)域高甲基化可導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)沉默，致使腫瘤的發(fā)生，從而確認(rèn)胃腸腫瘤。但該發(fā)明專 利需要對(duì)胃腸腫瘤DNA進(jìn)行25對(duì)引物的PCR檢測，檢測時(shí)間長，檢測過程復(fù)雜，延緩了病患的 確診和救治時(shí)間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種人胃腸腫瘤中P 基因的檢測 試劑，該檢測試劑具有檢測靈活快速，簡單方便，針對(duì)性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。
[0004] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:人胃腸腫瘤中基因 的檢測試劑，該檢測試劑為一對(duì)特異性引物，該對(duì)特異性引物核巧酸序列如下： 上游引物的核巧酸序列為:5 ' - GGAGTTAGGC GGGAGTATAG TAC -3 '， 下游引物的核巧酸序列為:5'- TTCTTCAAAA ATAACTAATA CCGAA -3'。
[0005] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于人胃腸腫瘤中P / i?之0 基因的檢測試 劑，該檢測試劑為一對(duì)特異性引物，其上游引物的核巧酸序列為GGAGTTAGGC GGGAGTATAG TAC，下游引物的核巧酸序列為:TTCTTCAAAA ATAACTAATA CCGAA;該檢測試劑針對(duì)人胃腸腫 瘤中P/i?スOJ?基因，戶/i?スOJ?基因目前與腫瘤的關(guān)系尚不清楚，但我們發(fā)現(xiàn)在胃 腸腫瘤中，癌變組織與癌旁組織之間P /i?之0 基因在巧光定量甲基化檢測中 戶/ i?之0 基因甲基化程度不同，癌變組織P / i?之0 基因甲基化程度明顯高于癌旁 組織，該檢測試劑具有檢測靈活快速，簡單方便，針對(duì)性強(qiáng)，準(zhǔn)確可靠、效率高，經(jīng)濟(jì)節(jié)約的 優(yōu)點(diǎn)，有利于結(jié)直腸癌和胃癌的早期發(fā)現(xiàn)和及時(shí)治療。
【具體實(shí)施方式】
[0006] W下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0007] 實(shí)施例1 人胃腸腫瘤中P / i?之0 基因的檢測試劑，該檢測試劑為一對(duì)特異性引物，其上 游引物的核巧酸序列為：5'- GGAGTTAGGC GGGAGTATAG TAC -3'，下游引物的核巧酸序列 為：5'- TTCTTCAAAA ATAACTAATA CCGAA -3'。是針對(duì)P /怎之0 ^基因的啟動(dòng)子區(qū)域設(shè) 計(jì)的巧光定量甲基化特異性擴(kuò)增上游引物和巧光定量甲基化特異性擴(kuò)增下游引物，經(jīng)過我 們大量篩選施驗(yàn)確認(rèn)得到，引物由上海生功生物工程股份有限公司合成。
[000引實(shí)施例2 利用實(shí)施例1的一對(duì)引物進(jìn)行病例檢測，具體檢測過程如下： 1、DNA提取:我們從寧波第Ξ人民醫(yī)院采集5例胃癌石蠟樣本和對(duì)應(yīng)的癌旁組織石蠟樣 本，用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(購于Qiagen, Hilden，德國）DNA提取試劑盒提取DNA 樣本，我們從寧波第Ξ人民醫(yī)院采集5例結(jié)直腸癌石蠟樣本和對(duì)應(yīng)的癌旁組織石蠟樣本，同 樣提取，得到DNA樣本，DNA樣本要求DNA的吸光度(A)的比值(A260/A280)約為1.80。
[0009] 2、DNA樣本甲基化:采用EZ DNA甲基化試劑盒（購于幻mo公司，美國）對(duì)樣本DNA進(jìn) 行亞硫酸氨鹽轉(zhuǎn)化，用重亞硫酸鹽處理DNA樣品后，可使發(fā)生甲基化的胞喀晚(C)堿基保持 不變，而使未發(fā)生甲基化的C轉(zhuǎn)變成了尿喀晚（U)，然后通過巧光定量進(jìn)行PCR反應(yīng)，測序 戶/ ^之0 ^基因甲基化率。
[0010] 3、PCR反應(yīng)：取DNA樣本1.6ul加入到lOul SYBR Green混合液（購于Roche公司， 美國）中，再加入6.8ul無 DNA和RNA酶水，并加入上述一對(duì)P ^基因的特異性 擴(kuò)增引物，進(jìn)行巧光定量PCR甲基化擴(kuò)增；所采用的巧光定量甲基化程序?yàn)椋菏紫?5Γ lOmin的變性;接著95°C 20s，59°C 30s，72°C 30s，共45個(gè)循環(huán)的退火反應(yīng);反應(yīng)完成后是 95°C Imin，59°C 30s，95°C 80s進(jìn)入烙解曲線分析，判斷產(chǎn)物的特異性。
[00川 4、完畢后，利用2-AG巧法分析各樣本戶/怎之口之基因甲基化程度，其中ACT = CT C訂W -CT心rs-CT陽性對(duì)照，^ C Γ公（管家基因，購于上海生功生物工程股份有限公司）、 陽性對(duì)照（甲基化標(biāo)準(zhǔn)品DNA，購于幻mo公司）的檢測同步驟2、3，采用SPSS 16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行 整理分析，我們發(fā)現(xiàn)：結(jié)直腸癌變組織與癌旁組織之間，胃癌癌變組織與癌旁組織之間的 DNA甲基化水平均存在顯著差異如表1。
[0012]表1:癌變組織基因與癌旁組織基因甲基化率比較表
' 從表1中可W看出，在胃癌和結(jié)直腸癌病癥患者中，通過P / i?之0 基因的檢測試' 劑檢測，其癌變組織的甲基化率明顯高于癌旁組織。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.人胃腸腫瘤中2基因的檢測試劑，該檢測試劑為一對(duì)特異性引物，其特征 在于該對(duì)特異性引物核苷酸序列如下： 上游引物的核苷酸序列為：GGAGTTAGGC GGGAGTATAG TAC， 下游引物的核苷酸序列為：TTCTTCAAAA ATAACTAATA CCGAA。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK106011278SQ201610564373
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年7月18日
【發(fā)明人】葉孟, 李錦蕓, 周重昌, 倪超, 楊平, 陳思, 畢旭兒
【申請(qǐng)人】寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院