咔唑?利凡斯的明二聯(lián)體及其藥物組合物和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物或其藥用鹽、藥物組合物及用途：。這些化合物涉及一系列咔唑和利凡斯的明的二聯(lián)體，它們通過適當?shù)慕宇^連接，一方面可以發(fā)揮良好的神經(jīng)保護作用，另一方面，促進神經(jīng)干細胞的增殖。
【專利說明】
咔唑-利凡斯的明二聯(lián)體及其藥物組合物和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及合成一系列咔唑和利凡斯的明的二聯(lián)體，它們通過適當?shù)慕宇^連接。 本發(fā)明的化合物一方面可以發(fā)揮良好的神經(jīng)保護作用；另一方面，促進神經(jīng)干細胞(例如 C17.2)的增殖。本發(fā)明還涉及包含該二聯(lián)體的藥物組合物及其應(yīng)用，以及它們的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 氧化應(yīng)激被認為是導致阿爾茨海默病、帕金森氏癥和腦缺血等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病 的罪魁禍首之一。細胞內(nèi)具有一套非常完善的抗氧化防御系統(tǒng)，可以維持活性氧或氧自由 基的水平，但是，在某些應(yīng)激情況下，自由基的生成遠遠超過其清除，引起氧化失衡，從而導 致氧化應(yīng)激，使細胞的功能發(fā)生改變，最終造成細胞的死亡。與其他器官相比，中樞神經(jīng)系 統(tǒng)富含多不飽和脂肪酸、需要消耗大量的氧、缺乏內(nèi)源性抗氧化蛋白，因此，中樞神經(jīng)系統(tǒng) 更易受到氧化應(yīng)激的損害。
[0003] 隨著阿爾茨海默癥(Alzheimer's disease, AD)病情的發(fā)展，患者大腦皮層和海 馬區(qū)的神經(jīng)遞質(zhì)膽堿的含量明顯減少，腦內(nèi)Ach的合成減少，導致突觸間Ach的水平下降以 及ACh受體的敏感性降低，最終使膽堿能神經(jīng)元出現(xiàn)不可修復的損傷。研究表明提高腦內(nèi) ACh水平，能夠改善患者的記憶和認知能力。利凡斯的明作為第二代乙酰膽堿酯酶抑制劑， 能同時作用于乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶，抑制兩者對膽堿酯酶的水解作用，提高體內(nèi) 膽堿酯酶的水平，改善AD的癥狀。
[0004] 咔唑類化合物是一類極為重要的含氮芳香環(huán)類化合物。研究發(fā)現(xiàn)咔唑衍生物對中 樞神經(jīng)系統(tǒng)多種疾病，尤其是AD相關(guān)的靶點顯示出良好的生物活性。根據(jù)文獻報道，具有咔 唑母核的衍生物能夠?qū)Χ鄠€抗AD靶標，例如影響與Αβ生成相關(guān)的酶(BACE1和γ-分泌酶）、 抑制Αβ積聚、神經(jīng)保護作用、抗炎、促進成體神經(jīng)發(fā)生等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 基于以上研究，我們設(shè)計了咔唑-利凡斯的明的二聯(lián)體及其衍生物，基于咔唑的優(yōu) 點，再進一步引入膽堿酯酶抑制劑的藥效團，以起到一藥"多靶點、多功能"的協(xié)同效果。
[0006] 本發(fā)明涉及式(I)的化合物或藥用鹽：
式⑴ 其中， X為C或N; R為-N(CH3) 2或-N(CH3) (CH2CH3)。
[0007] 除非另外指明，本發(fā)明的化合物還意欲包括區(qū)別僅在于存在一個或多個同位素富 集的原子的化合物。例如，具有本結(jié)構(gòu)的除了用氘或氚替換氫，或者用 13C或14C_富集的碳原 子替換碳原子，或15n-富集的氮以為的化合物屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0008] 本發(fā)明另一方面提供一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的任何一個化合物或其藥用 鹽，以及藥學上可接受的載體或賦形劑。
[0009] 本發(fā)明另一方面提供本發(fā)明的任一化合物或其藥用鹽在制備治療中樞神經(jīng)系統(tǒng) 退行性疾病或病癥的藥物中的應(yīng)用。在一些實施方式中，所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病或 病癥包括阿爾茨海默病、帕金森氏癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥或亨廷頓舞蹈病。
[0010] 本發(fā)明另一方面提供一種治療或緩解中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病或病癥的方法，所 述方法包括向有此需要的患者施用治療有效量的本發(fā)明的任一化合物或其藥用鹽，或本發(fā) 明的藥物組合物。在一些實施方式中，所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病或病癥包括阿爾茨海 默病、帕金森氏癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥或亨廷頓舞蹈病。
[0011] 本發(fā)明還預期，本發(fā)明的任一化合物的"藥用鹽、衍生物、溶劑化物、前藥"也具有 相同的活性。"藥用鹽、衍生物、溶劑化物、前藥"是指任何藥用鹽，酯，溶劑化物，或經(jīng)施用于 接受者后能夠提供(直接或間接)本文所述化合物的其他化合物。然而，應(yīng)當理解非藥用鹽 也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)，因為那些可能用于制備用鹽，鹽，前藥和衍生物的制備可以通過本 領(lǐng)域已知的方法進行。例如，本發(fā)明提供的化合物的藥用鹽可以通過常規(guī)方法由母體化合 物合成，該母體化合物含有堿或酸部分。通常，該鹽例如通過將游離酸或堿形式的這些化合 物與化學計算量的適當堿或酸在水中或在有機溶劑中或在兩者的混合物中制備。通常，非 水性介質(zhì)如乙醚，乙酸乙酯，乙醇，異丙醇或乙腈是優(yōu)選的。酸加成鹽的實例包括無機酸加 成鹽例如，鹽酸鹽，氫溴酸鹽，氫碘酸鹽，硫酸鹽，硝酸鹽，和有機酸加成鹽，如例如乙酸鹽， 馬來酸鹽，富馬酸鹽，檸檬酸鹽，草酸鹽，琥珀酸鹽，酒石酸鹽，蘋果酸鹽，扁桃酸鹽和對甲苯 磺酸鹽。堿加成鹽的實例包括無機鹽如鈉、鉀、鈣、銨、鎂、鋁和鋰鹽；以及有機堿如乙二胺、 乙醇胺、N，N-二烷基乙醇胺、三乙醇胺、葡糖胺和堿性氨基酸鹽。
[0012] 優(yōu)選的衍生物或前藥是相對于母體物質(zhì)，當將這些化合物使用于患者時提高本發(fā) 明化合物的生物利用度(例如通過使得口服給藥的化合物更容易被吸收到血液中）或增強 母體化合物向生物區(qū)室(例如腦或淋巴系統(tǒng)）的傳遞的那些。
[0013] 式（I)化合物前藥的任何化合物屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù)語"前藥"以其最廣泛的 意義使用并且包括在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為本發(fā)明化合物的那些衍生物。這些衍生物對于本領(lǐng)域技術(shù) 人員是顯而易見的，并且根據(jù)分子中存在的官能團，包括不限于本發(fā)明化合物的下列衍生 物:酯;氨基酸酯;磷酸;金屬鹽硫酸;氨基甲酸酯和酰胺。
[0014] 本發(fā)明的化合物可以是作為有利化合物或作為溶劑化物的晶體形式，意欲將兩種 形式都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。溶劑化的方法是本領(lǐng)域公知的。適當?shù)娜軇┗锸撬幱萌?劑化物。在一個具體實施方案中，溶劑化物是水合物。
[0015] 本發(fā)明的化合物一方面可以發(fā)揮良好的神經(jīng)保護作用；另一方面，促進神經(jīng)干細 胞(例如C17.2)的增殖，并且能夠同時抑制AChE和BuChE的活性，綜合了咔唑和利凡斯的明 的優(yōu)點，起到了一藥"多靶點、多功能"的協(xié)同效果。
【附圖說明】
[0016] 圖1.化合物對L-glutamate誘導HT22細胞死亡的保護作用和對HT22細胞的細胞 毒性。
[0017] 圖2.化合物促進C17.2神經(jīng)干細胞的細胞活力。
[0018]圖3.化合物5a對C17.2神經(jīng)干細胞的促增殖作用。
[0019] 圖4.化合物5a對HUVEC細胞活力的影響。
[0020] 圖5.化合物5a對L02細胞活力的影響。
【具體實施方式】
[0021] 以下描述用于制備本發(fā)明化合物的合成方法。
[0022] 下述反應(yīng)路線例舉了制備本發(fā)明的化合物的方法。
[0023] 反應(yīng)路線 合成條件：（a) K2 ⑶3，CH3CN，90 °C，6 h; (b) Et3N，95 °C，overnight; (c) SnCh，EtOAc/EtO，50 °C，5 h; (d) BiCl3, Cyclohexane, N2, 80 °C，36 h. 其步驟為:將化合物1與環(huán)氧氯丙烷混合，得到中間體2。再將原料3與不同的酰氯反應(yīng)， 得到中間體4a和4b;將原料6間硝基苯酚與不同的酰氯反應(yīng)，再經(jīng)過還原，得到中間體7a和 7b。最后將4a，4b，7a，7b分別與中間體2反應(yīng)，即可合成得到式（I)所示最終產(chǎn)物5a，5b，8a， 8b 〇
[0024] 實施例1:化合物2
將原料1(3.00 g)溶于100 ml乙腈中，加入環(huán)氧氯丙烷(31.00 g)、無水碳酸鉀（2.50 g)。反應(yīng)體系在90°C反應(yīng)6小時，加入140 ml水、200 ml二氯甲烷，萃取分層、收集有機相。有 機相用100 ml 0.2 Μ鹽酸洗滌一次后用無水硫酸鎂干燥，抽濾、真空濃縮得黃色固體。初 產(chǎn)物用乙酸乙酯/石油醚重結(jié)晶得到白色固體1.37 g。產(chǎn)率:40%。咕匪1?(400 1抱，0130-de) δ 8.48 (d, /= 1.9 Hz, 2H), 7.7-7.64 (m, 2H), 7.64-7.59 (m, 2H), 4.84 (dd, /= 15.8, 2.9 Hz, 1H), 4.42 (dd, /= 15.8, 5.8 Hz, 1H), 3.32-3.29 (m, 1H), 2.84-2.62 (m, 1H), 2.55-2.52 (m, 1H). 實施例2:化合物4a
將原料3(0.30 g)、二甲氨基甲酰氯(0.29 g)、三乙胺(3 g)混合加入燒瓶中，95°C回流 反應(yīng)過夜，加50 ml二氯甲烷溶解，75°C真空濃縮，加50 ml二氯甲烷復溶，然后用0.5 Μ氫氧 化鈉溶液洗滌三次?；旌嫌袡C相，用無水硫酸鎂干燥、抽濾得到粘稠狀物質(zhì)。真空干燥，得到 0.29 g棕黃色固體。產(chǎn)率：59%</Η MMR (400 MHz, DMSO-?) δ 7.41 (t, /= 7.8 Hz, 1H), 6.28 (dd, /= 8.0, 0.5 Hz, 1H), 6.13 (dd, /= 7.6, 0.5 Hz, 1H), 6.08 (br, 1H), 2.93 (d, /= 44.0 Hz, 6H). 實施例3:化合物4b
將原料3(0.30 g)、N-甲基乙基氨基甲酰氯(0.33 g)、三乙胺（3 g)混合加入燒瓶中， 95° C回流反應(yīng)過夜，加50ml二氯甲烷溶解，75° C真空濃縮，加50 ml二氯甲烷復溶，然后用 0.5 Μ氫氧化鈉溶液洗滌三次?；旌嫌袡C相，用無水硫酸鎂干燥、抽濾得到粘稠狀物質(zhì)。真空 干燥，得到0.29 g棕黃色固體。產(chǎn)率：55%</Η MMR (400 MHz, DMSO-?) δ 7.41 (t, / = 7.8 Hz, 1H), 6.28 (d, /= 7.9 Hz, 1H), 6.13 (d, /= 7.5 Hz, 1H), 6.08 (br, 2H), 3.30-3.23 (m, 2H), 2.91 (d, /= 40.2 Hz, 3H), 1.18-1.05 (m, 3H). 實施例4:化合物7a
將原料6(1.00 g)、二甲氨基甲酰氯(0.77 g)、三乙胺(3 g)混合加入燒瓶中，95°C回流 反應(yīng)過夜，加50 ml二氯甲烷溶解，75°C真空濃縮，加50 ml二氯甲烷復溶，然后用0.5 Μ氫氧 化鈉溶液洗滌三次。混合有機相，用無水硫酸鎂干燥、抽濾得到粘稠狀物質(zhì)。真空干燥，得到 1.23 g棕黃色固體。稱量0.42 g棕黃色固體、并與氯化亞錫（1.72 g)、乙酸乙酯（10 ml)、無 水乙醇（10 ml)混合，室溫下反應(yīng)2 h，然后50°C反應(yīng)5小時。向混合物中加入50 ml乙酸乙 酯，用0.5 Μ氫氧化鈉溶液洗滌一次，收集有幾層，再用飽和氯化鈉溶液洗滌兩次，有機層用 硫酸鎂干燥，抽濾、濃縮得到0.25 g黃色固體。產(chǎn)率：559^? M1R (400 MHz, DMSO-?) δ 6.97 (t, /= 7.2 Hz, 1H), 6.39 (d, /= 7.9 Hz, 1H), 6.28 (s, 1H), 6.20 (d, J =7.8 Hz, 1H), 5.27 (br, 2H), 2.94 (d, /= 46.1 Hz, 6H). 實施例5:化合物7b
將原料6(1.00 g)、N-甲基乙基氨基甲酰氯(0.87 g)、三乙胺(3 g)混合，95°C回流反應(yīng) 過夜，加50 ml二氯甲烷溶解，75°C真空濃縮，加50ml二氯甲烷復溶，然后用0.5 Μ氫氧化鈉 溶液洗滌三次?；旌嫌袡C相，用無水硫酸鎂干燥、抽濾得到粘稠狀物質(zhì)。真空干燥，得到1.30 g棕黃色固體。稱取0.47 g棕黃色固體，并與氯化亞錫（1.80 g)、乙酸乙酯（10 ml)、無水乙 醇（10 ml)混合，室溫下反應(yīng)2 h，然后50°C反應(yīng)5小時。向混合物中加入50 ml乙酸乙酯，用 0.5 Μ氫氧化鈉溶液洗滌一次，收集有幾層，再用飽和氯化鈉溶液洗滌兩次，有機層用硫酸 鎂干燥，抽濾、濃縮得到0.30 g黃色固體。產(chǎn)率:60%。咕NMR (400 MHz, DMSO-?) δ 6.97 (t, /= 8.0 Hz, 1H), 6.45-6.37 (m, 1H), 6.28 (t, /= 2.1 Hz, 1H), 6.24-6.18 (m, 1H), 5.24 (br, 1H), 3.46-3.35 (m, 1H), 2.93 (d, /= 41.5 Hz, 2H), 1.20- 1.06 (m, 3H). 實施例6:化合物5a
將化合物2(0.24 g)、化合物4a(0.15 g)、氯化鉍(0.15 g)混合，加入10 ml環(huán)己烷，氮 氣保護下室溫反應(yīng)10分鐘，然后81° C反應(yīng)36 h。反應(yīng)結(jié)束后向體系加入10 ml水、20 ml乙酸 乙酯，萃取分離水相和有機相，水相用乙酸乙酯萃取兩次，合并有機相并用無水硫酸鎂干 燥，抽濾、濃縮得到棕黃色油狀液體，真空干燥后得到0.10 g黃色固體。產(chǎn)率:28%。咕匪R (400 MHz, mSO-de) δ 8.52-8.44 (m, 2H), 7.65-7.59 (m, 4H), 7.41 (t, /= 7.8 Hz, 1H), 6.29 (dd, /= 8.0, 0.5 Hz, 1H), 6.14 (dd, /= 7.6, 0.5 Hz, 1H), 6.08 (br, 1H), 5.53 (d, /= 5.4 Hz, 1H), 4.49 (dd, /= 14.9, 3.9 Hz, 1H), 4.37 (dd, /= 14.9, 8.0 Hz, 1H), 4.16-4.04 (m, 1H), 3.75 (dd, /= 11.1, 4.7 Hz, 1H), 3.66 (dd, /= 11.1, 5.7 Hz, 1H), 2.99 (s, 3H), 2.88 (s, 3H). 13C NMR (101 MHz, MSO-de) δ 159.79, 157.86, 154.07, 140.43, 140.08, 129.19, 123.72, 123.49, 112.58, 111.85, 105.31, 102.29, 69.73, 47.96, 47.02, 38.71, 36.55. HRMS (ESI): calcd for (M+Na)+(C23H22〇3N4Br2Na+) 582.9951， found 582.9965. 實施例7:化合物5b
將化合物2(0.24 g)、化合物4b(0.15 g)、氯化鉍(0.15 g)混合，加入10ml環(huán)己烷，氮氣 保護下室溫反應(yīng)10分鐘，然后81°C反應(yīng)36 h。反應(yīng)結(jié)束后向體系加入10 ml水、20 ml乙酸乙 酯，萃取分離水相和有機相，水相用乙酸乙酯萃取兩次，合并有機相并用無水硫酸鎂干燥， 抽濾、濃縮得到棕黃色油狀液體，真空干燥后得到0.11 g黃色固體。產(chǎn)率:30%。咕NMR (400 MHz, mSO-de) δ 8.50-8.45 (m, 2H), 7.64-7.59 (m, 4H), 7.41 (t, /= 7.8 Hz, 1H), 6.29 (d, /= 8.0 Hz, 1H), 6.17-6.02 (m, 2H), 5.54 (s, 1H), 4.48 (dd, / = 14.9, 3.9 Hz, 1H), 4.37 (dd, /= 14.9, 8.0 Hz, 1H), 4.15-4.07 (m, 1H), 4.03 (q, /= 7.1 Hz, 2H), 3.75 (dd, /= 11.1, 4.7 Hz, 1H), 3.65 (dd, /= 11.1, 5.7 Hz, 1H), 2.92 (d, /= 40.0 Hz, 3H), 1.18 (t, /= 7.1 Hz, 3H). 13C 匪R (101 MHz, MSO-de) δ 159.71, 157.76, 157.67, 153.70, 153.58, 140.51, 140.09, 129.19, 123.72, 123.49, 112.59, 111.85, 105.40, 102.46, 102.26, 69.73, 47.96, 47.02， 43.97, 34.16, 34.04， 13.56. HRMS (ESI): calcd for (M+H)+(C24H25〇3N4Br2+) 575.0288,found 575.0301. 實施例8:化合物8a
將化合物2(0.20 g)、化合物7a(0.11 g)、氯化鉍(0.15 g)混合，加入10 ml環(huán)己烷，氮 氣保護下室溫反應(yīng)10分鐘，然后81° C反應(yīng)36 h。反應(yīng)結(jié)束后向體系加入10 ml水、20 ml乙酸 乙酯，萃取分離水相和有機相，水相用乙酸乙酯萃取兩次，合并有機相并用無水硫酸鎂干 燥，抽濾、濃縮得到棕黃色油狀液體。然后用硅膠柱梯度洗脫過柱(洗脫劑為乙酸乙酯/石油 醚）。得到0.035 g黃色固體。產(chǎn)率：12%。咕 MMR (400 MHz, DMSO-?) δ 8.47-8.45 (m, 2H), 7.63-7.55 (m, 4H), 7.04 (t, /= 8.1 Hz, 1H), 6.46 (dd, /= 8.2, 1.4 Hz, 1H), 6.33 (t, /= 1.9 Hz, 1H), 6.26 (dd, /= 7.6, 1.8 Hz, 1H), 6.00-5.80 (m, 1H), 5.27-5.14 (m, 1H), 4.52-4.44 (m, 1H), 4.39-4.31 (m, 1H), 4.11-4.03 (m, 1H), 2.96 (d, /= 44.0 Hz, 6H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-?) δ 154.59，152.88， 150.29, 140.16, 140.08, 129.72, 129.08, 123.70, 123.67, 123.45, 123.42, 112.66, 112.60, 111.73, 111.69, 109.78, 109.58, 105.99, 68.50, 47.81, 47.71, 36.71, 36.54. HRMS (ESI): calcd for (M+H)+(C24H24〇3N3Br2+) 560.0179， found 560.0189. 實施例9:化合物8b
將化合物2(0.20 g)、化合物7b(0.10 g)、氯化鉍(0.15 g)混合，加入10 ml環(huán)己烷，氮 氣保護下室溫反應(yīng)10分鐘，然后81° C反應(yīng)36 h。反應(yīng)結(jié)束后向體系加入10 ml水、20 ml乙酸 乙酯，萃取分離水相和有機相，水相用乙酸乙酯萃取兩次，合并有機相并用無水硫酸鎂干 燥，抽濾、濃縮得到棕黃色油狀液體。然后用硅膠柱梯度洗脫過柱(洗脫劑為乙酸乙酯/石油 醚）。得到0.030 g黃色固體。產(chǎn)率：10%</Η NMR (400 MHz, DMSO-?) δ 8.46 (d, /= 1.8 Hz, 2H), 7.65-7.53 (m, 4H), 7.04 (t, /= 8.1 Hz, 1H), 6.46 (dd, /= 8.1, 1.5 Hz, 1H), 6.36-6.30 (m, 1H), 6.26 (dd, /= 7.9, 1.6 Hz, 1H), 5.86 (t, /= 5.9 Hz, 1H), 5.18 (d, /= 5.3 Hz, 1H), 4.49 (dd, /= 14.9, 3.8 Hz, 1H), 4.35 (dd, /= 14.9, 8.0 Hz, 1H), 4.11-4.05 (m, 1H), 3.44-3.34 (m, 2H), 2.94 (d, / = 38.0 Hz, 4H), 1.18 (t, /= 7.1 Hz, 3H). 13C 匪R (101 MHz, DMSO-?) δ154·25, 152.85, 150.30, 140.16, 129.73, 129.08, 123.67, 123.41, 112.67, 111.68, 109.69, 109.57, 106.01, 68.49, 47.81, 47.71, 43.88, 34.33, 34.02, 13.56. HRMS (ESI): calcd for (M+H) + (C25H26〇3N3Br2+) 574.0335，found 574.0347. 實施例10:抑制L-glutamate誘導細胞毒性作用 小鼠海馬神經(jīng)元細胞株HT22,用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，在37°C，飽和濕 度，含體積分數(shù)為5% C02、95%空氣的二氧化碳培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞，以 0.25%胰酶消化后，完全培養(yǎng)基重懸，顯微鏡下細胞計數(shù)板計數(shù)并調(diào)整細胞濃度為10 X 104 個/ml，接種96孔細胞培養(yǎng)板，100 μ!7孔，培養(yǎng)過夜，使細胞貼壁。將96孔板中培養(yǎng)基吸走， 待測化合物用DMS0溶解，用完全培養(yǎng)基稀釋，加入到96孔板中，100 μ!7孔。預孵育30 min 后，加入2 yL lOOmM L-glutamate。模型組不加待測化合物，直接加入2 yL lOOmM L-glutamate。孵育24 h后，每孔加入10 yL 5mg/mL MTT，孵育2h，棄去上清，加 DMSO 100 μ!7 孔，振蕩使生成物formazan充分溶解，在酶標儀上測定各孔吸光度值，測定波長570 nm。采 用公式化合物促進細胞的存活率(％)=1 〇〇%* (A待) / (Α|_-Α?)計算細胞存活率。 結(jié)果見圖1。
[0025]實施例11:促進C17.2神經(jīng)干細胞的細胞活力 小鼠神經(jīng)干細胞細胞株C17.2，用含10%胎牛血清、5%馬血清和2 mM L-谷氨酰胺的DMEM 完全培養(yǎng)基，在37°C，飽和濕度，含體積分數(shù)為5% C02、95%空氣的二氧化碳培養(yǎng)箱中常規(guī) 培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞，以〇. 25%胰酶消化后，完全培養(yǎng)基重懸，顯微鏡下細胞計數(shù)板計數(shù) 并調(diào)整細胞濃度為10 X 1〇4個/ml，接種96孔細胞培養(yǎng)板，100 μ!7孔，培養(yǎng)過夜，使細胞貼 壁。將96孔板中培養(yǎng)基吸走，待測化合物用DMS0溶解，用完全培養(yǎng)基稀釋，加入到96孔板中， 100 μ!7孔。孵育24 h后，每孔加入10 yL 5mg/mL ΜΤΤ，孵育2h，棄去上清，加 DMS0 100 μ!7 孔，振蕩使生成物formazan充分溶解，在酶標儀上測定各孔吸光度值，測定波長570 nm。采 用公式化合物促進細胞的存活率(％) = 1〇〇%*(Α待/ (A機粗-Ase)計算細胞存活 率。結(jié)果見圖2。
[0026] 實施例12: BrdU摻入法檢測細胞增殖 實驗前，C17.2細胞經(jīng)10 μΜ的Brdu處理4h。
[0027] (1)取出蓋玻片，用PBS緩沖液輕輕洗滌細胞3次； (2) 加入適量預冷的95%乙醇，室溫固定30 min; (3) 棄去固定液，用PBS緩沖液輕輕洗滌細胞3次，每次5 min; (4) 加入適量0.5% Triton-X 100溶液，室溫放置30 min; (5) 棄去0.5% Triton-X 100溶液，用roS緩沖液輕輕洗滌細胞3次，每次5 min; (6) 加入適量2 N鹽酸溶液，室溫放置30 min; (7) 棄去2 N鹽酸溶液，用roS緩沖液輕輕洗滌細胞3次，每次5 min; (8) 加入適量硼酸緩沖液，室溫放置12 min; (9) 棄去硼酸緩沖液，用PBS緩沖液輕輕洗滌細胞3次，每次5 min; (10) 加入適量2% BSA溶液，室溫放置15 min; (11) 棄去2% BSA溶液，加入適量2% BSA溶液稀釋的一抗，于4 °C孵育過夜； (12) 棄去一抗，用2% BSA溶液輕輕洗滌細胞3次，每次5 min; (13) 加入適量2% BSA溶液稀釋的熒光二抗，室溫放置1.5 h; (14) 棄去二抗，用2% BSA溶液輕輕洗滌細胞3次，每次5 min; (15) 加入DAPI工作液(5 yg/mL)，室溫放置10 min; (16) 棄去DAPI工作液，用2% BSA溶液輕輕洗滌細胞3次，每次5 min; (17) 把蓋玻片撬起，將貼有細胞面的蓋玻片朝下，貼在滴有抗熒光淬滅封片劑的載玻 片上，透明指甲油封片； (18) 激光共聚焦上機，拍照。結(jié)果見圖3。
[0028] 實施例13:化合物5a對HUVEC和L02細胞活力的影響 人臍靜脈內(nèi)皮細胞株HUVEC和人正常肝細胞株L02,用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng) 基，在37°C，飽和濕度，含體積分數(shù)為5% C02、95%空氣的二氧化碳培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。取 對數(shù)生長期細胞，以0.25%胰酶消化后，完全培養(yǎng)基重懸，顯微鏡下細胞計數(shù)板計數(shù)并調(diào)整 細胞濃度為10 X 1〇4個/ml，接種96孔細胞培養(yǎng)板，100 μ!7孔，培養(yǎng)過夜，使細胞貼壁。將96 孔板中培養(yǎng)基吸走，待測化合物用DMS0溶解，用完全培養(yǎng)基稀釋，加入到96孔板中，100 μL7 孔。孵育24 h后，每孔加入10 yL 5mg/mL ΜΤΤ，孵育2h，棄去上清，加 DMS0 100 μ!7孔，振蕩 使生成物formazan充分溶解，在酶標儀上測定各孔吸光度值，測定波長570 nm。采用公式化 合物促進細胞的存活率(％)=1〇〇%*(Α待/ (Α|_-Α?)計算細胞存活率。結(jié)果見 圖4和圖5。
[0029] 實施例14:抑制乙酰膽堿酯酶(AChE)和丁酰膽堿酯酶(BuChE)的活性 反應(yīng)體系總體積200 yL，其中AChE終濃度為0.03 U/mL(BuChE終濃度為0.05 U/mL)， DTNB終濃度500 μΜ，底物硫代乙酰膽堿或硫代丁酰膽堿終濃度500 μΜ，同時設(shè)對照組(0.1 M pH 8.0 PBS代替待測化合物)和空白組(酶稀釋液代替酶溶液）。
[0030] 96孔板中每孔加入2 yL酶溶液(或酶稀釋液），40 yL DTNB，118 yL ros，20 UL待 測化合物（10XX37 °C孵育20 min，最后加入20 uL底物。在412 nm處測定5 min內(nèi)吸光度變 化(每隔1 min讀數(shù)一次）。單次實驗每個濃度設(shè)2個復孔，重復三次實驗。結(jié)果見表1。
[0031] 表1.化合物抑制AChE和BuChE的活性
an.t. means no test. b n.a. means no active. 實施例15:平行人造膜通透性測定方法測定血腦屏障透過性 1)米用平行人工膜滲透模型（parallel artificial membrane permeability assay PAMPA)研究化合物的膜滲透作用。豬腦脂質(zhì)PBL溶于鏈烷中，濃度為2%。滴加4 μL的PBL到 96-孔1^受體板親脂性濾膜上以模擬生物膜，加入300 1^的？85/^切!1(7:3)緩沖液，在供 體管中加入化合物樣品液(0.1 mg/ml)，將96孔濾膜置于接收板上，使磷脂膜能接觸到供體 液，如此形成三明治結(jié)構(gòu)，25°C靜置10小時，待擴散完畢，分別吸取受體液和供體液，用紫外 分光光度計測定濃度。化合物設(shè)置4個復孔，檢測五個波長，n=3，以平均值±標準誤表示。
[0032] 2)在每次實驗中，用13種已商品化的上市藥物來進行驗證分析。根據(jù)下面公式計 算凡值，結(jié)果見表2。
[0033] 式中Vd是接受池的體積，Va是接受池的體積，A是膜面積，t是滲透時間， 是接受池的吸光度，[c/rag'iUuiiibri?是理論平衡吸光度。
[0034] 表2.血腦屏障透過性·
a PeXl(TB cm 值大于5.3,則化合物能夠透過血腦屏障，小于2.4被定義為不能透過 血腦屏障。
【主權(quán)項】
1. 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物或其藥用鹽：式(I) 其中， X為C或N; R為-N(CH3)2或-N(CH3) (CH2CH3)。2. -種藥物組合物，包括如權(quán)利要求1所述的任一化合物或其藥用鹽，以及藥學上可接 受的載體或賦形劑。3. 權(quán)利要求1的任一化合物或其藥用鹽在制備治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病或病癥的 藥物中的應(yīng)用。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病或病癥包括阿爾茨海默 病、帕金森氏癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥或亨廷頓舞蹈病。
【文檔編號】C07D209/88GK106045972SQ201610385701
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月3日
【發(fā)明人】皮榮標, 顏金武, 楊曉紅, 陳紫薇, 王勝男, 陳景考
【申請人】中山大學