一種利用肽配基親和純化凝血因子viii的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用肽配基親和純化凝血因子VIII的方法，該方法選用了對人凝血因子Ⅷ的特異性的肽配基作為親和基質(zhì)，并將該特異性的肽配基固定在瓊脂糖凝膠載體上，實現(xiàn)凝血因子Ⅷ的快速、特異、高效純化。其中，所述肽配基為能與凝血因子VIII發(fā)生親和反應(yīng)的多肽；所述多肽為EYCPC、GCVSGCLCWEYC和RKWNCTDHEYC中的任意一種或者EYCPC、GCVSGCLCWEYC和RKWNCTDHEYC按任意比混合后得到的混合物。利用該方法得到的凝血因子VIII的得率高、比活高，可以實現(xiàn)凝血因子Ⅷ的規(guī)?；兓c制備。
【專利說明】
一種利用肽配基親和純化凝血因子VI I I的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物分離純化領(lǐng)域，具體涉及一種利用肽配基親和純化凝血因子VIII 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 凝血因子VIII(coagulation factor VIII，F(xiàn)VIII)是內(nèi)源性凝血途徑中一種重要 的凝血因子，作為凝血因子IXa的輔因子，參與凝血因子X的激活，在血漿中的含量約為 O.lmg/I^FVIII遺傳性缺乏將導(dǎo)致甲型血友病(或血友病A)，所以又被稱為抗血友病球蛋白 或抗血友病因子。靜注FVIII制品替代治療甲型血友病，是當(dāng)前的主要治療手段。
[0003] 早在19世紀(jì)，歐美國家就開始通過輸血治療甲型血友病患者的出血癥狀，但是這 種治療方式效果并不明顯；1956年一種粗純的凝血因子珊制品面世，并用以治療甲型血友 病患者的出血癥狀。1964年制備的比活性僅有0.51 U/mg蛋白已經(jīng)可以十分有效的對甲型血 友病患者進(jìn)行替代治療。隨著各種層析工藝的開發(fā)與應(yīng)用，比活性可以達(dá)到l〇IU/mg蛋白的 中純凝血因子珊產(chǎn)品開始用于臨床治療。到了 20紀(jì)70年代末期，以凝血因子珊抗體為配基 的親和層析工藝開始應(yīng)用于凝血因子珊產(chǎn)品的純化，但是由于該類凝血因子珊產(chǎn)品穩(wěn)定性 很差，需要加入人血白蛋白作為保護(hù)劑，比活性也只能達(dá)到15IU/mg蛋白，而且也增加了產(chǎn) 品的成本。1992年Baxter公司成功推出第一個基因重組的凝血因子珊產(chǎn)品。
[0004] 盡管基因重組類的凝血因子珊產(chǎn)品己經(jīng)有了較好的臨床應(yīng)用效果，但并不意味著 我們就要放棄血漿來源的凝血因子珊。一方面血漿來源的凝血因子Vi成本要低于重組類的 凝血因子珊，而且因為是從人血液中提取的天然蛋白質(zhì)，因此沒有臨床副反應(yīng)的發(fā)生；另一 方面，血漿是一種寶貴的資源，除凝血因子VI外，還可以提取人免疫球蛋白、人血白蛋白、人 凝血酶原復(fù)合物、纖維蛋白原等產(chǎn)品；而且如果以低溫離心冷沉淀為起始原料提取凝血因 子珊的話，基本對上述產(chǎn)品的提取沒有影響，既提高了血漿的綜合利用效率和使用價值，又 分?jǐn)偭藛蝹€血液產(chǎn)品的成本。因此，尋找一種替代單抗純化凝血因子珊的方法就顯得尤為 重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種利用肽配基親和純化凝血 因子VIII的方法;該方法選用了對人凝血因子珊的特異性的肽配基作為親和基質(zhì)，并將該 特異性的肽配基固定在載體上，實現(xiàn)凝血因子珊的快速、特異、高效純化。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0007] -種利用肽配基親和純化凝血因子VIII的方法，包括以下步驟：
[0008] (1)純化用親和層析樹脂的制備：
[0009] a、肽配基溶液的配制：稱取2.8-3.2μηιο1肽配基溶于0.8_2ml雙蒸水中，攪拌至肽 配基完全溶解，得到肽配基溶液;其中，所述的肽配基為能與凝血因子VIII發(fā)生親和反應(yīng)的 多肽;所述多肽為EYCPC(其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示）、GCVSGCLCWEYC(其氨基酸序列 如SEQIDN0.2所示）和RKWNCTDHEYC(其氨基酸序列如SEQIDN0.3所示）中的任意一種或 者EYCPC、GCVSGCLCWEYC和RKWNCTDHEYC按任意比混合后得到的混合物，所述多肽EYCPC、 GCVSGCLCWEYC和RKWNCTDHEYC均采用常規(guī)多肽合成方法合成的，每種多肽的純度不低于 95% ；
[0010] b、瓊脂糖凝膠預(yù)處理:量取8-12ml保存于20%乙醇水溶液中的瓊脂糖凝膠，采用 過量蒸餾水對瓊脂糖凝膠進(jìn)行反復(fù)洗滌，除去瓊脂糖凝膠表面的乙醇，得到濕瓊脂糖凝膠；
[0011] C、將經(jīng)過步驟b處理后得到的濕瓊脂糖凝膠裝入離心管中，向離心管中加入20-25ml預(yù)冷的ImM HC1，振蕩混合均勻后在4°C靜置8-12min;然后在4°C3000rpm離心4-8min， 棄上清，得到沉淀；向沉淀中加入25-35ml去離子水，振蕩混合均勻后在4°C靜置8-12min;然 后在4°C3000rpm離心4-8min，棄上清，得到凝膠沉淀；向凝膠沉淀中加入0.8-2ml步驟a配制 的肽配基溶液和8-15ml去離子水，振蕩混合均勾，再加入0.8-1.5ml 5mg/ml的碳二亞胺溶 液，振蕩混合均勻后在室溫下lOOrpm反應(yīng)3.5-5h;
[0012] d、反應(yīng)結(jié)束后，向步驟C的反應(yīng)液中加入0.5-lml冰乙酸，振蕩混合均勻，在室溫下 lOOrpm 繼續(xù)反應(yīng) 1-1 · 5h;
[0013] e、反應(yīng)結(jié)束后，向步驟d的反應(yīng)液中加入0.8-1.5ml含20%哌啶的二甲基甲酰胺溶 液，振蕩混合均勻，在室溫下lOOrpm繼續(xù)反應(yīng)7-1 Omin，收集反應(yīng)產(chǎn)物；
[0014] f、用100-150ml 5mmol/L pH4.4的醋酸-醋酸鈉緩沖液對步驟e得到的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn) 行洗滌；然后再分別用0.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液和含0.5M NaCl的20mM pH4.4醋酸-醋酸鈉緩沖液各20-30ml對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行交替洗滌3次；
[0015] g、將經(jīng)過步驟f處理后的反應(yīng)產(chǎn)物用100-150ml去離子水進(jìn)行洗滌，然后再用50-100ml 20%的乙醇水溶液洗滌，洗滌結(jié)束后，即得到純化用親和層析樹脂;將純化用親和層 析樹脂4°C保存在20 %的乙醇水溶液中，備用；
[0016] (2)將步驟(1)制備得到的純化用親和層析樹脂裝入凝膠過濾層析柱中，然后向凝 膠過濾層析柱上加入0.02M PBS緩沖液進(jìn)行洗滌處理，洗滌至流出液的pH值與0.02M PBS緩 沖液相同時，停止洗滌；
[0017] (3)將待純化的血清或血漿用0.02M PBS緩沖液稀釋4-6倍，然后用蛋白純化儀將 稀釋后的血清或血漿栗入凝膠過濾層析柱中，控制蛋白純化儀恒流栗的轉(zhuǎn)速為2ml/min，凝 膠過濾層析柱的柱壓為0.3MPa;用50ml的含0.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液進(jìn)行 洗脫，然后再用25ml含0.5M NaCl的pH2.5的50mM的甘氨酸溶液進(jìn)行洗脫，采用部分收集器 對洗脫液進(jìn)行收集，每管收集3-5mL，并用紫外檢測設(shè)備對收集的洗脫液進(jìn)行檢測，出現(xiàn)凝 血因子VIII洗脫峰的洗脫液即為凝血因子VIII粗品；
[0018] (4)用pH8.8的0.1M TriS-HC1溶液將凝血因子VIII粗品的pH值調(diào)節(jié)至pH5.0-pH7.0之間，然后再用0.02M pH7.2的PBS緩沖液作為透析液對其進(jìn)行透析處理，透析處理時 透析液與凝血因子VIII粗品的體積比為10:1，每次透析時間為4h，連續(xù)透析6次;透析處理 后既得到純化的凝血因子VIII，即凝血因子VIII純品。
[0019] 根據(jù)上述的利用肽配基親和純化凝血因子VIII的方法，步驟a中所述多肽為 GCVSGCLCWEYC、RKWNCTDHEYC和EYCPC按摩爾比1:1:1混合后得到的混合物。
[0020] 根據(jù)上述的利用肽配基親和純化凝血因子VIII的方法，步驟b中所述的瓊脂糖凝 膠為瓊脂糖凝膠微球。
[0021] 根據(jù)上述的利用肽配基親和純化凝血因子VIII的方法，所述瓊脂糖微球優(yōu)選為 S印harose CL-4B即瓊脂糖凝膠CL-4B〇
[0022] 本發(fā)明取得的積極有益效果：
[0023] (1)本發(fā)明的方法有效避免了冷沉淀制劑回收凝血因子VIII比活不確定、純度較 低等問題，同時也解決了離子層析法對工藝條件要求較高及單克隆抗體親和層析制備容易 造成單抗親和層析中鼠類蛋白的污染問題，豐富了凝血因子VIII的純化方法，有效提高原 料血漿的利用率。
[0024] (2)本發(fā)明采用肽配基理性設(shè)計篩選出了能夠與人凝血因子珊的特異性親和的肽 配基，選用該肽配基作為親和基質(zhì)，并將該特異性的肽配基固定在載體上，實現(xiàn)了凝血因子 VI的快速、特異、尚效純化;并且該妝配基未和效率尚、廉價、易于制備，因此，利用本發(fā)明的 方法可以實現(xiàn)凝血因子珊的規(guī)模化純化與制備。
[0025] (3)與藥典中所述的冷沉淀法相比，采用本發(fā)明的方法，凝血因子珊的得率平均提 高了 41.8%，比活平均提高了 58.5%;而且，采用本發(fā)明的純化方法不僅可以有效降低上清 中其他人凝血因子及纖維結(jié)合蛋白的量，還避免了 Al3+的引入，從而增加凝血因子VI的臨床 靜脈注射安全性，克服了傳統(tǒng)方法存在的凝血因子珊得率低、比活低的難題。分別采用冷沉 淀法與本發(fā)明方法對三批原料進(jìn)行實驗，其對比結(jié)果見表1。
[0026]表1本發(fā)明方法與冷沉淀法純化凝血因子珊的結(jié)果比較

【具體實施方式】
[0028]以下通過具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但并不限定本發(fā)明的保護(hù)范 圍。
[0029] 實施例1:
[0030] -種利用肽配基親和純化凝血因子VIII的方法，包括以下步驟：
[0031] (1)純化用親和層析樹脂的制備：
[0032] a、肽配基溶液的配制：稱取2.8μπι〇1肽配基溶于0.8ml雙蒸水中，攪拌至肽配基完 全溶解，得到肽配基溶液;其中，所述的肽配基為能與凝血因子VIII發(fā)生親和反應(yīng)的多肽； 所述多肽為GCVSGCLCWEYC;
[0033] b、瓊脂糖凝膠預(yù)處理:量取8ml保存于20%乙醇水溶液中的S印harose CL-4B即瓊 脂糖凝膠CL-4B，采用過量蒸餾水對瓊脂糖凝膠CL-4B進(jìn)行反復(fù)洗滌，除去瓊脂糖凝膠CL-4B 表面的乙醇，得到濕瓊脂糖凝膠CL-4B;
[0034] c、將經(jīng)過步驟b處理后得到的濕瓊脂糖凝膠CL-4B裝入離心管中，向離心管中加入 20ml預(yù)冷的ImM HC1，振蕩混合均勻后在4°C靜置8min;然后在4°C3000rpm離心4min，棄上 清，得到沉淀；向沉淀中加入25ml去離子水，振蕩混合均勻后在4°C靜置8min;然后在4°C 3000rpm離心4min，棄上清，得到凝膠沉淀；向凝膠沉淀中加入0.8ml步驟a配制的肽配基溶 液和8ml去離子水，振蕩混合均勾，再加入0.8ml 5mg/ml的碳二亞胺溶液，振蕩混合均勾后 在室溫下lOOrpm反應(yīng)3.5h;
[0035] d、反應(yīng)結(jié)束后，向步驟c的反應(yīng)液中加入0.5ml冰乙酸，振蕩混合均勻，在室溫下 lOOrpm繼續(xù)反應(yīng)lh;
[0036] e、反應(yīng)結(jié)束后，向步驟d的反應(yīng)液中加入0.8ml含20 %哌啶的二甲基甲酰胺溶液， 振蕩混合均勻，在室溫下lOOrpm繼續(xù)反應(yīng)7min，收集反應(yīng)產(chǎn)物；
[0037] f、用100ml 5mmol/L pH4.4的醋酸-醋酸鈉緩沖液對步驟e得到的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行洗 滌；然后再分別用〇.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液和含0.5M NaCl的20mM pH4.4醋 酸-醋酸鈉緩沖液各20ml對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行交替洗滌3次；
[0038] g、將經(jīng)過步驟f處理后的反應(yīng)產(chǎn)物用100ml去離子水進(jìn)行洗滌，然后再用50ml 20%的乙醇水溶液洗滌，洗滌結(jié)束后，即得到純化用親和層析樹脂;將純化用親和層析樹脂 4 °C保存在20 %的乙醇水溶液中，備用；
[0039] (2)將步驟(1)制備得到的純化用親和層析樹脂裝入凝膠過濾層析柱中，然后向凝 膠過濾層析柱上加入0.02M PBS緩沖液進(jìn)行洗滌處理，洗滌至流出液的pH值與0.02M PBS緩 沖液相同時，停止洗滌；
[0040] (3)將待純化的血清或血漿用0.02M PBS緩沖液稀釋4倍，然后用蛋白純化儀將稀 釋后的血清或血漿栗入凝膠過濾層析柱中，控制蛋白純化儀恒流栗的轉(zhuǎn)速為2ml/min，凝膠 過濾層析柱的柱壓為0.3MPa;用50ml的含0.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液進(jìn)行洗 脫，然后再用25ml含0.5M NaCl的pH2.5的50mM的甘氨酸溶液進(jìn)行洗脫，采用部分收集器對 洗脫液進(jìn)行收集，每管收集3mL，并用紫外檢測設(shè)備對收集的洗脫液進(jìn)行檢測，出現(xiàn)凝血因 子VIII洗脫峰的洗脫液即為凝血因子VIII粗品；
[0041 ] (4)用pH8.8的0.1M Tris-HCl溶液將凝血因子VIII粗品的pH值調(diào)節(jié)至pH5.0- pH7.0之間，然后再用0.02M pH7.2的PBS緩沖液作為透析液對其進(jìn)行透析處理，透析處理時 透析液與凝血因子VIII粗品的體積比為10:1，每次透析時間為4h，連續(xù)透析6次;透析處理 后既得到純化的凝血因子VIII，即凝血因子VIII純品。
[0042] 實施例2:
[0043] -種利用肽配基親和純化凝血因子VIII的方法，包括以下步驟：
[0044] (1)純化用親和層析樹脂的制備：
[0045] a、肽配基溶液的配制：稱取3.Ομπιο?肽配基溶于lml雙蒸水中，攪拌至肽配基完全 溶解，得到肽配基溶液;其中，所述的肽配基為能與凝血因子VIII發(fā)生親和反應(yīng)的多肽;所 述多肽為RKWNCTDHEYC;
[0046] b、瓊脂糖凝膠預(yù)處理:量取10ml保存于20%乙醇水溶液中的Sepharose CL-4B即 瓊脂糖凝膠CL-4B，采用過量蒸餾水對瓊脂糖凝膠CL-4B進(jìn)行反復(fù)洗滌，除去瓊脂糖凝膠CL-4B表面的乙醇，得到濕瓊脂糖凝膠CL-4B;
[0047] c、將經(jīng)過步驟b處理后得到的濕瓊脂糖凝膠CL-4B裝入離心管中，向離心管中加入 25ml預(yù)冷的ImM HC1，振蕩混合均勻后在4°C靜置lOmin;然后在4°C3000rpm離心6min，棄上 清，得到沉淀；向沉淀中加入30ml去離子水，振蕩混合均勻后在4°C靜置1 Omin;然后在4°C 3000rpm離心5min，棄上清，得到凝膠沉淀；向凝膠沉淀中加入lml步驟a配制的肽配基溶液 和10ml去離子水，振蕩混合均勾，再加入lml 5mg/ml的碳二亞胺溶液，振蕩混合均勾后在室 溫下lOOrpm反應(yīng)4h;
[0048] d、反應(yīng)結(jié)束后，向步驟c的反應(yīng)液中加入0.8ml冰乙酸，振蕩混合均勻，在室溫下 100印111繼續(xù)反應(yīng)1.211;
[0049] e、反應(yīng)結(jié)束后，向步驟d的反應(yīng)液中加入lml含20%哌啶的二甲基甲酰胺溶液，振 蕩混合均勻，在室溫下lOOrpm繼續(xù)反應(yīng)10min，收集反應(yīng)產(chǎn)物；
[0050] f、用120ml 5mmol/L PH4.4的醋酸-醋酸鈉緩沖液對步驟e得到的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行洗 滌；然后再分別用〇.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液和含0.5M NaCl的20mM pH4.4醋 酸-醋酸鈉緩沖液各25ml對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行交替洗滌3次；
[0051 ] g、將經(jīng)過步驟f處理后的反應(yīng)產(chǎn)物用120ml去離子水進(jìn)行洗滌，然后再用80ml 20%的乙醇水溶液洗滌，洗滌結(jié)束后，即得到純化用親和層析樹脂;將純化用親和層析樹脂 4 °C保存在20 %的乙醇水溶液中，備用；
[0052] (2)將步驟(1)制備得到的純化用親和層析樹脂裝入凝膠過濾層析柱中，然后向凝 膠過濾層析柱上加入0.02M PBS緩沖液進(jìn)行洗滌處理，洗滌至流出液的pH值與0.02M PBS緩 沖液相同時，停止洗滌；
[0053] (3)將待純化的血清或血漿用0.02M PBS緩沖液稀釋5倍，然后用蛋白純化儀將稀 釋后的血清或血漿栗入凝膠過濾層析柱中，控制蛋白純化儀恒流栗的轉(zhuǎn)速為2ml/min，凝膠 過濾層析柱的柱壓為0.3MPa;用50ml的含0.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液進(jìn)行洗 脫，然后再用25ml含0.5M NaCl的pH2.5的50mM的甘氨酸溶液進(jìn)行洗脫，采用部分收集器對 洗脫液進(jìn)行收集，每管收集5mL，并用紫外檢測設(shè)備對收集的洗脫液進(jìn)行檢測，出現(xiàn)凝血因 子VIII洗脫峰的洗脫液即為凝血因子VIII粗品；
[0054] (4)用pH8.8的0.1M Tris-HCl溶液將凝血因子VIII粗品的pH值調(diào)節(jié)至pH5.0- pH7.0之間，然后再用0.02M pH7.2的PBS緩沖液作為透析液對其進(jìn)行透析處理，透析處理時 透析液與凝血因子VIII粗品的體積比為10:1，每次透析時間為4h，連續(xù)透析6次;透析處理 后既得到純化的凝血因子VIII，即凝血因子VIII純品。
[0055] 實施例3:
[0056] -種利用肽配基親和純化凝血因子VIII的方法，包括以下步驟：
[0057] (1)純化用親和層析樹脂的制備：
[0058] a、肽配基溶液的配制：稱取3.2μπι〇1肽配基溶于2ml雙蒸水中，攪拌至肽配基完全 溶解，得到肽配基溶液;其中，所述的肽配基為能與凝血因子VIII發(fā)生親和反應(yīng)的多肽;所 述多肽為EYCPC;
[0059] b、瓊脂糖凝膠預(yù)處理:量取12ml保存于20%乙醇水溶液中的Sepharose CL-4B即 瓊脂糖凝膠CL-4B，采用過量蒸餾水對瓊脂糖凝膠CL-4B進(jìn)行反復(fù)洗滌，除去瓊脂糖凝膠CL-4B表面的乙醇，得到濕瓊脂糖凝膠CL-4B;
[0060] C、將經(jīng)過步驟b處理后得到的濕瓊脂糖凝膠CL-4B裝入離心管中，向離心管中加入 25ml預(yù)冷的ImM HC1，振蕩混合均勻后在4°C靜置12min;然后在4°C3000rpm離心8min，棄上 清，得到沉淀；向沉淀中加入35ml去離子水，振蕩混合均勻后在4°C靜置12min;然后在4°C 3000rpm離心8min，棄上清，得到凝膠沉淀；向凝膠沉淀中加入1.5ml步驟a配制的肽配基溶 液和12ml去離子水，振蕩混合均勾，再加入1.2ml 5mg/ml的碳二亞胺溶液，振蕩混合均勾后 在室溫下lOOrpm反應(yīng)5h;
[00611 d、反應(yīng)結(jié)束后，向步驟c的反應(yīng)液中加入1ml冰乙酸，振蕩混合均勻，在室溫下 lOOrpm繼續(xù)反應(yīng)1 · 5h;
[0062] e、反應(yīng)結(jié)束后，向步驟d的反應(yīng)液中加入1.5ml含20 %哌啶的二甲基甲酰胺溶液， 振蕩混合均勻，在室溫下lOOrpm繼續(xù)反應(yīng)9min，收集反應(yīng)產(chǎn)物；
[0063] f、用150ml 5mmol/L pH4.4的醋酸-醋酸鈉緩沖液對步驟e得到的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行洗 滌；然后再分別用〇.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液和含0.5M NaCl的20mM pH4.4醋 酸-醋酸鈉緩沖液各30ml對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行交替洗滌3次；
[0064] g、將經(jīng)過步驟f處理后的反應(yīng)產(chǎn)物用150ml去離子水進(jìn)行洗滌，然后再用100ml 20%的乙醇水溶液洗滌，洗滌結(jié)束后，即得到純化用親和層析樹脂;將純化用親和層析樹脂 4 °C保存在20 %的乙醇水溶液中，備用；
[0065] (2)將步驟(1)制備得到的純化用親和層析樹脂裝入凝膠過濾層析柱中，然后向凝 膠過濾層析柱上加入0.02M PBS緩沖液進(jìn)行洗滌處理，洗滌至流出液的pH值與0.02M PBS緩 沖液相同時，停止洗滌；
[0066] (3)將待純化的血清或血漿用0.02M PBS緩沖液稀釋6倍，然后用蛋白純化儀將稀 釋后的血清或血漿栗入凝膠過濾層析柱中，控制蛋白純化儀恒流栗的轉(zhuǎn)速為2ml/min，凝膠 過濾層析柱的柱壓為0.3MPa;用50ml的含0.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液進(jìn)行洗 脫，然后再用25ml含0.5M NaCl的pH2.5的50mM的甘氨酸溶液進(jìn)行洗脫，采用部分收集器對 洗脫液進(jìn)行收集，每管收集4mL，并用紫外檢測設(shè)備對收集的洗脫液進(jìn)行檢測，出現(xiàn)凝血因 子VIII洗脫峰的洗脫液即為凝血因子VIII粗品；
[0067] (4)用pH8.8的0.1M Tris-HCl溶液將凝血因子VIII粗品的pH值調(diào)節(jié)至pH5.0- pH7.0之間，然后再用0.02M pH7.2的PBS緩沖液作為透析液對其進(jìn)行透析處理，透析處理時 透析液與凝血因子VIII粗品的體積比為10:1，每次透析時間為4h，連續(xù)透析6次;透析處理 后既得到純化的凝血因子VIII，即凝血因子VIII純品。
[0068] 實施例4:
[0069] -種利用肽配基親和純化凝血因子VIII的方法，包括以下步驟：
[0070] (1)純化用親和層析樹脂的制備：
[0071] a、肽配基溶液的配制：稱取3.Ομπιο?肽配基溶于1.5ml雙蒸水中，攪拌至肽配基完 全溶解，得到肽配基溶液;其中，所述的肽配基為能與凝血因子VIII發(fā)生親和反應(yīng)的多肽； 所述多肽為GCVSGCLCWEYC、RKWNCTDHEYC和EYCPC按摩爾比1:1:1混合后得到的混合物；
[0072] b、瓊脂糖凝膠預(yù)處理:量取12ml保存于20%乙醇水溶液中的Sepharose CL-4B即 瓊脂糖凝膠CL-4B，采用過量蒸餾水對瓊脂糖凝膠CL-4B進(jìn)行反復(fù)洗滌，除去瓊脂糖凝膠CL- 4B表面的乙醇，得到濕瓊脂糖凝膠CL-4B;
[0073] c、將經(jīng)過步驟b處理后得到的濕瓊脂糖凝膠CL-4B裝入離心管中，向離心管中加入 25ml預(yù)冷的ImM HC1，振蕩混合均勻后在4°C靜置12min;然后在4°C3000rpm離心8min，棄上 清，得到沉淀；向沉淀中加入35ml去離子水，振蕩混合均勻后在4°C靜置12min;然后在4°C 3000rpm離心8min，棄上清，得到凝膠沉淀；向凝膠沉淀中加入2ml步驟a配制的肽配基溶液 和15ml去離子水，振蕩混合均勾，再加入1.5ml 5mg/ml的碳二亞胺溶液，振蕩混合均勾后在 室溫下lOOrpm反應(yīng)5h;
[0074] d、反應(yīng)結(jié)束后，向步驟c的反應(yīng)液中加入1ml冰乙酸，振蕩混合均勻，在室溫下 lOOrpm繼續(xù)反應(yīng)1 · 5h;
[0075] e、反應(yīng)結(jié)束后，向步驟d的反應(yīng)液中加入1.5ml含20 %哌啶的二甲基甲酰胺溶液， 振蕩混合均勻，在室溫下lOOrpm繼續(xù)反應(yīng)lOmin，收集反應(yīng)產(chǎn)物；
[0076] f、用150ml 5mmol/L pH4.4的醋酸-醋酸鈉緩沖液對步驟e得到的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行洗 滌；然后再分別用〇.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液和含0.5M NaCl的20mM pH4.4醋 酸-醋酸鈉緩沖液各30ml對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行交替洗滌3次；
[0077] g、將經(jīng)過步驟f處理后的反應(yīng)產(chǎn)物用150ml去離子水進(jìn)行洗滌，然后再用100ml 20%的乙醇水溶液洗滌，洗滌結(jié)束后，即得到純化用親和層析樹脂;將純化用親和層析樹脂 4 °C保存在20 %的乙醇水溶液中，備用；
[0078] (2)將步驟(1)制備得到的純化用親和層析樹脂裝入凝膠過濾層析柱中，然后向凝 膠過濾層析柱上加入0.02M PBS緩沖液進(jìn)行洗滌處理，洗滌至流出液的pH值與0.02M PBS緩 沖液相同時，停止洗滌；
[0079] (3)將待純化的血清或血漿用0.02M PBS緩沖液稀釋5倍，然后用蛋白純化儀將稀 釋后的血清或血漿栗入凝膠過濾層析柱中，控制蛋白純化儀恒流栗的轉(zhuǎn)速為2ml/min，凝膠 過濾層析柱的柱壓為0.3MPa;用50ml的含0.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液進(jìn)行洗 脫，然后再用25ml含0.5M NaCl的pH2.5的50mM的甘氨酸溶液進(jìn)行洗脫，采用部分收集器對 洗脫液進(jìn)行收集，每管收集5mL，并用紫外檢測設(shè)備對收集的洗脫液進(jìn)行檢測，出現(xiàn)凝血因 子VIII洗脫峰的洗脫液即為凝血因子VIII粗品；
[0080] (4)用pH8.8的0.1M Tris-HCl溶液將凝血因子VIII粗品的pH值調(diào)節(jié)至pH5.0-pH7.0之間，然后再用0.02M pH7.2的PBS緩沖液作為透析液對其進(jìn)行透析處理，透析處理時 透析液與凝血因子VIII粗品的體積比為10:1，每次透析時間為4h，連續(xù)透析6次;透析處理 后既得到純化的凝血因子VIII，即凝血因子VIII純品。
[0081 ] 實施例5:
[0082] -種利用肽配基親和純化凝血因子VIII的方法，包括以下步驟：
[0083] (1)純化用親和層析樹脂的制備：
[0084] a、肽配基溶液的配制：稱取2.8μπι〇1肽配基溶于1.2ml雙蒸水中，攪拌至肽配基完 全溶解，得到肽配基溶液;其中，所述的肽配基為能與凝血因子VIII發(fā)生親和反應(yīng)的多肽； 所述多肽為者GCVSGCLCWEYC、RKWNCTDHEYC和EYCPC按任意比混合后得到的混合物；
[0085] b、瓊脂糖凝膠預(yù)處理:量取10ml保存于20%乙醇水溶液中的Sepharose CL-4B即 瓊脂糖凝膠CL-4B，采用過量蒸餾水對瓊脂糖凝膠CL-4B進(jìn)行反復(fù)洗滌，除去瓊脂糖凝膠CL-4B表面的乙醇，得到濕瓊脂糖凝膠CL-4B;
[0086] c、將經(jīng)過步驟b處理后得到的濕瓊脂糖凝膠CL-4B裝入離心管中，向離心管中加入 25ml預(yù)冷的ImM HC1，振蕩混合均勻后在4°C靜置lOmin;然后在4°C3000rpm離心5min，棄上 清，得到沉淀；向沉淀中加入30ml去離子水，振蕩混合均勻后在4°C靜置1 Omin;然后在4°C 3000rpm離心5min，棄上清，得到凝膠沉淀；向凝膠沉淀中加入1.5ml步驟a配制的肽配基溶 液和12ml去離子水，振蕩混合均勾，再加入1.5ml 5mg/ml的碳二亞胺溶液，振蕩混合均勾后 在室溫下lOOrpm反應(yīng)5h;
[0087] d、反應(yīng)結(jié)束后，向步驟c的反應(yīng)液中加入0.8ml冰乙酸，振蕩混合均勻，在室溫下 lOOrpm繼續(xù)反應(yīng)lh;
[0088] e、反應(yīng)結(jié)束后，向步驟d的反應(yīng)液中加入1.2ml含20 %哌啶的二甲基甲酰胺溶液， 振蕩混合均勻，在室溫下lOOrpm繼續(xù)反應(yīng)lOmin，收集反應(yīng)產(chǎn)物；
[0089] f、用120ml 5mmol/L pH4.4的醋酸-醋酸鈉緩沖液對步驟e得到的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行洗 滌；然后再分別用〇.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液和含0.5M NaCl的20mM pH4.4醋 酸-醋酸鈉緩沖液各20ml對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行交替洗滌3次；
[0090] g、將經(jīng)過步驟f處理后的反應(yīng)產(chǎn)物用140ml去離子水進(jìn)行洗滌，然后再用50ml 20%的乙醇水溶液洗滌，洗滌結(jié)束后，即得到純化用親和層析樹脂;將純化用親和層析樹脂 4 °C保存在20 %的乙醇水溶液中，備用；
[0091] (2)將步驟(1)制備得到的純化用親和層析樹脂裝入凝膠過濾層析柱中，然后向凝 膠過濾層析柱上加入0.02M PBS緩沖液進(jìn)行洗滌處理，洗滌至流出液的pH值與0.02M PBS緩 沖液相同時，停止洗滌；
[0092] (3)將待純化的血清或血漿用0.02M PBS緩沖液稀釋4倍，然后用蛋白純化儀將稀 釋后的血清或血漿栗入凝膠過濾層析柱中，控制蛋白純化儀恒流栗的轉(zhuǎn)速為2ml/min，凝膠 過濾層析柱的柱壓為0.3MPa;用50ml的含0.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液進(jìn)行洗 脫，然后再用25ml含0.5M NaCl的pH2.5的50mM的甘氨酸溶液進(jìn)行洗脫，采用部分收集器對 洗脫液進(jìn)行收集，每管收集3mL，并用紫外檢測設(shè)備對收集的洗脫液進(jìn)行檢測，出現(xiàn)凝血因 子VIII洗脫峰的洗脫液即為凝血因子VIII粗品；
[0093] (4)用pH8.8的0.1M Tris-HCl溶液將凝血因子VIII粗品的pH值調(diào)節(jié)至pH5.0- pH7.0之間，然后再用0.02M pH7.2的PBS緩沖液作為透析液對其進(jìn)行透析處理，透析處理時 透析液與凝血因子VIII粗品的體積比為10:1，每次透析時間為4h，連續(xù)透析6次;透析處理 后既得到純化的凝血因子VIII，即凝血因子VIII純品。
[0094] 實施例6:
[0095] -種利用肽配基親和純化凝血因子VIII的方法，包括以下步驟：
[0096] (1)純化用親和層析樹脂的制備：
[0097] a、肽配基溶液的配制：稱取3.2μπι〇1肽配基溶于1.5ml雙蒸水中，攪拌至肽配基完 全溶解，得到肽配基溶液;其中，所述的肽配基為能與凝血因子VIII發(fā)生親和反應(yīng)的多肽； 所述多肽為GCVSGCLCWEYC;
[0098] 13、瓊脂糖凝膠預(yù)處理:量取81111保存于20%乙醇水溶液中的5印1^仰此（^-48即瓊 脂糖凝膠CL-4B，采用過量蒸餾水對瓊脂糖凝膠CL-4B進(jìn)行反復(fù)洗滌，除去瓊脂糖凝膠CL-4B 表面的乙醇，得到濕瓊脂糖凝膠CL-4B;
[0099] c、將經(jīng)過步驟b處理后得到的濕瓊脂糖凝膠CL-4B裝入離心管中，向離心管中加入 20ml預(yù)冷的ImM HC1，振蕩混合均勻后在4°C靜置12min;然后在4°C3000rpm離心4min，棄上 清，得到沉淀；向沉淀中加入25ml去離子水，振蕩混合均勻后在4°C靜置12min;然后在4°C 3000rpm離心4min，棄上清，得到凝膠沉淀；向凝膠沉淀中加入2ml步驟a配制的肽配基溶液 和10ml去離子水，振蕩混合均勾，再加入1.0ml 5mg/ml的碳二亞胺溶液，振蕩混合均勾后在 室溫下lOOrpm反應(yīng)3.5h;
[0100] d、反應(yīng)結(jié)束后，向步驟c的反應(yīng)液中加入0.6ml冰乙酸，振蕩混合均勻，在室溫下 lOOrpm繼續(xù)反應(yīng)lh;
[0101] e、反應(yīng)結(jié)束后，向步驟d的反應(yīng)液中加入1.0ml含20 %哌啶的二甲基甲酰胺溶液， 振蕩混合均勻，在室溫下lOOrpm繼續(xù)反應(yīng)8min，收集反應(yīng)產(chǎn)物；
[0102] f、用100ml 5mmol/L PH4.4的醋酸-醋酸鈉緩沖液對步驟e得到的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行洗 滌；然后再分別用〇.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液和含0.5M NaCl的20mM pH4.4醋 酸-醋酸鈉緩沖液各30ml對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行交替洗滌3次；
[0103] g、將經(jīng)過步驟f處理后的反應(yīng)產(chǎn)物用150ml去離子水進(jìn)行洗滌，然后再用80ml 20%的乙醇水溶液洗滌，洗滌結(jié)束后，即得到純化用親和層析樹脂;將純化用親和層析樹脂 4 °C保存在20 %的乙醇水溶液中，備用；
[0104] (2)將步驟(1)制備得到的純化用親和層析樹脂裝入凝膠過濾層析柱中，然后向凝 膠過濾層析柱上加入0.02M PBS緩沖液進(jìn)行洗滌處理，洗滌至流出液的pH值與0.02M PBS緩 沖液相同時，停止洗滌；
[0105] (3)將待純化的血清或血漿用0.02M PBS緩沖液稀釋4倍，然后用蛋白純化儀將稀 釋后的血清或血漿栗入凝膠過濾層析柱中，控制蛋白純化儀恒流栗的轉(zhuǎn)速為2ml/min，凝膠 過濾層析柱的柱壓為0.3MPa;用50ml的含0.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液進(jìn)行洗 脫，然后再用25ml含0.5M NaCl的pH2.5的50mM的甘氨酸溶液進(jìn)行洗脫，采用部分收集器對 洗脫液進(jìn)行收集，每管收集5mL，并用紫外檢測設(shè)備對收集的洗脫液進(jìn)行檢測，出現(xiàn)凝血因 子VIII洗脫峰的洗脫液即為凝血因子VIII粗品；
[0106] (4)用pH8.8的0.1M TriS-HC1溶液將凝血因子VIII粗品的pH值調(diào)節(jié)至pH5.0-pH7.0之間，然后再用0.02M pH7.2的PBS緩沖液作為透析液對其進(jìn)行透析處理，透析處理時 透析液與凝血因子VIII粗品的體積比為10:1，每次透析時間為4h，連續(xù)透析6次;透析處理 后既得到純化的凝血因子VIII，即凝血因子VIII純品。
[0107] 實施例7:
[0108] -種利用肽配基親和純化凝血因子VIII的方法，包括以下步驟：
[0109] (1)純化用親和層析樹脂的制備：
[0110] a、肽配基溶液的配制：稱取3.2μπι〇1肽配基溶于1.0ml雙蒸水中，攪拌至肽配基完 全溶解，得到肽配基溶液;其中，所述的肽配基為能與凝血因子VIII發(fā)生親和反應(yīng)的多肽； 所述多肽為GCVSGCLCWEYC、RKWNCTDHEYC和EYCPC按摩爾比1:1:1混合后得到的混合物；
[0111] b、瓊脂糖凝膠預(yù)處理:量取12ml保存于20%乙醇水溶液中的Sepharose CL-4B即 瓊脂糖凝膠CL-4B，采用過量蒸餾水對瓊脂糖凝膠CL-4B進(jìn)行反復(fù)洗滌，除去瓊脂糖凝膠CL-4B表面的乙醇，得到濕瓊脂糖凝膠CL-4B;
[0112] c、將經(jīng)過步驟b處理后得到的濕瓊脂糖凝膠CL-4B裝入離心管中，向離心管中加入 20ml預(yù)冷的ImM HC1，振蕩混合均勻后在4°C靜置lOmin;然后在4°C3000rpm離心6min，棄上 清，得到沉淀；向沉淀中加入25ml去離子水，振蕩混合均勻后在4°C靜置lOmin;然后在4°C 3000rpm離心6min，棄上清，得到凝膠沉淀；向凝膠沉淀中加入2ml步驟a配制的肽配基溶液 和10ml去離子水，振蕩混合均勾，再加入1.0ml 5mg/ml的碳二亞胺溶液，振蕩混合均勾后在 室溫下lOOrpm反應(yīng)4h;
[0113] d、反應(yīng)結(jié)束后，向步驟c的反應(yīng)液中加入0.6ml冰乙酸，振蕩混合均勻，在室溫下 lOOrpm繼續(xù)反應(yīng)1 · 5h;
[0114] e、反應(yīng)結(jié)束后，向步驟d的反應(yīng)液中加入1.0ml含20 %哌啶的二甲基甲酰胺溶液， 振蕩混合均勻，在室溫下lOOrpm繼續(xù)反應(yīng)8min，收集反應(yīng)產(chǎn)物；
[0115] f、用100ml 5mmol/L pH4.4的醋酸-醋酸鈉緩沖液對步驟e得到的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行洗 滌；然后再分別用〇.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液和含0.5M NaCl的20mM pH4.4醋 酸-醋酸鈉緩沖液各30ml對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行交替洗滌3次；
[0116] g、將經(jīng)過步驟f處理后的反應(yīng)產(chǎn)物用150ml去離子水進(jìn)行洗滌，然后再用80ml 20%的乙醇水溶液洗滌，洗滌結(jié)束后，即得到純化用親和層析樹脂;將純化用親和層析樹脂 4 °C保存在20 %的乙醇水溶液中，備用；
[0117] (2)將步驟(1)制備得到的純化用親和層析樹脂裝入凝膠過濾層析柱中，然后向凝 膠過濾層析柱上加入0.02M PBS緩沖液進(jìn)行洗滌處理，洗滌至流出液的pH值與0.02M PBS緩 沖液相同時，停止洗滌；
[0118] (3)將待純化的血清或血漿用0.02M PBS緩沖液稀釋4倍，然后用蛋白純化儀將稀 釋后的血清或血漿栗入凝膠過濾層析柱中，控制蛋白純化儀恒流栗的轉(zhuǎn)速為2ml/min，凝膠 過濾層析柱的柱壓為0.3MPa;用50ml的含0.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液進(jìn)行洗 脫，然后再用25ml含0.5M NaCl的pH2.5的50mM的甘氨酸溶液進(jìn)行洗脫，采用部分收集器對 洗脫液進(jìn)行收集，每管收集5mL，并用紫外檢測設(shè)備對收集的洗脫液進(jìn)行檢測，出現(xiàn)凝血因 子VIII洗脫峰的洗脫液即為凝血因子VIII粗品；
[0119] (4)用pH8.8的0.1M Tris-HCl溶液將凝血因子VIII粗品的pH值調(diào)節(jié)至pH5.0-pH7.0之間，然后再用0.02M pH7.2的PBS緩沖液作為透析液對其進(jìn)行透析處理，透析處理時 透析液與凝血因子VIII粗品的體積比為10:1，每次透析時間為4h，連續(xù)透析6次;透析處理 后既得到純化的凝血因子VIII，即凝血因子VIII純品。
【主權(quán)項】
1. 一種利用肽配基親和純化凝血因子VIII的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 純化用親和層析樹脂的制備： a、 肽配基溶液的配制：稱取2.8-3.2μπι〇1肽配基溶于0.8-2ml雙蒸水中，攪拌至肽配基 完全溶解，得到肽配基溶液;其中，所述的肽配基為能與凝血因子VIII發(fā)生親和反應(yīng)的多 肽；所述多肽為EYCPC、GCVSGCLCWEYC和RKWNCTDHEYC中的任意一種或者EYCPC、 GCVSGCLCWEYC和RKWNCTDHEYC按任意比混合后得到的混合物； b、 瓊脂糖凝膠預(yù)處理:量取8-12ml保存于20%乙醇水溶液中的瓊脂糖凝膠，采用過量 蒸餾水對瓊脂糖凝膠進(jìn)行反復(fù)洗滌，除去瓊脂糖凝膠表面的乙醇，得到濕瓊脂糖凝膠； c、 將經(jīng)過步驟b處理后得到的濕瓊脂糖凝膠裝入離心管中，向離心管中加入20-25ml預(yù) 冷的ImM HC1，振蕩混合均勻后在4°C靜置8-12min;然后在4°C3000rpm離心4-8min，棄上清， 得到沉淀；向沉淀中加入25-35ml去離子水，振蕩混合均勻后在4°C靜置8-12min;然后在4°C 3000rpm離心4-8min，棄上清，得到凝膠沉淀；向凝膠沉淀中加入0.8-2ml步驟a配制的肽配 基溶液和8-151111去離子水，振蕩混合均勻，再加入0.8-1.5111151^/1111的碳二亞胺溶液，振蕩 混合均勻后在室溫下lOOrpm反應(yīng)3.5-5h; d、 反應(yīng)結(jié)束后，向步驟c的反應(yīng)液中加入0.5 -1 m 1冰乙酸，振蕩混合均勻，在室溫下 lOOrpm 繼續(xù)反應(yīng) 1-1 · 5h; e、 反應(yīng)結(jié)束后，向步驟d的反應(yīng)液中加入0.8-1.5ml含20 %哌啶的二甲基甲酰胺溶液， 振蕩混合均勻，在室溫下lOOrpm繼續(xù)反應(yīng)7-10min，收集反應(yīng)產(chǎn)物； f、 用100-150ml 5mmol/L pH4.4的醋酸-醋酸鈉緩沖液對步驟e得到的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行洗 滌；然后再分別用〇.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液和含0.5M NaCl的20mM pH4.4醋 酸-醋酸鈉緩沖液各20_30ml對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行交替洗滌3次； g、 將經(jīng)過步驟f處理后的反應(yīng)產(chǎn)物用100-150ml去離子水進(jìn)行洗滌，然后再用50-100ml 20%的乙醇水溶液洗滌，洗滌結(jié)束后，即得到純化用親和層析樹脂;將純化用親和層析樹脂 4 °C保存在20 %的乙醇水溶液中，備用； (2) 將步驟(1)制備得到的純化用親和層析樹脂裝入凝膠過濾層析柱中，然后向凝膠過 濾層析柱上加入0.02M PBS緩沖液進(jìn)行洗滌處理，洗滌至流出液的pH值與0.02M PBS緩沖液 相同時，停止洗滌； (3) 將待純化的血清或血漿用0.02M PBS緩沖液稀釋4-6倍，然后用蛋白純化儀將稀釋 后的血清或血漿栗入凝膠過濾層析柱中，控制蛋白純化儀恒流栗的轉(zhuǎn)速為2ml/min，凝膠過 濾層析柱的柱壓為0.3MPa;用50ml的含0.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液進(jìn)行洗脫， 然后再用25ml含0.5M NaCl的pH2.5的50mM的甘氨酸溶液進(jìn)行洗脫，采用部分收集器對洗脫 液進(jìn)行收集，每管收集3_5mL，并用紫外檢測設(shè)備對收集的洗脫液進(jìn)行檢測，出現(xiàn)凝血因子 VIII洗脫峰的洗脫液即為凝血因子VIII粗品； (4) 用pH8 · 8的0 · 1M Tris-HCl溶液將凝血因子VIII粗品的pH值調(diào)節(jié)至ρΗ5 ·0-pH7 · 0之 間，然后再用0.02M pH7.2的PBS緩沖液作為透析液對其進(jìn)行透析處理，透析處理時透析液 與凝血因子VIII粗品的體積比為10:1，每次透析時間為4h，連續(xù)透析6次;透析處理后既得 到純化的凝血因子VIII，即凝血因子VIII純品。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用肽配基親和純化凝血因子VIII的方法，其特征在于，步驟 a中所述多肽為GCVSGCLCWEYC、RKWNCTDHEYC和EYCPC按摩爾比1:1:1混合后得到的混合物。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用肽配基親和純化凝血因子VIII的方法，其特征在于，步驟 b中所述的瓊脂糖凝膠為瓊脂糖凝膠微球。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用肽配基親和純化凝血因子VIII的方法，其特征在于，所述 瓊脂糖微球為S印harose CL-4B即瓊脂糖凝膠CL-4B。
【文檔編號】C07K1/36GK106046148SQ201610493555
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月27日
【發(fā)明人】陳正躍, 許建文, 陳美光, 王建剛, 段素芳, 高夏歡
【申請人】新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院