一種成纖維細(xì)胞的快速提取方法及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種成纖維細(xì)胞的快速提取方法。包括以下步驟：S1）取離體的腫瘤組織，剪碎，加入膠原酶溶液進(jìn)行消化；S2）轉(zhuǎn)移到離心管中進(jìn)行震蕩、孵育及離心后，取沉淀物放進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；S3）再加入膠原酶溶液進(jìn)行消化，并重復(fù)步驟S2），得到經(jīng)交替消化、培養(yǎng)后的組織結(jié)構(gòu)松散的腫瘤組織；S4）加入胰酶溶液，常溫靜置后加入胎牛血清終止消化，再將懸浮物倒掉，得到胰酶消化后貼壁的腫瘤單細(xì)胞；S5）加入DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)，得到所述腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞。還提供了本發(fā)明提取方法的應(yīng)用，利用本提取方法得到的成纖維細(xì)胞純度非常高，成纖維細(xì)胞高表達(dá)FAP，表達(dá)率為99.2%，適合醫(yī)學(xué)推廣。
【專利說明】
一種成纖維細(xì)胞的快速提取方法及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種成纖維細(xì)胞的快速提取方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CA!7)是腫瘤間質(zhì)中最主要的細(xì)胞成分，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著至關(guān)重要的角色。CAF可以募集內(nèi)皮祖細(xì)胞到腫瘤局部促進(jìn)腫瘤新生血管的生成和腫瘤的生長。這些腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞除了表達(dá)vimentin這一成纖維細(xì)胞的標(biāo)記物外，還特異性表達(dá)FAP、a-SMA，但不表達(dá)CK、desmin，在形態(tài)、功能、蛋白質(zhì)表達(dá)、對(duì)細(xì)胞因子的反應(yīng)性及遺傳學(xué)水平上，它與正常成纖維細(xì)胞(MO存在明顯差異。
[0003]腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞目前是研究熱點(diǎn)之一，很多機(jī)制尚存在爭(zhēng)議，但是普遍認(rèn)為該細(xì)胞與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移侵襲有著密不可分的關(guān)系。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞能分泌趨化因子12(CXCL12)和肝細(xì)胞生長因子(HGH，前者能直接刺激腫瘤細(xì)胞進(jìn)行增殖和轉(zhuǎn)移，后者導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的改變，進(jìn)而造成體內(nèi)上皮細(xì)胞增殖和發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。除此之外，CXCL12和HGF與腫瘤分泌的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)—起影響腫瘤新生血管的生成。以此方式，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞能同時(shí)影響正常上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的旁泌性因子來影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，越來越多的證據(jù)表明腫瘤基質(zhì)中成纖維細(xì)胞的突變往往發(fā)生在癌癥發(fā)展之前。以腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞為靶點(diǎn)的藥物是提高腫瘤治愈率的一種新方法。正是這種固有差異為新藥物的設(shè)計(jì)和治療策略的高度選擇性提供了多種獨(dú)特的靶點(diǎn)。但是在現(xiàn)有的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞提取方法上，不能獲得大量的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，為研究其機(jī)制及作用帶來很大的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于:針對(duì)上述存在的問題，提供一種成纖維細(xì)胞的快速提取方法及應(yīng)用。本發(fā)明的提取方法可以有效、快速提高腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的提取量及純度。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
一種成纖維細(xì)胞的快速提取方法，包括以下步驟:
51)取離體的腫瘤組織，剪碎，然后往剪碎后的腫瘤組織中加入膠原酶溶液進(jìn)行消化，得到膠原酶消化后的腫瘤組織；
52)將所述膠原酶消化后的腫瘤組織轉(zhuǎn)移到離心管中進(jìn)行震蕩、孵育及離心后，取沉淀物放進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，得到組織結(jié)構(gòu)松散的腫瘤組織；
53)再加入膠原酶溶液進(jìn)行消化，并重復(fù)步驟S2)，得到經(jīng)交替消化、培養(yǎng)后的組織結(jié)構(gòu)松散的腫瘤組織；
54)向所述組織結(jié)構(gòu)松散的腫瘤組織中加入胰酶溶液，常溫靜置后加入胎牛血清終止消化，再將懸浮物倒掉，得到胰酶消化后貼壁的腫瘤單細(xì)胞；
55)在所述胰酶消化后貼壁的腫瘤單細(xì)胞中加入DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)，得到所述腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞。
[0006]進(jìn)一步地，在步驟SI)，所述將離體的腫瘤組織剪碎前，還包括將離體的腫瘤組織在PBS中浸泡1-3min，所述PBS的摩爾濃度為0.0 Imo 1/L，所述膠原酶溶液為膠原酶I溶液。
[0007]進(jìn)一步地，在步驟SI)，所述摩爾濃度為0.0lmol/L的PBS的配制方法為:將KCL0.2g^KH2PO4 0.24g、NaCl 8.0g和Na2HPO4 1.44g 溶解于100mL DDH2O中；所述膠原酶I溶液中膠原酶I的質(zhì)量-體積濃度為0.8-1.5mg/mL0
[0008]進(jìn)一步地，在步驟S2)，所述震蕩的頻率為1500-2000rpm，時(shí)間為2-4min;所述孵育為在35-38°C水浴鍋中孵育l_3min;所述震蕩和孵育交替進(jìn)行2-4次。
[0009]進(jìn)一步地，在步驟S2)，所述離心為將孵育后的腫瘤組織于300g下離心5-7 min，棄上清液；向沉淀中加入18-25 mL摩爾濃度為0.01mol/L的PBS，混勻后于300g下離心5-7min，棄上清液;再向沉淀中加入18-25 mL摩爾濃度為0.01mol/L的I3BS,混勻后于300g下離心5-7min，棄上清液，取沉淀物即可。
[0010]進(jìn)一步地，在步驟S2)，所述細(xì)胞培養(yǎng)箱中CO2的體積百分比為6-8%，溫度為35-38°C，培養(yǎng)的時(shí)間為1-3天。
[0011]進(jìn)一步地，在步驟S4)，所述胰酶溶液的配制方法為:將NaCl 7_9g、NaHC03 0.4-0.6g、葡萄糖0.8-1.2g、EDTA 0.2-0.4g及胰酶2.3-2.8g溶解于100mL DDH2O中；所述常溫靜置的時(shí)間為l_2min。
[0012]進(jìn)一步地，在步驟S5)，在進(jìn)行傳代培養(yǎng)之前，還包括用PBS將所述胰酶消化后貼壁的腫瘤單細(xì)胞洗滌2-3次;所述DMEM完全培養(yǎng)基為向DMEM不完全培養(yǎng)基中加入胎牛血清和P/S得到的溶液，其中胎牛血清的體積百分比為10%，P/S的體積百分比為1%。
[0013]本發(fā)明還提供了一種成纖維細(xì)胞的快速提取方法在提取腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的應(yīng)用。
[0014]更進(jìn)一步地，所述腫瘤為實(shí)體瘤，該實(shí)體瘤為肺癌、肝癌、腸癌、前列腺癌、胰腺癌和肺腺癌中的一種或幾種。
[0015]綜上所述，由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是:利用本發(fā)明的成纖維細(xì)胞的快速提取方法得到的成纖維細(xì)胞純度非常高，成纖維細(xì)胞高表達(dá)FAP，表達(dá)率為99.2%。顯微鏡下腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞呈長梭形或星芒狀，胞質(zhì)豐富，嗜酸性，胞核位于胞體中央，圓形或長橢圓形，細(xì)胞呈放射狀或束狀排列，部分細(xì)胞排列紊亂，極性消失，有明顯的交叉重疊現(xiàn)象。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果提示，成纖維細(xì)胞表面能特異性結(jié)合抗FAP單克隆熒光抗體，發(fā)出紅色熒光。實(shí)驗(yàn)證明，可利用本發(fā)明的成纖維細(xì)胞的快速提取方法提取腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，適合醫(yī)學(xué)推廣。
【附圖說明】
[0016]本發(fā)明將通過例子并參照附圖的方式說明，其中:
圖1為從荷瘤小鼠剝離得到的腫瘤組織。
[0017]圖2為剪碎的腫瘤組織。
[0018]圖3為腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)。
[0019]圖4為利用本發(fā)明提取方法得到的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的FAP表達(dá)率。
[0020]圖5為利用本發(fā)明提取方法得到的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)染色的實(shí)
驗(yàn)結(jié)果?！揪唧w實(shí)施方式】
[0021]
本說明書中公開的所有特征，或公開的所有方法或過程中的步驟，除了互相排斥的特征和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。
[0022]本說明書(包括任何附加權(quán)利要求、摘要)中公開的任一特征，除非特別敘述，均可被其他等效或具有類似目的的替代特征加以替換。即，除非特別敘述，每個(gè)特征只是一系列等效或類似特征中的一個(gè)例子而已。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0023]一、實(shí)施例中使用的材料及試劑
眼科剪為大都器械醫(yī)療有限公司產(chǎn)品，型號(hào)為YYJ-PT> 1cm彎剪。該眼科剪頭端寬0.4毫米，尖而不銳。
[0024]人肝癌HepG2細(xì)胞(ATCC，貨號(hào)HB-8065)，公眾可從
【申請(qǐng)人】處獲得該生物材料，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。
[0025]BALB/c裸鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，貨號(hào)401)，公眾可從
【申請(qǐng)人】處獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。
[0026]震蕩器為IKA產(chǎn)品，型號(hào)為VORTXl。
[0027]胎牛血清(FBS)為Gibco公司產(chǎn)品，貨號(hào)10099-141。
[0028]膠原酶I溶液為向DMEM不完全培養(yǎng)基(Gibco公司產(chǎn)品，貨號(hào)11995-065)中加入胎牛血清和P/S(青霉素(索萊寶，貨號(hào)P8420)和鏈霉素(索萊寶，貨號(hào)S8290-5))得到的溶液，其中胎牛血清的體積百分比濃度為10%，P/S的體積百分比濃度為1%; P/S中膠原酶I的濃度為I OOmg/ mL。該膠原酶I溶液中膠原酶I的濃度為lmg/ mL。
[0029]胰酶溶液為向DDH2O中加入NaCl、NaH⑶3、葡萄糖、EDTA和胰酶得到的溶液，其中，NaCl的濃度為8mg/mL，NaHC03的濃度為0.5mg/mL，葡萄糖的濃度為lmg/mL，EDTA的濃度為
0.3mg/ mL，胰酶的濃度為2.5mg/ mL。
[0030]0.01mol/L PBS 的配制方法為:KCL 0.2g, KH2PO4 0.24g，NaCl 8.0g, Na2HPO41.44g 溶解于 I OOOmL DDH2O。
[0031]DMEM完全培養(yǎng)基為向DMEM不完全培養(yǎng)基(Gibco，貨號(hào)11995-065)中加入胎牛血清和P/S(青霉素(索萊寶，貨號(hào)P8420)和鏈霉素(索萊寶，貨號(hào)S8290-5)得到的溶液，其中胎牛血清的體積百分比濃度為10%，P/S的體積百分比濃度為1%。
[0032]二、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的提取
步驟SI):取3只4-5周齡BALB/c裸鼠，每只于右側(cè)腋下皮下接種人肝癌HepG2細(xì)胞，待腫瘤平均體積長至約1.0 X 1.0X 1.0cm3時(shí)，得到荷瘤小鼠。將荷瘤小鼠頸椎脫臼處死后浸泡于75%(體積百分比濃度)的乙醇水溶液中3-5 min，得到消毒后的小鼠；在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用無菌剪刀和無菌鑷子從消毒后的小鼠胸口剪開小鼠皮膚，小心剝離得到腫瘤組織。附圖1為從荷瘤小鼠剝離得到的腫瘤組織。
[0033]用眼科剪稍微剪碎腫瘤組織(此時(shí)的腫瘤組織大小為0.5 X 0.5 X 0.5cm3)，并在
0.01mol/L PBS中浸泡(使腫瘤組織完全浸潤在0.01mol/L PBS中)2min后將其取出，得到浸泡后的腫瘤組織。用眼科剪在無菌平皿上充分剪碎浸泡后的腫瘤組織(此時(shí)的腫瘤組織大小為0.2X0.2X0.2mm3)，在剪碎浸泡后的腫瘤組織的過程中適時(shí)滴加0.0 Imo I /L PBS,保持該腫瘤組織處于濕潤狀態(tài)，得到剪碎的腫瘤組織。附圖2為用眼科剪充分剪碎腫瘤組織得到的剪碎的腫瘤組織。向上述盛有剪碎的腫瘤組織的無菌平皿中滴加膠原酶I溶液，用剪過頭的I mL槍頭吹散腫瘤組織，得到膠原酶1-腫瘤組織混合物。
[0034]上述方法中，所述眼科剪又稱眼科手術(shù)剪、眼用手術(shù)剪，是剪切眼部軟組織用的器械。所述眼科剪可為頭端寬0.4毫米，尖而不銳的眼科剪;所述眼科剪也可為頭端寬1.6毫米的眼科剪。
[0035]步驟S2):把膠原酶1-腫瘤組織混合物轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，然后將該離心管進(jìn)行如下Cl)和C2)的處理，Cl)和C2)交替進(jìn)行3次:
Cl)將盛有膠原酶1-腫瘤組織混合物的50mL離心管在震蕩器上進(jìn)行震蕩3 min，得到震蕩后的膠原酶-腫瘤組織混合物；
C2)將震蕩后的膠原酶-腫瘤組織混合物在37°C水浴鍋中孵育2 min，得到膠原酶消化后的腫瘤組織A。
[0036]將步驟C2)的膠原酶消化后的腫瘤組織A進(jìn)行離心處理:
Cl)將孵育后的膠原酶消化后的腫瘤組織于300g下離心6 min，棄上清液；c2)向步驟cl)的沉淀中加入20 mL 0.01mol/L PBS，混勾后于300g下離心6 min，棄上清液；
c3)向步驟c2)的沉淀中加入20 mL 0.01mol/L PBS，混勾后于300g下離心6 min，棄上清液，得到膠原酶消化后的腫瘤組織。
[0037]將上述膠原酶消化后的腫瘤組織鋪在培養(yǎng)瓶中，加入DMEM完全培養(yǎng)基，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩天，細(xì)胞培養(yǎng)箱中CO2的體積百分比為6-8%，溫度為35-38°C，得到組織結(jié)構(gòu)松散的腫瘤組織。
[0038]步驟S3):再在結(jié)構(gòu)松散的腫瘤組織中加入膠原酶溶液進(jìn)行消化，并重復(fù)步驟S2)，得到經(jīng)交替消化、培養(yǎng)后的組織結(jié)構(gòu)松散的腫瘤組織。
[0039]步驟S4):向組織結(jié)構(gòu)松散的腫瘤組織中加入胰酶溶液，得到胰酶-腫瘤組織混合物，將胰酶-腫瘤組織混合物在在超凈工作臺(tái)上常溫靜置Imin后，加入1mL胎牛血清FBS終止消化，倒掉胰酶腫瘤組織懸液，得到胰酶消化后貼壁的腫瘤單細(xì)胞。在胰酶消化后貼壁的腫瘤單細(xì)胞中加入DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)，得到純化后的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞。
[0040]步驟S5):將上述腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:DMEM完全培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)箱(細(xì)胞培養(yǎng)箱中CO2的體積百分比為6-8%，溫度為35-38°C)，得到貼壁的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞。附圖3為腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)。
[0041]本發(fā)明成纖維細(xì)胞的快速提取方法可應(yīng)用于提取腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞。所述腫瘤為實(shí)體瘤，該實(shí)體瘤為肺癌、肝癌、腸癌、前列腺癌、胰腺癌和肺腺癌中的一種或幾種。所述腫瘤具體可為在BALB/c裸鼠上生長的人肝癌。
[0042]三、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的鑒定
I.腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞FAP的表達(dá)水平檢測(cè)
用流式細(xì)胞儀測(cè)定腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞表達(dá)FAP的水平。首先將腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞與一抗(0.58/1\106細(xì)胞)(六1?^111公司產(chǎn)品，貨號(hào)為3匕54651)在0.0111101/1 PBS中22°C反應(yīng)30分鐘，反應(yīng)結(jié)束后以0.01mol/L PBS洗三次，然后再與DyLight ? 488標(biāo)記的二抗(0.0lmol/L PBS稀釋，稀釋比例為l/500)(Abcam公司產(chǎn)品，貨號(hào)為ab96879)在4°C反應(yīng)30分鐘，反應(yīng)結(jié)束后以0.0lmol/L PBS洗三次，上機(jī)分析，結(jié)果如圖4所示，圖4中左峰是陰性對(duì)照峰，右峰是陽性結(jié)果峰，表示的是FAP的表達(dá)情況;結(jié)果顯示腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞純度很高，高表達(dá)FAP，表達(dá)率為99.2%(即表達(dá)FAP的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞占所檢測(cè)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的百分比為99.2%)。
[0043]2.腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)
(I)將純化后貼壁的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞鋪板于6孔板中，用不含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)，細(xì)胞密度可為5 X 15/孔。
[0044](2)0.01mol/LPBS 洗滌 2遍，4% 多聚甲醛固定 30min。
[0045](3)用濃度為5%的胎牛血清對(duì)非特異結(jié)合進(jìn)行封閉，常溫下反應(yīng)30min。
[0046](4)更換含抗FAP單克隆一抗(配成濃度為Iug/mL) (Abcam公司產(chǎn)品，貨號(hào)為ab28244M90.01mol/L PBS，4°C反應(yīng)過夜。
[0047](5)0.0lmol/L PBS洗滌2遍，與AlexaFluor ? 594紅色焚光標(biāo)記的二抗(0.0lmol/LPBS稀釋，稀釋比例為I/400)(Abcam公司產(chǎn)品，貨號(hào)Sab 150080)在常溫反應(yīng)30分鐘。
[0048](6)0.01mol/L PBS洗滌2遍，染DAPI(配成濃度為0.14mg/mL)3分鐘，0.01mol/LPBS洗滌2遍，熒光顯微鏡下觀察。
[0049]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示成纖維細(xì)胞特異性結(jié)合抗FAP單克隆抗體后發(fā)出紅色熒光。見附圖5為利用本發(fā)明的提取方法得到的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)染色的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。顯微鏡下腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞呈長梭形或星芒狀，胞質(zhì)豐富，嗜酸性，胞核位于胞體中央，圓形或長橢圓形，細(xì)胞呈放射狀或束狀排列，部分細(xì)胞排列紊亂，極性消失，有明顯的交叉重疊現(xiàn)象。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果提示，成纖維細(xì)胞表面能特異性結(jié)合抗FAP單克隆熒光抗體，發(fā)出紅色熒光。
[0050]本發(fā)明并不局限于前述的【具體實(shí)施方式】。本發(fā)明擴(kuò)展到任何在本說明書中披露的新特征或任何新的組合，以及披露的任一新的方法或過程的步驟或任何新的組合。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種成纖維細(xì)胞的快速提取方法，其特征在于，包括以下步驟: 51)取離體的腫瘤組織，剪碎，然后往剪碎后的腫瘤組織中加入膠原酶溶液進(jìn)行消化，得到膠原酶消化后的腫瘤組織； 52)將所述膠原酶消化后的腫瘤組織轉(zhuǎn)移到離心管中進(jìn)行震蕩、孵育及離心后，取沉淀物放進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，得到組織結(jié)構(gòu)松散的腫瘤組織； 53)再加入膠原酶溶液進(jìn)行消化，并重復(fù)步驟S2)，得到經(jīng)交替消化、培養(yǎng)后的組織結(jié)構(gòu)松散的腫瘤組織； 54)向步驟S3)所述組織結(jié)構(gòu)松散的腫瘤組織中加入胰酶溶液，常溫靜置后加入胎牛血清終止消化，再將懸浮物倒掉，得到胰酶消化后貼壁的腫瘤單細(xì)胞； S5)在所述胰酶消化后貼壁的腫瘤單細(xì)胞中加入DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)，得到所述腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成纖維細(xì)胞的快速提取方法，其特征在于，在步驟SI)，所述將離體的腫瘤組織剪碎前，還包括將離體的腫瘤組織在I3BS中浸泡l-3min，所述I3BS的摩爾濃度為0.0lmol/L，所述膠原酶溶液為膠原酶I溶液。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的成纖維細(xì)胞的快速提取方法，其特征在于，所述摩爾濃度為0.01mol/L的PBS的配制方法為:將KCL 0.2g^KH2PO4 0.24g、NaCl 8.0g和Na2HPO4 1.44g 溶解于100mL DDH2O中；所述膠原酶I溶液中膠原酶I的質(zhì)量-體積濃度為0.8-1.5mg/mL。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成纖維細(xì)胞的快速提取方法，其特征在于，在步驟S2)，所述震蕩的頻率為1500-2000rpm，時(shí)間為2-4min;所述孵育為在35-38°C水浴鍋中孵育l-3min;所述震蕩和孵育交替進(jìn)行2-4次。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成纖維細(xì)胞的快速提取方法，其特征在于，在步驟S2)，所述離心為將孵育后的腫瘤組織于300g下離心5-7 min，棄上清液；向沉淀中加入18-25 mL摩爾濃度為0.01mol/L的PBS，混勾后于300g下離心5_7min，棄上清液;再向沉淀中加入18-25mL摩爾濃度為0.01mol/L的PBS，混勾后于300g下離心5_7min，棄上清液，取沉淀物即可。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成纖維細(xì)胞的快速提取方法，其特征在于，在步驟S2)，所述細(xì)胞培養(yǎng)箱中CO2的體積百分比為6-8%，溫度為35-38°C，培養(yǎng)的時(shí)間為1-3天。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成纖維細(xì)胞的快速提取方法，其特征在于，在步驟S4)，所述胰酶溶液的配制方法為:將NaCl 7-9g,NaHCO3 0.4-0.6g、葡萄糖0.8-1.2g、EDTA 0.2_0.4g及胰酶2.3-2.8g溶解于100mL DDH2O中；所述常溫靜置的時(shí)間為l_2min。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成纖維細(xì)胞的快速提取方法，其特征在于，在步驟S5)，在進(jìn)行傳代培養(yǎng)之前，還包括用PBS將所述胰酶消化后貼壁的腫瘤單細(xì)胞洗滌2-3次;所述DMEM完全培養(yǎng)基為向DMEM不完全培養(yǎng)基中加入胎牛血清和P/S得到的溶液，其中胎牛血清的體積百分比為10%，P/S的體積百分比為I %。9.一種成纖維細(xì)胞的快速提取方法在提取腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的應(yīng)用。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述腫瘤為實(shí)體腫瘤，該實(shí)體腫瘤為肺癌、肝癌、腸癌、前列腺癌、胰腺癌和肺腺癌中的一種或幾種。
【文檔編號(hào)】C12N5/09GK106047813SQ201610537670
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年7月11日
【發(fā)明人】趙永祥, 盧小玲, 周素芳, 黃盈盈
【申請(qǐng)人】廣西醫(yī)科大學(xué)