用于檢測惡性贅生性疾病的組合物和方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了包含至少兩種靶向試劑的組合物，其中至少一種第一靶向試劑識別角蛋白7肽和/或其片段，且至少一種第二靶向試劑識別角蛋白19肽和/或其片段。所述第一和第二靶向試劑能夠特異性且同時結(jié)合至角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段。本發(fā)明的組合物可用于診斷和/或預(yù)后、預(yù)測受試者中的惡性贅生性疾病諸如例如肺癌、膀胱癌、食道癌和卵巢癌的治療效力、評價其治療結(jié)果或評價其復(fù)發(fā)的方法中。
【專利說明】
用于檢測惡性寶生性疾病的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及惡性寶生性疾病的領(lǐng)域。具體地，其設(shè)及用于改進(jìn)檢測惡性寶生性疾 病的組合物和方法W及其診斷和/或預(yù)后用途。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 極大地需要可W幫助診斷惡性疾病的簡單、準(zhǔn)確和節(jié)約成本的方法，W輔助患者 的治療決策和管理。目前可用的腫瘤標(biāo)志物(存在少數(shù)例外）已經(jīng)由于缺乏靈敏度和特異性 而減少至治療監(jiān)測。基本上所有腫瘤標(biāo)志物作為單一標(biāo)志物都是無法令人滿意的，并且需 要新的且更特定的標(biāo)志物補(bǔ)充建立的標(biāo)志物。特別地，缺乏腫瘤特異性，即各種組織中的各 種良性病況諸如肝硬化、腎衰竭和一般炎癥中的標(biāo)志物值增加，是當(dāng)前可用的腫瘤標(biāo)志物 的一個基本問題。
[0004] 從調(diào)亡或壞死的腫瘤和非腫瘤細(xì)胞釋放的在血清中循環(huán)的角蛋白或其片段已經(jīng) 用作用于監(jiān)測幾種癌癥中的疾病進(jìn)展的腫瘤標(biāo)志物。多個角蛋白的上皮細(xì)胞特異性的方式 的表達(dá)和角蛋白表達(dá)概況在寶生性轉(zhuǎn)化過程中保持相對穩(wěn)定的事實(shí)解釋了為什么角蛋白 通常用于腫瘤標(biāo)志物。
[0005] 最常用的角蛋白腫瘤標(biāo)志物是組織多膚抗原（TPA;角蛋白8化8)、角蛋白18化18) 和角蛋白19化19)的混合物），組織多膚特異性抗原（TPS;源自K18)，細(xì)胞角蛋白片段21-1 (CYFRA 21-1;源自K19)dTPA已經(jīng)用作潛在的血清標(biāo)志物W鑒定具有各種上皮細(xì)胞相關(guān)的 癌、包括設(shè)及乳腺、結(jié)腸直腸、肺癌和膀脫的那些的個體。TPS已經(jīng)臨床應(yīng)用于護(hù)理具有乳 腺、卵巢、前列腺的癌癥的個體，且CYFRA 21-1已經(jīng)臨床應(yīng)用于護(hù)理具有肺癌的個體。TPA、 TPS和CYFRA 21-1的主要潛在的臨床用途是監(jiān)測治療響應(yīng)和腫瘤復(fù)發(fā)和提供預(yù)測信息。對 于推薦作為腫瘤標(biāo)志物的常規(guī)用途，運(yùn)些標(biāo)志物因?yàn)樗鼈冊诜菒盒约膊≈腥狈ζ鞴偬禺愋?和升高的血清水平而具有有限的臨床效用。在幾種肝臟疾病和各種炎性疾病的背景下發(fā)現(xiàn) 高ITS和TPA水平。CYFRA 21 -1是角蛋白標(biāo)志物中最特異性的，并且已經(jīng)獲得廣泛的接受度。 然而，高CYFRA水平伴隨間質(zhì)性肺纖維化和腎衰竭。此外，在屯、臟衰竭中，CYFRA水平導(dǎo)致假 陽性結(jié)果。
[0006] 如上所提到，目前使用的腫瘤標(biāo)志物，不僅CYFRA 21-1，給出假陽性結(jié)果的問題， 而且例如癌胚抗原（CEA)、癌抗原125(CA125)、癌抗原19-9(CA 19-9)、癌抗原15-3(CA15- 3)、神經(jīng)元特異性締醇化酶(NSE)、鱗狀細(xì)胞癌(see)也提到一些。
[0007] 因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)當(dāng)W簡單和可靠的方式診斷和預(yù)后惡性寶生性疾病時更好的 診斷和預(yù)后標(biāo)志物、方式和方法，W及進(jìn)行精確和更少偏倚的用于檢測惡性寶生性疾病的 方法或測定法的方式。因此，本發(fā)明的一個目標(biāo)是提供當(dāng)診斷或預(yù)后惡性寶生性疾病時W 簡單和有效的常規(guī)測試方式進(jìn)行精確和更少偏倚的診斷測定法的方式和方法。
[000引發(fā)明概述
[0009]該目的可W通過W下實(shí)現(xiàn):提供包含至少兩種祀向試劑的組合物，其中至少一種 第一祀向試劑識別角蛋白7化7)膚和/或其片段，且至少一種第二祀向試劑識別角蛋白19 化19)膚和/或其片段。所述第一和第二祀向試劑能夠特異性且同時結(jié)合至角蛋白7與角蛋 白19的異型復(fù)合物和/或其片段。
[0010] 第一和/或第二祀向試劑可W是任何種類的分子，其識別和結(jié)合至被祀向膚或其 片段。第一祀向試劑識別角蛋白7膚和/或其片段。角蛋白7化7)是在人中由KRT7基因編碼的 蛋白。角蛋白7是II型角蛋白，并且在內(nèi)部器官腔內(nèi)層的簡單上皮中和腺導(dǎo)管和血管中特異 性表達(dá)。K7是51kDa蛋白，并且是469個氨基酸長。
[0011] 第二祀向試劑識別角蛋白19膚和/或其片段。角蛋白19化19)是在人中由KRT19基 因編碼的蛋白。K19是在角皮(包圍正在發(fā)育的表皮的淺表層）中特異性存在的I型角蛋白。 K19是44kDa蛋白，并且是400個氨基酸長。
[0012] 第一和/或第二祀向試劑有利地選自配體、抑制劑、擬膚化合物、膚、蛋白、抗體、抗 體的抗原結(jié)合片段和/或其組合。第一和第二祀向試劑兩者均能夠特異性且同時結(jié)合至角 蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段。
[0013] 如本文所使用的術(shù)語"角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物"意指源自全長角蛋白7 和全長角蛋白19及其片段之間的平行和對齊二聚體的分子實(shí)體。該術(shù)語進(jìn)一步包括角蛋白 7和角蛋白19之間的重疊二聚體，其在角蛋白7和角蛋白19及其片段之間形成反平行四聚 體。其進(jìn)一步包括由運(yùn)些四聚體及其任何片段組裝的寡聚物、原絲和細(xì)絲。
[0014] 在角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物中，在源自異型復(fù)合物的角蛋白7部分的不間 斷序列中必須存在最少至少3個、優(yōu)選至少5個或至少10個、或至少15個、或至少20個、或至 少25個或至少30個、但更優(yōu)選多于40個氨基酸，并且在源自異型復(fù)合物的角蛋白19部分的 不間斷序列中必須存在最少至少3個、優(yōu)選至少5個或至少10個、或至少15個、或至少20個、 或至少25個或至少30個、但更優(yōu)選多于40個氨基酸。所述氨基酸必須分別對于角蛋白7或角 蛋白19是獨(dú)特的。
[0015] 有利地，所述不間斷序列中的最少至少3個、優(yōu)選至少5個或至少10個、或至少15 個、或至少20個、或至少25個或至少30個、但更優(yōu)選多于40個氨基酸來自角蛋白7中的256- 412氨基酸序列。更優(yōu)選地，所述不間斷序列來自角蛋白7中的300-380氨基酸序列。有利地， 所述不間斷序列中的最少至少3個、優(yōu)選至少5個或至少10個、或至少15個、或至少20個、或 至少25個或至少30個、但更優(yōu)選多于40個氨基酸來自角蛋白19中的244-400氨基酸序列。更 優(yōu)選地，所述不間斷序列來自角蛋白19中的311-375氨基酸序列。當(dāng)?shù)谝缓偷诙胂蛟噭┨?異性和同時結(jié)合至所述角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段時，它們都將結(jié)合至 角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段，且形成包含所述第一和第二祀向試劑和角 蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的=聯(lián)體。在足夠長使得通過本文所述的任何 方式或方法或者另外通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式或方法檢測=聯(lián)體的時間段過程中， 所述第一和第二祀向試劑將和角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段形成所述= 聯(lián)體。
[0016] 在一個有利的實(shí)施方案中，所述第一或第二祀向試劑中的至少一種是抗體、其抗 原結(jié)合片段、或變體、融合體、衍生物或其組合。有利地，第一和第二祀向試劑兩者均為抗 體、其抗原結(jié)合片段、或變體、融合體、衍生物或其組合，其將識別并結(jié)合至角蛋白7與角蛋 白19的異型復(fù)合物和/或其片段，并形成抗原-抗體=聯(lián)體。所述抗原-抗體=聯(lián)體因此包含 角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段，第一和第二抗體、其抗原結(jié)合片段、或變 體、融合體、衍生物或其組合均與之結(jié)合。第一抗體、其抗原片段、變體、融合體、衍生物或其 組合結(jié)合至角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的角蛋白7-膚部分，且第二抗 體、其抗原片段或變體、融合體、衍生物或其組合結(jié)合至角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物 和/或其片段的角蛋白19-膚部分。
[0017] 當(dāng)?shù)谝缓偷诙胂蛟噭┦强贵w、其抗原片段或變體、融合體、衍生物或其組合時， 它們將有利地結(jié)合至角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的不同的抗原性位點(diǎn)。 通常，第一抗體、其抗原片段、變體、融合體、衍生物或其組合特異性識別并結(jié)合至位于角蛋 白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的角蛋白7部分的抗原性位點(diǎn)。第二抗體、其抗原 片段、變體、融合體、衍生物或其組合特異性識別并結(jié)合至位于角蛋白7與角蛋白19的異型 復(fù)合物和/或其片段的角蛋白19部分的抗原性位點(diǎn)。
[0018] 所述第一和第二祀向試劑可W結(jié)合至角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其 片段，且W任何順序與其形成=聯(lián)體。運(yùn)意味著，在一個實(shí)施方案中，第一祀向試劑將首先 結(jié)合至角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的角蛋白7部分，且形成雙聯(lián)體。其 后，第二祀向試劑將結(jié)合至所述雙聯(lián)體的角蛋白19部分，且形成=聯(lián)體。
[0019] 在另一個實(shí)施方案中，第二祀向試劑將首先結(jié)合至角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù) 合物和/或其片段的角蛋白19部分，且形成雙聯(lián)體。其后，第一祀向試劑將結(jié)合至所述雙聯(lián) 體的角蛋白7部分W形成=聯(lián)體。在一個進(jìn)一步實(shí)施方案中，第一和第二祀向試劑兩者將基 本上同時結(jié)合角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段。
[0020] 在一個有利的實(shí)施方案中，第一和/或第二祀向試劑是一抗，和或其片段，并且在 另一個有利的實(shí)施方案中，所述第一和/或第二祀向試劑是單克隆或重組抗體，和或其片 段。
[0021] 當(dāng)?shù)谝混胂蛟噭┦强贵w時，其有利地選自抗體C-35、C-62、C-68、C18、C35、KS 7.18、〇)5-68^?化和1?〇(105或其抗體片段變體、融合體、衍生物或其組合，其識別角蛋白7 膚和/或其片段，且具有特異性結(jié)合至角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的能 力。有利地，第一祀向試劑識別位于角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物的角蛋白7部分上的 至少3個、或至少5個、或至少7個、或10個或更多個氨基酸的序列，并且其對于角蛋白7蛋白 序列是獨(dú)特的。有利地，所述第一祀向試劑識別位于角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物的角 蛋白7部分中的256-412氨基酸序列內(nèi)的序列。更優(yōu)選地，所述序列來自角蛋白7部分中的 300-380氨基酸序列。
[0022] 有利地，識別角蛋白7膚或其片段的抗體是由得自Progen Biotechnik，GmBH，德國 的克隆Ks 7.18產(chǎn)生的Ks 7.18單克隆抗體。單克隆抗體KS 7.18特異性結(jié)合至角蛋白7與角 蛋白19的異型復(fù)合物或其片段的K7部分的氨基酸300-350。
[0023] 或者，識別角蛋白7膚或其片段的抗體是由得自Acris Antibodies Gm化的克隆 RCK105產(chǎn)生的RCK105單克隆抗體。
[0024] 當(dāng)?shù)诙胂蛟噭┦强贵w時，其有利地選自抗體453-8/42.26曰1?1、1(8 19.1、81- 19.21、CCD003、CCD004、CKS04、CKS06、CKS14、K19.2、KM 4.62、LP2K、SA 21、和SA45或其抗體 片段、變體、融合體、衍生物或其組合，其識別角蛋白19膚和/或其片段，且具有特異性結(jié)合 至角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的能力。有利地，第二祀向試劑識別位于 角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物的角蛋白19部分上的至少3個、或至少5個、或至少7個、或 10個或更多個氨基酸的序列，并且其對于角蛋白19蛋白序列是獨(dú)特的。有利地，所述序列位 于角蛋白19中的244-400氨基酸序列內(nèi)。更優(yōu)選地，所述序列來自角蛋白19中的311-375氨 基酸序列。
[00巧]有利地，識別角蛋白19膚或其片段的抗體是由得自Roche Diagnostics的克隆BM- 19.21產(chǎn)生的BM-19.21單克隆抗體。BM 19.21特異性結(jié)合至角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合 物的K19部分的氨基酸346-367。
[0026] 或者，識別角蛋白19膚或其片段的抗體是得自Progen Biotechnik，GmBH的Ks 19.2單克隆抗體。Ks 19.2特異性結(jié)合至角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物的K19部分的氨 基酸 352-368。
[0027] 或者，識別角蛋白19膚或其片段的抗體是由克隆Ks 19.1aka A53-B/A2產(chǎn)生的Ks 19.1單克隆抗體。Ks 19.1特異性結(jié)合至角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物的K19部分的氨 基酸 311-335。
[002引有利地，第一祀向試劑是Ks 7.18單克隆抗體，且第二祀向試劑是BM-19.21單克隆 抗體。
[0029] 或者，第一祀向試劑是Ks 7.18單克隆抗體，且第二祀向試劑是Ks 19.2單克隆抗 體。
[0030] 或者，第一祀向試劑是RCK105單克隆抗體，且第二祀向試劑是Ks 19.1單克隆抗 體。
[0031] 本發(fā)明的一個進(jìn)一步方面設(shè)及用于檢測生物樣品中的角蛋白7與角蛋白19的異型 復(fù)合物和/或其片段的體外方法，所述方法包括W下步驟：
[0032] a)使所述生物樣品與如本文所述的組合物接觸;或者可替代地
[0033] b)使所述生物樣品與識別角蛋白7膚和/或其片段的第一祀向試劑接觸;和
[0034] C)使所述生物樣品與識別角蛋白19膚和/或其片段的第二祀向試劑接觸;和
[0035] 檢測所述角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段;其中步驟b)和C)可 任何順序或同時進(jìn)行。
[0036] 在該方法的一個有利的實(shí)施方案中，如本文公開的組合物用于在合適條件下接觸 生物樣品。下文在別處描述所述組合物和生物樣品接觸的合適條件的實(shí)例。其后，通過也如 本文所述的任何合適的方法檢測角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段。
[0037] 或者，第一和第二祀向試劑分開且不作為組合物提供。然而，可W將生物樣品與所 述第一和第二祀向試劑W任何順序接觸。因此，在一個實(shí)施方案中，生物樣品將首先與將結(jié) 合至生物樣品中存在的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的角蛋白7部分的第 一祀向試劑接觸，并且在第一祀向試劑和異型復(fù)合物之間形成雙聯(lián)體。其后，所述第一祀向 試劑和因此形成的異型復(fù)合物之間的所述雙聯(lián)體將與將結(jié)合至所述形成的雙聯(lián)體的角蛋 白19部分的第二祀向試劑接觸，并且由此形成包含結(jié)合至異型復(fù)合物的第一和第二祀向試 劑的=聯(lián)體。
[0038] 在另一個實(shí)施方案中，生物樣品將首先與將首先結(jié)合至角蛋白7與角蛋白19的異 型復(fù)合物和/或其片段的角蛋白19部分的第二祀向試劑接觸，并且在第二祀向試劑和異型 復(fù)合物之間形成雙聯(lián)體。其后，包含第二祀向試劑和因此形成的異型復(fù)合物的所述雙聯(lián)體 將與將結(jié)合至所述形成的雙聯(lián)體的角蛋白7部分的第一祀向試劑接觸，并且由此形成包含 第一和第二祀向試劑和異型復(fù)合物的=聯(lián)體。
[0039] 在一個又進(jìn)一步實(shí)施方案中，第一和第二祀向試劑兩者將基本上同時結(jié)合角蛋白 7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段。
[0040] 其后，通過如下面所述的任何合適的方法檢測角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物 和/或其片段。
[0041 ]體外方法中使用的第一和第二祀向試劑有利地如上所述。
[0042] 生物樣品可W是選自固體組織樣品諸如例如活檢樣本、組織培養(yǎng)物或源自其的細(xì) 胞及其后代、臨床樣品、培養(yǎng)物中的細(xì)胞、細(xì)胞上清液、細(xì)胞裂解物或體液的任何樣品。生物 樣品中可W表達(dá)或可W不表達(dá)角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段。
[0043] 有利地，所述方法用于生物流體樣品，諸如例如血清、血漿、淋己液、滲出液、排泄 物、胃酸、胃液、淋己液、粘液、屯、包液、腹膜液、胸膜液、脈液、唾液、疲液、滑液、淚液、汗液、 陰道分泌物、嘔吐物和尿液。在一個特別有利的實(shí)施方案中，所述方法用于血液、血漿和或 血清樣品。
[0044] 在一個有利的實(shí)施方案中，所述方法包括將生物樣品中的角蛋白7與角蛋白19的 異型復(fù)合物和/或其片段的表達(dá)與陽性和/或陰性對照進(jìn)行比較的進(jìn)一步步驟，其中所述陽 性對照包含角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段，且所述陰性對照不包含角蛋白 7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段。
[0045] 在一個有利的實(shí)施方案中，所述陽性對照是獲得自患有惡性寶生性疾病的受試者 的生物樣品，并且所述陰性對照是獲得自未患有惡性疾病的健康受試者的生物樣品。
[0046] 在一個進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述方法可W包括對角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合 物和/或其片段的量評分的步驟。所述評分可W根據(jù)本領(lǐng)域已知或本文所述的標(biāo)準(zhǔn)評分系 統(tǒng)通過檢測的祀向試劑復(fù)合物的方式來完成。
[0047] 有利地，在自動化讀取裝置上進(jìn)行所述方法或手動進(jìn)行所述檢測。
[0048] 本發(fā)明的一個進(jìn)一步方面是用于W下的體外方法
[0049] i)診斷和/或預(yù)后受試者中的惡性寶生性疾病，和/或
[0050] ii)預(yù)測受試者中的惡性寶生性疾病的治療效力，和/或
[0051] i i i)評價受試者中的惡性寶生性疾病的治療結(jié)果，和/或
[0052] iv)評價受試者中的惡性寶生性疾病的復(fù)發(fā)
[0053] 其中所述受試者是具有或懷疑具有惡性寶生性疾病的哺乳動物。
[0054] 所述受試者是選自人，非人靈長類諸如黑猩猩和其它猿類和猴類，農(nóng)場動物諸如 牛、綿羊、豬、山羊和馬，家養(yǎng)哺乳動物諸如狗和貓，實(shí)驗(yàn)動物，包括曬齒動物諸如小鼠、大鼠 和豚鼠的哺乳動物。有利地，所述受試者是哺乳動物，包括人和非人哺乳動物。在最有利的 實(shí)施方案中，所述受試者是人。
[0055] 所述惡性寶生性疾病可W是選自膽管癌(肝外）、膀脫癌、乳腺癌、未知(原發(fā)性)的 癌、子宮頸癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、食道癌、膽囊癌、胃部（胃）癌、頭頸癌、肝細(xì)胞(肝)癌、下 咽癌、腎癌、喉癌、肝癌(原發(fā)性）、肺癌(非小細(xì)胞）、肺癌(小細(xì)胞）、間皮瘤、非小細(xì)胞肺癌、 卵巢癌、卵巢上皮癌(表面上皮-間質(zhì)瘤）、卵巢生殖細(xì)胞腫瘤、卵巢低惡性潛能腫瘤、膜腺 癌、前列腺癌、直腸癌、腎細(xì)胞癌（腎癌）、唾液腺癌、小細(xì)胞肺癌、小腸癌、胃癌、睪丸癌、甲狀 腺癌、腎孟和輸尿管的移行細(xì)胞癌或子宮癌(子宮內(nèi)膜）。
[0056] 有利地，所述惡性寶生性疾病選自肺癌、膀脫癌、食道癌、肝細(xì)胞癌、膜腺癌、胃癌 和卵巢癌。當(dāng)所述惡性寶生性疾病選自肺癌、膀脫癌、食道癌和卵巢癌時，所述方法是特別 有利的。
[0057] 當(dāng)診斷和/或預(yù)后受試者中的惡性寶生性疾病時，所述方法包括W下步驟
[0058] a)從給定受試者獲得生物樣品
[0059] b)使所述生物樣品與如本文所述的組合物接觸;或者可替代地
[0060] C)使所述生物樣品與識別細(xì)胞角蛋白7膚和/或其片段的第一祀向試劑接觸;和
[0061] d)使所述生物樣品與識別細(xì)胞角蛋白19膚和/或其片段的第二祀向試劑接觸;和
[0062] e)檢測所述細(xì)胞角蛋白7與細(xì)胞角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段；
[0063] 其中步驟C)和d)可W W任何順序或同時進(jìn)行;和
[0064] f)將檢測的細(xì)胞角蛋白7與細(xì)胞角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的量與陽性 和/或陰性對照進(jìn)行比較，由此診斷和/或預(yù)后受試者中的惡性寶生性疾病。
[0065] 任選地，可W根據(jù)本領(lǐng)域已知或本文所述的標(biāo)準(zhǔn)評分系統(tǒng)完成檢測的抗原-抗體 復(fù)合物的評分。
[0066] 所述樣品可W是可能包含惡性寶生性疾病的任何樣品。
[0067] 進(jìn)一步實(shí)施方案是其中所述陽性對照包含來自患有惡性寶生性疾病的受試者的 細(xì)胞。甚至進(jìn)一步實(shí)施方案是其中所述陰性對照包含來自未患有惡性寶生性疾病的健康受 試者的細(xì)胞。
[0068] 當(dāng)預(yù)測患有惡性寶生性疾病的受試者中的治療結(jié)果時，所述方法包括W下步驟
[0069] a)從患有惡性寶生性疾病的受試者獲得生物樣品
[0070] b)檢測所述生物樣品中的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物的表達(dá)
[0071] C)將角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物的表達(dá)與陽性和/或陰性對照進(jìn)行比較，由 此基于檢測的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的表達(dá)預(yù)測所述受試者中的 惡性寶生性疾病的治療結(jié)果。
[0072] 當(dāng)評價正在針對惡性寶生性疾病進(jìn)行治療的受試者中的惡性寶生性疾病的治療 效力時，所述方法包括W下步驟
[0073] a)從正在經(jīng)歷針對惡性寶生性疾病的治療的受試者獲得生物樣品
[0074] b)檢測所述生物樣品中的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物的表達(dá)
[0075] C)在針對惡性寶生性疾病治療所述受試者過程中的一個或多個時間點(diǎn)重復(fù)步驟 a)和b)，并且其中角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物的相對表達(dá)隨時間的變化指示治療效 力。
[0076] 因此，有效治療的指示是角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物的漸降表達(dá)相對于重 復(fù)所述方法的步驟中分析的先前樣品的相對變化。
[0077] 任選地，可W根據(jù)本領(lǐng)域已知或本文所述的標(biāo)準(zhǔn)評分系統(tǒng)完成檢測的角蛋白7與 角蛋白19的異型復(fù)合物的評分。
[0078] 所述樣品可W是可能包含惡性寶生性疾病的任何樣品，優(yōu)選來自具有惡性寶生性 疾病的受試者的生物樣品，并且該受試者將在兩者之間或目前正在治療。
[0079] 當(dāng)評價惡性寶生性疾病的復(fù)發(fā)時，所述方法包括W下步驟
[0080] a)從先前已經(jīng)具有惡性寶生性疾病的受試者獲得生物樣品，
[0081] b)檢測所述生物樣品中的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物的表達(dá)，
[0082] c)在針對惡性寶生性疾病治療所述受試者后的一個或多個時間點(diǎn)重復(fù)步驟a)和 b)，并且其中角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物的相對表達(dá)隨時間的變化可指示惡性寶生 性疾病的復(fù)發(fā)。
[0083] 因此，復(fù)發(fā)的指示是鑒定惡性寶生性疾病的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物的 漸增量（即，蛋白標(biāo)志物角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物的表達(dá)的隨時間增加)相對于重 復(fù)所述方法的步驟中分析的先前樣品的相對變化。
[0084] 在一個進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供體外方法用于W下的用途
[0085] i)檢測角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和或其片段，和/或
[0086] ii)檢測惡性寶生性疾病;和/或
[0087] i i i)診斷或預(yù)后受試者中的惡性寶生性疾病，和/或
[0088] iv)預(yù)測受試者中的惡性寶生性疾病的治療結(jié)果，和/或
[0089] V)評價受試者中的惡性寶生性疾病的治療效力，和/或
[0090] Vi)評價受試者中的惡性寶生性疾病的復(fù)發(fā)。
[0091 ]在一個進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供試劑盒，其用于
[0092] i)檢測生物樣品中的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段;和/或
[0093] i i)檢測受試者中的惡性寶生性疾病;和/或
[0094] i i i)診斷或預(yù)后受試者中的惡性寶生性疾病;和/或
[0095] iv)預(yù)測受試者中的惡性寶生性疾病的治療結(jié)果;和/或
[0096] V)評價受試者中的惡性寶生性疾病的治療效力;和/或
[0097] Vi)評價受試者中的惡性寶生性疾病的復(fù)發(fā)；
[0098] 所述試劑盒包含：
[0099] a)如本文所述的組合物;或者可替代地
[0100] b)第一容器，其包含識別角蛋白7膚和/或其片段的第一祀向試劑;和
[0101] C)第二容器，其包含識別角蛋白19膚和/或其片段的第二祀向試劑，和
[0102] d)任選地用于進(jìn)行如本文所述的方法的說明書。
[0103] 附圖簡述
[0104] 圖1顯示角蛋白結(jié)構(gòu)和細(xì)絲組裝。
[0105] 圖2顯示K7/19測定的典型校準(zhǔn)曲線。
[0106] 圖3顯示如通過本發(fā)明的方法測定的對于良性疾病的靈敏度VS95%特異性。
[0107] 圖4顯示比較卵巢癌中的不同腫瘤標(biāo)志物CA125、肥4、K7/19和CYFRA的R0C-曲線。
[0108] 圖5顯示比較組合CA12祀IA&HE4EIA與組合CA12祀IA&K7/19測定法的R0C-曲線。
[0109] 發(fā)明詳述
[0110] 在描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于所描述的具體實(shí)施方案，因此方法、 裝置和制劑當(dāng)然可W變化。也應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的術(shù)語僅用于描述具體實(shí)施方案的目 的，并且不意欲限制本發(fā)明的范圍，其將僅由所附權(quán)利要求限定。必須指出的是，如本文和 所附權(quán)利要求中所使用，單數(shù)形式"一個/種(a)、（an)"和"該(the)"包括復(fù)數(shù)對象，除非上 下文另有明確指出，并且包括提及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的等同步驟和方法。
[0111] 通常預(yù)期本發(fā)明中使用的術(shù)語符合分子生物學(xué)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn) 定義。如下所列的少數(shù)例外已經(jīng)進(jìn)一步定義于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0112] 如本文所使的"至少一個/種"意指一個/種或多個/種，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 個/種等。
[0113] 如本文所使用的"檢測（detection)、（detect)、（detecting)"包括在參考或不參 考對照的情況下的定性和/或定量檢測(測量水平），并且進(jìn)一步是指鑒定給蛋白、特別是角 蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的存在、不存在或量。
[0114] 如本文所使用的"診斷"包括疾病性質(zhì)的鑒定。
[0115] 如本文所使用的"預(yù)后"包括關(guān)于疾病的可能結(jié)果的預(yù)測，關(guān)于通過由疾病的性質(zhì) 和癥狀所表明的從疾病恢復(fù)的希望。
[0116] "真陽性者"是指具有局部或轉(zhuǎn)移的惡性寶生物的那些受試者。
[0117] "假陰性者"是指具有局部或轉(zhuǎn)移的惡性寶生物且沒有通過診斷測定法歸類為運(yùn) 樣的那些受試者。
[0118] "真陰性者"是指不具有局部或轉(zhuǎn)移的惡性寶生物且通過診斷測定法歸類為運(yùn)樣 的那些受試者。
[0119] "假陽性者"是指不具有局部或轉(zhuǎn)移的惡性寶生物、但通過常規(guī)診斷測定法歸類為 具有局部或轉(zhuǎn)移的惡性寶生物的那些受試者。
[0120] 根據(jù)上下文，術(shù)語"假陽性者"也可W是指不具有惡性寶生物、但通過診斷測定法 歸類為具有惡性寶生物或非惡性疾病的那些受試者。
[0121] 如其應(yīng)用于診斷測定法的上下文中本文所使用的"靈敏度"是指被正確鑒定為運(yùn) 樣的具有局部或轉(zhuǎn)移的惡性寶生物的受試者的比例（即，真陽性者的數(shù)目除W真陽性者和 假陰性者的數(shù)目的總和）。
[0122] 如其應(yīng)用于診斷測定法的上下文中本文所使用的診斷測定法的"特異性"是指被 正確鑒定為運(yùn)樣的沒有局部和轉(zhuǎn)移的惡性寶生物的所有受試者的比例（即，真陰性者的數(shù) 目除W真陰性者和假陽性者的數(shù)目的總和）。
[0123] 術(shù)語"寶生物"或"腫瘤"可互換使用，并且是指組織的異常腫塊，其中腫塊的生長 超過正常組織的生長，且不與正常組織的生長協(xié)調(diào)。寶生物或腫瘤可被定義為"良性"或"惡 性"，其取決于W下特征:細(xì)胞分化的程度，包括形態(tài)和功能，生長的速率，局部侵襲和轉(zhuǎn)移。 "良性"寶生物通常是分化良好的，具有比惡性寶生物特征性更慢的生長，并且保持定位至 來源部位。此外，良性腫瘤不具有滲透、侵襲或轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)端部位的能力。
[0124] "惡性"寶生物通常是低分化的（退行發(fā)育），具有特征性快速生長，伴隨周圍組織 的進(jìn)行性滲透、侵襲和破壞。此外，惡性寶生物具有轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)端部位的能力。術(shù)語"轉(zhuǎn)移"是 指癌性細(xì)胞從原發(fā)性(初始)腫瘤擴(kuò)散或遷移另一器官或組織，且典型地可通過原發(fā)性(初 始)腫瘤的組織類型的"繼發(fā)性腫瘤"或"次級細(xì)胞塊"的存在，而不是定位次級(轉(zhuǎn)移性)腫 瘤的器官或組織的"繼發(fā)性腫瘤"或"次級細(xì)胞塊"的存在。例如已經(jīng)遷移至骨的肺癌被認(rèn)為 是轉(zhuǎn)移的肺癌，并且由源自骨組織中生長的上皮肺細(xì)胞的癌細(xì)胞組成。
[0125] "健康"是指具有良好健康的受試者。運(yùn)樣的受試者表明不存在任何惡性或非惡性 的疾病。在本申請的上下文中，"健康個體"只有當(dāng)他們不存在任何惡性或非惡性疾病才是 健康的；"健康個體"可W具有通常不被視為"健康"的其它疾病或病況。
[0126] 如本文所使用的"受試者"包括人，非人靈長類諸如黑猩猩和其它猿類和猴類，農(nóng) 場動物諸如牛、綿羊、豬、山羊和馬，家養(yǎng)哺乳動物諸如狗和貓，實(shí)驗(yàn)動物，包括曬齒動物諸 如小鼠、大鼠和豚鼠等。該術(shù)語并不表明特定的年齡或性別。因此，意欲覆蓋成年和新生的 受試者W及胎兒，不論是雄性還是雌性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述受試者是哺乳動物，包 括人和非人哺乳動物。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述受試者是人。
[0127] 如本文所使用的"單克隆抗體"或"mAb"是指具有單一氨基酸組成的抗體，其針對 特定抗原，并且由B細(xì)胞或雜交瘤的單克隆產(chǎn)生。
[0128] 如本文所使用的"多克隆抗體"是指源自不同的B細(xì)胞系的針對特定抗原的抗體。
[0129] 如本文所使用的"Fab"是指具有約50,000Da的分子量和抗原結(jié)合活性的抗體片 段，其中在通過用蛋白酶木瓜蛋白酶處理IgG獲得的片段之中，約一半的H鏈的N端側(cè)和完整 的L鏈通過二硫鍵結(jié)合在一起。
[0130] 如本文所使用的"F(ab'）2"是指在通過用蛋白酶胃蛋白酶處理IgG獲得的片段之 中，具有約100，OOODa的分子量和抗原結(jié)合活性的抗體片段，所述抗體片段通過較鏈區(qū)的二 硫鍵結(jié)合，稍大于化b。
[0131] 如本文所使用的"Fabi"是指具有約50,000Da的分子量和抗原結(jié)合活性的抗體片 段，所述抗體片段通過切割F(ab'）2的較鏈區(qū)的二硫鍵獲得。如本文所使用的單鏈Fv(" scFv")多膚是共價連接的VH::化異源二聚體，所述異源二聚體通常表達(dá)自包括通過膚編碼 接頭連接的VH和化編碼基因的融合基因。本發(fā)明的人scFv片段包括W適當(dāng)構(gòu)象保持的CDR， 其優(yōu)選通過使用基因重組技術(shù)。
[0132] 如本文所使用的"雜交瘤"表示通過將用抗原免疫非人哺乳動物制備的B細(xì)胞經(jīng)受 與源自小鼠等的骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞融合而獲得的細(xì)胞，其產(chǎn)生具有抗原特異性的期望的單 克隆抗體。
[0133] 術(shù)語"多膚"、"蛋白"和"膚"在本文中可互換用于指其中氨基酸殘基通過膚鍵或修 飾的膚鍵連接的氨基酸鏈。氨基酸鏈可W是多于兩個氨基酸的任何長度。除非另有指明，術(shù) 語"多膚"、"蛋白"和"膚"也包括其各種修飾形式。運(yùn)樣的修飾形式可W是天然存在的修飾 形式或化學(xué)修飾形式。修飾形式的實(shí)例包括，但不限于，糖基化形式、憐酸化形式、肉豆違酷 化形式、棟桐酷化形式、核糖基化形式、乙酷化形式、泛素化形式等。修飾還包括分子內(nèi)交聯(lián) 和與各個部分諸如脂質(zhì)、黃素、生物素、聚乙二醇或其衍生物的共價附接等。此外，修飾也可 W包括環(huán)化、支化和交聯(lián)。進(jìn)一步，多膚中也可W包括除了由基因編碼的常規(guī)二十種氨基酸 W外的氨基酸。
[0134] 如本文所使用的"生物樣品"包括獲得自具有或不具有惡性寶生物的任何受試者 的各種樣品類型。典型的受試者是人;然而，具有可能發(fā)展癌癥的惡性寶生物的任何哺乳動 物可W充當(dāng)可用于公開的方法中的生物樣品的來源?？捎糜诠_的方法中的示例性生物樣 品包括但不限于固體組織樣品諸如例如活檢樣本、組織培養(yǎng)物或源自其的細(xì)胞及其后代、 臨床樣品、培養(yǎng)物中的細(xì)胞、細(xì)胞上清液、細(xì)胞裂解物、體液。例如，生物樣品包括獲得自從 懷疑具有惡性寶生物的個體采集的組織或體液的樣品。
[0135] 生物流體樣品的實(shí)例包括但不限于血清、血漿、淋己液、滲出液、排泄物、胃酸、胃 液、淋己液、粘液、屯、包液、腹膜液、胸膜液、脈液、唾液、疲液、滑液、淚液、汗液、陰道分泌物、 嘔吐物和尿液。
[0136] 進(jìn)一步的實(shí)例是活檢樣品和/或細(xì)針抽吸物。樣品可W是新鮮的或收集后處理的 (例如，用于存檔目的）。在一些實(shí)例中，處理的樣品可W是固定的（例如福爾馬林固定的） 和/或蠟(例如，石蠟)包埋的。用于封固的細(xì)胞和組織制備物的固定劑是本領(lǐng)域中眾所周知 的，并且包括但不限于:95%乙醇Bouin氏固定劑;95%乙醇固定劑;85固定劑、8〇11；[]1氏固定 劑、福爾馬林固定劑、Karnovsky氏固定劑(戊二醒）、^dman氏固定劑、化1 lande氏固定劑、 Orth氏溶液（重銘酸鹽固定劑）和Zenker氏固定劑（參見，例如，Carson, Hi stotechology: A Self-Inshuctional Text ,Qiicago :ASCP Press, 1997)。在一些實(shí)例中，所述樣品（或其部 分)存在于固體支持物上。
[0137] 公開的方法中使用的固體支持物僅需要承受生物樣品，并且任選地、但有利地允 許方便地檢測樣品中目標(biāo)蛋白。示例性支持物包括顯微鏡載片（例如玻璃顯微鏡載片或塑 料顯微鏡載片）、蓋片(例如，玻璃蓋片或塑料蓋片）、組織培養(yǎng)皿、多孔板、膜(例如，硝化纖 維素或聚偏二氣乙締(PVD巧）或BIAC0RE⑩；忍片。
[0138] 如本文所使用的"治療"被定義為通過內(nèi)科或外科的方式處置患者。所述治療改善 或減輕醫(yī)學(xué)病況或疾病的至少一種癥狀，并且被要求提供治愈。如本文所使用的術(shù)語"治療 結(jié)果"或"治療的結(jié)果"是所述治療對患者的身體影響。
[0139] 如本文所使用的術(shù)語"算法"是指提供兩個或更多個量之間的關(guān)系的數(shù)學(xué)公式。運(yùn) 樣的公式可W是線性的或非線性的，并且可作為計(jì)算機(jī)存儲器中的多種數(shù)字加權(quán)因子而存 在。
[0140] "肺癌"是指給定受試者內(nèi)的肺的寶生物，例如，惡性寶生物，其中所述寶生物是上 皮來源的，即肺癌。肺癌通過惡性細(xì)胞的大小和外觀進(jìn)行歸類，且術(shù)語"肺癌"包括非小細(xì)胞 肺癌(NS化C)和小細(xì)胞肺癌(S化C)兩者。當(dāng)不限定使用時，術(shù)語"肺癌"包括局部和轉(zhuǎn)移的肺 癌兩者。術(shù)語"肺癌"可W通過術(shù)語"局部的"或"轉(zhuǎn)移的"來定性W區(qū)分不同類型的腫瘤，其 中"局部的"是指初始母腫瘤，轉(zhuǎn)移的是指已經(jīng)從初始母腫瘤擴(kuò)散的腫瘤。
[0141] ?M系統(tǒng)(腫瘤、結(jié)節(jié)、轉(zhuǎn)移)可用于在初始評估中對NS化C分期。使用T醒描述符，分 配組，范圍為隱匿性癌癥，至階段〇、IA(--4)、18、114、118、1114、1118和1￥(4)。該階段組輔 助治療的選擇和預(yù)后的估計(jì)。
[0142] 小細(xì)胞肺癌已經(jīng)常規(guī)地被歸類為"受限階段"（限于胸部的一半和單個可耐受放療 域的范圍內(nèi)）或"擴(kuò)展階段"（更廣泛的疾病）。然而，TNM分類和分組可用于估計(jì)預(yù)后。
[0143] 對于NS化C和SCLC兩者，兩種一般類型的分期評估是臨床分期和手術(shù)分期。臨床分 期在確定性手術(shù)之前進(jìn)行。其基于成像研究(諸如CT掃描和PET掃描）的結(jié)果和活檢結(jié)果。手 術(shù)分期在手術(shù)過程中或之后評估，并且基于手術(shù)和臨床發(fā)現(xiàn)(包括胸部淋己結(jié)的外科采樣） 的組合結(jié)果。
[0144] "卵巢癌"是指給定雌性受試者內(nèi)的卵巢的寶生物，例如，惡性寶生物，其中所述寶 生物是上皮來源的。
[0145] 當(dāng)不限定使用時，術(shù)語"卵巢癌"包括局部和轉(zhuǎn)移的卵巢癌兩者。術(shù)語"卵巢癌"可 W通過術(shù)語"局部的"或"轉(zhuǎn)移的"來定性W區(qū)分不同類型的腫瘤，其中"局部的"是指初始母 腫瘤，轉(zhuǎn)移的是指已經(jīng)從初始母腫瘤擴(kuò)散的腫瘤。
[0146] 卵巢癌可W根據(jù)AJCC/TNM系統(tǒng)進(jìn)行分期。運(yùn)描述了原發(fā)性腫瘤(T)的程度，不存在 或存在轉(zhuǎn)移至附近的淋己結(jié)(N)，W及不存在或存在遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移(M)。原發(fā)性腫瘤的程度含有 S種子類別1'1^2^3。運(yùn)非常類似于大多數(shù)婦科腫瘤學(xué)家實(shí)際使用的系統(tǒng)，稱為。160系統(tǒng)。 兩者都依賴于手術(shù)對于實(shí)際階段的結(jié)果。在FIG0系統(tǒng)中，腫瘤分期根據(jù)腫瘤已經(jīng)擴(kuò)散多遠(yuǎn) 而分類為I-IV。其中階段IV是最差的，意指腫瘤已經(jīng)擴(kuò)散至其估計(jì)極限。階段I-III含有子 類型A、B和C。
[0147]"食道癌"是指給定受試者內(nèi)的食道的寶生物，例如，惡性寶生物，其中所述寶生物 是上皮來源的，即食道癌。運(yùn)些癌分為兩類:腺癌或鱗狀細(xì)胞癌。
[0148]用于對食道癌分期的最常見的系統(tǒng)是美國癌癥聯(lián)合委員會（American Joint Committee on化11。日'，41〇：)的1'醒系統(tǒng)。?M分期系統(tǒng)基于幾個關(guān)鍵的信息片段:T是指原 發(fā)性腫瘤已經(jīng)生長入食道壁和附近器官多遠(yuǎn)。N是指擴(kuò)散至附近淋己結(jié)的癌癥。M表示癌癥 是否已經(jīng)擴(kuò)散(擴(kuò)散至遠(yuǎn)端器官）dG描述了癌癥的等級，其基于如何在顯微鏡下看癌細(xì)胞的 模式。分期還考慮癌癥的細(xì)胞類型(鱗狀細(xì)胞癌或腺癌）。對于鱗狀細(xì)胞癌，腫瘤的位置也可 W是分期中的因素。
[0149]"膀脫癌"是指給定受試者內(nèi)的泌尿膀脫的寶生物，例如，惡性寶生物，其中所述寶 生物源自尿路上皮或移行上皮。膀脫癌因此是指移行細(xì)胞(上皮)癌，但其也是指膀脫的腺 癌。
[0150]最常用于膀脫癌的分期系統(tǒng)是美國癌癥聯(lián)合委員會(American化int Committee on Cancer，AJCC)的分期系統(tǒng)。運(yùn)也稱為?M系統(tǒng)。描述腫瘤的T類型含有子類型：T0、Ta、 Tis、Tl、T2a、T2b、T3a、T3b、T4。
[0巧1] 免疫測定，諸如免疫組織化學(xué)（IHC)和免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC)
[0152] 如本文中所使用的"免疫測定"是測量經(jīng)常含有物質(zhì)的復(fù)雜混合物的樣品中的物 質(zhì)的存在或濃度的生化測試。運(yùn)樣的測定基于抗體W高特異性結(jié)合至一種或非常有限組的 分子或抗原的獨(dú)特能力。免疫組織化學(xué)（IHC)和免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC)是公開的方法和用途中 可用于檢測角蛋白7與角蛋白19的抗原異型復(fù)合物和/或其片段的兩種示例性免疫測定技 術(shù)。
[0153] 免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC)是一種常見的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，其使用經(jīng)由特異性表位祀向細(xì)胞 中的特異性膚或蛋白抗原的抗體。然后可使用幾種不同的方法檢測運(yùn)些結(jié)合的抗體。ICC允 許研究人員評估特定樣品中的細(xì)胞是否表達(dá)考慮的抗原。在發(fā)現(xiàn)免疫陽性信號的情況下， ICC還允許研究人員確定哪些亞細(xì)胞隔室表達(dá)所述抗原。
[0154] 在免疫組織化學(xué)（IHC)中，樣品是生物組織，其中各細(xì)胞由組織結(jié)構(gòu)完整組織中通 常發(fā)現(xiàn)的其它細(xì)胞所包圍。免疫細(xì)胞化學(xué)是用于通過使用與之結(jié)合的特異性抗體評價細(xì)胞 (培養(yǎng)的細(xì)胞，細(xì)胞懸浮液）中的特定蛋白或抗原的存在、由此允許在顯微鏡下顯現(xiàn)和檢查 的技術(shù)。其為用于測定來自單個細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)容物的有價值的工具。可分析的樣品包括血 液涂片、抽吸物、拭子、培養(yǎng)的細(xì)胞和細(xì)胞懸浮液。
[0155] 酶聯(lián)免疫吸附測定化LISA)和夾屯、化ISA是有利地用于本文公開的方法中的免疫 巧憶。在(直接化LISA中，將未知量的抗原固定至表面，然后將特異性抗體應(yīng)用至表面上，使 得其可W結(jié)合至抗原。該抗體連接至酶，并且在最后步驟中，添加物質(zhì)，使得所述酶能夠轉(zhuǎn) 化為一些可檢測的信號，最通常為化學(xué)底物的顏色變化。在夾屯、化ISA中，將可W結(jié)合至抗 原的捕獲抗體固定至表面。其它步驟等同于化ISA。
[0156] 在類似于夾屯、化ISA的酶免疫測定化IA)中，將鏈霉抗生物素蛋白固定至表面，然 后將捕獲抗體生物素化，否則與化ISA相同地進(jìn)行其它步驟。本文公開的方法中有利地使用 EIA免疫測定。
[0157] Western印跡(有時稱為蛋白免疫印跡)是用于檢測組織勻漿或提取物的給定樣品 中的特定蛋白的廣泛使用的分析技術(shù)。其使用凝膠電泳W(wǎng)通過多膚的長度(變性條件)或通 過蛋白3-D結(jié)構(gòu)(天然/非變性條件)分離天然或變性的蛋白。然后將蛋白轉(zhuǎn)移至膜(通常為 硝化纖維素或PVD巧，在膜上，使用對于目標(biāo)蛋白特異性的抗體探測(檢測)它們。
[0158] 祀向試劑諸如例如，對于角蛋白7和角蛋白19和/或它們的片段特異性的抗體、抗 原結(jié)合片段或變體、融合體或衍生物可用于檢測角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其 片段的表達(dá)。本發(fā)明的祀向試劑被有利地提供為組合物，但也可W分開、但在彼此之后提 供。本發(fā)明的方法因此提供了結(jié)合至角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的抗 體、抗原結(jié)合片段或變體、融合體或衍生物?？蒞，如本文進(jìn)一步描述，通過例如用放射性標(biāo) 記、巧光標(biāo)記、半抗原標(biāo)記諸如生物素或酶諸如辣根過氧化物酶或堿性憐酸酶直接標(biāo)記抗 體本身，檢測抗體?；蛘?，使用間接標(biāo)記，其中未標(biāo)記的一抗與標(biāo)記的二抗結(jié)合使用，所述標(biāo) 記的二抗包含例如對于一抗特異性的抗血清、多克隆抗血清或單克隆抗體。IHC和ICC方案 是本領(lǐng)域中眾所周知的并且可商購，參見例如Antibodies :A Laboratoir Manual,化rlow and Lane(Cold Spring Harbor Laboratory press ,Cold Spring Harbor,NY 1988)和 Current Protocols in Immunology,曰nd Current Protocols in Molecular Biology, both John Wiley and Sons,Inc.,N.Y.)，其通過引用并入本文。
[0159] 如上所掲示，本發(fā)明提供了改進(jìn)惡性寶生性疾病諸如例如肺癌、膀脫癌、食道癌 和/或卵巢癌的診斷和/或預(yù)后的靈敏度和特異性的方式和方法。更具體地，本發(fā)明提供了 運(yùn)樣的組合物，其對于惡性寶生性疾病的檢測給出更好的靈敏度，W便改進(jìn)化ISA和EIA中 W及IHC和ICC中的惡性寶生性蛋白標(biāo)志物的檢測，由此當(dāng)進(jìn)行具有惡性寶生性疾病諸如例 如肺癌、膀脫癌、食道癌和/或卵巢癌的患者的診斷和/或預(yù)后時給出更一致和可靠的結(jié)果。
[0160] 進(jìn)一步，根據(jù)本發(fā)明的方法將與可用方法相比改進(jìn)惡性寶生性疾病諸如例如肺 癌、膀脫癌、食道癌和/或卵巢癌的鑒定。
[0161] 本文方法中使用的祀向試劑因此顯示當(dāng)與其它已知方法諸如例如CYFRA 21-1相 比時各種惡性寶生性疾病的改進(jìn)檢測(參見本文給出的實(shí)施例）。
[0162] 實(shí)施例2-5顯示，通過角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的表達(dá)鑒定 惡性寶生性疾病諸如例如肺癌、膀脫癌、食道癌和/或卵巢癌。
[0163] 所述方法用特異性結(jié)合至角蛋白7與角蛋白19和/或其片段的異型復(fù)合物的抗體 檢測惡性寶生性疾病諸如例如肺癌、膀脫癌、食道癌和/或卵巢癌。
[0164] gQ
[0165] ^明的方法包括使用至少兩種祀向試劑諸如例如兩種一抗、抗原結(jié)合片段、變 體、融合體、衍生物或其片段。至少一種第一一抗特異性結(jié)合至角蛋白7或其片段，且至少一 種第二一抗特異性結(jié)合至角蛋白19或其片段。所述第一和第二一抗兩者均能夠特異性且同 時結(jié)合至角蛋白7與角蛋白19和/或它們的片段的異型復(fù)合物和/或其片段。
[0166] 也稱為細(xì)胞角蛋白7(CK7)或肌凝集素（S化）的角蛋白7化7KNCBI參考序列： 005547.3，NCBI基因 ID: 3855)是在人中由KRT7基因編碼的蛋白。角蛋白7是II型角蛋白，且 與編碼II型角蛋白的其它基因在染色體12ql2-ql3的區(qū)域中聚集在一起。K7是469個氨基酸 長的51kDa蛋白，并且具有如圖1中所見的一般結(jié)構(gòu)。替代剪接可W導(dǎo)致幾種轉(zhuǎn)錄變體。其在 內(nèi)部器官腔內(nèi)層的簡單上皮中和腺導(dǎo)管和血管中特異性表達(dá)）。
[0167] 角蛋白19化19)(NCBI參考序列:NP_002267.2，NCBI基因 ID:3880)也稱為細(xì)胞角蛋 白19(CK19)，并且是在角皮（圍繞正在發(fā)育的表皮的淺表層）中特異性發(fā)現(xiàn)的I型角蛋白。 K19是400個氨基酸長的44kDa蛋白，并且具有如圖1中所見的一般結(jié)構(gòu)。K19在人中由KRT19 基因編碼且位于染色體17ql2-q21基因的區(qū)域中。
[0168] 體內(nèi)角蛋白組裝為異源聚合物，即I型和II型蛋白形式異源二聚體，其進(jìn)而組裝W 形成四聚體。兩個單體通過將它們的a螺旋桿卷繞成呈對齊和相同方向取向的卷曲螺旋而 形成平行二聚體，然后兩個二聚體W交錯反平行取向并行接合W形成雙向四聚體(參見圖 1)。當(dāng)角蛋白K7和K19組裝成異源二聚體和四聚體時，形成角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合 物。
[0169] 如本文所使用的術(shù)語"角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物"意欲包括源自全長角蛋 白7和全長角蛋白19及其片段之間的平行和對齊二聚體的分子實(shí)體。其進(jìn)一步包括角蛋白7 和角蛋白19之間的二聚體重疊成角蛋白7和角蛋白19及其片段之間的反平行四聚體。其進(jìn) 一步包括由運(yùn)些四聚體及其任何片段組裝的寡聚物、原絲和細(xì)絲。對于角蛋白的異型復(fù)合 物的總體結(jié)構(gòu)，參見圖1。
[0170] 在角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物中，在源自異型復(fù)合物的角蛋白7部分的不間 斷序列中有利地存在最少至少3個、優(yōu)選至少5個或至少10個、或至少15個、或至少20個、或 至少25個或至少30個、但更優(yōu)選多于40個氨基酸，并且在源自異型復(fù)合物的角蛋白19部分 的不間斷序列中必須存在最少至少3個、優(yōu)選至少5個或至少10個、或至少15個、或至少20 個、或至少25個或至少30個、但更優(yōu)選多于40個氨基酸。所述氨基酸必須分別對于角蛋白7 或角蛋白19是獨(dú)特的。
[0171] 有利地，所述不間斷序列中的最少至少3個、優(yōu)選至少5個或至少10個、或至少15 個、或至少20個、或至少25個或至少30個、但更優(yōu)選多于40個氨基酸來自角蛋白7蛋白中的 256-412氨基酸序列。更優(yōu)選地，所述不間斷序列來自角蛋白7中的300-380氨基酸序列。
[0172] 有利地，所述不間斷序列中的最少至少3個、優(yōu)選至少5個或至少10個、或至少15 個、或至少20個、或至少25個或至少30個、但更優(yōu)選多于40個氨基酸來自角蛋白19蛋白中的 244-400氨基酸序列。更優(yōu)選地，所述不間斷序列來自角蛋白19中的311-375氨基酸序列。
[0173] 抗體
[0174] 在一個方面，本發(fā)明提供了包括使用至少兩種祀向試劑，諸如例如兩種一抗、抗原 結(jié)合片段、或其變體、融合體或衍生物W檢測生物樣品中的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合 物和/或其片段的存在的方法，其中第一一抗、抗原結(jié)合片段、或其變體、融合體或衍生物特 異性結(jié)合至所述異型復(fù)合物的角蛋白7或其片段，且第二一抗、抗原結(jié)合片段、或其變體、融 合體或衍生物特異性結(jié)合至所述異型復(fù)合物的角蛋白19或其片段。有利地，所述至少兩種 抗體、抗原結(jié)合片段、或其變體、融合體或衍生物一起存在于抗體混合物中，其呈使用者即 用的形式，或需要在其使用前稀釋的濃縮溶液，有時稱為儲備溶液。
[0175] 因此，本發(fā)明的一個方面包括包含識別角蛋白7膚和/或其片段的至少一種第一一 抗、抗原結(jié)合片段或其變體、融合體或衍生物和識別角蛋白19膚和/或其片段的至少一種第 二一抗、抗原結(jié)合片段或其變體、融合體或衍生物的組合物，其中第一和第二一抗能夠特異 性且同時結(jié)合至角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段。
[0176] 如本文所使用的"特異性結(jié)合至"或"與...特異性反應(yīng)"意欲等于"能夠選擇性結(jié) 合"或"特異性結(jié)合至"。如本文所使用的該表述意指，抗體或其抗原結(jié)合片段或變體、融合 體或衍生物，包括任何抗體衍生的結(jié)合部分，其能夠結(jié)合至分子的抗原，并且進(jìn)一步與另一 種蛋白相比更強(qiáng)至少10倍、例如更強(qiáng)至少50倍或更強(qiáng)至少100倍結(jié)合。所述結(jié)合部分能夠在 生理?xiàng)l件下（例如在體內(nèi)）選擇性結(jié)合至所述蛋白。用于測量相對結(jié)合強(qiáng)度的合適的方法包 括免疫測定，例如其中所述結(jié)合部分是抗體?；蛘撸Y(jié)合可W使用競爭性測定或使用 Biacore(R)分析(Biacore International AB,瑞典）進(jìn)行評價。
[0177] 如本文所使用的術(shù)語"特異性且同時結(jié)合至"意指第一和第二祀向試劑特異性且 同時結(jié)合至角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段，且形成包含所述第一和第二祀 向試劑和角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的=聯(lián)體。在足夠長使得通過本文 所述的任何方式或方法或者另外通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式或方法檢測復(fù)合物的時 間段過程中，所述第一和第二祀向試劑將和角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段 形成所述=聯(lián)體。
[0178] 在一個方面實(shí)施方案中，所述第一和第二抗體或抗原結(jié)合片段或其變體、融合體 或衍生物各自結(jié)合至角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的分開抗原位點(diǎn)。典型 地，所述第一一抗與角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的K7部分上存在的抗原 性位點(diǎn)特異性反應(yīng)，且所述第二一抗與角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的 K19部分上存在的抗原性位點(diǎn)特異性反應(yīng)。
[0179] 因?yàn)榕c螺旋結(jié)構(gòu)平行且對齊比對角蛋白7和角蛋白19之間的異型復(fù)合物的兩個單 體角蛋白7和角蛋白19,所W分別結(jié)合至角蛋白7和角蛋白19上從螺旋1A開始至螺旋2B的對 應(yīng)位置(參見圖1)的任何兩種抗體將不同時結(jié)合。運(yùn)意味著，在角蛋白7卷繞角蛋白19的情 況下，對應(yīng)的暴露位置由于空間原因?qū)⒉辉试S兩種抗體的同時結(jié)合。運(yùn)進(jìn)一步例舉為，例 如，角蛋白19上的氨基酸271-291與角蛋白7上的氨基酸283-303在卷曲螺旋中配對起來。如 果針對角蛋白7的抗體在角蛋白7上的283-303的序列內(nèi)結(jié)合，則針對角蛋白19的抗體將因 為空間位阻而不能同時結(jié)合至異型復(fù)合物中的角蛋白19上的氨基酸271-291。
[0180] 特異性結(jié)合至角蛋白7的許多可用抗體可W用于本文呈現(xiàn)的方法中，諸如例如(：- 35、C-62、C-68、C18、C35、KS 7.18、〇)5-68、1?化、1?〇(105。然而，一種有利地用于本文呈現(xiàn)的 方法中的抗體是由得自ProgenBiotechnik，GmBH，德國的克隆Ks7.18產(chǎn)生的角蛋白7單克 隆抗體。單克隆抗體KS 7.18特異性結(jié)合至角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段 的K7部分的氨基酸300-350。
[0181] 將特異性結(jié)合至角蛋白19的可用抗體的實(shí)例是453-8/42.26曰1?11(319.1、81- 19.21、CCD003、CCD004、CKS04、CKS06、SA 21、SA 45、Ks 19.2、LP2K。然而，一種有利地用于 本文呈現(xiàn)的方法中的抗體是由得自Roche Diagnostics的克隆BM-19.21產(chǎn)生的也稱為BM- 19.21單克隆抗體的得自？'〇旨61161〇16油1114,61118哺化3 19.2單克隆抗體。81-19.21特異性 結(jié)合至角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的K19部分的氨基酸346-367。幾種針 對角蛋白 19的抗體描述于:Epitope Specificity of SOMonoklonal Antibodies against Cytokeratin Antigens:The ISOBM TD-lworkshop,Tumor Biol 1998;19:132-152。
[0182] 有利地，所述第一和第二一抗或抗原結(jié)合片段或其變體、融合體或衍生物各自作 為含水形式或冷凍干燥的粉末形式的抗體混合物提供于組合物中。對于后者，在使用前需 要再水合步驟W便將抗體置于可用液體形式中。
[0183] 或者，分開提供所述第一和第二一抗，即，當(dāng)在本文呈現(xiàn)的方法中使用時，一種抗 體在另一種之前提供。在一個實(shí)施方案中，將識別角蛋白7膚和/或其片段的第一一抗提供 給含有角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的樣品。第一一抗將結(jié)合至角蛋白7 與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的K7部分上存在的抗原性位點(diǎn)，且形成抗原-K7-抗 體復(fù)合物。其后，將識別角蛋白19膚和/或其片段的第二一抗提供給含有角蛋白7與角蛋白 19的異型復(fù)合物-K7-抗體的樣品。所述第二一抗將結(jié)合至角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合 物的K19部分上存在的抗原性位點(diǎn)，且形成K19-抗體-抗原-K7-抗體復(fù)合物。
[0184] 在一個替代實(shí)施方案中，將識別角蛋白19膚和/或其片段的第二一抗提供給含有 角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的樣品。所述第二一抗將結(jié)合至角蛋白7與 角蛋白19的異型復(fù)合物的K19部分上存在的抗原性位點(diǎn)，且形成抗原-K19-抗體復(fù)合物。其 后，將識別角蛋白7膚和/或其片段的第一一抗提供給含有角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合 物-K19-抗體的樣品。所述第一一抗將結(jié)合至角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物的K7部分上 存在的抗原性位點(diǎn)，且形成K7-抗體-抗原-K19-抗體復(fù)合物。
[0185] 所述抗體可W是完整的抗體或其片段，例如，抗原結(jié)合片段，或其變體、融合體或 衍生物，只要其能夠在體外結(jié)合至期望的蛋白。運(yùn)樣的結(jié)合特異性可W通過本領(lǐng)域中眾所 周知的方法來確定，諸如例如，ELISA、EIA、免疫組織化學(xué)、免疫沉淀、Western印跡、色譜法 和使用表達(dá)所有亞基或其異源二聚體的經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)(參見實(shí)施例）。
[0186] "抗體"包括任何物種諸如曬齒類動物例如小鼠、大鼠、豚鼠或非曬齒類動物諸如 兔、山羊、綿羊、狗、豬、駱駝、單峰駱駝、驢、馬或雞的實(shí)質(zhì)上完整的抗體分子，W及嵌合抗 體、人源化抗體、人抗體(其中相對于天然存在的人抗體突變至少一個氨基酸）、單鏈抗體、 雙特異性抗體、抗體重鏈、抗體輕鏈、抗體重和/或輕鏈的同源二聚體和異源二聚體，W及其 抗原結(jié)合片段和衍生物。例如，所述抗體可W是單克隆抗體。
[0187] 抗原特異性由可變結(jié)構(gòu)域賦予，并且不依賴于恒定結(jié)構(gòu)域，如從設(shè)及都包含一個 或多個可變結(jié)構(gòu)域的抗體片段的細(xì)菌表達(dá)的實(shí)驗(yàn)所知。運(yùn)些分子包括化b樣分子;Fv分子； 單鏈Fv(ScFv)分子，其中VH和化伴侶結(jié)構(gòu)域經(jīng)由柔性的寡膚連接;和包含分離的V結(jié)構(gòu)域的 單結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)。參與合成保留其特異性結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段的技術(shù)的一般綜述可見 于Winter&Milstein( 1991 )NaUire ：349，293-299。
[0188] 因此，"抗原結(jié)合片段"意指能夠結(jié)合至蛋白K7或K19或其片段和角蛋白7與角蛋白 19的異型復(fù)合物和/或其片段中任一種的抗體的功能片段。示例性抗原結(jié)合片段可W選自 Fv片段(例如，單鏈Fv和二硫鍵鍵合的Fv)，F(xiàn)ab樣片段(例如，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)ab'片段和F(ab)2片 段），單抗體鏈（例如，重鏈或輕鏈），單可變結(jié)構(gòu)域（例如，VH和化結(jié)構(gòu)域）和結(jié)構(gòu)域抗體 (dAb，包括單和雙形式;即dAb-接頭-dAb)。
[0189] 因此，在一個實(shí)施方案中，所述抗體或抗原結(jié)合片段或其變體、融合體或衍生物包 含完整抗體或由其組成。在一個實(shí)施方案中，所述抗體是單克隆抗體。
[0190] 例如，所述抗體或抗原結(jié)合片段或其變體、融合體或衍生物基本上由完整抗體組 成。"基本上由…組成"意指所述抗體或抗原結(jié)合片段、其變體、融合或衍生物由足W保留對 于兩種不同的蛋白K7和K19或其片段中任一種的結(jié)合特異性的完整抗體的部分組成。在進(jìn) 一步實(shí)施方案中，兩種不同的蛋白K7和K19是人來源的。
[0191] 術(shù)語"抗體"還包括所有類型的抗體，包括IgG、IgA、IgM、I曲和IgE。然而，在一個實(shí) 施方案中，所述抗體是IgG分子，諸如IgG 1、IgG2、IgG3或IgG4分子。在一個實(shí)施方案中，所述 抗體是IgGl分子。在一個進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述抗體是具有K輕鏈的IgGl分子。
[0192] 在一個進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述抗體可W是非天然存在的抗體。當(dāng)然，當(dāng)所述抗體 是天然存在的抗體時，其W分離的形式(即，不同于其在自然界中發(fā)現(xiàn)的形式)提供。
[0193] 本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括抗體及其抗原結(jié)合片段的修飾版本，例如通過聚乙二醇或 其它合適的聚合物的共價連接修飾，及其用途。
[0194] 生成抗體和抗體片段的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的。例如，抗體可W經(jīng)由W下幾 種方法的任一種來生成，所述方法采用誘導(dǎo)抗體分子的體內(nèi)產(chǎn)生，篩選免疫球蛋白文庫，或 通過培養(yǎng)的細(xì)胞系生成單克隆抗體分子。運(yùn)些包括但不限于，雜交瘤技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤 技術(shù)和邸病毒化BV)-雜交瘤技術(shù)。
[01M]例如，生成針對K7或K19的單克隆或多克隆抗體可W通過免疫來進(jìn)行，在所述免疫 中，可W將完整蛋白或其合適的片段注入非人哺乳動物(諸如小鼠或兔），隨后加強(qiáng)注射，W 產(chǎn)生抗體反應(yīng)?？蒞針對其中含有的多克隆抗體分離從被免疫的動物分離的血清，或者可 W使用來自被免疫動物的脾臟用于產(chǎn)生雜交瘤和單克隆抗體。
[0196] 在一個實(shí)例中，針對一種蛋白的單克隆抗體可W根據(jù)Kohler和Mil stein陽曰化re, 256:495，1975)的經(jīng)典方法或其衍生方法從鼠雜交瘤制備。簡言之，小鼠（諸如Ba化/c)在幾 周的時間段內(nèi)被重復(fù)地接種幾微克選擇的蛋白或其膚片段，或其合適的載體綴合物。然后 將小鼠處死，并且分離脾臟的抗體產(chǎn)生細(xì)胞。借助聚乙二醇將脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融 合，并且通過將該體系在包含氨基蝶嶺的選擇性培養(yǎng)基化AT培養(yǎng)基)上生長而破壞過量的 未融合細(xì)胞。將成功融合的細(xì)胞稀釋，并且將稀釋物的各等分試樣置于微量滴定板的各孔 中，在所述微量滴定板的各孔中繼續(xù)培養(yǎng)物的生長。
[0197] 通過經(jīng)由免疫測定程序和其衍生方法檢測各孔的上清液中的抗體而鑒定抗體產(chǎn) 生克隆，所述免疫測定程序諸如ELISA，如最初由EngvalKEnzymol.，70:419，1980)所述。
[0198] 可W擴(kuò)增選擇的陽性克隆，并且收獲其單克隆抗體產(chǎn)物用于使用。
[0199] 抗體的商業(yè)來源包括DAK0 A/"S、Abeam、Lab Vision、BioCare Medical、Cell Marque Corp.Abnova、Acris、Progen、Santa cruz biotech等。
[0200] 通過對免疫動物采血和用合適的多克隆抗體-其滴度選擇適當(dāng)?shù)膭游锒b定產(chǎn)生 多克隆抗體的動物。
[0201] 在一些實(shí)施方案中，在使用前純化抗體。使用本領(lǐng)域中可用且技術(shù)人員已知的技 術(shù)完成抗體的純化。
[0202] 抗體K7和K19的生成描述于本領(lǐng)域中且可得自如本文所述的商業(yè)來源，或者使用 技術(shù)人員已知的技術(shù)使用本文所附且因此通過引用并入本文的參考文獻(xiàn)可得。
[0203] 抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物也可W通過重組的方式產(chǎn)生。針對選擇的抗原和 蛋白的合適的單克隆抗體可W通過技術(shù)人員已知的技術(shù)制備?？贵w片段也可W使用本領(lǐng)域 中眾所周知的方法來獲得。例如，抗體片段可W通過抗體的蛋白酶水解，或者通過在大腸桿 菌中或哺乳動物細(xì)胞(例如，中國倉鼠卵巢細(xì)胞培養(yǎng)物或其它蛋白表達(dá)系統(tǒng)）中表達(dá)編碼該 片段的DNA來制備。或者，抗體片段可W通過經(jīng)由常規(guī)方法胃蛋白酶或者木瓜蛋白酶消化完 整抗體而獲得。
[0204] 因此，在一個實(shí)施方案中，如本文呈現(xiàn)的方法中使用的一抗中的至少一種是單克 隆抗體。在一個進(jìn)一步實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法中使用的一抗中的至少一種是重組抗體。 [020日]或者，可W使用duolink(〇-link bioscience)檢測復(fù)合物形成。常規(guī)免疫巧光可 W掲示個體蛋白的存在，但無法掲示不同蛋白之間的異源二聚體的形成。使用Duolink，將 可能恰好定位異源二聚化發(fā)生且定量相互作用的相對程度的位置。因此，可能使用duolink 技術(shù)來使用一種針對角蛋白7的抗體和一種針對角蛋白19的抗體定位和定量角蛋白7和角 蛋白19之間的異型復(fù)合物，其中兩種抗體同時結(jié)合至角蛋白7和角蛋白19之間是異型復(fù)合 物。
[0206] 本文描述的抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物，或包含所述抗體或其抗原結(jié)合片段 或衍生物的組合物可W凍干用于儲存且在使用前重構(gòu)于合適的載體中?？蒞利用任何合適 的凍干方法(例如噴霧干燥、結(jié)塊干燥(cake化ying))和/或重構(gòu)技術(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將 理解，凍干和重構(gòu)可導(dǎo)致不同程度的抗體活性損失，（例如，用常規(guī)免疫球蛋白，IgM抗體趨 于具有比IgG抗體更大的活性），并且使用水平可能不得不向上調(diào)節(jié)來補(bǔ)償。在一個實(shí)施方 案中，凍干(冷凍干燥)的組合物損失當(dāng)重新水合時其活性(在凍干之前）的不超過約20%， 或不超過約25%，或不超過約30%，或不超過約35%，或不超過約40%，或不超過約45%，或 不超過約50%。本領(lǐng)域技術(shù)人員將進(jìn)一步理解的是，本文描述的抗體及其抗原結(jié)合片段、變 體、融合體和衍生物可單體形式或其同源或異源多聚體(例如二聚體、=聚體、四聚體、 五聚體等)的形式存在。
[0207] 本文進(jìn)一步提供了所述一抗或其片段可W用可檢測部分直接或間接標(biāo)記。直接標(biāo) 記意指可檢測部分附接至所述抗體。間接標(biāo)記意指可檢測部分附接至接頭，諸如例如二抗 或=抗。所述可檢測部分可W是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何部分或標(biāo)志物，或者如本文所 述，并且作為能夠生成允許其所附接的分子的直接或間接定量或相對測量的運(yùn)樣的部分。
[0208] 多種多樣的可檢測部分或標(biāo)記和綴合技術(shù)是已知的，并且深入報道于科學(xué)和專利 文獻(xiàn)中。合適的標(biāo)記包括技術(shù)人員眾所周知的放射性核素、酶、底物、輔因子、抑制劑、巧光 劑、化學(xué)發(fā)光劑、磁性顆粒等。所述可檢測部分可W是單一原子或分子，其直接或間接參與 可檢測物質(zhì)的產(chǎn)生。任選地，所述可檢測部分選自：巧光部分、酶連接部分、生物素化部分和 放射性標(biāo)記部分，例如，如W下本文中進(jìn)一步描述。"標(biāo)記"、"可檢測部分"意指可直接(例 如，整合入多膚的巧光分子)或間接(例如，借助用具有整合的巧光分子的二級、=級或進(jìn)一 步試劑結(jié)合至一抗)附接至目標(biāo)分子的任何可檢測的標(biāo)簽。因此，標(biāo)記、標(biāo)志物或可檢測部 分是可W例如用成像方法顯現(xiàn)的任何標(biāo)簽。
[0209] "可檢測部分"進(jìn)一步包括W下含義:該部分是當(dāng)將本發(fā)明的組合物提供給生物樣 品諸如組織樣品或生物流體樣品之后位于目標(biāo)部位時可在體外檢測的部分。其包括，可檢 測部分是生成信號的且如果該可檢測部分可被檢測并且可確定該部分的相對量和/或位置 (例如，組織樣品上的位置），則該可檢測部分是更方便的且因此被包括在進(jìn)一步實(shí)施方案 中?？蓹z測部分是本領(lǐng)域中眾所周知的。
[0210] 因此，抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物或包含所述抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生 物的組合物可用于運(yùn)樣的方法中，所述方法在本文進(jìn)一步例舉為用于檢測角蛋白7與角蛋 白19的異型復(fù)合物和/或其片段、診斷或預(yù)后體外生物樣品的惡性寶生性疾病諸如例如肺 癌、膀脫癌、食道癌和卵巢癌的方法和用途。在進(jìn)一步實(shí)施方案中，本文例舉所用的免疫化 學(xué)方法。
[0211] 合適的可檢測部分是本領(lǐng)域中眾所周知的，并且將運(yùn)些部分附接或連接至多膚和 蛋白是本領(lǐng)域中進(jìn)一步眾所周知的?？蓹z測部分的進(jìn)一步實(shí)例是酶;酶底物;酶抑制劑;輔 酶;酶前體;酶蛋白；巧光物質(zhì);色素;化學(xué)發(fā)光化合物;發(fā)光物質(zhì)；顯色物質(zhì);磁性物質(zhì);或金 屬顆粒諸如金膠體;放射性物質(zhì)諸如1251、1311、3中、化、 355或14。憐酸化的酪衍生物諸如硝基 苯憐酸醋、巧光素衍生物或二氧雜環(huán)下燒(dioxetane)衍生物;或類似物。所述酶可W是脫 氨酶;氧化還原酶諸如還原酶或氧化酶;催化官能團(tuán)諸如氨基、簇基、甲基、酷基或憐酸醋基 的轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移酶;可水解鍵諸如醋鍵、糖巧鍵、酸鍵或膚鍵的水解酶;裂解酶;異構(gòu)酶;或連 接酶。所述酶還可W綴合至另一酶。所述酶可通過酶促循環(huán)來檢測。例如，當(dāng)可檢測標(biāo)記是 堿性憐酸酶時，可通過觀察由合適的底物諸如傘形酬衍生物生成的巧光或發(fā)光來進(jìn)行測 量。傘形酬衍生物可包含4-甲基-傘形酬憐酸醋（4-methy-umbel 1 ipheirl phosphate)。巧 光或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記可W是巧光素異硫氯酸醋;若丹明衍生物諸如若丹明B異硫氯酸醋或四 甲基若丹明異硫氯酸醋;丹橫酷氯(5-(二甲基氨基)-1-糞橫酷氯）；丹橫酷氣;巧光胺(4-苯 基螺[巧喃-2(3H);基-(3yH)-異苯并巧喃]-3:35-二酬）；藻膽蛋白諸如藻藍(lán)蛋白或藻紅蛋 白；叮晚鐵鹽(acridini皿salt);魯米諾化合物諸如巧光素、巧光素酶或水母發(fā)光蛋白；咪 挫類;草酸醋;稀±元素諸如館化U)、鋪(Tb)或衫(Sm)的馨合化合物;或香豆素衍生物諸如 7-氨基-4-甲基香豆素。所述標(biāo)記也可W是半抗原，諸如金剛棚(adamantine)、巧光素異硫 氯酸醋或巧挫。當(dāng)與含有部分的多價抗體或(鏈霉抗生物素蛋白接觸時，所述半抗原可允許 形成聚集體。可檢測部分的進(jìn)一步實(shí)例包括但不限于W下:放射性同位素，例如化、Mc、35s 、1231、1251、1311、99了。、1111〇、9種、18836)，放射性核素（例如11(：、18。、64加），巧光標(biāo)記，（例如 門TC、若丹明、銅系元素巧光粉（Ian化anide曲OS地or)、幾花青）；酶促標(biāo)記(例如辣根過氧 化物酶、e-半乳糖巧酶、巧光素酶、堿性憐酸酶），化學(xué)發(fā)光的生物素基團(tuán)和由二級結(jié)合實(shí)體 識別的預(yù)定的多膚表位(例如，亮氨酸拉鏈對序列，二抗的結(jié)合位點(diǎn)，金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域、表位 或蛋白標(biāo)簽、碳水化合物類）。在一些實(shí)施方案中，將標(biāo)記通過各種長度的間隔臂附接W減 少可能的空間位阻。
[0212] 在間接標(biāo)記中，使額外的分子或部分與抗體-抗原復(fù)合物（即一抗和其結(jié)合的蛋白 之間的免疫復(fù)合物)接觸，或者在抗體-抗原復(fù)合物（即一抗和其結(jié)合的蛋白之間的免疫復(fù) 合物)的位點(diǎn)生成。例如，可檢測部分諸如酶可被附接至如本文例舉的檢測抗體或檢測分子 或者與如本文例舉的檢測抗體或檢測分子締合。然后，信號生成分子可在免疫復(fù)合物的位 點(diǎn)生成可檢測的信號。例如，當(dāng)提供有合適的底物時，酶可在免疫復(fù)合物的位點(diǎn)生成可見的 或可檢測的產(chǎn)物。
[0213] 作為間接標(biāo)記的另一個實(shí)例，可W結(jié)合至目標(biāo)分子或目標(biāo)抗體(一抗)的額外分子 (其可W稱為結(jié)合劑），諸如針對一抗的二抗，可W與免疫復(fù)合物接觸。所述額外分子可W具 有信號生成分子或可檢測部分。
[0214] 所述額外分子可W是抗體，其因此可W被稱為二抗、=抗或進(jìn)一步抗體。二抗與一 抗的結(jié)合可W第一抗體(或一抗)和目標(biāo)分子形成所謂的夾屯、?？蒞在有效且足W允許形成 二級免疫復(fù)合物的條件和時間段下使免疫復(fù)合物與標(biāo)記的二抗接觸。然后通?？蒞洗涂二 級免疫復(fù)合物W去除任何非特異性結(jié)合的標(biāo)記的二抗，并且然后可W檢測二級免疫復(fù)合物 中剩余的標(biāo)記。所述額外分子還可W是或包括可W結(jié)合至彼此的分子或部分對(諸如生物 素/抗生物素蛋白分子)之一，并且所述檢測抗體或檢測分子然后應(yīng)當(dāng)包括所述對的另一個 成員。
[0215] 間接標(biāo)記的進(jìn)一步實(shí)例包括通過兩步法檢測一抗-抗原(免疫復(fù)合物）。例如，對于 一抗-抗原復(fù)合物之間的一級免疫復(fù)合物具有結(jié)合親和力的分子(其可W被稱為第一結(jié)合 劑），諸如抗體，可W用于形成二級復(fù)合物。洗涂之后，可W再次在有效且足W允許形成=級 復(fù)合物的條件和時間段下使二級復(fù)合物與對于第一結(jié)合劑具有結(jié)合親和力的另一種進(jìn)一 步分子(其可W稱為第二結(jié)合劑)接觸。在該實(shí)例中，所述第二結(jié)合劑可W連接至可檢測的 部分，允許檢測由此形成的=級復(fù)合物。該系統(tǒng)可W進(jìn)一步包含提供信號擴(kuò)增的方式。
[0216] 具有用于信號擴(kuò)增的方式的一級、二級或進(jìn)一步結(jié)合劑的實(shí)例是綴合的抗免疫球 蛋白諸如生物素化的抗體(例如，與抗生物素蛋白/鏈霉抗生物素蛋白綴合)或葡萄球菌蛋 白A(結(jié)合IgG)、蛋白G、葡聚糖、適配子、蛋白、膚、小有機(jī)分子、天然化合物(例如類固醇）、非 膚聚合物，或特異性且有效結(jié)合至與可檢測部分綴合的不是可檢測部分的其它分子的任何 其它分子。在一個進(jìn)一步實(shí)施方案中，二級、=級或進(jìn)一步結(jié)合劑是抗體，諸如抗小鼠綴合 物，例如豬抗小鼠抗體。所述綴合物可W是如上文所述的葡聚糖、HRP生物素、堿性憐酸酶 等。
[0217] 在一個實(shí)施方案中，所述可檢測的部分是與葡聚糖和HRP綴合的豬抗小鼠抗體。
[0218] 在一個進(jìn)一步實(shí)施方案中，二級、=級或進(jìn)一步結(jié)合劑是抗體，諸如抗兔綴合物， 例如山羊抗兔綴合物。所述綴合物可W是與如上文所述的葡聚糖、HRP、生物素等的綴合物。
[0219] 在一個實(shí)施方案中，所述可檢測的部分是與葡聚糖綴合的山羊抗兔。
[0220] 在一個進(jìn)一步實(shí)施方案中，二級、=級或進(jìn)一步結(jié)合劑是抗體，諸如抗山羊綴合 物，諸如例如兔抗山羊綴合物。所述綴合物可W是與如上文所述的葡聚糖、HRP、生物素等的 綴合物。
[0221] 在一個實(shí)施方案中，所述可檢測的部分是與葡聚糖和堿性憐酸酶AP綴合的兔抗山 羊。
[0222] 在又一個進(jìn)一步實(shí)施方案中，本文提供的組合物進(jìn)一步包含緩沖液。
[0223] 緩沖液的實(shí)例是化is-緩沖液諸如化is-HCI，和PBS-緩沖液。合適的緩沖液是本領(lǐng) 域中可得且已知的。
[0224] 緩沖液的進(jìn)一步添加劑可W是例如Tween⑥2〇、BSA、疊氮化鋼、甘油和水，W及 約 5.5至約8.0、諸如約5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、 6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0的抑。
[0225] 當(dāng)抗體組合物呈液體形式時，其可被提供為"即用"形式或濃縮形式，所述濃縮形 式可在使用之前在任何合適的緩沖系統(tǒng)中稀釋，諸如在例如本文提供的緩沖系統(tǒng)中或本領(lǐng) 域技術(shù)人員可W明顯的任何中在使用后稀釋例如至少1x10、1x20、1x30、1x40、1x50、1x60、 1 巧0、1x80、1x90、1x100、1x1000、1x10000 和其之間所有范圍和值。
[0226] 在一個有利的實(shí)施方案中，將識別角蛋白7膚和/或其片段的第一一抗單克隆抗體 Ks 7.18綴合至生物素，并且將識別角蛋白19膚和/或其片段的第二一抗BM 19.21綴合至過 氧化物酶(辣根過氧化物酶化RP))。生物素或HRP的綴合是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
[0227] 根據(jù)本發(fā)明的組合物也可W單獨(dú)使用或與用于檢測惡性腫瘤的其它方式組合使 用，所述其它方式包括，但不限于用于檢測和測量另一種腫瘤標(biāo)志物諸如：CA125、皿4、CA 19-9、CEA、CYFRA 21-1、50：、？'〇61?\〔4242、？54的方式或診斷方式諸如超聲、(：1'-掃描、胸部 放射成像和/或1肥標(biāo)志物諸如閒、1(2〇、刊。-1、〔〇乂2、]\11]〇2、963、0-聯(lián)蛋白、953、34-0-612、 ER、CD56、NCAM、K6、K7、K19。 帷引方法和組合物的用途
[0229] 本文描述的抗體或抗原結(jié)合片段或其衍生物，或包含運(yùn)樣的抗體或抗原結(jié)合片段 或其衍生物的組合物可W用于各種免疫方法諸如免疫組織化學(xué)（IHC)和免疫化學(xué)方法中。 用于運(yùn)樣的免疫方法、特別是免疫組織化學(xué)方法的一般方案是本領(lǐng)域中已知的。此外，本發(fā) 明的方法和用途可W與其它診斷方法組合W改善差異診斷的結(jié)果。
[0230] 準(zhǔn)確確定惡性寶生物的存在或不存在的重要性是顯而易見的。對患者和健康護(hù)理 系統(tǒng)兩者的影響也是進(jìn)一步顯而易見的。因此，所述方法和用途的一些實(shí)施方案提供給定 生物樣品內(nèi)的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的檢測。所述方法和用途包括
[0231] 從受試者獲得生物樣品，
[0232] 使所述樣品與本文公開的對于兩種蛋白K7和K19特異性的抗體或抗原結(jié)合片段或 其衍生物，或包含運(yùn)樣的抗體或抗原結(jié)合片段或其衍生物的組合物接觸，
[0233] 檢測所述抗體和角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物或其片段之間的相互作用，
[0234] 其中相互作用的檢測指示角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的存在 或不存在，由此允許例如檢測角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段，檢測生物樣 品中的惡性寶生性疾病，根據(jù)本文公開的任何方法的診斷，預(yù)后等，其結(jié)果之一可W確定受 試者是否是健康的，或者是否具有惡性寶生性疾病。
[0235] 當(dāng)所述惡性寶生性疾病是膽管癌(肝外）、膀脫癌、乳腺癌、未知（原發(fā)性）的癌、子 宮頸癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、食道癌、膽囊癌、胃部（胃）癌、頭頸癌、肝細(xì)胞(肝)癌、下咽癌、 腎癌、喉癌、肝癌（原發(fā)性）、肺癌（非小細(xì)胞）、肺癌（小細(xì)胞）、間皮瘤、非小細(xì)胞肺癌、卵巢 癌、卵巢上皮癌(表面上皮-間質(zhì)瘤）、卵巢生殖細(xì)胞腫瘤、卵巢低惡性潛能腫瘤、膜腺癌、前 列腺癌、直腸癌、腎細(xì)胞癌（腎癌）、唾液腺癌、小細(xì)胞肺癌、小腸癌、胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌、 腎孟和輸尿管的移行細(xì)胞癌或子宮癌(子宮內(nèi)膜)時，可W使用本發(fā)明的組合物和方法。
[0236] 當(dāng)所述惡性寶生性疾病是肺癌、膀脫癌、食道癌、肝細(xì)胞癌、膜腺癌、胃癌和卵巢癌 時，本發(fā)明的組合物和方法是合適的。
[0237] 當(dāng)所述惡性寶生性疾病是肺癌、膀脫癌、食道癌或卵巢癌之一時，本發(fā)明的組合物 和方法是特別合適的。
[023引相對于健康個體，對于運(yùn)些個體，良性疾病趨于提高一點(diǎn)腫瘤標(biāo)志物值。升高標(biāo)志 物濃度的典型良性疾病是膽道、肝臟和腎臟的疾病。由于運(yùn)些升高的值，邊界線區(qū)或"灰色 區(qū)域"經(jīng)常用于大多數(shù)標(biāo)志物，且該灰色區(qū)域也使得所述標(biāo)志物不適合于診斷目的。邊界線 區(qū)中的腫瘤標(biāo)志物值是非常不確定的，并且不能被歸類為腫瘤或良性疾病。落入該灰色區(qū) 域內(nèi)的受試者可能被錯誤地懷疑為具有或不具有癌癥。落入該灰色區(qū)域內(nèi)的受試者將得益 于本文提供的方法。在公開的方法和用途內(nèi)，角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片 段可W升高水平、W降低水平存在，或完全不存在于取自特定臨床狀態(tài)(例如，健康或具有 惡性寶生性疾病諸如例如肺癌、膀脫癌、食道癌或卵巢癌）的受試者的樣品內(nèi)。
[0239]因此，給定生物樣品中發(fā)現(xiàn)的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的差 異存在提供關(guān)于所測試的受試者是否具有惡性寶生性疾病諸如例如肺癌、膀脫癌、食道癌 和卵巢癌或是健康的概率的有用信息。所測試的受試者具有惡性寶生性疾病諸如例如肺 癌、膀脫癌、食道癌和卵巢癌或是健康的概率取決于取自所述受試者的測試樣品中的角蛋 白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的量與取自健康受試者的生物樣品中的角蛋白7 與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的量或已知存在于健康受試者中的對照水平是否是 統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。
[0240] 給定生物樣品中發(fā)現(xiàn)的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的差異也 可用于確定已知具有惡性寶生性疾病諸如例如肺癌、膀脫癌、食道癌或卵巢癌的受試者是 否響應(yīng)于所施用的治療性處理。將治療時所取的樣品中檢測的角蛋白7與角蛋白19的異型 復(fù)合物和/或其片段的量與施用治療前所取的樣品中檢測的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù) 合物和/或其片段的量進(jìn)行比較。此外，將治療時所取的樣品中檢測的角蛋白7與角蛋白19 的異型復(fù)合物和/或其片段的量與表明健康受試者的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/ 或其片段的參考進(jìn)行比較。基于比較，可W確定所述受試者是否響應(yīng)于治療性處理，和響應(yīng) 的程度。
[0241] 此外，給定生物樣品中發(fā)現(xiàn)的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的存 在的差異也可用于確定已知具有惡性寶生性疾病諸如例如肺癌、膀脫癌、食道癌或卵巢癌 的受試者是否將響應(yīng)于給定治療性處理。將取自被診斷為具有惡性寶生性疾病諸如例如肺 癌、膀脫癌、食道癌或卵巢癌的受試者的樣品中檢測的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物 和/或其片段的量與取自已經(jīng)經(jīng)歷不同形式的治療的具有類似診斷的受試者的角蛋白7與 角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的參考實(shí)驗(yàn)對象組進(jìn)行比較。由取自暴露于給定治療 (其中所述治療導(dǎo)致陽性結(jié)果）的受試者的樣品生成的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物 和/或其片段的參考實(shí)驗(yàn)對象組被認(rèn)為表明給定治療對所述受試者具有積極作用，且因此 被認(rèn)為是成功的。由取自暴露于給定治療(其中所述治療導(dǎo)致中性結(jié)果)的受試者的樣品生 成的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的參考實(shí)驗(yàn)對象組被認(rèn)為表明給定治 療對所述受試者不具有治療作用，且因此被認(rèn)為是不成功的。由取自暴露于給定治療(其中 所述治療導(dǎo)致陰性結(jié)果）的受試者的樣品生成的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其 片段的參考實(shí)驗(yàn)對象組被認(rèn)為表明給定治療對所述受試者不具有治療作用，且被認(rèn)為是不 成功的?；诒容^，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠?yàn)樗鍪茉囌呤┯米罴阎委熌Ｊ健?br>[0242] 此外，給定生物樣品中發(fā)現(xiàn)的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的差 異存在也可用于確定受試者中的惡性寶生性疾病諸如例如肺癌、膀脫癌、食道癌和卵巢癌 的階段。
[0243] 將取自被診斷為具有惡性寶生性疾病諸如例如肺癌、膀脫癌、食道癌或卵巢癌的 受試者的樣品中檢測的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物的量與取自已經(jīng)具有惡性寶生性 疾病諸如例如肺癌、膀脫癌、食道癌或卵巢癌的特定階段或分期的受試者的參考實(shí)驗(yàn)對象 組進(jìn)行比較?；诒容^，將能夠確定所述受試者內(nèi)的惡性寶生性疾病諸如例如肺癌、膀脫 癌、食道癌或卵巢癌的階段或分期。
[0244] 角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段可W升高水平、W降低水平存在， 或完全不存在于取自特定臨床狀態(tài)(例如，健康或具有惡性寶生性疾病諸如例如肺癌、膀脫 癌、食道癌或卵巢癌）的受試者的樣品內(nèi)。
[0245] 因此，給定生物樣品中發(fā)現(xiàn)的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的任 何存在提供關(guān)于所測試的受試者是否具有惡性寶生性疾病諸如例如肺癌、膀脫癌、食道癌 或卵巢癌或者是健康的概率的有用信息。所測試的受試者具有惡性寶生性疾病諸如例如肺 癌、膀脫癌、食道癌或卵巢癌或是健康的概率取決于取自所述受試者的測試樣品中的角蛋 白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的量與取自健康受試者的生物樣品中的角蛋白7 與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的量或已知存在于健康受試者中的對照水平是否是 統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。
[0246] 被稱為具有惡性寶生性疾病諸如例如肺癌、膀脫癌、食道癌或卵巢癌的受試者具 有其組織的形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和功能改變，使得所述組織可被表征為惡性寶生性疾病諸如 例如肺癌、膀脫癌、食道癌或卵巢癌。惡性寶生性疾病諸如例如肺癌、膀脫癌、食道癌或卵巢 癌已經(jīng)進(jìn)展的階段可W使用目前可用和本文呈現(xiàn)的已知方法來確定。
[0247] 分析角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的存在或不存在的數(shù)據(jù)分析 可包括W下步驟:測定監(jiān)測的生物標(biāo)志物的信號強(qiáng)度(例如，峰的強(qiáng)度），除去"異常值"（偏 離預(yù)定統(tǒng)計(jì)分布的數(shù)據(jù)）。實(shí)例是峰的標(biāo)準(zhǔn)化，運(yùn)是計(jì)算每個峰相對于特定參考的強(qiáng)度的過 程。例如，參考可W是由儀器生成的背景噪聲和/或化學(xué)物質(zhì)(例如，能量吸收分子），其在標(biāo) 度中被設(shè)置為零。然后，對各蛋白檢測的信號強(qiáng)度可在期望標(biāo)度(例如，100)中的相對 強(qiáng)度的形式顯示。在一個實(shí)施方案中，觀察到的給定峰的信號可表示為該峰的強(qiáng)度與在指 定的質(zhì)荷比范圍內(nèi)觀察到的峰和背景噪聲的全部信號的總和的比率。在一個實(shí)施方案中， 標(biāo)準(zhǔn)品可被樣品接納，使得來自該標(biāo)準(zhǔn)品的峰可用作參考W計(jì)算對于檢測的角蛋白7與角 蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段所觀察到的信號的相對強(qiáng)度。
[0248] 可W通常通過使用計(jì)算機(jī)算法將所得數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成各種顯示形式。使用任何上述顯 示形式，可W從信號顯示容易地確定在樣品中是否檢測到角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合 物和/或其片段。
[0249] 示例性方法可W用于例如診斷、預(yù)后、分期惡性寶生性疾病諸如例如肺癌、膀脫 癌、食道癌或卵巢癌，預(yù)測治療結(jié)果，預(yù)測惡性寶生性疾病諸如例如肺癌、膀脫癌、食道癌或 卵巢癌復(fù)發(fā)的可能性等，如本文進(jìn)一步所述。
[0250] 復(fù)發(fā)意指惡性寶生性疾病諸如例如肺癌、膀脫癌、食道癌或卵巢癌在初始（或后 續(xù))治療之后已經(jīng)回復(fù)。代表性初始治療包括放射治療、化學(xué)療法、抗激素治療和/或外科手 術(shù)。
[0251] 本文公開的一些方法可用于預(yù)后惡性寶生性疾病諸如例如肺癌、膀脫癌、食道癌 或卵巢癌。預(yù)后是疾病的可能結(jié)果(通常不依賴于治療）。
[0252] 本文公開的方法可用于預(yù)后，即，預(yù)測疾病的可能結(jié)果，諸如例如完全在運(yùn)樣的復(fù) 發(fā)前收集的樣品中的復(fù)發(fā)。對于具有侵襲性更強(qiáng)的癌癥的受試者，不良（或較差)預(yù)后是可 能的。在一些方法實(shí)施方案中，不良預(yù)后是寶生性疾病的初始診斷之后患者的少于5年存活 (諸如少于1年存活或少于2年存活）。在一些方法實(shí)施方案中，良好預(yù)后是寶生性疾病的初 始診斷之后患者的大于2年存活(諸如大于3年存活、大于5年存活或大于7年存活）。
[0253] 還有其它方法實(shí)施方案預(yù)測患者中的惡性寶生性疾病諸如例如肺癌、膀脫癌、食 道癌或卵巢癌的治療結(jié)果，并且可用于為癌癥患者指導(dǎo)(例如，選擇有用的）治療方式。如本 說明書中別處所討論，角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的表達(dá)預(yù)測治療(例 如免疫療法、熱療法、激光療法、外科手術(shù)、放射療法、化學(xué)療法)可能失敗(例如，疾病將復(fù) 發(fā)）。因此，護(hù)理者可W使用角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段W便就治療(例 如免疫療法、激光療法、外科手術(shù)、熱療法、放射療法、化學(xué)療法)的可能成功建議癌癥患者。 考慮具體受試者的病史的情形，患者和護(hù)理者可W更好地明智決策是否治療(例如，進(jìn)行外 科手術(shù))和/或是否提供替代治療(諸如，外部束放射療法、近距離放射療法、化學(xué)療法或觀 察等待）。
[0254] 因此，本發(fā)明設(shè)及用于通過檢測特定受試者的生物樣品內(nèi)表達(dá)的角蛋白7與角蛋 白19的異型復(fù)合物和/或其片段而診斷和預(yù)后惡性寶生性疾病諸如例如肺癌、膀脫癌、食道 癌或卵巢癌的方法，其中角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的存在或不存在允 許將受試者診斷或預(yù)后為健康的或具有惡性寶生性疾病諸如例如肺癌、膀脫癌、食道癌或 卵巢癌。在一個實(shí)施方案中，所述方法檢測樣品中的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/ 或其片段的存在，其中健康、無病的個體中不表達(dá)所述標(biāo)志物。在相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明 的方法檢測與正常、健康的個體相比在來自具有惡性寶生性疾病諸如例如肺癌、膀脫癌、食 道癌或卵巢癌的個體的樣品中W更高水平存在的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或 其片段的升高水平。
[0255] 本發(fā)明的一個方面是用于檢測生物樣品中的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物 和/或其片段的體外方法，所述方法包括W下步驟
[0256] a)使所述生物樣品與包含至少第一和第二祀向試劑或其片段的組合物接觸;或
[0257] b)使所述生物樣品與識別角蛋白7膚和/或其片段的第一祀向試劑接觸;和
[0258] C)使所述生物樣品與識別角蛋白19膚和/或其片段的第二祀向試劑接觸;和
[0259] d)檢測角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段;其中步驟b)和C)可任 何順序或同時進(jìn)行。
[0260] 例如，在一個實(shí)施方案中，將生物樣品與包含至少兩種祀向試劑的組合物接觸，其 中至少一種第一祀向試劑識別角蛋白7-膚和/或其片段，且至少一種第二祀向試劑識別角 蛋白19-膚和/或其片段。所述第一和第二祀向試劑能夠特異性且同時結(jié)合至角蛋白7與角 蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段。其后借助本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的任何方法或者可 替代地通過如本文所述的有利方法檢測所述第一和第二祀向試劑與角蛋白7與角蛋白19的 異型復(fù)合物和/或其片段的特異性和同時結(jié)合。
[0261] 在一個替代實(shí)施方案中，所述生物樣品不與作為組合物的部分的第一和第二一抗 接觸，但分開提供第一和第二一抗，即一種一抗在另一種之前提供。例如，在一個實(shí)施方案 中，將識別角蛋白7膚和/或其片段的第一一抗與生物樣品接觸。第一一抗將結(jié)合至所述生 物樣品中存在的角蛋白7與角蛋白19或其片段的異型復(fù)合物的K7部分上存在的抗原性位 點(diǎn)。角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段和識別角蛋白7膚和/或其片段的抗體之 間的復(fù)合物將形成。其后，將識別角蛋白19膚和/或其片段的第二一抗提供給含有結(jié)合至識 別角蛋白7膚和/或其片段的第一一抗的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的 生物樣品。所述第二一抗將結(jié)合至角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的K19部 分上存在的抗原性位點(diǎn)，且形成K19抗體-抗原-K7-抗體復(fù)合物，即包含角蛋白7與角蛋白19 的異型復(fù)合物和/或其片段和分別識別角蛋白7和角蛋白19膚和/或它們的片段的兩種一抗 的=重復(fù)合物。
[0262] 在一個替代實(shí)施方案中，將識別角蛋白19膚和/或其片段的第二一抗提供給生物 樣品。第二一抗將結(jié)合至角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的K19部分上存在 的抗原性位點(diǎn)，且形成抗原-K19-抗體復(fù)合物。其后，將識別角蛋白7膚和/或其片段的第一 一抗提供給含有角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段-K19-抗體的樣品。所述第 一一抗將結(jié)合至角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的K7部分上存在的抗原性 位點(diǎn)，且形成K7-抗體-抗原-K19-抗體復(fù)合物，即包含角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/ 或其片段和分別識別角蛋白7和角蛋白19膚和/或它們的片段的兩種一抗的S重復(fù)合物。
[0263] 在一個進(jìn)一步步驟中，可W將所檢測的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其 片段的量與陽性和/或陰性對照進(jìn)行比較，其中所述陽性對照包含角蛋白7與角蛋白19的異 型復(fù)合物和/或其片段，且所述陰性對照不包含角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其 片段。在一個進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述陽性對照包含獲得自被診斷具有惡性寶生性疾病的 受試者的組織或體液，且所述陰性對照是獲得自未患有惡性疾病的健康受試者的生物樣 品。
[0264] 任選地，可W根據(jù)本領(lǐng)域已知或本文所述的標(biāo)準(zhǔn)評分系統(tǒng)完成檢測的抗原-抗體 復(fù)合物的評分。
[0265] 所述樣品當(dāng)然可W是可能包含角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的 任何生物樣品。運(yùn)樣的生物樣品的實(shí)例是來自人，曬齒類動物諸如小鼠、大鼠、豚鼠，或來自 山羊、綿羊、豬、駱駝、狗、貓和甚至兔或另外如本文公開的組織樣品、體液樣品或細(xì)胞樣品。 在一個實(shí)施方案中，所述樣品來自人。在又一個進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述樣品是組織樣品或 人體液樣品，諸如例如血清、血漿、淋己液、滲出液、排泄物、胃酸、胃液、淋己液、粘液、屯、包 液、腹膜液、胸膜液、脈液、唾液、疲液、滑液、淚液、汗液、陰道分泌物、嘔吐物和尿液。所述生 物樣品可能需要為了工作而進(jìn)行準(zhǔn)備，且可W根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來完成樣品 的預(yù)處理。
[0266] 如本文呈現(xiàn)的用于檢測生物樣品中的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其 片段的體外復(fù)發(fā)可W有利地用于
[0267] i)診斷和/或預(yù)后受試者中的惡性寶生性疾病，或
[0268] ii)預(yù)測受試者中的惡性寶生性疾病的治療效力，或
[0269] iii)評價受試者中的惡性寶生性疾病的治療結(jié)果，或
[0270] iv)評價受試者中的惡性寶生性疾病的復(fù)發(fā)，其中所述受試者是具有或懷疑具有 惡性寶生性疾病的哺乳動物。
[0271] 所述惡性寶生性疾病可W是W下中的任一種:膽管癌(肝外）、膀脫癌、乳腺癌、未 知（原發(fā)性）的癌、子宮頸癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、食道癌、膽囊癌、胃部（胃）癌、頭頸癌、肝 細(xì)胞(肝)癌、下咽癌、腎癌、喉癌、肝癌（原發(fā)性）、肺癌(非小細(xì)胞）、肺癌(小細(xì)胞）、間皮瘤、 非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、卵巢上皮癌(表面上皮-間質(zhì)瘤）、卵巢生殖細(xì)胞腫瘤、卵巢低惡性潛 能腫瘤、膜腺癌、前列腺癌、直腸癌、腎細(xì)胞癌(腎癌）、唾液腺癌、小細(xì)胞肺癌、小腸癌、胃癌、 睪丸癌、甲狀腺癌、腎孟和輸尿管的移行細(xì)胞癌、子宮癌(子宮內(nèi)膜）。
[0272] 然而，當(dāng)所述受試者是具有或懷疑具有肺癌、膀脫癌、食道癌、肝細(xì)胞癌、膜腺癌、 胃癌和卵巢癌的哺乳動物時，如本文公開的方法可用于
[0273] i)診斷和/或預(yù)后受試者中的惡性寶生性疾病，或
[0274] ii)預(yù)測受試者中的惡性寶生性疾病的治療效力，或
[0275] i i i)評價受試者中的惡性寶生性疾病的治療結(jié)果，或
[0276] iv)評價受試者中的惡性寶生性疾病的復(fù)發(fā)。
[0277] 當(dāng)所述受試者是具有或懷疑具有肺癌、膀脫癌、食道癌和卵巢癌的哺乳動物時，本 文公開的方法是特別有用的。
[0278] 例如，本發(fā)明的一個方面是用于體外檢測生物樣品中的惡性寶生性疾病的方法。 所述樣品可W是可能包含惡性寶生性疾病的任何生物樣品，所述方法包括W下步驟
[0279] a)使所述生物樣品與如本文所述的組合物接觸;或
[0280] b)使所述生物樣品與識別細(xì)胞角蛋白7膚和/或其片段的第一祀向試劑接觸;和
[0281] C)使所述生物樣品與識別細(xì)胞角蛋白19膚和/或其片段的第二祀向試劑接觸;和
[0282] d)檢測所述細(xì)胞角蛋白7與細(xì)胞角蛋白19的異型復(fù)合物；
[0283 ] 其中步驟b)和C)可W W任何順序或同時進(jìn)行。
[0284] 可W借助本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的任何方法或者可替代地通過如本文所述的 有利方法檢測所述第一和第二祀向試劑與角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段 的特異性和同時結(jié)合，由此檢測生物樣品中的惡性寶生性疾病。
[0285] 在一個進(jìn)一步步驟中，可W將所檢測的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其 片段的量與陽性和/或陰性對照進(jìn)行比較，其中所述陽性對照包含來自患有惡性寶生性疾 病的受試者的細(xì)胞，且所述陰性對照包含未患有惡性寶生性疾病的健康受試者的細(xì)胞。
[0286] 任選地，可W根據(jù)本領(lǐng)域已知或本文所述的標(biāo)準(zhǔn)評分系統(tǒng)完成檢測的抗原-抗體 復(fù)合物的評分。
[0287] -個進(jìn)一步方面是用于體外診斷和/或預(yù)后生物樣品中的惡性寶生性疾病的方 法，所述方法包括W下步驟
[0288] a)使所述生物樣品與如本文定義的組合物接觸;或
[0289] b)使所述生物樣品與識別細(xì)胞細(xì)胞角蛋白7膚和/或其片段的第一祀向試劑接觸； 和
[0290] C)使所述生物樣品與識別細(xì)胞細(xì)胞角蛋白19膚和/或其片段的第二祀向試劑接 觸;和
[0291] d)檢測細(xì)胞角蛋白7與細(xì)胞角蛋白19的異型復(fù)合物；
[0292 ] 其中步驟b)和C)可W W任何順序或同時進(jìn)行;和
[0293] e)將檢測的細(xì)胞角蛋白7與細(xì)胞角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的量與陽性 和/或陰性對照進(jìn)行比較，由此診斷和/或預(yù)后惡性寶生性疾病。
[0294] 任選地，可W根據(jù)本領(lǐng)域已知或本文所述的標(biāo)準(zhǔn)評分系統(tǒng)完成檢測的抗原-抗體 復(fù)合物的評分。
[02M]所述樣品可W是可能包含惡性寶生性疾病的任何樣品。
[0296] 進(jìn)一步實(shí)施方案是其中所述陽性對照包含來自患有惡性寶生性疾病的受試者的 細(xì)胞。甚至進(jìn)一步實(shí)施方案是其中所述陰性對照包含來自未患有惡性寶生性疾病的健康受 試者的細(xì)胞。
[0297] 因此，通過檢測特定受試者的生物樣品內(nèi)的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/ 或其片段的表達(dá)或不表達(dá)而診斷或預(yù)后惡性寶生性疾病的方法可W是，其中角蛋白7與角 蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的存在或不存在允許將受試者診斷或預(yù)后為健康的或具 有惡性寶生性疾病。在一個實(shí)施方案中，所述方法檢測樣品中的角蛋白7與角蛋白19的異型 復(fù)合物和/或其片段的存在，其中健康、無病的個體中不表達(dá)所述標(biāo)志物。在相關(guān)實(shí)施方案 中，本發(fā)明的方法檢測與正常、健康的個體相比在來自具有惡性寶生性疾病諸如例如肺癌、 膀脫癌、食道癌、肝細(xì)胞癌、膜腺癌、胃癌和卵巢癌的個體的樣品中W更高水平存在的角蛋 白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的升高水平。本文公開的實(shí)施例進(jìn)一步顯現(xiàn)了運(yùn) 一點(diǎn)。
[0298] 在一個實(shí)施方案中，診斷或預(yù)后惡性寶生性疾病的方法包括:從給定受試者獲得 生物樣品
[0299] 在特異性結(jié)合條件下使所述樣品與本文公開的組合物接觸，
[0300] 使結(jié)合至角蛋白7膚和/或其片段和角蛋白19膚和/或其片段的抗體結(jié)合至角蛋白 7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段，
[0301] 使用檢測方法檢測所述抗體，其中所述檢測方法生成所述樣品內(nèi)的所述角蛋白7 與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的表達(dá)概況，
[0302] 將生成的概況轉(zhuǎn)化為計(jì)算機(jī)可讀形式，和
[0303] 將所述樣品的概況與含有來自對于健康受試者、具有惡性寶生性疾病的受試者特 異性的相當(dāng)樣品的概況的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。所述比較的結(jié)果將允許基于角蛋白7與角蛋白 19的異型復(fù)合物和/或其片段的存在、不存在或比較量確定由其獲得生物樣品的受試者是 否健康或具有惡性寶生性疾病。
[0304] 在進(jìn)一步實(shí)施方案中，角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的檢測可W 與將受試者診斷為是健康或具有惡性寶生性疾病的另一種診斷工具組合使用。例如，角蛋 白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的檢測可W與對于肺癌、膀脫癌、食道癌和卵巢 癌檢測特異性的其它診斷工具(諸如、但不限于通過合格臨床醫(yī)師的活檢評估、放射成像和 癥候?qū)W評估)組合使用。
[0305] 醫(yī)師通常使用胸部放射成像和計(jì)算機(jī)斷層掃描來診斷患者的肺癌。使用膀脫鏡檢 查診斷膀脫癌，且尿結(jié)合的標(biāo)志物如NMP 22也可輔助診斷，通常通過食管胃十二指腸鏡檢 化GD)或者可能吞領(lǐng)診斷食道癌。使用骨盆檢查、超聲波和CA125診斷卵巢癌。必須用外科手 術(shù)證實(shí)所述診斷。
[0306] 如果任何測試是異常的，則醫(yī)生將預(yù)定活檢W證實(shí)他們的發(fā)現(xiàn)。然后由病理學(xué)家 檢查活檢組織。也可W使用額外測試，諸如CT-掃描或組合的CT和PET掃描或磁共振成像 (MRI)和所提及癌癥的臨床實(shí)踐中已知的其它方法。
[0307] 本發(fā)明的包含特異性結(jié)合至角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的抗 體的組合物可用于檢測模棱不清的病變，因?yàn)榻Y(jié)合至角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/ 或其片段的抗體將僅檢測具有惡性寶生性疾病的受試者，并且將在模棱不清的情況下評分 為負(fù)。
[0308] 可W使用本領(lǐng)域中眾所周知的方法確定樣品中的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合 物和/或其片段的量。用于測定生物樣品中的所述蛋白（或抗原）水平的合適方法包括基于 抗體的技術(shù)。例如，可W用經(jīng)典的免疫化學(xué)和/或免疫組織學(xué)方法來研究組織中的所述蛋白 的蛋白表達(dá)。在運(yùn)些中，根據(jù)本發(fā)明的組合物中的一抗(多克隆或單克隆)提供特異性識別。 二級檢測系統(tǒng)可W利用如本文討論的巧光、酶或其它綴合的二抗。
[0309] 在一個實(shí)施方案中，通過與相應(yīng)的正常健康細(xì)胞相比角蛋白7與角蛋白19的異型 復(fù)合物和/或其片段的上調(diào)或下調(diào)來將待測試的生物樣品鑒定為與惡性寶生性疾病相聯(lián)的 樣品。"上調(diào)"意味著角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段與正常(健康)細(xì)胞中的 所述蛋白的表達(dá)相比增加至少10%。類似地，"下調(diào)"意味著角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合 物和/或其片段的量與正常(健康)細(xì)胞中的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段 的表達(dá)相比減少至少10%。例如，角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的水平可 W增加至少20 %、30 %、40%、50%或甚至100 %或更多。本文公開且本領(lǐng)域中進(jìn)一步已知測 量樣品中的抗原水平的方式。
[0310] 可W使用本文和本領(lǐng)域中進(jìn)一步描述的本領(lǐng)域中眾所周知的臨床成像和診斷的 方法實(shí)現(xiàn)檢測化合物或抗體。
[0311] 所需具體方法將取決于附接至根據(jù)本發(fā)明的組合物的抗體的可檢測標(biāo)記的類型。
[0312] -個進(jìn)一步方面是用于預(yù)測惡性寶生性疾病患者的受試者中的治療結(jié)果的體外 方法，所述方法包括W下步驟
[0313] a)檢測獲得自所述受試者的生物樣品中的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/ 或其片段的表達(dá)，
[0314] b)將角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的表達(dá)與陽性和/或陰性對照 進(jìn)行比較，且由此基于檢測的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的表達(dá)預(yù)測所 述受試者中的惡性寶生性疾病的治療結(jié)果。
[0315] 任選地，可W根據(jù)本領(lǐng)域已知或本文所述的標(biāo)準(zhǔn)評分系統(tǒng)完成檢測的角蛋白7與 角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的評分。
[0316] 所述生物樣品可W是可能包含惡性寶生性疾病的任何樣品，優(yōu)選來自具有惡性寶 生性疾病的受試者的生物樣品。
[0317] -個進(jìn)一步方面是評價惡性寶生性疾病的治療效力的體外方法，所述方法包括W 下步驟
[0318] a)提供來自具有惡性寶生性疾病的受試者的生物樣品，
[0319] b)檢測角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段，
[0320] C)在針對惡性寶生性疾病治療所述受試者過程中的一個或多個時間點(diǎn)重復(fù)步驟 a)和b)，并且其中角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的相對表達(dá)隨時間的變化 指示有效治療。
[0321] 因此，有效治療的指示是角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的漸降表 達(dá)相對于重復(fù)所述方法的步驟中分析的先前時間樣品的相對變化。
[0322] 任選地，可W根據(jù)本領(lǐng)域已知或本文所述的標(biāo)準(zhǔn)評分系統(tǒng)完成檢測的抗原-抗體 復(fù)合物的評分。
[0323] 所述樣品可W是可能包含惡性寶生性疾病的任何樣品，優(yōu)選來自具有惡性寶生性 疾病的受試者的生物樣品，并且該受試者將在兩者之間或目前正在治療。
[0324] -個進(jìn)一步方面是評價惡性寶生性疾病的復(fù)發(fā)的體外方法，所述方法包括W下步 驟:a)提供來自先前已經(jīng)具有惡性寶生性疾病的受試者獲得生物樣品，
[0325] b)檢測角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段，
[0326] C)在針對惡性寶生性疾病治療所述受試者過程中的一個或多個時間點(diǎn)重復(fù)步驟 a)和b)，并且其中角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的相對表達(dá)隨時間的變化 指示惡性寶生性疾病的復(fù)發(fā)。
[0327] 因此，復(fù)發(fā)的指示是鑒定惡性寶生性疾病的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/ 或其片段的漸增量（即，角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的表達(dá)的隨時間增 加)相對于重復(fù)所述方法的步驟中分析的先前時間樣品的相對變化。
[0328] 本文提供的方法可W手動或優(yōu)選在自動閱讀裝置上進(jìn)行。因此，在一個實(shí)施方案 中，手動進(jìn)行所述方法。在進(jìn)一步實(shí)施方案中，在自動閱讀裝置上進(jìn)行所述方法。
[0腳]組合物的用途
[0330] 本發(fā)明的進(jìn)一步方面包括本文提供的方法和組合物的用途。
[0331] 本發(fā)明的一個進(jìn)一步方面是本文提供的方法用于檢測角蛋白7與角蛋白19的異型 復(fù)合物和/或其片段的用途。
[0332] 本發(fā)明的一個進(jìn)一步方面是本文提供的方法用于檢測惡性寶生性疾病諸如例如 肺癌、膀脫癌、食道癌或卵巢癌的用途。
[0333] 本發(fā)明的一個進(jìn)一步方面是所述方法用于診斷或預(yù)后惡性寶生性疾病諸如例如 肺癌、膀脫癌、食道癌或卵巢癌的用途。
[0334] 本發(fā)明的一個進(jìn)一步方面是所述方法用于預(yù)測惡性寶生性疾病諸如例如肺癌、膀 脫癌、食道癌或卵巢癌的治療結(jié)果的用途。
[0335] 本發(fā)明的一個進(jìn)一步方面是所述方法用于評價惡性寶生性疾病諸如例如肺癌、膀 脫癌、食道癌或卵巢癌的治療效力的用途。
[0336] 本發(fā)明的一個進(jìn)一步方面是所述方法用于評價惡性寶生性疾病諸如例如肺癌、膀 脫癌、食道癌或卵巢癌的復(fù)發(fā)的用途。
[0；337] 試劑盒
[0338] 本發(fā)明還提供用于免疫測定諸如免疫組織化學(xué)的試劑盒。因此，本發(fā)明的一個進(jìn) 一步方面提供用于免疫測定的試劑盒，其包含
[0339] a)本文提供的本發(fā)明的組合物;或
[0340] b)第一容器，其包含如本文定義的識別角蛋白7膚和/或其片段的第一祀向試劑； 和
[0341] C)第二容器，其包含如本文定義的識別角蛋白19膚和/或其片段的第二祀向試劑， 和
[0342] d)任選地用于進(jìn)行如本文定義的方法的說明書。
[0343] 進(jìn)一步實(shí)施方案包括能夠檢測特異性結(jié)合至角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物 和/或其片段的組合物的顯現(xiàn)試劑。顯現(xiàn)和檢測試劑的實(shí)例是本領(lǐng)域中已知的。
[0344] 在一些試劑盒實(shí)施方案中，一種或多種一抗可W如本文所述直接標(biāo)記。
[0345] 其它試劑盒實(shí)施方案將包括二級或進(jìn)一步檢測，諸如如本文所述的二抗(例如，山 羊抗兔抗體、兔抗小鼠抗體、抗半抗原抗體)或非抗體半抗原-結(jié)合分子(例如，抗生物素蛋 白或鏈霉抗生物素蛋白）。在運(yùn)樣的試劑盒中，所述二級或進(jìn)一步檢測方式可W用可檢測部 分直接標(biāo)記。在其它情況下，二級（或進(jìn)一步)抗體或結(jié)合劑將被綴合至半抗原（諸如生物 素、DNP和/或FITC)，其可通過可檢測標(biāo)記的同源半抗原結(jié)合分子(例如，鏈霉抗生物素蛋白 (SA)辣根過氧化物酶、SA堿性憐酸酶)檢測。一些試劑盒實(shí)施方案可W在合適容器中包括比 色試劑(例如，DAB和/或AEC)W用于與一級或二級(或更高階)檢測方式(例如，抗體或結(jié)合 實(shí)體)接觸，所述一級或二級(或更高階)檢測方式(例如，抗體或結(jié)合實(shí)體）w用于運(yùn)樣的比 色試劑的顯色的酶標(biāo)記。
[0346] 在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括陽性或陰性對照樣品，諸如已知表達(dá)或不表達(dá)角 蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的細(xì)胞系、組織或體液。對照樣品的實(shí)例包括 但不限于正常（例如，非癌性)細(xì)胞或組織，來自已知不具有或具有治療之后（例如，治療之 后至少5年或至少10年)的惡性寶生性疾病的任何復(fù)發(fā)的受試者的惡性寶生性樣品。
[0347] 在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括說明性材料，其公開，例如，使用所述組合物的方 式或進(jìn)一步結(jié)合實(shí)體或檢測方式，例如特異性結(jié)合角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或 其片段的抗體，或使用特定試劑的方式。所述說明性材料可電子形式書寫(例如計(jì)算機(jī) 軟盤或光盤），或者可W是可視的（例如，視頻文件）。所述試劑盒還可包括額外的組分W便 于試劑盒為此設(shè)計(jì)的特定應(yīng)用。因此，例如，所述試劑盒可包括慣例地用于特定公開方法的 實(shí)施的緩沖液和其它試劑。運(yùn)樣的試劑盒和適當(dāng)?shù)膬?nèi)容物是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
[0348] 所述試劑盒可W進(jìn)一步包含作為分開包裝的試劑的足W用于至少一次測定的量 的根據(jù)本發(fā)明的組合物。
[0349] 通常還包括用于使用包裝試劑的說明書。運(yùn)樣的說明書通常包括描述試劑濃度 和/或至少一種測定方法參數(shù)諸如待混合的試劑與樣品的相對量、試劑/樣品混合物的維持 時間段、溫度、緩沖液條件等的有形表述。
[0350] 本發(fā)明的一個進(jìn)一步方面提供用于檢測體外生物樣品中的角蛋白7與角蛋白19的 異型復(fù)合物和/或其片段的試劑盒，所述試劑盒包含
[0351] a)本文提供的本發(fā)明的組合物;或
[0352] b)第一容器，其包含如本文定義的識別角蛋白7膚和/或其片段的第一祀向試劑； 和
[0353] C)第二容器，其包含如本文定義的識別角蛋白19膚和/或其片段的第二祀向試劑， 和
[0354] d)任選地用于進(jìn)行如本文定義的方法的說明書。
[0355] 本發(fā)明的一個進(jìn)一步方面提供用于檢測體外生物樣品中的惡性寶生性疾病諸如 例如肺癌、膀脫癌、食道癌或卵巢癌的試劑盒，所述試劑盒包含
[0356] a)本文提供的本發(fā)明的組合物;或
[0357] b)第一容器，其包含如本文定義的識別角蛋白7膚和/或其片段的第一祀向試劑； 和
[0358] C)第二容器，其包含如本文定義的識別角蛋白19膚和/或其片段的第二祀向試劑， 和
[0359] d)任選地用于進(jìn)行如本文定義的方法的說明書。
[0360] 本發(fā)明的一個進(jìn)一步方面提供用于診斷和/或預(yù)后體外生物樣品中的惡性寶生性 疾病諸如例如肺癌、膀脫癌、食道癌或卵巢癌的試劑盒，所述試劑盒包含
[0361] a)本文提供的本發(fā)明的組合物;或
[0362] b)第一容器，其包含如本文定義的識別角蛋白7膚和/或其片段的第一祀向試劑； 和
[0363] C)第二容器，其包含如本文定義的識別角蛋白19膚和/或其片段的第二祀向試劑， 和
[0364] d)任選地用于進(jìn)行如本文定義的方法的說明書。
[0365] 本發(fā)明的一個進(jìn)一步方面提供用于預(yù)測受試者中惡性寶生性疾病諸如例如肺癌、 膀脫癌、食道癌或卵巢癌患者的治療結(jié)果的試劑盒，所述試劑盒包含
[0366] a)本文提供的本發(fā)明的組合物;或
[0367] b)第一容器，其包含如本文定義的識別角蛋白7膚和/或其片段的第一祀向試劑； 和
[0368] C)第二容器，其包含如本文定義的識別角蛋白19膚和/或其片段的第二祀向試劑， 和
[0369] d)任選地用于進(jìn)行如本文定義的方法的說明書。
[0370] 本發(fā)明的一個進(jìn)一步方面提供用于評價惡性寶生性疾病諸如例如肺癌、膀脫癌、 食道癌或卵巢癌的治療效力的試劑盒，所述試劑盒包含
[0371] a)本文提供的本發(fā)明的組合物;或
[0372] b)第一容器，其包含如本文定義的識別角蛋白7膚和/或其片段的第一祀向試劑； 和
[0373] C)第二容器，其包含如本文定義的識別角蛋白19膚和/或其片段的第二祀向試劑， 和
[0374] d)任選地用于進(jìn)行如本文定義的方法的說明書。
[0375] 本發(fā)明的一個進(jìn)一步方面提供用于評價惡性寶生性疾病諸如例如肺癌、膀脫癌、 食道癌或卵巢癌的復(fù)發(fā)的試劑盒，所述試劑盒包含
[0376] a)本文提供的本發(fā)明的組合物;或
[0377] b)第一容器，其包含如本文定義的識別角蛋白7膚和/或其片段的第一祀向試劑； 和
[0378] C)第二容器，其包含如本文定義的識別角蛋白19膚和/或其片段的第二祀向試劑， 和
[0379] d)任選地用于進(jìn)行如本文定義的方法的說明書。
[0380] 某些試劑盒實(shí)施方案可包括載體裝置，諸如盒、袋、包、塑料箱(諸如成型塑料或其 它透明包裝）、包裝材料(諸如，密封的或可密封的塑料、紙或金屬包裝材料），或其它容器。
[0381] 在一些實(shí)例中，試劑盒組分將被裝入單一包裝單元諸如盒或其它容器中，所述包 裝單元可具有隔室，在所述隔室中可放置所述試劑盒的一種或多種組分。在其它實(shí)例中，試 劑盒包括可保留例如一種或多種待測試的生物樣品的一個或多個容器，比如小瓶、管等。
[0382] 所述試劑盒實(shí)施方案包括，例如，注射器、棉拭子或乳膠手套，其可用于處理、收集 和/或處理生物樣品。試劑盒還可任選地包含可用于將生物樣品從一個位置移動至另一個 位置的器具，包括例如滴管、注射器等。還有其它試劑盒實(shí)施方案可包括用于丟棄用過的或 不再需要的物品（諸如受試者樣品，等）的處理裝置。運(yùn)樣的處理裝置可包括、但不限于：能 夠含有從丟棄材料的泄漏物的容器，諸如塑料的、金屬的或其它不可滲透的袋、盒或容器。
[0383] 現(xiàn)在將描述體現(xiàn)本發(fā)明的某些方面的非限制性實(shí)施例。
[0384] 實(shí)施例1
[0385] 用于測定體液中角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物的測定法
[0386] 目的是生成適合于臨床評估的測定法。
[0387] f 良據(jù)（'Recent development in the periodate method of conjugating horseradish peroxidase(HRP)to antibodies''（M Barbara Wilson和Paul K.Nakane , Elsevier/North-Holland Biomedical Press, 1978)中描述的方法，將對于角蛋白7特異性 的單克隆抗體Ks 7.18綴合至生物素，并將對于角蛋白19特異性的單克隆抗體BM 19.21綴 合至過氧化物酶。
[0388] 實(shí)施夾屯、酶-免疫測定，W確定獲得自被診斷具有惡性寶生性疾病的患者或獲得 自被診斷具有非惡性疾病的患者或被認(rèn)為健康的個體的體液中角蛋白7與角蛋白19的異型 復(fù)合物或其片段的存在。在該程序中，將含有兩種單克隆抗體(生物素綴合的Ks 7.18(化g/ 1111)和過氧化物酶綴合的8119.21(2蛇/1111))的854化13緩沖液抑7.2中的10化1抗體溶液 與50iU血清樣品或校準(zhǔn)物（即，具有已知濃度的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物或其片段 的樣品)在微孔板的鏈霉抗生物素蛋白包被的孔中一起解育，其在室溫振搖一小時。解育之 后，將各孔用0.05 %Tween/PBS洗涂6次W去除過量抗體。隨后，將10化1緩沖的TMB底物(過 氧化氨和3,3'，5,5'四甲基聯(lián)苯胺)添加至各孔，使酶反應(yīng)在室溫進(jìn)行30分鐘。在酶反應(yīng)過 程中，如果抗原，即，角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物或其片段存在于血清樣品中，則孔中 顯藍(lán)色。在酶標(biāo)儀中在62化m處測定顏色強(qiáng)度。通過將各校準(zhǔn)物的吸光度值相對于濃度繪圖 而對于各測定構(gòu)建校準(zhǔn)曲線。從該校準(zhǔn)曲線測定患者樣品中存在的角蛋白7與角蛋白19的 異型復(fù)合物或其片段的濃度。如本實(shí)施例中描述的測定法在下文被稱為"K7/K19測定法"。 圖2顯示典型的校準(zhǔn)曲線。
[0389] 實(shí)施例2
[0390] K7/K19測定法對于不同形式的癌癥的靈敏度
[0391] 使用實(shí)施例1中描述的K7/19測定法測試來自患有各種形式的癌癥的患者的總共 398份血清。結(jié)果概述于表1中。
[0392] 總之，K7/K19測定法顯示與研究的其它癌癥相比對于膀脫癌、卵巢癌、肺癌和食道 癌的最高臨床靈敏度，并且尤其來自肺癌、膀脫癌和卵巢癌患者的樣品具有高濃度的角蛋 白7與角蛋白19的異型復(fù)合物(或其片段）。相反，K7/K19測定法對于宮頸的鱗狀細(xì)胞癌和乳 腺癌W及頭頸癌和胃腸道癌癥顯示低至10%或更低的靈敏度。運(yùn)些后者癌癥患者的角蛋白 7與角蛋白19的異型復(fù)合物(或其片段）的濃度值在與表2中的對照組(健康和良性）的那些 相同的范圍內(nèi)。K7/K19測定法因此通常因?yàn)榈挽`敏度而不適合于運(yùn)些類型的癌癥。然而，兩 個乳腺癌患者和一個胃腸道癌癥患者具有比來自良性疾病組中的樣品的最高值更高的值。 運(yùn)些高值可表明侵襲性癌癥或較差預(yù)后。也就是說，盡管該測定法通常不適合于一些癌癥， 但其中該測定法確實(shí)給出高值的少數(shù)情況可具有臨床價值。
[0393] 表1:對于各種癌癥的靈敏度相比96%特異性。
[0394]
[0；3巧]實(shí)施例3:
[0396] 健康個體的參考范圍的建立。
[0397] 根據(jù)如實(shí)施例1中所述的K7/K19測定法測試來自明顯健康個體的一百一十二 (112)份血清，W便為不具有惡性寶生性疾病的明顯體征的個體建立參考范圍。95%的個體 具有小于l.OlU/mL的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合體或其片段的濃度，或95.5%具有 1.09U/mL或更小的值。112個健康個體中的五(5)個（即4.5% )具有高于1. lU/mL的濃度。:J則 試個體的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物或其片段的平均濃度為0.1抓/mL(參見表2)。
[0；3側(cè)實(shí)施例4:
[0399 ]具有良性(非癌性)寶生性疾病的個體的參考范圍的建立。
[0400] 根據(jù)實(shí)施例1在K7/19測定中測試來自患有已知通常給出升高腫瘤標(biāo)志物值的患 者的總共239份血清。結(jié)果顯示于下表2中。
[0401] 總之，95百分位數(shù)值對于良性疾病不比健康血液供體更高。所有組使用1.09U/mL 的截止值得到5%或更少的陽性樣品，且99%的來自良性組的樣品具有低于1.8U/mL的值 (未顯示）。
[0402] 表2:健康血液供體和良性疾病各自的參考值和％陽性樣品
[0403]
[0404] 實(shí)施例5A:
[0405] 與角蛋白8與角蛋白19的異型復(fù)合物或角蛋白19的可能交叉反應(yīng)性的測試
[0406] 如實(shí)施例1中所述，測定如通過CYFRA 21-1EIA試劑盒(Fujirebio Diagnostics Inc.)所測定具有50tig/L的角蛋白19濃度的含有角蛋白8與角蛋白19的異型復(fù)合物的校準(zhǔn) 物，SPCYFRA 21-1 試劑盒校準(zhǔn)物（描述于：Lung cancer-associated keratin 19fragments: development and biochemical characterisation of the new serum assay Enzymun-Test CYFRA 21-1. Bodenmul ler H，Of enloch-脫hn'le B，Lane EB, Dessauer A, BottgerV'Doni有F，Int J Biol Markers.1994Apr-Jun;9(2):75-81)，連同 血液供體樣品，K7/K19測定中的校準(zhǔn)物0(其由不含角蛋白7/19的校準(zhǔn)物基質(zhì)組成)和由來 自卵巢癌患者的血清組成的陽性對照。
[0407] 表3:K7/19測定中的樣品的結(jié)果
[040引
[0409] 結(jié)論:該測定中未檢測到顯著信號，或者檢測到的濃度對于CYFRA 21-1校準(zhǔn)物50y g/L足夠低，即與K19或角蛋白8與角蛋白19的異型復(fù)合物的任何交叉反應(yīng)性會影響臨床表 現(xiàn)。運(yùn)是顯而易見的，因?yàn)閬碜訡YFRA試劑盒(5化g/L)的最高校準(zhǔn)物在K7/19測定法的檢出 限值附近，并且同時也低于血液供體血清，并且比由卵巢癌血清組成的陽性對照低得多。
[0410] 實(shí)施例5B
[04川1(3 19.2和8119.21克隆之間的比較
[0412] 如實(shí)施例1中構(gòu)建和運(yùn)行測定法，但使用角蛋白19單克隆抗體克隆Ks 19.2代替克 隆BM 19.21。將該測定法與具有角蛋白19單克隆抗體克隆BM 19.21的測定法進(jìn)行比較。在 相同樣品上運(yùn)行測定法。根據(jù)如實(shí)施例1中所述的K7/K19測定法測試來自患有癌癥(肺癌、 食道癌、膀脫癌或卵巢癌）的個體的十五（15)份血清和來自患有良性疾病(肝臟-、腎臟-、 肺-或CH巧的患者的13份血清。
[0413] 結(jié)果：
[0414] 巧憶法之間存在高相關(guān)性(r = 0.97)，并且陽性樣品數(shù)為：
[0415]
[0416] 結(jié)論:兩種測定法之間沒有顯著差異。任何的"BM 19.21樣"單克隆抗體可用于證 明本發(fā)明。
[0417] 實(shí)施例6
[041引與建立的角蛋白19標(biāo)志物CYFRA 21-1的比較
[0419] 用CYFRA 21 -1酶免疫定量測定法化IA)根據(jù)如包括的使用說明（Fu j i reb i o Diagnostics Inc.)測試實(shí)施例3和4中測定的相同樣品。CYFRA 21-lEIA提供人血清中的可 溶性角蛋白19片段的定量測定，并且經(jīng)常用作肺癌患者的疾病和治療進(jìn)程過程中監(jiān)測疾病 進(jìn)展的輔助手段?；诹夹约膊。ㄆ渲信懦I臟疾?。╪ = 199)針對CYFRA 21-1EIA計(jì)算 2.42yg/L的95百分位數(shù)參考上限。結(jié)果圖示顯示于圖3中。圖3顯示對于良性疾病(排除腎臟 疾?。┑撵`敏度VS 95%特異性。CYFRA 21-化IA的截止值為2.42iig/L，且K7/19測定法的截 止值為l.lU/mL。
[0420] 結(jié)論:K7/19測定法顯示與CYFRA 21-化IA相比優(yōu)異的特異性。從圖3看到，不僅在 患有腎臟疾病的患者中，而且在具有屯、臟衰竭的患者中，腫瘤標(biāo)志物CYFRA 12-1(角蛋白 19)的水平升高。K7/19測定法也更加組織受限，但在卵巢癌、食道癌（SCC)和膀脫癌中具有 相當(dāng)?shù)撵`敏度。肺癌(所有組織型）中的靈敏度比CYFRA 21-1中更低。
[0421] 實(shí)施例7
[0422] K7/K19測定法用于卵巢癌的評估和與建立的標(biāo)志物的比較。
[0423] 在W下測定中運(yùn)行來自由于下腹部或骨盆區(qū)域(骨盆腫塊）的異常生長而就醫(yī)的 婦女的血清樣品：CA 125EIA、HE4EIA、CYFRA 21-1EIA(其中所有都購自化jirebio Diagnostics Inc.)和根據(jù)實(shí)施例1的K7/19測定法。CA 12祀IA對于CA125抗原是特異性的， 且肥4EIA對于肥4抗原是特異性的。兩種測試經(jīng)常用于監(jiān)測具有婦科惡性腫瘤諸如上皮卵 巢癌的患者。充分表征的樣品描述于下表3中。發(fā)現(xiàn)在該樣品集合中，21個患者具有卵巢癌， 且60個患者具有良性疾病。生成比較四種測定法的靈敏度VS.特異性概況的接受者操作特 性（Receiver operating characteristicKROC)曲線：卵巢癌中的CA 125EIA、皿4EIA、 CYFRA 21-1EIA，如圖4中所見。
[0424] CA12祀IA和K7/19測定得到在95%特異性的最高靈敏度，52%，和最大曲線下面 積，因此表明與肥4EIA或CYFRA 21-化IA相比區(qū)分卵巢癌和良性骨盆腫塊的較高能力。
[0425] 表4用于卵巢癌研究的患者材料
[04%] 12345678
2
[04巧]實(shí)施例8 3 來自實(shí)施例7的生物標(biāo)志物的組合。 4 圖5顯示比較組合CA12祀IA&HE4EIA與組合CA12祀IA&K7/19測定法的R0C曲線。如 果將CA12祀IA與K7/19測定法比較，診斷靈敏度與當(dāng)單獨(dú)使用CA 12祀IA或K7/19測定法時 相比增加。 5 CA12祀IA&K7/19測定法的靈敏度在95%特異性時為62%，并且在70%的特異性時 達(dá)到100 %的靈敏度。 6 結(jié)論:實(shí)施例7和8表明，K7/19測定法可臨床用于控制卵巢癌患者。由于K7/19測定 7 法的相對高的癌癥特異性，使用角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物作為惡性寶生性疾病諸 8 如例如肺癌、膀脫癌、食道癌和卵巢癌作為標(biāo)志物可W增加靈敏度，而不降低特異性。
[04；3；3] 實(shí)施例9
[0434] 肺癌:NSCLC和SCLC之間的差異診斷
[0435] 根據(jù)如實(shí)施例1中所述的K7/K19測定法測試來自小細(xì)胞肺癌患者的二十九(29)份 血清。二十八個樣品具有低于l.lU/mL的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合體(或其片段)的濃 度，即只有一個樣品在K7/19測定法中是陽性的。所述樣品先前也針對ProGRP進(jìn)行分析，并 且29個樣品中的17個具有高于20化g/mL的ProGRP濃度，表明所述樣品取自具有活躍SCLC的 個體。
[0436] K7/K19測定法能夠區(qū)分非小細(xì)胞肺癌(NS化C)和小細(xì)胞肺癌（S化C)。運(yùn)與K7/1W則 定法的高特異性組合，使得K7/K19測定法適合作為輔助小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌之間的差異 診斷的工具。K7/K19測定法將特別可用于與ProGRP(具有對于小細(xì)胞肺癌的高靈敏度和特 異t生）組合（T曰n邑 Ji曰n-hu曰，等人.Met曰曰n曰lysis,Diagnostic value of tumours marker pro-gastrin-releasing peptide in patients with small cell lung cancer: a systematic review,Qiinese Medical Journal 2011;124(10):1563-1568.)〇CYFRA 21-1 還檢測SCLC,因此不可用于運(yùn)樣的應(yīng)用。
[0437] 也可W預(yù)期，ProGRP和K7/19的組合測量對于區(qū)分S化C和組合型SCLC(c-SCLC) W 及大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌化C-NET)和SCLC是有價值的。
[0438] 實(shí)施例10
[0439] K7/K19測定法在肺癌中的診斷潛能。
[0440] 使用四倍于用于良性疾病的截止值的截止值利用來自實(shí)施例3(來自健康個體的 112個樣品）、實(shí)施例4(良性疾病的239個樣品）和實(shí)施例5(惡性寶生性疾病的398個樣品）的 數(shù)據(jù)(在CYFRA 21-化IA中排除腎臟疾病W不使該測定法失信），得到截止值:對于K7/19測 定法為4.4U/mL，且對于CYFRA 21-1EIA為9.化g/L。用運(yùn)些限值，陽性肺癌樣品、其它陽性癌 癥樣品（即，不是肺癌樣品）和來自患有良性疾病的患者的陽性樣品的數(shù)目概述于表5中。 [0441 ] 表5使用診斷截止值的K7/19測定法和CYFRA 21-化IA中的陽性樣品
[0442]
12345 PPV肺癌=對于肺癌的陽性預(yù)測值(即，陽性肺癌樣品/所有陽性樣品） 2 結(jié)論:盡管陽性樣品的百分比相當(dāng)?shù)?，但陽性樣品高概率是癌癥。在K7/K19測定法 的情況下，具有高于4.4U/mL的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物(或其片段)的值的樣品是 肺癌癥的概率大于50%。對于CYFRA 21-1EIA，該概率較低，并且也不能排除腎衰竭的可能 性（陽性良性樣品）。在該初步數(shù)據(jù)集中，肺癌的組織學(xué)類型是未知的。 3 實(shí)施例11 4 K7/K19測定法在膽道癌中的潛能 5 在如實(shí)施例1中所述的K7/19測定法中運(yùn)行來自具有晚期證實(shí)的膽道上皮癌或證 實(shí)的晚期胃癌的患者的血清。
[044引
[0449] 結(jié)論:K7/K19測定法在控制患有上述上皮癌的患者中也可具有臨床價值。
[0450] 實(shí)施例 12Nytt
[0451] 用于測定血清中角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物的替代測定法。
[0452] 目的是比較與實(shí)施例1中描述的KS7.18/BM 19.21測定法相比的適合于具有對于 抗體的主要不同表位位置的臨床評估的測定法。
[0453] 對于角蛋白19特異性的抗體Ks. 19.1結(jié)合至角蛋白19上的氨基酸序列311-335( B6ttger 等人.Eur.J.Biochem. 231,475-485,1995)，且單克隆抗體 RCK 105 對于角蛋白 7 是特異性的（Ramaekers等人.Exp Cell Res.170(1):235-49,1987)。
[0454] 根據(jù)('Recent development in the periodate method of conjugating horseradish peroxidase(HRP)to antibodies''（M Barbara Wilson和Paul K.Nakane , Elsevier/Nodh-Holland Biomedical Press, 1978)中描述的方法，將單克隆抗體RCK105 綴合至生物素，并將單克隆抗體BM Ks 19.1綴合至過氧化物酶。
[0455] 如實(shí)施例1中實(shí)施夾屯、酶-免疫測定，W確定獲得自被診斷具有惡性寶生性疾病的 患者的血清中角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物或其片段的存在。針對相同的19個癌癥樣 品比較兩種測定。
[0456] 在測定之間存在高相關(guān)性，r = 0.98，n=19個樣品，并且可m正明沒有重大臨床差 異，如下表所見。
[0457] 結(jié)果概述于下表中。
[045引
[0459] 結(jié)論:可W通過使用結(jié)合至角蛋白19上的氨基酸311-331與RCK105(其表位定位至 不同于抗體Ks 7.18的角蛋白7的另一部分)的配對而構(gòu)建角蛋白7/19的替代測定法。
[0460] 實(shí)施例13
[0461] 可W通過測定中Ks 19.1角蛋白19抗體對角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物的完 全抑制而建立角蛋白7上的抗體Ks 7.18的表位位置。
[0462] 如實(shí)施例1中構(gòu)建測定法，但用與過氧化物酶綴合的Ks 19. Imab替代BM 19.21mab。對于定義樣品，與Ks 7.18抗體組合的兩種不同的角蛋白19抗體的結(jié)果概述于下 表中。
[0463]
[0
[04例結(jié)論；
[0466] 因?yàn)榕c螺旋結(jié)構(gòu)平行且對齊比對角蛋白7和角蛋白19之間的異型復(fù)合物，所W分 別結(jié)合至角蛋白7和角蛋白19上的對應(yīng)的暴露位置(從螺旋1A開始至螺旋2B)的任何兩種抗 體將不同時結(jié)合，即，其中角蛋白7在角蛋白19周圍卷曲，那些相應(yīng)位置由于空間原因而不 會允許同時結(jié)合。運(yùn)進(jìn)一步例舉為，例如，角蛋白19上的氨基酸271-291與角蛋白7上的氨基 酸283-303在卷曲螺旋中配對起來。
[0467] BM 19.21的表位位于角蛋白19上的氨基酸序列352-368。
[0468] 角蛋白19上的Ks 19.1抗體的表位已經(jīng)被定位至氨基酸序列311-335。角蛋白7上 的相應(yīng)序列是323-347。
[0469] 可W得出結(jié)論，Ks 7.18的表位定位至角蛋白7上的300-350的氨基酸序列。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 包含至少兩種靶向試劑的組合物，其中至少一種第一靶向試劑識別角蛋白7肽和/或 其片段，且至少一種第二靶向試劑識別角蛋白19肽和/或其片段，其特征在于所述第一和第 二靶向試劑能夠特異性且同時結(jié)合至角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第一和/或第二靶向試劑選自配體、抑制劑、 擬肽化合物、肽、蛋白、抗體、抗體的抗原結(jié)合片段和/或其組合。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述第一或第二靶向試劑中的至少一種是抗體、 抗原結(jié)合片段或其組合。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述第一和第二靶向試劑兩者均為抗體、抗原結(jié) 合片段或其組合。5. 根據(jù)權(quán)利要求3和4所述的組合物，其中所述第一或第二靶向試劑中的至少一種是一 抗、抗原結(jié)合片段或其組合。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述一抗是單克隆或重組抗體、抗原結(jié)合片段或 其組合。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述第一靶向試劑選自抗體(：-35、(：- 62、C-68、C18、C35、KS 7.18、〇)3-68、1^11(和1?〇(105或抗原結(jié)合片段變體、融合體、衍生物或 其組合，且識別位于角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物的角蛋白7部分上的至少3個或至少5 個或至少7個或10個或更多個氨基酸的序列。8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述第一靶向試劑識別位于角蛋白7 與角蛋白19的異型復(fù)合物的角蛋白7部分中的256-412氨基酸序列內(nèi)或更優(yōu)選300-380氨基 酸序列內(nèi)的序列。9. 根據(jù)權(quán)利要求7-8中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述第一靶向試劑是由得自Progen 81(^6(*1111^61^!1，德國的克隆1(8 7.18產(chǎn)生的1(8 7.18單克隆抗體。10. 根據(jù)權(quán)利要求7-8中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述第一靶向試劑是由得自Acris Antibodies Gmbh，德國的克隆RCK105產(chǎn)生的RCK105單克隆抗體。11. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述第二靶向試劑選自抗體A53-B/ A2.26aka Ksl9.1、BM-19.21、CCD003、CCD004、CKS04、CKS06、Ksl9.2、KM 4.62、LP2K、SA 21、 SA 45或其抗原結(jié)合片段變體、融合體、衍生物或其組合，且識別位于角蛋白7與角蛋白19的 異型復(fù)合物的角蛋白19部分上的至少3個或至少5個或至少7個或10個或更多個氨基酸的序 列。12. 根據(jù)權(quán)利要求1-7和11中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述第二靶向試劑識別位于角 蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物的角蛋白19部分中的244-400氨基酸序列內(nèi)或更優(yōu)選311-375氨基酸序列內(nèi)的序列。13. 根據(jù)權(quán)利要求11-12中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述第二靶向試劑是由得自 Roche Diagnostics的克隆BM-19.21產(chǎn)生的BM 19.21單克隆抗體，且特異性結(jié)合至角蛋白 19的氨基酸序列346-367。14. 根據(jù)權(quán)利要求11-12中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述第二靶向試劑是由得自 ?1'〇861113;[(^6〇111111^，611113!1，德國的克隆1(8 19.2產(chǎn)生的1(8 19.2單克隆抗體，且特異性結(jié)合 至角蛋白19的氨基酸序列352-368。15. 根據(jù)權(quán)利要求11-12中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述第二靶向試劑是結(jié)合至角蛋 白19上的氨基酸序列311-335的Ksl9.1單克隆抗體。16. 根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述第一靶向試劑是Ks 7.18單克 隆抗體，且所述第二靶向試劑是BM-19.21單克隆抗體。17. 根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述第一靶向試劑是Ks 7.18單克 隆抗體，且所述第二靶向試劑是Ks 19.2單克隆抗體。18. 根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述第一靶向試劑是RCK105單克 隆抗體，且所述第二祀向試劑是Ks 19.1單克隆抗體。19. 用于檢測生物樣品中的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段的體外方 法，所述方法包括以下步驟： a) 使所述生物樣品與如權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)中所定義的組合物接觸;或者可替代地 b) 使所述生物樣品與識別角蛋白7肽和/或其片段的第一靶向試劑接觸;和 c) 使所述生物樣品與識別角蛋白19肽和/或其片段的第二靶向試劑接觸;和 d) 檢測所述角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段； 其中步驟b)和c)可以以任何順序或同時進(jìn)行。20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述生物樣品是生物流體樣品，其選自血清、血 漿、淋巴液、滲出液、排泄物、胃酸、胃液、淋巴液、粘液、心包液、腹膜液、胸膜液、膿液、唾液、 痰液、滑液、淚液、汗液、陰道分泌物、嘔吐物和尿液。21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述生物流體樣品選自血液、血清和血漿。22. 根據(jù)權(quán)利要求19-21所述的方法，其中所述第一和/或第二靶向試劑選自配體、抑制 劑、擬肽化合物、肽、蛋白、抗體、抗體的抗原結(jié)合片段和/或其組合。23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述第一或第二靶向試劑中的至少一種是抗體、 抗原結(jié)合片段或其組合。24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述第一和第二靶向試劑兩者均為抗體、抗原結(jié) 合片段或其組合。25. 根據(jù)權(quán)利要求23和24所述的方法，其中所述第一或第二靶向試劑中的至少一種是 一抗、抗原結(jié)合片段或其組合。26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述一抗是單克隆或重組抗體、抗原結(jié)合片段或 其組合。27. 根據(jù)權(quán)利要求19-26中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一靶向試劑選自抗體C-35、 C-62、C-68、C18、C35、KS 7.18、〇)3-68、1^11(和1?〇(105或其抗原結(jié)合片段變體、融合體、衍生 物或其組合，且識別位于角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物的角蛋白7部分上的至少3個或 至少5個或至少7個或10個或更多個氨基酸的序列。28. 根據(jù)權(quán)利要求19-27所述的方法，其中所述第一靶向試劑識別位于角蛋白7與角蛋 白19的異型復(fù)合物的角蛋白19部分中的244-400氨基酸序列內(nèi)或更優(yōu)選311-375氨基酸序 列內(nèi)的序列。29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述第一靶向試劑是由得自Progen 81(^6(*1111^61^!1，德國的克隆1(8 7.18產(chǎn)生的1(8 7.18單克隆抗體。30. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述第一祀向試劑是由得自Acris Antibodies Gmbh，德國的克隆RCK05產(chǎn)生的RCK105單克隆抗體。31. 根據(jù)權(quán)利要求19-26中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第二靶向試劑選自抗體A53-B/ A2.26aka Ksl9.1、BM-19.21、CCD003、CCD004、CKS04、CKS06、Ksl9.2、KM 4.62、LP2K、SA 21、 SA 45或其抗體片段變體、融合體、衍生物或其組合，且識別位于角蛋白7與角蛋白19的異型 復(fù)合物的角蛋白19部分上的至少3個或至少5個或至少7個或10個或更多個氨基酸的序列。32. 根據(jù)權(quán)利要求19-26和31中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第二靶向試劑識別位于角 蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物的角蛋白19部分中的244-400氨基酸序列內(nèi)或更優(yōu)選311-375氨基酸序列內(nèi)的序列。33. 根據(jù)權(quán)利要求31-32中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第二靶向試劑是由得自Roche Diagnostics的克隆BM-19.21產(chǎn)生的BM 19.21單克隆抗體，且特異性結(jié)合至角蛋白19上的 氨基酸序列346-367。34. 根據(jù)權(quán)利要求31-32中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第二靶向試劑是結(jié)合至角蛋白 19上的氨基酸序列311-335的Ksl9.1單克隆抗體。35. 根據(jù)權(quán)利要求19-34中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一靶向試劑是Ks 7.18單克 隆抗體，且所述第二靶向試劑是BM-19.21單克隆抗體。36. 根據(jù)權(quán)利要求19-34中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一靶向試劑是Ks 7.18單克 隆抗體，且所述第二靶向試劑是Ks 19.2單克隆抗體。37. 根據(jù)權(quán)利要求19-34中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一靶向試劑是RCK105單克隆 抗體，且所述第二祀向試劑是Ks 19.1單克隆抗體。38. 根據(jù)權(quán)利要求19-37中任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括將角蛋白7與角蛋白19的 異型復(fù)合物和/或其片段的表達(dá)與陽性和/或陰性對照比較的步驟。39. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述陽性對照包含角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù) 合物和/或其片段。40. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述陽性對照是獲得自患有惡性贅生性疾病的 受試者的生物樣品。41. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述陰性對照不含角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù) 合物和/或其片段。42. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述陰性對照是獲得自未患有惡性疾病的健康 受試者的生物樣品。43. 根據(jù)權(quán)利要求19-42中任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括對角蛋白7與角蛋白19的 異型復(fù)合物和/或其片段的量評分的步驟。44. 根據(jù)權(quán)利要求19-43中任一項(xiàng)所述的方法，其在自動閱讀裝置上進(jìn)行。45. 根據(jù)權(quán)利要求19-43中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述檢測手動進(jìn)行。46. 根據(jù)權(quán)利要求19-45中任一項(xiàng)所述的體外方法，其用于 i) 診斷和/或預(yù)后受試者中的惡性贅生性疾病，和/或 ii) 預(yù)測受試者中的惡性贅生性疾病的治療效力，和/或 i i i)評價受試者中的惡性贅生性疾病的治療結(jié)果，和/或 iv)評價受試者中的惡性贅生性疾病的復(fù)發(fā)， 其中所述受試者是具有或懷疑具有惡性贅生性疾病的哺乳動物。47. 根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述惡性贅生性疾病選自：膽管癌(肝外）、膀胱 癌、乳腺癌、未知（原發(fā)性）的癌、子宮頸癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、食道癌、膽囊癌、胃部（胃） 癌、頭頸癌、肝細(xì)胞(肝)癌、下咽癌、腎癌、喉癌、肝癌(原發(fā)性）、肺癌(非小細(xì)胞）、肺癌(小細(xì) 胞）、間皮瘤、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、卵巢上皮癌(表面上皮-間質(zhì)瘤）、卵巢生殖細(xì)胞腫瘤、 卵巢低惡性潛能腫瘤、胰腺癌、前列腺癌、直腸癌、腎細(xì)胞癌(腎癌）、唾液腺癌、小細(xì)胞肺癌、 小腸癌、胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌、腎盂和輸尿管的移行細(xì)胞癌、子宮癌(子宮內(nèi)膜）。48. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述惡性贅生性疾病選自肺癌、膀胱癌、食道癌、 肝細(xì)胞癌、胰腺癌、睪丸癌和卵巢癌。49. 根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述惡性贅生性疾病選自肺癌、膀胱癌、食道癌 和卵巢癌。50. 根據(jù)權(quán)利要求19-49中任一項(xiàng)所述的體外方法用于以下的用途： i)檢測角蛋白7與角蛋白19和或其片段的異型復(fù)合物，或 i i)檢測生物樣品中的惡性贅生性疾病;或 i i i)診斷或預(yù)后受試者中的惡性贅生性疾病，或 iv) 預(yù)測受試者中的惡性贅生性疾病的治療結(jié)果，或 v) 評價受試者中的惡性贅生性疾病的治療效力，或 vi) 評價受試者中的惡性贅生性疾病的復(fù)發(fā)。51. 根據(jù)權(quán)利要求50所述的用途，其中所述惡性贅生性疾病選自：膽管癌(肝外）、膀胱 癌、乳腺癌、未知（原發(fā)性）的癌、子宮頸癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、食道癌、膽囊癌、胃部（胃） 癌、頭頸癌、肝細(xì)胞(肝)癌、下咽癌、腎癌、喉癌、肝癌(原發(fā)性）、肺癌(非小細(xì)胞）、肺癌(小細(xì) 胞）、間皮瘤、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、卵巢上皮癌(表面上皮-間質(zhì)瘤）、卵巢生殖細(xì)胞腫瘤、 卵巢低惡性潛能腫瘤、胰腺癌、前列腺癌、直腸癌、腎細(xì)胞癌(腎癌）、唾液腺癌、小細(xì)胞肺癌、 小腸癌、胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌、腎盂和輸尿管的移行細(xì)胞癌、子宮癌(子宮內(nèi)膜）。52. 根據(jù)權(quán)利要求51所述的用途，其中所述惡性贅生性疾病選自肺癌、膀胱癌、食道癌、 肝細(xì)胞癌、胰腺癌、睪丸癌和卵巢癌。53. 根據(jù)權(quán)利要求52所述的用途，其中所述惡性贅生性疾病選自肺癌、膀胱癌、食道癌 和卵巢癌。54. 試劑盒，其用于： i)檢測生物樣品中的角蛋白7與角蛋白19的異型復(fù)合物和/或其片段;或 i i)檢測受試者中的惡性贅生性疾病;或 i i i)診斷或預(yù)后受試者中的惡性贅生性疾病;或 iv) 預(yù)測受試者中的惡性贅生性疾病的治療結(jié)果;或 v) 評價受試者中的惡性贅生性疾病的治療效力;或 vi) 評價受試者中的惡性贅生性疾病的復(fù)發(fā)； 所述試劑盒包含： a) 如權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)中所定義的組合物;或者可替代地 b) 第一容器，其包含識別角蛋白7肽和/或其片段的第一靶向試劑;和 c) 第二容器，其包含識別角蛋白19肽和/或其片段的第二靶向試劑，和 d) 任選地用于進(jìn)行如權(quán)利要求18-48中所定義的方法的說明書。
【文檔編號】G01N33/569GK106061998SQ201580007662
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2015年2月4日
【發(fā)明人】A·奧爾維克, O·雷文
【申請人】弗吉瑞必歐診斷股份公司