一種ProtoRAG轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種ProtoRAG轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，該P(yáng)rotoRAG轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)包括兩種轉(zhuǎn)座酶和兩種轉(zhuǎn)座酶識別的上下游末端重復(fù)序列，采用該系統(tǒng)能夠很好地將目的基因?qū)胧荏w基因組，實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移。
【專利說明】
一種ProtoRAG轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)及其用途
技術(shù)領(lǐng)域
[00011本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)，具體涉及一種ProtoRAG轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002] 轉(zhuǎn)座子(Transposon)最早是由McClintock于20世紀(jì)50年代在研究玉米籽粒的顏 色變異中發(fā)現(xiàn)的一類不依靠同源重組而能在基因組內(nèi)和基因組間發(fā)生位置改變的DNA序 列，因此也被稱為跳躍基因或者可移動元件。轉(zhuǎn)座子種類多樣，數(shù)量龐大，且分布廣泛。從細(xì) 菌，古細(xì)菌，到真核生物中都有發(fā)現(xiàn)，（占人類基因組的45%)被認(rèn)為是基因組進(jìn)化的重要驅(qū) 動力。根據(jù)其轉(zhuǎn)座機(jī)制的不同主要分為兩類:反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和DNA轉(zhuǎn)座子。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子首 先通過轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)錄出RNA中間體，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成dsDNA插入宿主基因組，這種工作方式 被稱為"復(fù)制-粘貼"模式。DNA轉(zhuǎn)座子則需要通過轉(zhuǎn)座酶將轉(zhuǎn)座子序列切出，然后通過DNA攻 擊的方式插入新的基因組位置，也稱為"剪切-粘貼"模式。而根據(jù)轉(zhuǎn)座子是否自主編碼轉(zhuǎn)座 需要的轉(zhuǎn)座酶基因，又將轉(zhuǎn)座子分為：自主轉(zhuǎn)座子和非自主轉(zhuǎn)座子?；蚪M中自主轉(zhuǎn)座子由 于更易于造成基因組的不穩(wěn)定性，往往受到宿主更嚴(yán)格的調(diào)控甚至使其失活。非自主轉(zhuǎn)座 子由于不編碼完整功能的轉(zhuǎn)座酶，因此必須借助自主轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行轉(zhuǎn)座。
[0003] 隨著不同物種中新轉(zhuǎn)座子的逐步發(fā)現(xiàn)，以及對轉(zhuǎn)座機(jī)制和轉(zhuǎn)座活性的深入研究， 利用轉(zhuǎn)座子作為基因?qū)胧侄我呀?jīng)在多個技術(shù)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，如:成體和胚系轉(zhuǎn)基因， 功能基因組研究，基因治療等。其中使用較為廣泛的有SleepingBeauty ,piggyBAC等轉(zhuǎn)座 子。在自然狀態(tài)下，因?yàn)榇罅坷鄯e突變的存在，SleepingBeauty都不具有轉(zhuǎn)座活性。首個有 活性的SleepingBeauty轉(zhuǎn)座子是通過對魚類基因組中多個失活的Tcl/mariner轉(zhuǎn)座子進(jìn)行 分子重建產(chǎn)生的，能夠插入到AT二堿基區(qū)域，同時(shí)傾向于插入到內(nèi)含子中。此后，為了提高 SleepingBeauty的轉(zhuǎn)座活性，研究人員對SleepingBeauty轉(zhuǎn)座酶基因進(jìn)行了廣泛的氨基酸 突變篩選，最終獲得了活性增加100倍的SleepingBeauty突變體，從而能夠獲得與病毒載體 相近的穩(wěn)定重組效率。PiggyBAC最初在鱗翅目昆蟲中發(fā)現(xiàn)，能夠插入到TTAA的四堿基區(qū)域， 并且更傾向于插入到轉(zhuǎn)錄元件的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近。隨后進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其在哺乳動物細(xì) 胞系以及生殖細(xì)胞中都具有良好的轉(zhuǎn)座活性，成為哺乳動物遺傳操作的有力工具。此外，不 同的轉(zhuǎn)座子在宿主選擇，轉(zhuǎn)座子活性，外源基因的荷載能力，轉(zhuǎn)座插入位點(diǎn)的偏好性以及轉(zhuǎn) 座子移動范圍等方面表現(xiàn)出明顯差異，使得轉(zhuǎn)座子在具體的問題解決過程中表現(xiàn)出不同的 適用性。因此，對于新轉(zhuǎn)座子的發(fā)現(xiàn)以及應(yīng)用成為一個持續(xù)的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處而提供了一種ProtoRAG轉(zhuǎn)座子 系統(tǒng)，本發(fā)明還提供了采用該P(yáng)rotoRAG轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)轉(zhuǎn)移基因的方法，本發(fā)明還提供了該 ProtoRAG轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的用途。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，所采取的技術(shù)方案:一種ProtoRAG轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，所述ProtoRAG轉(zhuǎn) 座子系統(tǒng)包括可插入目的基因的轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒和提供轉(zhuǎn)座活性的轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒，所述 轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒依次包括轉(zhuǎn)座子5 '末端重復(fù)序列、多克隆插入位點(diǎn)和轉(zhuǎn)座子3 '末端重復(fù)序 列，所述轉(zhuǎn)座子5'末端重復(fù)序列包括SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列或者與SEQ ID NO: 10 具有至少95%同源性且與SEQ ID N0:10功能相同的核苷酸序列，所述轉(zhuǎn)座子3'末端重復(fù)序 列包括SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列或者與SEQ ID NO: 11具有至少95%同源性且與SEQ ID NO: 11功能相同的核苷酸序列。
[0006] 優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)座子5'末端重復(fù)序列包括如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列或者 與SEQ ID NO:8具有至少95%同源性且與SEQ ID NO:8功能相同的核苷酸序列。
[0007] 優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)座子3'末端重復(fù)序列包括SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列或者與 SEQ ID NO:9具有至少95%同源性且與SEQ ID NO:9功能相同的核苷酸序列。
[0008] 優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒表達(dá)轉(zhuǎn)座酶BbRAGlL和轉(zhuǎn)座酶BbRAG2L，所述轉(zhuǎn)座酶 BbRAGlL的編碼序列選自SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列中的一種，所述轉(zhuǎn) 座酶BbRAG2L的編碼序列選自SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列中的一種。
[0009] 優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒表達(dá)轉(zhuǎn)座酶BbRAG IL和轉(zhuǎn)座酶BbRAG2L，所述轉(zhuǎn)座酶 BbRAGlL的編碼序列是與SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:6具有至少95%同源性，且與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 6功能相同的核苷酸序列；所述轉(zhuǎn)座酶BbRAG2L的編碼序列是與SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:7具有至少95%同源性，且與SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:7功能相同的核 苷酸序列。
[0010] 優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒表達(dá)轉(zhuǎn)座酶BbRAGlL和轉(zhuǎn)座酶BbRAG2L，所述轉(zhuǎn)座酶 BbRAGlL的氨基酸序列包括SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 22所示的氨基酸序列，所述轉(zhuǎn)座酶 BbRAG2L的氨基酸序列包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
[0011] 優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒是將所述轉(zhuǎn)座子5 '末端重復(fù)序列、多克隆插入位點(diǎn) 和轉(zhuǎn)座子3 '末端重復(fù)序列連入真核表達(dá)載體pcDNA3.1而得的。
[0012] 優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒是將轉(zhuǎn)座酶編碼序列連入真核表達(dá)載體PCDNA3.1而 得的。
[0013] 本發(fā)明提供了一種采用上述所述ProtoRAG轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)轉(zhuǎn)移基因的方法，所述方法 是通過所述RAG轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)將目的基因?qū)胧荏w基因組。
[0014] 本發(fā)明提供了上述所述ProtoRAG轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在介導(dǎo)DNA導(dǎo)入細(xì)胞中的用途。
[0015] 文昌魚屬于脊索動物門（Chordata)，頭索動物亞門（Cephalochordata)，是無脊椎 動物進(jìn)化到脊椎動物的過渡類型。通過基因組的比較研究發(fā)現(xiàn)，文昌魚基因組中包含具有 很高多樣性的轉(zhuǎn)座子群體，既涵蓋了脊椎動物中的絕大部分的轉(zhuǎn)座子家族，也包括許多無 脊椎動物所特有的轉(zhuǎn)座子家族。本發(fā)明的發(fā)明人從文昌魚中發(fā)現(xiàn)并率先克隆了 ProtoRAG轉(zhuǎn) 座子，包含兩端的TIR序列和中間的BbRAGlL和BbRAG2L轉(zhuǎn)座酶。通過設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)揭示了這一原 始轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座特性，可以將其應(yīng)用于制備基因重組載體、基因重組細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動物等 生產(chǎn)實(shí)踐。
[0016]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明提供了一種ProtoRAG轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，該P(yáng)rotoRAG轉(zhuǎn) 座子系統(tǒng)包括兩種轉(zhuǎn)座酶和兩種轉(zhuǎn)座酶識別的上下游末端重復(fù)序列，采用該系統(tǒng)能夠很好 地將目的基因?qū)胧荏w基因組，實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移。
【附圖說明】
[0017] 圖1為本發(fā)明所述ProtoRAG轉(zhuǎn)座子基因組結(jié)構(gòu)示意圖，其包含的BbRAGlL和 BbRAG2L基因的編碼區(qū)也如圖所示；
[0018] 圖2a為本發(fā)明所述真核重組表達(dá)質(zhì)粒BbRAGlL-pcDNA3.1的構(gòu)建示意圖；
[0019]圖2b為本發(fā)明所述真核重組表達(dá)質(zhì)粒BbRAG2L-pcDNA3.1的構(gòu)建示意圖；
[0020] 圖3a為BbRAGlL和BbRAG2L轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)的TIR底物切出；
[0021]圖3b為本發(fā)明實(shí)施例5中BbRAGlL和BbRAG2L轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)的TIR底物切出后的瓊脂 糖凝膠電泳圖；
[0022]圖4a為本發(fā)明實(shí)施例6中TIR關(guān)鍵序列設(shè)計(jì)策略；
[0023] 圖4b為本發(fā)明實(shí)施例6中BbRAGlL和BbRAG2L轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)的mini-TIR切出結(jié)果； [0024] 圖5a為本發(fā)明實(shí)施例7中BbRAGlL和BbRAG2L轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座示意圖；
[0025]圖5b為BbRAGlL和BbRAG2L轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座插入位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)圖；
[0026]圖5c為BbRAGlL和BbRAG2L轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座插入位點(diǎn)堿基序列組成統(tǒng)計(jì)圖；
[0027]圖6a為BbRAGlL轉(zhuǎn)座酶關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域研究策略；
[0028]圖6b為BbRAGlL轉(zhuǎn)座酶不同結(jié)構(gòu)域活性差異研究；
[0029]圖7a為BbRAGlL轉(zhuǎn)座酶關(guān)鍵氨基酸研究策略；
[0030]圖7b為BbRAGlL轉(zhuǎn)座酶關(guān)鍵氨基酸突變后的活性研究。
【具體實(shí)施方式】
[0031]為更好的說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面將結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明 作進(jìn)一步說明。
[0032] 本申請發(fā)明人在中國白氏文昌魚(Branchiostoma belcheri)中發(fā)現(xiàn)的一種全新 的轉(zhuǎn)座子基因，其編碼的轉(zhuǎn)座酶蛋白質(zhì)與脊椎動物V(D)J重組中的RAG1/2重組酶具有較高 的相似度，故此命名為ProtoRAG轉(zhuǎn)座子，包含上下游的末端重復(fù)序列(TIR)和兩個轉(zhuǎn)座酶基 因，ProtoRAG轉(zhuǎn)座子基因組結(jié)構(gòu)如圖1所示，其DNA序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0033]本發(fā)明根據(jù)生物信息分析在文昌魚基因組中找到的基因組片段，通過Bac文庫篩 選獲得完整的包含ProtoRAG轉(zhuǎn)座子的基因組序列，進(jìn)而在胚胎發(fā)育時(shí)期的cDNA中擴(kuò)增獲得 文昌魚BbRAGlL和BbRAG2L基因編碼區(qū)序列，本發(fā)明所述ProtoRAG轉(zhuǎn)座子所包含的兩個轉(zhuǎn)座 酶基因 BbRAGlL和BbRAG2L，其編碼區(qū)核苷酸序列分別如SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:4所示， 其編碼的BbRAGlL和BbRAG2L轉(zhuǎn)座酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5所示。該蛋 白預(yù)測的等電點(diǎn)分別為為7.31和8.05,分子量分別為126054和39461道爾頓。BbRAGlL和 BbRAG2L基因編碼區(qū)密碼子優(yōu)化后的cDNA序列分別如SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7所示。 [0034]本發(fā)明所述的BbRAGlL和BbRAG2L轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)轉(zhuǎn)座所依賴的上、下游末端重復(fù)序列 (TIR)，分別如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示。
[0035] 本發(fā)明所述的BbRAGlL和BbRAG2L介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)座活性和機(jī)制如下（圖5a和圖5b): [0036]將BbRAGlL和BbRAG2L轉(zhuǎn)座酶核苷酸序列分別克隆到哺乳動物真核表達(dá)載體 pcDNA3.1 上，得到真核表達(dá)載體BbRAGlL-pcDNA3.1 和BbRAG2L-pcDNA3.1 (圖2a和圖2b); [0037] 將轉(zhuǎn)座子上下游末端重復(fù)序列SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9克隆到pcDNA3.1載體 上，呈對向排列。在TIR序列之間插入由Iac啟動子控制的氯霉素基因，構(gòu)成ProtoRAG的重組 底物，稱為pTIR123(圖5a)。
[0038]將BbRAGlL-pcDNA3.1 和BbRAG2L-pcDNA3.1 與pTIR123，pEGFPNl 共同轉(zhuǎn)染 HEK293T 細(xì)胞。48小時(shí)后，能夠檢測到lac啟動子控制的氯霉素基因轉(zhuǎn)座插入到pEGFPNl載體中，形成 具有K+Chl+雙重抗性的重組質(zhì)粒。
[0039] 針對所述BbRAGlL轉(zhuǎn)座酶開發(fā)的潛在變體，按照圖6a的策略研究BbRAGlL轉(zhuǎn)座酶的 關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，從圖6b結(jié)果可以看出不同結(jié)構(gòu)域的活性差異，并且得出BbRAGlL轉(zhuǎn)座酶的關(guān)鍵 結(jié)構(gòu)域?yàn)?68-1136aa;按照圖7a的策略研究BbRAGlL轉(zhuǎn)座酶的關(guān)鍵氨基酸，從圖7b結(jié)果可以 看出突變后的BbRAGlL轉(zhuǎn)座酶的活性差異，并且得出BbRAGlL轉(zhuǎn)座酶的關(guān)鍵氨基酸為D701， D811，E1063,其完整序列如序列表中SEQIDN0:22所示。
[0040]針對所述轉(zhuǎn)座依賴的TIR序列存在的潛在變體，其上游末端重復(fù)序列關(guān)鍵核苷酸 如SEQ ID NO: 10所示，下游末端重復(fù)序列關(guān)鍵核苷酸如SEQ ID NO: 11所示。
[0041 ] 實(shí)施例1:中國白氏文昌魚受精卵mRNA的提取和cDNA合成
[0042]總RNA的提取和mRNA純化：收集文昌魚胚胎，采用Trizol試劑法提取總RNA，利用 QiagenOligotex mRNA Mini Kit(codeNo.70022)試劑盒純化mRNA。
[0043] 普通cDNA-鏈的合成：取lygmRNA，按照Τ0Υ0Β0公司的First Strand cDNA Synthesis Kit ReverTra Ace_a-TM(code No.FSK-100)說明書操作，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成用于 擴(kuò)增基因片段和克隆基因全長的cDNA第一鏈。
[0044] 實(shí)施例2:擴(kuò)增BbRAGlL和BbRAG2L基因的全長編碼區(qū)序列
[0045] 根據(jù)基因組預(yù)測的編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)BbRAGlL和BbRAG2L基因特異的編碼區(qū)擴(kuò)增引 物，擴(kuò)增BbRAGlL的引物對：
[0046] BbeRAGl_FUl:5，-TAGCTAGATATTAGACGTTGAATGTTAA-3，（SEQ ID NO:12)，
[0047] BbeRAGl_FLl:5，-TTGGGCAATTAAATCATTACATACAGTT-3，（SEQ ID N0:13);
[0048] 擴(kuò)增BbRAG2L的引物對：
[0049] BbeRAG2_FUl:5'-CAGCGCGAGATCTAAACAAACGCACATT-3'（SEQ ID NO:14)，
[0050] BbeRAG2_FLl:5'-TCGAGGCCTGATACATGTACACGAACAG-3'（SEQ ID N0:15)。
[0051 ] 采用Takara公司的PrimerStar聚合酶擴(kuò)增BbRAGlL和BbRAG2L的全長基因，分別擴(kuò) 增得到3468bp和1244bp長度的DNA片段。將擴(kuò)增得到的DNA片段連接到pGEM T easy載體后 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，挑選重組克隆測序。對測序結(jié)果進(jìn)行拼接分析，獲得BbRAGlL和 BbRAG2L基因的全長序列，分別包含完整的BbRAGlL和BbRAG2L基因的編碼區(qū)序列，如 SEQIDN0:2和SEQIDN0:4所示。
[0052] 實(shí)施例3 :BbRAGlL和BbRAG2L編碼區(qū)密碼子優(yōu)化
[0053]由于BbRAGl L和BbRAG2L基因在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)量低，在保證不改變編碼氨基 酸的情況下，對BbRAGlL和BbRAG2L編碼區(qū)的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，使其能夠在哺乳動物細(xì)胞中 順利表達(dá)。優(yōu)化后的BbRAGIL編碼序列如SEQ ID NO: 6所示，優(yōu)化后的BbRAG2L編碼序列如 SEQ ID N0:7所示，優(yōu)化后的cDNA序列克隆在pUC57載體上。
[0054] 實(shí)施例4:重組BbRAGlL和BbRAG2L表達(dá)載體的構(gòu)建
[0055] 根據(jù)優(yōu)化后的BbRAGlL基因序列，設(shè)計(jì)引物，上游引物包含HindIII內(nèi)切酶切割位 點(diǎn)，下游引物包含XhoI內(nèi)切酶切割位點(diǎn)。上游引物如SEQ ID NO: 16所示，下游引物如SEQ ID NO: 17所示。
[0056] BmRAGl_pCDNA3.1_Ul:CCCAAGCTTATGTTCTTTACAAGCTCTCA(SEQ ID N0:16)，
[0057] BmRAGl_pCDNA3.1_L1:CGGCTCGAGGTTAGAATCGCTTTCAATGT(SEQ ID NO:17)。
[0058] 根據(jù)優(yōu)化后的BbRAG2L基因序列設(shè)計(jì)引物，上游引物包含HindIII內(nèi)切酶切割位 點(diǎn)，下游引物包含EcoRI內(nèi)切酶切割位點(diǎn)。上游引物如SEQ ID NO: 18所示，下游引物如SEQ ID NO: 19所示。
[0059] BmRAG2_pCDNA3.1_Ul:CCAAGCTTATGAGTAGCGGACCTATCTTTAG(SEQ ID N0:18)，
[0060] BmRAG2_pCDNA3.1_Ll:CCGGAATTCCAGGTTAGTGCAACAGTTCA(SEQ ID N0:19)。
[0061 ]分別以含有 BbRAGlL 和 BbRAG2L 基因的 pGEM-Teasy 質(zhì)粒為模板，BmRAGl_pCDNA3.1_ U1/L1和BmRAG2_praNA3.1_Ul/Ll為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到特異擴(kuò)增的單一條帶，產(chǎn)物大小 分別為3400和IlOObp左右。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1上，得到重組表達(dá) 載體BbRAGlL-pcDNA3.1和BbRAG2L-pcDNA3.1(其構(gòu)建過程如圖2a和圖2b所示）。表達(dá)載體中 的外源基因序列經(jīng)測序鑒定正確。
[0062] 實(shí)施例5:BbRAGlL和BbRAG2L介導(dǎo)的TIR基因盒切出
[0063] 根據(jù)TIR序列設(shè)計(jì)合成策略:基因盒包括呈對向排列的TIR，以及插入其中的polyA 轉(zhuǎn)錄終止序列，通過上游的XhoI和下游的Apa頂每切位點(diǎn)連入peGFPNl載體，得到重組載體 pTIRGl。載體構(gòu)建示意圖如圖3a所示，其序列如序列表中SEQ ID N0:23所示。
[0064] BbRAGlL-pcDNA3 · I (1 · 6yg)和BbRAG2L-pcDNA3 · I (1 · 6yg)，pTIRGl (0 · 8yg)共同轉(zhuǎn) 染HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞。通過Omegaplasmidextractionkit提取質(zhì)粒。通 過P1/P2引物擴(kuò)增（P1 :5'GTCGTAACAACTCCGC3'（SEQIDN0:20);P2:5'GTCGTAACAACTCCGC 3'（SEQ ID N0:21))，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（圖3b)。未發(fā)生TIR基因盒切出的片段大小為 1168bp;發(fā)生TIR基因盒切出的片段大小約為240bp。
[0065] 實(shí)施例6:BbRAGlL和BbRAG2L介導(dǎo)的mini-TIR序列確立
[0066]根據(jù)圖4a所示設(shè)計(jì)TIR序列合成策略：基因盒包括呈對向排列的TIR，以及插入其 中的PolyA轉(zhuǎn)錄終止序列，通過上游的XhoI和下游的ApaI酶切位點(diǎn)連入peGFPNl載體。載體 構(gòu)建示意圖如圖3a所示。
[0067] BbRAGlL-pcDNA3 · I (1 · 6yg)和BbRAG2L-pcDNA3 · I (1 · 6yg)，pTIRGl (0 · 8yg)共同轉(zhuǎn) 染HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞。通過Omegaplasmidextractionkit提取質(zhì)粒。通 過P1/P2引物擴(kuò)增（P1 :5'GTCGTAACAACTCCGC3'（SEQIDN0:20);P2:5'GTCGTAACAACTCCGC 3'（SEQ ID NO: 21))，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（圖4b)。電泳結(jié)果顯示，5TIR的上游和3TIR的上 游為TIR基因盒切出所必需的最短TIR，稱為mini-TIR，上游末端重復(fù)序列關(guān)鍵核苷酸如SEQ ID NO: 10所示，下游末端重復(fù)序列關(guān)鍵核苷酸如SEQ ID NO: 11所示。
[0068] 實(shí)施例7 :BbRAGlL和BbRAG2L的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)座
[0069] 根據(jù)TIR序列設(shè)計(jì)合成策略:基因盒包括呈對向排列的TIR，以及插入其中的由Iac 啟動子控制的氯霉素表達(dá)框，通過上游的BamHI和下游的XholI酶切位點(diǎn)連入pcDNA3.1( + ) 載體，得到重組載體PTIR123。載體構(gòu)建示意圖如圖5a所示，其序列如序列表中SEQ ID NO: 24所示。
[0070] BbRAGlL-pcDNA3.1(1.6yg)和BbRAG2L-pcDNA3.1(1.6yg)，pTIR123(0.8yg)， pEGFPNl(lyg)共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞。通過 Omegaplasmidextract ionkit提取質(zhì)粒。將得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，利用Chl+ K+雙重抗性平板進(jìn)行篩選，得到重組的陽性克隆(示意圖如圖5a所示）。挑取陽性克隆，進(jìn)行 測序，然后比對PeGFPNl載體，確定TIR基因盒轉(zhuǎn)座插入的位置，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖5b所示。同時(shí) 分析插入位點(diǎn)兩側(cè)的堿基組成發(fā)現(xiàn)，BbRAGlL和BbRAG2L介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)座偏好于插入受體載 體的CG富集區(qū)，插入位點(diǎn)附近的堿基統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖5c所示。
[0071]最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保 護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng) 理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì) 和范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種ProtoRAG轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，其特征在于，所述ProtoRAG轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)包括可插入目的 基因的轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒和提供轉(zhuǎn)座活性的轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒，所述轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒依次包括 轉(zhuǎn)座子5 '末端重復(fù)序列、多克隆插入位點(diǎn)和轉(zhuǎn)座子3 '末端重復(fù)序列，所述轉(zhuǎn)座子5 '末端重 復(fù)序列包括SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列或者與SEQ ID NO: 10具有至少95%同源性且 與SEQ ID NO: 10功能相同的核苷酸序列，所述轉(zhuǎn)座子3'末端重復(fù)序列包括SEQ ID NO: 11所 示的核苷酸序列或者與SEQ ID NO: 11具有至少95%同源性且與SEQ ID NO: 11功能相同的 核苷酸序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的ProtoRAG轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，其特征在于，所述轉(zhuǎn)座子5 '末端重復(fù)序 列包括如SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列或者與SEQ ID N0:8具有至少95%同源性且與SEQ ID NO:8功能相同的核苷酸序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的ProtoRAG轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，其特征在于，所述轉(zhuǎn)座子3 '末端重復(fù)序 列包括SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列或者與SEQ ID N0:9具有至少95%同源性且與SEQ ID NO:9功能相同的核苷酸序列。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的ProtoRAG轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，其特征在于，所述轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒表達(dá) 轉(zhuǎn)座酶BbRAGIL和轉(zhuǎn)座酶BbRAG2L，所述轉(zhuǎn)座酶BbRAGIL的編碼序列選自SEQ ID N0:2和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列中的一種，所述轉(zhuǎn)座酶BbRAG2L的編碼序列選自SEQ ID NO:4和 SEQ ID NO :7所示的核苷酸序列中的一種。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的ProtoRAG轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，其特征在于，所述轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒表達(dá) 轉(zhuǎn)座酶BbRAGIL和轉(zhuǎn)座酶BbRAG2L，所述轉(zhuǎn)座酶BbRAGIL的編碼序列是與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6具有至少95%同源性，且與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:6功能相同的核苷酸序列；所 述轉(zhuǎn)座酶BbRAG2L的編碼序列是與SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:7具有至少95%同源性，且與 SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7功能相同的核苷酸序列。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的ProtoRAG轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，其特征在于，所述轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒表達(dá) 轉(zhuǎn)座酶BbRAGIL和轉(zhuǎn)座酶BbRAG2L，所述轉(zhuǎn)座酶BbRAGIL的氨基酸序列包括SEQ ID NO: 3或 SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，所述轉(zhuǎn)座酶BbRAG2L的氨基酸序列包括SEQ ID NO:5所示 的氨基酸序列。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的ProtoRAG轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒是將 所述轉(zhuǎn)座子5 '末端重復(fù)序列、多克隆插入位點(diǎn)和轉(zhuǎn)座子3 '末端重復(fù)序列連入真核表達(dá)載體 pcDNA3.1而得的。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的ProtoRAG轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，其特征在于，所述轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒是將 轉(zhuǎn)座酶編碼序列連入真核表達(dá)載體pcDNA3.1而得的。9. 一種采用如權(quán)利要求1-8任一所述ProtoRAG轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)轉(zhuǎn)移基因的方法，其特征在 于，所述方法是通過所述ProtoRAG轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)將目的基因?qū)胧荏w基因組。10. 如權(quán)利要求1-8任一所述ProtoRAG轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在介導(dǎo)DNA導(dǎo)入細(xì)胞中的用途。
【文檔編號】C12N15/85GK106086070SQ201610399041
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月7日
【發(fā)明人】陶鑫, 徐安龍, 黃盛豐, 元少春, 陳尚武
【申請人】中山大學(xué)