專利名稱：一類丹磺酰類分子探針及其合成方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子影像學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一類丹磺酰類分子探針及其合成和應(yīng)用的 方法。
背景技術(shù)：
分子影像學(xué)(Molecular Imaging)是運(yùn)用影像學(xué)手段顯示組織水平、細(xì)胞和亞細(xì) 胞水平的特定分子，反應(yīng)活體狀態(tài)下分子的水平變化，對(duì)其生物學(xué)行為在影像方面進(jìn)行定 性和定量研究的一門新興邊緣學(xué)科[M Rudin,R ffeissleder. Molecular imaging in drug discovery and development. Nat. Rev. Drug Discov.,2003,2,123-131 ；HR Herschman. Molecular imaging :looking at problems, seeing solutions.Science,2003,302, 605-08 ；R ffeissleder. Molecular imaging in cancer. Science,2006,312,1168-1171.]。 經(jīng)典的影像診斷(CT、MRI等)主要顯示的是一些分子改變的終效應(yīng)，而分子影像學(xué)通過(guò)發(fā) 展新的分子探針、工具及方法，探究疾病過(guò)程中細(xì)胞和組織在分子水平上的異常，在尚無(wú)解 剖改變的疾病發(fā)生前檢出異常，為探索疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)變，為藥物的療效評(píng)估，為分 子水平的疾病治療開(kāi)啟了新天地。分子影像學(xué)的概念于1999年首次提出[RWeissleder. Molecular imaging :exploring the next frontier. Radiology，1999，212，609-614.]，融 合了化學(xué)、分子生物學(xué)、物理學(xué)、放射醫(yī)學(xué)、核醫(yī)學(xué)等多個(gè)學(xué)科和技術(shù)，具有傳統(tǒng)影像成像手 段所不具有的優(yōu)點(diǎn)無(wú)創(chuàng)傷、實(shí)時(shí)、活體、特異、精細(xì)(分子水平)顯像等獨(dú)特性質(zhì)。分子影 像學(xué)最大的挑戰(zhàn)來(lái)自影像探針?lè)肿拥膶ふ液脱兄?。?yōu)良的探針需要具備結(jié)合的特異性、一 定的穿透性以及能產(chǎn)生良好的影像信號(hào)等特點(diǎn)。影像探針的研制一直以來(lái)吸引著科學(xué)家的 注意，這也使其在生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域蘊(yùn)藏著巨大的應(yīng)用前景，實(shí)現(xiàn)對(duì)活體內(nèi)特異性物質(zhì)的 識(shí)別，尤其是對(duì)腫瘤特異性分子相關(guān)的診斷中發(fā)揮重要的作用。細(xì)胞凋亡或程序化細(xì)胞死亡是多細(xì)胞有機(jī)體為調(diào)控機(jī)體發(fā)育，維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定， 由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡過(guò)程，是細(xì)胞衰老自然死亡的主要方式之一。隨著對(duì)細(xì)胞凋亡 研究的深入開(kāi)展，人們認(rèn)識(shí)到凋亡是多細(xì)胞生物體保證個(gè)體正常生理過(guò)程所必需的，而凋 亡過(guò)多或過(guò)少都可引起疾病發(fā)生。因而，探討細(xì)胞凋亡的奧秘將有助于人們了解生命，戰(zhàn)勝 疾病。要了解細(xì)胞凋亡過(guò)程，首先需要準(zhǔn)確地檢測(cè)異常細(xì)胞凋亡的發(fā)生和監(jiān)測(cè)這一病理狀 態(tài)的動(dòng)態(tài)變化。因此發(fā)展一種具有高靈敏性和特異性的分子影像學(xué)探針用于檢測(cè)細(xì)胞凋 亡對(duì)疾病的診斷和治療具有重要意義，這將為疾病發(fā)生的早期檢測(cè)、預(yù)警、診斷和療效評(píng)估 提供新方法和新手段。目前，檢測(cè)細(xì)胞凋亡的手段還很有限。Armexin V法是目前運(yùn)用最 為廣泛的一種手段，也是作為檢測(cè)細(xì)胞凋亡的標(biāo)準(zhǔn)方法(Gold Starndard) [MK Squier, JJ Cohen. Standard quantitative assays for apoptosis. Molecular Biotechnology,2001, 19，305-312. ]。Armexin V是一種分子量為35. 8KDa的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與細(xì)胞 凋亡早期過(guò)程中翻轉(zhuǎn)到膜外的磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine^S)高親和力結(jié)合。利 用這種特性，熒光標(biāo)記Armexin V可通過(guò)檢測(cè)暴露在細(xì)胞膜表面的PS而產(chǎn)生光學(xué)成像。其 中Armexin V-EGFP和Armexin V-FITC，靈敏度高，被作為FACS (流式細(xì)胞分選)方法篩選凋亡細(xì)胞的基石出[DT Dicker,WS El-Deiry. Flow cytometric analysis of tumor suppressor gene-induced apoptosis. Methods in Molecular Biology,2003,223,271-282. ]。Annexin 和碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)進(jìn)行的雙染色，可用來(lái)區(qū)別凋亡早期細(xì)胞與壞死細(xì)胞 和凋亡晚期的細(xì)胞。除此之外，生物素(Biotin)偶聯(lián)的Armexin V也可通過(guò)常用的酶聯(lián)顯 色反應(yīng)光學(xué)成像檢測(cè)凋亡[E Miller. Apoptosis measurement by annexin V staining. Methods in Molecular Medicine，2004，88，191-202.]。近年隨著分子核醫(yī)學(xué)顯像研究的 發(fā)展，用放射性核素標(biāo)記Armexin V的凋亡顯像劑研究成為研究的熱點(diǎn)和重心，這些標(biāo)記分 子探針包括=18F-SFB-Annexin V,"mTc-hydraziono-nicotinamide-AnnexinV("mTc-HYNIC-AnnexinV), 99mTc-Ethylenedicysteine-Annexin V ("mTc-ED-Annexin V)等[HH Boersma, BL Kietselaer, LMStolk, A Bennaghmouch, L Hofstra, J Narula, GA Heidendal, CP Reutelingsperger. Past, present, andfuture of annexin A5 :from protein discovery to clinical applications. J Nuc1. Med. ,2005,46,2035-2050 ;S Rottey, D Loose, L Vakaet,C Lahorte,H Vermeersch,S Van Belle,C van de ffiele. 99mTc-HYNIC Annexin-V imaging of tumors and its relationship to response to radiotherapy and/ orchemotherapy. JNuc 1. Med. Mol. Imaging，2007，51，182—188.]。豐示 i 己 Armexin 子對(duì)活體的凋亡顯像研究在器官移植、腫瘤治療、心臟疾病、中樞神經(jīng)疾病等，特別是在腫 瘤治療評(píng)價(jià)和預(yù)后處理方面取得了很大的進(jìn)步，顯現(xiàn)出非常重要的科學(xué)意義和研究?jī)r(jià)值。然而，Annexin V是一個(gè)分子量為35. SKDa的生物大分子，在 體內(nèi)背景高，代謝緩 慢，從結(jié)合到體內(nèi)的完全清除需要很長(zhǎng)時(shí)間；熒光或者核素標(biāo)記的純化問(wèn)題一直未能有效 解決；另外一方面PS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外的這種特征并不是凋亡所獨(dú)特的，也常發(fā)生在細(xì)胞壞 死(Necrosis)中，這種非特異性還體現(xiàn)在Armexin跟部分正常細(xì)胞也結(jié)合；加上來(lái)源有限， 價(jià)格昂貴等，種種弊端嚴(yán)重影響和限制了它在臨床上的應(yīng)用。與生物大分子相比，有機(jī)小分子探針結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，易于合成，純化方便，來(lái)源相 對(duì)廣泛，體內(nèi)代謝清除快，因而在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用備受關(guān)注，發(fā)展Armexin V的可變代 替物將有很大的潛在市場(chǎng)和價(jià)值。但就目前而言，能應(yīng)用到活體內(nèi)的有機(jī)小分子探針還十 分有限，尤其是可用成像技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)的就更少了，這也是發(fā)展新方法所要解決的瓶頸問(wèn) 題之一。我們基于丹磺酰類設(shè)計(jì)合成的分子探針，通過(guò)凋亡細(xì)胞與探針的特異性反應(yīng)，利用 共聚焦掃描顯微鏡實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤凋亡細(xì)胞的直接有效檢測(cè)。此研究結(jié)果為各種途徑引起的 細(xì)胞凋亡、為疾病(如器官移植、腫瘤治療、心臟疾病、中樞神經(jīng)疾病等)的治療，特別是在 腫瘤治療評(píng)價(jià)和預(yù)后處理方面顯現(xiàn)出非常重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種快速、高效、高選擇性、高靈敏度檢測(cè)凋亡細(xì)胞的分 子探針，為疾病的早期診斷與預(yù)防，藥物的療效評(píng)估等，提供良好的輔助手段；目的之二是 發(fā)展一種工藝簡(jiǎn)單，高效的探針合成方法；目的之三是提供該探針的用途。本發(fā)明的丹磺酰類分子探針，具有式I或式II所示的結(jié)構(gòu)IIl式I中，R為芳基環(huán)、單環(huán)雜芳基環(huán)或雙環(huán)芳基團(tuán)，所述的芳基環(huán)、單環(huán)雜芳基環(huán)的 鄰、對(duì)、間位分別或同時(shí)為氫、鹵素、氨基、C1-C8的取代烷氧基或取代烷基；所述的芳基環(huán) 為含有6-10個(gè)碳原子的芳族碳環(huán)基團(tuán)；所述的單環(huán)雜芳基環(huán)包括噻吩基、噻唑基、呋喃基、 吡啶基、吡咯基、嘧啶基、吡嗪基或四氮唑基；所述的雙環(huán)芳基團(tuán)包括萘基、噴哚基、苯并咪 唑基、嘌呤基、喹啉基或異喹啉基。式II中，R為含有6-10個(gè)碳原子的芳族碳環(huán)基團(tuán)。上述丹磺酰類分子探針I(yè)的合成方法，按丹磺酰胼或者丹磺酰胺脂肪醛或芳香 醛=0. 5mmol 0. 6mmol配比將兩類原料溶解于2mL的二氯甲烷甲醇=1 1體積配比 的混合溶液中，得到的混合液加熱到80°C回流1-3小時(shí)，再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)反應(yīng)混合液除去溶劑， 得到分子探針粗品，然后將該粗品用柱層析分離純化得到分子探針純品。所述的丹磺酰類分子探針I(yè)I的合成方法，0.5mmol按重量比1 16配制的五氧 化二磷和二氧化硅載體加到0. 5mmol丹磺酰胺與Iml芳香醛體系中，得到的混合液加熱到 110°C攪拌1-3小時(shí)，過(guò)濾，所得濾液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去反應(yīng)溶劑，得到分子探針粗品，然后 將該粗品用快速柱層析分離純化得到分子探針純品。
本發(fā)明的目的之三可以通過(guò)如下技術(shù)措施來(lái)實(shí)現(xiàn)將本發(fā)明基于丹磺酰類設(shè)計(jì)合成的分子探針，可與凋亡細(xì)胞特異性識(shí)別和結(jié)合， 通過(guò)共聚焦掃描顯微鏡可以實(shí)現(xiàn)了對(duì)這些凋亡細(xì)胞的有效驗(yàn)證和直接檢測(cè)。此研究結(jié)果為 各種途徑引起的細(xì)胞凋亡進(jìn)行顯像檢查，檢測(cè)各種疾病中細(xì)胞凋亡發(fā)生的程度和范圍，為 疾病的檢測(cè)提供參考依據(jù)。另外該系列分子探針涉及的結(jié)構(gòu)模塊的結(jié)構(gòu)新穎、合理，制備方法相對(duì)簡(jiǎn)單，效率 高，易于制備。而傳統(tǒng)的應(yīng)用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡的探針為生物大分子化合物，如最為廣泛使 用的是膜聯(lián)蛋白Armexin-V，分子量高達(dá)36K Da，但來(lái)源有限，純化困難，操作復(fù)雜，價(jià)格昂 貴；在成像實(shí)驗(yàn)時(shí)還需要結(jié)合熒光基團(tuán)(如異硫氨酸熒光黃，F(xiàn)ITC)才能實(shí)現(xiàn)對(duì)凋亡細(xì)胞 的檢測(cè)；同時(shí)生物大分子化合物的活體成像，從結(jié)合到體內(nèi)的完全清除往往需要數(shù)天，周期 長(zhǎng)。小分子探針有效地克服了這些不足，如小分子化合物活體實(shí)驗(yàn)時(shí)只需幾小時(shí)就被完全 代謝。另外Armexin-V還非特異性地部分結(jié)合正常細(xì)胞，造成偏差。舉例如圖一所示，乳腺 癌細(xì)胞MCF-7經(jīng)紫杉醇處理后發(fā)生凋亡，利用Armexin-V-FITC檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn)，凋亡的癌癥 細(xì)胞在顯微鏡下觀察為紅色(如圖C中箭頭a和b)；同時(shí)這些細(xì)胞也可同時(shí)用我們的小分 子探針檢測(cè)(圖B中箭頭a和b)，凋亡的腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)被染為綠色，說(shuō)明小分子探針可以 用來(lái)檢測(cè)凋亡細(xì)胞。此外，在顯微鏡下，圖A中箭頭c所示細(xì)胞為正常細(xì)胞，應(yīng)該無(wú)任何熒 光標(biāo)記，但圖C所示為紅色，顯示Armexin-V-FITC非特異性地結(jié)合該正常細(xì)胞，造成假象和 誤判；而同樣用小分子探針檢測(cè)圖B中則無(wú)染色，沒(méi)有特異性結(jié)合，此可說(shuō)明小分子探針比 大分子探針Armexin-V具有更好的特異性。本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)是
1.設(shè)計(jì)、合成了新結(jié)構(gòu)的小分子探針，能夠直接用于對(duì)凋亡細(xì)胞的直接檢測(cè)，無(wú)需 其他試劑，目具有高選擇性和專一性。2.該類化合物結(jié)構(gòu)新穎，合成方法簡(jiǎn)單，原料易得，而且具有很高的衍生性，可以 較方便地更換不同官能團(tuán)來(lái)調(diào)節(jié)分子探針的生化特性，具有廣泛的潛在應(yīng)用價(jià)值。 3.該類分子探針使用安全方便，并克服了現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)中的不足，提供了一種可 進(jìn)一步用于對(duì)活體中凋亡細(xì)胞檢測(cè)的新工具。


圖1是本發(fā)明分子探針I(yè)對(duì)人的乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)的成像(分辨率100 μ m)。人的乳腺癌細(xì)胞MCF-7經(jīng)紫杉醇處理后，取待測(cè)細(xì)胞IO5個(gè)/mL，用HEPS洗滌2次， 加入Annexin V-FITC及小分子熒光探針I(yè)或II，室溫輕輕混勻反應(yīng)體系15分鐘，用HEPS 洗滌3次，即完成細(xì)胞熒光標(biāo)記。在熒光顯微鏡下分析，正常細(xì)胞無(wú)任何熒光標(biāo)記；凋亡細(xì) 胞膜上染有熒光標(biāo)記而呈現(xiàn)光環(huán)。A圖為人的乳腺癌細(xì)胞MCF-7經(jīng)紫杉醇處理后的凋亡 照片；B圖為丹磺酰分子探針對(duì)A圖的MCF-7乳腺癌細(xì)胞的熒光成像照片；C圖為膜聯(lián)蛋白 AnnexinV-FITC對(duì)A圖的MCF-7的熒光成像照片；D圖為A圖的MCF-7乳腺癌細(xì)胞用膜聯(lián)蛋 白ArmexinV-FITC和丹磺酰分子探針的激光共聚焦成像照片。箭頭a和b所示為凋亡的乳 腺癌細(xì)胞，c所示為正常細(xì)胞。D圖可以說(shuō)明B圖和C圖所染色的凋亡細(xì)胞基本一致，但丹磺 酰分子探針更具特異性，箭頭c所示的正常細(xì)胞沒(méi)有被丹磺酰染色，而被Armexin V-FITC 染色。圖2是本發(fā)明分子探針對(duì)人的乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)的成像(高分辨率20 μ m)。A圖為人的乳腺癌細(xì)胞MCF-7經(jīng)紫杉醇處理后的凋亡照片；B圖為丹磺酰分子探 針對(duì)A圖的MCF-7乳腺癌細(xì)胞的熒光成像照片；C圖為膜聯(lián)蛋白Armexin V-FITC對(duì)A圖的 MCF-7的熒光成像照片；D圖為A圖的MCF-7乳腺癌細(xì)胞用膜聯(lián)蛋白Armexin V-FITC和丹 磺酰分子探針的激光共聚焦成像照片。高分辨率熒光顯微鏡可見(jiàn)單細(xì)胞情況，圖D所示的 凋亡細(xì)胞可同時(shí)被丹磺酰分子探針和Annexin V-FITC染色，所不同的是Annexin V-FITC 染色在凋亡細(xì)胞膜上，而小分子探針染色凋亡細(xì)胞胞質(zhì)。圖3是本發(fā)明分子探針I(yè)I對(duì)人的乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)的成像(分辨率100 μ m)。A圖為人的乳腺癌細(xì)胞MCF-7經(jīng)紫杉醇處理后的凋亡照片；B圖為分子探針I(yè)I對(duì)A 圖的MCF-7乳腺癌細(xì)胞的熒光成像照片；C圖為膜聯(lián)蛋白Armexin V-FITC對(duì)A圖的MCF-7 的熒光成像照片；D圖為A圖的MCF-7乳腺癌細(xì)胞用膜聯(lián)蛋白Armexin V-FITC和分子探針 II的激光共聚焦成像照片。同樣說(shuō)明小分子探針I(yè)I可以選擇性地識(shí)別凋亡癌癥細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例子說(shuō)明應(yīng)用本發(fā)明所涵蓋的結(jié)構(gòu)模塊設(shè)計(jì)、制備的丹磺酰分子探針及 其應(yīng)用，但這里僅僅是舉例說(shuō)明，并不限制本專利適應(yīng)范圍。實(shí)施例1化合物3的制備<formula>formula see original document page 7</formula> 室溫下化合物1 (138mg，0. 50mmol)溶解于2. OmL甲醇/ 二氯甲烷混合溶液中(體 積比1:1)，加入化合物醛2 (0. 60mmol)?；衔锛訜峄亓鲾嚢?小時(shí)。TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完 成，減壓濃縮得到粗產(chǎn)品，柱層析(石油醚乙酸乙酯=3 1)得到淡黃色化合物171mg， 產(chǎn)率93%。 1H 匪R (400MHz，CDCl3). δ (ppm) = 8. 58 (m, 2H)，8. 43 (m, 2H)，7. 90 (m, 1H)，7. 58 (m, 2H)，7. 17 (m, 2H)，6. 46 (d, J=Il. 6Hz)，3. 81 (s，3H)，3. 80 (s, 3H)，2. 86 (s,6H) ·13C NMR(100MHz, CDCl3). δ (ppm) = 157. 5,155. 1,151. 9,145. 5,140. 5,133. 7, 131. 2，130. 8，130. 0，129. 8，128. 3，123. 2,119. 2,115. 2,112. 0，106. 8,99. 3,99. 0,56. 2， 56. 1,45. 4.實(shí)施例2化合物5的制備<formula>formula see original document page 7</formula>室溫下化合物1 (138mg，0. 50mmol)溶解于2. OmL甲醇中，加入化合物對(duì)氟苯甲醛 4(0. 60mmol)?；衔锛訜峄亓鲾嚢?小時(shí)。TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完成，減壓濃縮得到粗產(chǎn)品，柱層 析(石油醚乙酸乙酯=3 1)得到淡黃色化合物176mg，產(chǎn)率95%。1H NMR (400MHz，CDCl3) · δ (ppm) = 9. 01 (s，1H)，8. 57 (m，2H)，8. 46 (m，1H)，7. 78 (m， 1H)，7. 62 (m, 3H)，7. 42 (m, 2H)，2. 83 (s,6H)，2. 05 (s, 1H).13C NMR(1 OOMHz，CDCl3). δ (ppm) = 162. 3,151. 4,146. 8,133. 7,133. 3,131. 3, 130. 1，129. 9，129. 7，129. 1，128. 9，128. 8，127. 3，123. 5，119. 3，115. 6，115. 3,45. 3.實(shí)施例3化合物7的制備<formula>formula see original document page 8</formula>室溫下化合物l(138mg，0. 50mmol)溶解于2. OmL甲醇中，加入化合物苯甲醛 6(0. 60mmol)?；衔锛訜峄亓鲾嚢?小時(shí)。TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完成，減壓濃縮得到粗產(chǎn)品，柱層 析(石油醚乙酸乙酯=3 1)得到淡黃色化合物168mg，產(chǎn)率95%。1H NMR (400MHz, CDCl3). δ (ppm) = 8. 78 (br, 1H), 8. 56 (m, 2H), 8. 44 (m, 1Η), 7. 70 (m, 1Η)，7. 60 (m, 4Η)，7. 24 (m, 2Η)，2. 83 (s,6H)，2. 04 (s, 1H).13C NMR(1 OOMHz，CDCl3). δ (ppm) = 159. 2,151. 8,147. 1,133. 7,133. 1,131. 1, 130. 8，130. 0，129. 8，128. 4，128. 3，127. 2，127. 0，123. 2，119. 2，115. 3,45. 3.實(shí)施例4化合物9的制備
<formula>formula see original document page 8</formula>室溫下化合物1 (138mg，0. 50mmol)溶解于2. OmL甲醇中，加入對(duì)碘苯甲醛化合物 8(0. 60mmol)?；衔锛訜峄亓鲾嚢?小時(shí)。TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完成，減壓濃縮得到粗產(chǎn)品，柱層 析(石油醚乙酸乙酯=3 1)得到淡黃色化合物204mg，產(chǎn)率85%。1H NMR (400MHz, CDCl3). δ (ppm) = 8. 59-8. 43 (m, 3H)，8. 04 (m, 1H)，7. 79 (m, 1H)， 7. 54 (m, 4H)，7. 16 (m, 1H)，2. 84 (s,6H)，2. 19 (s, 1H).13C NMR(1 OOMHz，CDCl3). δ (ppm) = 158. 1,151. 9,148. 2,143. 3,139. 1,133. 6, 133. 4，131. 5，129. 8，129. 7，128. 6，128. 5，127. 6，127. 2，123. 6，118. 9，115. 4,45. 3.實(shí)施例5化合物11的制備<image>image see original document page 9</image>室溫下化合物1 (138mg，0. 50mmol)溶解于2. OmL甲醇中，加入對(duì)硝基苯甲醛化合 物10(0.60mmol)。化合物加熱回流攪拌1小時(shí)。TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完成，減壓濃縮得到粗產(chǎn)品， 柱層析(石油醚乙酸乙酯=3 1)得到淡黃色化合物140mg，產(chǎn)率74%。1H NMR (400MHz, CDCl3). δ (ppm) = 8. 70 (br, 1H), 8. 47 (m, 2H), 8. 32 (m, 1Η), 7. 47 (m, 3Η)，7. 22 (m, 3Η)，2. 85 (s,6H)，1. 96 (s, 1H).13C NMR(1 OOMHz，CDCl3). δ (ppm) = 159. 0,151. 9,145. 8,137. 6,133. 5,132. 6, 131. 4，130. 9，129. 8，128. 8，128. 6，128. 5，127. 3，127. 0，123. 3，119. 0，115. 3,45. 5.實(shí)施例6化合物13的制備
<image>image see original document page 9</image>
室溫下化合物1 (138mg，0. 50mmol)溶解于2. OmL甲醇中，加入化合物 12(0.60mmol)。化合物加熱回流攪拌1小時(shí)。TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完成，減壓濃縮得到粗產(chǎn)品，柱 層析(石油醚乙酸乙酯=3 1)得到淡黃色化合物166mg，產(chǎn)率84%。1H 匪R (400MHz ,CDCl3). δ (ppm) = 8· 52 (m，2H)，8· 49 (m，1H)，8· 12 (m，1H)，7· 63 (m， 3Η)，7. 33 (m, 2H)，7. 16 (m, 1H)，2. 93 (s,6H)，2. 84 (s,6H)，2. 04 (s, 1H).13C NMR(1 OOMHz，CDCl3). δ (ppm) = 151. 8,149. 2,134. 5,133. 2,130. 8,130. 7, 129. 9，128. 8，128. 2，128. 6，128. 5，123. 2，120. 9，119. 3，115. 1，114. 4,45. 3,40. 0.實(shí)施例7化合物15的制備<formula>formula see original document page 10</formula>室溫下化合物l(138mg，0. 50mmol)溶解于2. OmL甲醇中，加入1_萘醛化合物 14(0.60mmol)?；衔锛訜峄亓鲾嚢?小時(shí)。TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完成，減壓濃縮得到粗產(chǎn)品，柱 層析(石油醚乙酸乙酯=3 1)得到淡黃色化合物161mg，產(chǎn)率80%。1H NMR (400MHz，CDCl3) · δ (ppm) = 8. 51 (m，2H)，8. 48 (m，1H)，8. 02 (m，1H)，7. 96 (m， 1H)，7. 67 (m, 4H)，7. 32 (m, 2H)，7. 15 (m, 2H)，2. 85 (s,6H)，2. 04 (s, 1H).HR-MS Calcd for C23H21N3O2S 403. 1354. Found 403. 1378.實(shí)施例8化合物17的制備<formula>formula see original document page 10</formula>
室溫下化合物1 (139mg，0. 50mmol)溶解于1. OmL甲醇和1. OmL 二氯甲烷的混合溶 液中，加入化合物醛16(0. 60mmol)?；衔锛訜峄亓鲾嚢?小時(shí)。TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完成，減 壓濃縮得到粗產(chǎn)品，柱層析(石油醚乙酸乙酯=2 1)得到淡黃色化合物154mg，產(chǎn)率 76%。1H 匪R (400MHz ,CDCl3). δ (ppm) = 8· 89 (d，1H)，8· 65 (d，1H)，8· 32 (m，3H)，8· 01 (m， 1Η)，7. 97 (m, 2H)，7. 66 (m, 4H)，7. 36 (m, 1H)，2. 86 (s,6H)，2. 05 (s, 1H).實(shí)施例9化合物19的制備<formula>formula see original document page 10</formula>室溫下化合物1 (138mg，0. 50mmol)溶解于1. OmL甲醇和1. OmL 二氯甲烷的混合溶液中，加入化合物醛18(0. 60mmol)?；衔锛訜峄亓鲾嚢?小時(shí)。TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完成，減 壓濃縮得到粗產(chǎn)品，柱層析(石油醚乙酸乙酯=4 1)得到淡黃色化合物130mg，產(chǎn)率 79%。1H 匪R (400MHz ,CDCl3). δ (ppm) = 8. 25 (m, 2H) ,8.11 (m, 2H), 7. 82 (m, 1H) ,7.71 (d, 1H)，7. 37 (m, 1H)，7. 01 (m, 1H)，6. 99 (d, 1H)，6. 93 (d, 1H)，6. 58 (m, 1H)，2. 87 (s,6H).實(shí)施例10化合物21的制備
<formula>formula see original document page 11</formula>室溫下化合物1 (137mg，0. 50mmol)溶解于1. OmL甲醇和1. OmL 二氯甲烷的混合溶 液中，加入化合物醛20(0. 60mmol)?；衔锛訜峄亓鲾嚢?0分鐘。TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完成，減壓 濃縮得到粗產(chǎn)品，柱層析(石油醚乙酸乙酯=3 1)得到黃色化合物151mg，產(chǎn)率84%。1H 匪R (400MHz，CDCl3). δ (ppm) = 8. 26 (m, 3H)，8. 09 (m, 2H)，7. 82 (m, 1H)，7. 70 (m, 2H)，7. 17 (m, 1H)，7. 00 (m, 1H)，2. 86 (s,6H).實(shí)施例11 化合物23的制備
<formula>formula see original document page 11</formula>室溫下化合物22(126mg，0. 50mmol)加入到1. OmL的1_萘甲醛14中，再加入 0. 5mmol五氧化二磷-二氧化硅(重量比1 16)載體?；旌衔锛訜岬?10°C攪拌3小時(shí)。 TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完成，減壓濃縮得到粗產(chǎn)品，快速柱層析(石油醚乙酸乙酯=3 1)得到固 體粉末169mg，產(chǎn)率87%。1H NMR (400MHz, CDCl3). δ (ppm) = 8. 49 (d, 1H, J = 8. 4Hz) ,8. 09 (d, 1H, J = 7. 2Hz)，7. 44-7. 48 (3H, m)，7. 38-7. 42 (3H, m)，6. 97 (d, 1H, J = 8. OHz)，6. 85 (d, 1H, J = 7. 6Hz)，6. 17 (d, 1H, J = 9. 6Hz)，4. 97 (d, 1H, J = 10. OHz)，2. 87 (s,6H) ·實(shí)施例12化合物24的制備<formula>formula see original document page 12</formula>室溫下化合物22(126mg，0. 5mmol)加入到1. OmL苯甲醛6中，加入0. 5mmol五氧 化二磷-二氧化硅(重量比1 16)載體?；旌衔锛訜岬?10°C攪拌3小時(shí)。TLC監(jiān)測(cè)反 應(yīng)完成，減壓濃縮得到粗產(chǎn)品，快速柱層析(石油醚乙酸乙酯=3 1)得到淺黃色固體 147mg，產(chǎn)率 87%。1H NMR (400MHz, CDCl3). δ (ppm) = 8. 49 (d, 1H, J = 8. 4Hz) ,8. 09 (d, 1H, J = 7. 2Hz)，7. 38-7. 48 (4H, m)，7. 38-7. 42 (2H, m)，6. 97 (d, 1H, J = 8. OHz)，6. 85 (d, 1H, J = 7. 6Hz)，6. 17 (d, 1H, J = 9. 6Hz)，4. 97 (d, 1H, J = 10. OHz)，2. 87 (s,6H) ·實(shí)施例13化合物26的制備
<formula>formula see original document page 12</formula>室溫下化合物22 (126mg, 0. 5mmol)加入到1. OmL醛化合物25中，加入0. 5mmol五 氧化二磷-二氧化硅(重量比1 16)載體。混合物加熱到110°C攪拌2小時(shí)。TLC監(jiān)測(cè) 反應(yīng)完成，減壓濃縮得到粗產(chǎn)品，快速柱層析(石油醚乙酸乙酯=6 1)得到淺黃色固 體 142mg，產(chǎn)率 82%。1H NMR (400MHz，CDCl3). (ppm) = 8. 27 (d, 1H)，8. 06 (d, 1H)，7. 82 (m, 2H)，7. 49 (d, 1H)，7. 38 (m, 1H)，7. 00 (m, 1H)，2. 86 (s,6H)，1. 54 (m, 2H)，1. 29 (m, 8H)，0. 89 (t, 3H)。
權(quán)利要求
一類丹磺酰類分子探針，其特征在于，具有式I所示的結(jié)構(gòu)式I中，R為芳基環(huán)、單環(huán)雜芳基環(huán)或雙環(huán)芳基團(tuán)，所述的芳基環(huán)、單環(huán)雜芳基環(huán)的鄰、對(duì)、間位分別或同時(shí)為氫、鹵素、氨基、C1-C8的取代烷氧基或取代烷基；所述的芳基環(huán)為含有6-10個(gè)碳原子的芳族碳環(huán)基團(tuán)；單環(huán)雜芳基環(huán)包括噻吩基、噻唑基、呋喃基、吡啶基、吡咯基、嘧啶基、吡嗪基或四氮唑基；雙環(huán)芳基團(tuán)包括萘基、吲哚基、苯并咪唑基、嘌呤基、喹啉基或異喹啉基。FDA0000021767090000011.tif
2.一類丹磺酰類分子探針，其特征在于，具有式II所示的結(jié)構(gòu)o^oUIl式π中，R為含有6-10個(gè)碳原子的芳族碳環(huán)基團(tuán)。
3.權(quán)利要求1所述的丹磺酰類分子探針的合成方法，其特征在于，按丹磺酰胼脂肪 醛或芳香醛為0. 5mmol 0. 6mmol配比將兩類原料溶解于2mL的二氯甲烷甲醇為1 1 體積配比的混合溶液中，得到的混合液加熱到80°C反應(yīng)1-3小時(shí)，再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)反應(yīng)混合液 除去溶劑，得到分子探針粗品，然后將該粗品用快速柱層析分離純化得到分子探針純品。
4.權(quán)利要求2所述的丹磺酰類分子探針的合成方法，其特征在于，0.5mmol按重量比 1 16配制的五氧化二磷和二氧化硅載體加到0. 5mmol丹磺酰胺與Iml芳香醛體系中，得 到的混合液加熱到iio°c攪拌1-3小時(shí)，過(guò)濾，所得濾液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去反應(yīng)溶劑，得到 分子探針粗品，然后將該粗品用快速柱層析分離純化得到分子探針純品。
5.權(quán)利要求1或2所述的丹磺酰類分子探針的應(yīng)用，其特征在于，將所述的丹磺酰類分 子探針I(yè)或II用于對(duì)凋亡細(xì)胞的檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一類丹磺酰類分子探針及其合成和應(yīng)用的方法。該類分子具有式I或式II的結(jié)構(gòu)。式I中，R為6-10個(gè)碳原子的芳族碳環(huán)、單環(huán)雜芳基環(huán)或雙環(huán)芳基環(huán)，其鄰、對(duì)、間位分別或同時(shí)為氫、鹵素、氨基、C1-C8的取代烷氧基或取代烷基基團(tuán)；單環(huán)雜芳基環(huán)包括噻吩基、噻唑基、呋喃基、吡啶基、吡咯基、嘧啶基、吡嗪基或四氮唑基；雙環(huán)芳基團(tuán)包括萘基、吲哚基、苯并咪唑基、嘌呤基、喹啉基或異喹啉基。式II中，R為6-10個(gè)碳原子的芳族碳環(huán)。運(yùn)用該類結(jié)構(gòu)模塊設(shè)計(jì)的分子探針可以用于生物檢測(cè)技術(shù)和臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是細(xì)胞凋亡試劑盒的應(yīng)用；藥物的治療評(píng)估；放射治療的評(píng)估；凋亡誘導(dǎo)劑和抑制劑的評(píng)估以及藥物活性的高通量篩選等。
文檔編號(hào)C09K11/06GK101818056SQ201010183549
公開(kāi)日2010年9月1日 申請(qǐng)日期2010年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月27日
發(fā)明者劉治國(guó), 曾文彬, 黃佳國(guó) 申請(qǐng)人:中南大學(xué)