在斷奶之前對抗豬繁殖與呼吸綜合征（prrs）病毒的有效疫苗接種的制作方法
【專利說明】在斷奶之前對抗豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS)病毒的有效 疫苗接種
[0001] 本申請是申請日為2013年5月15日、申請?zhí)枮?01380025700. X、發(fā)明名稱"在斷 奶之前對抗豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS)病毒的有效疫苗接種"的專利申請的分案申請。
技術領域
[0002] 本發(fā)明是在動物健康領域中并且針對正極性RNA病毒、新穎RNA病毒以及其經修 飾的活的形式的感染性cDNA克隆，并且使用所述cDNA克隆構造疫苗，具體來說，豬疫苗。 更具體地說，本發(fā)明還提供了豬崽在斷奶之前的安全并且早期疫苗接種，包括從出生之后 即刻（即僅1日齡或更?。┑絻芍荦g，在所有時間任選地與多價組合豬疫苗組合，例如二價 PRRSV/豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae ;M.hyo)疫苗、二價PRRSV/2型豬圓環(huán)病 毒（PCV2)疫苗以及三價PRRSV/M.hyo/PCV2疫苗，或簡單地單價PRRSV疫苗。在所述條件 下對抗PRRS的早期疫苗接種提供保護性免疫的早發(fā)，所述保護性免疫在接種疫苗之后不 遲于約14天，即在生命第1天接種疫苗之后在第15天、在生命第7天接種疫苗之后在第21 天以及在生命第14天接種疫苗之后在不遲于約第28天出現。雖然本發(fā)明說明書提供了北 美PRRS病毒的"P129病毒株"的許多構造體（參見PCT/IB2011/055003和US 6, 500, 662)， 它們可作為高效疫苗，包括用于所述早期和安全使用，但是已經確定，所述保護性免疫的早 發(fā)（即在早在出生之后第1天給予的接種疫苗免疫之后約2周）也適用于其它北美和歐洲 卩1??病毒株的使用，例如在1]5 5,476,778、1]3 5,846,805、1]3 6,380,376、1]5 6,982，160以 及US 6, 197, 310中所述的那些。
【背景技術】
[0003] 豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS)的特征在于大母豬和小母豬中的流產、死產以及其 它繁殖問題，以及幼豬中的呼吸道疾病。病原體是PRRS病毒（PRRSV)，動脈炎病毒科和巢 狀病毒目的一個成員。巢狀病毒是具有由單股正極性RNA組成的基因組的包膜病毒。正鏈 RNA病毒的基因組RNA實現了在遺傳信息的儲存和表達兩方面的雙重作用。沒有DNA參與 巢狀病毒的復制或轉錄。非結構蛋白從巢狀病毒的基因組RNA直接轉譯為大多蛋白并且 隨后被病毒蛋白酶裂解成樸素的功能蛋白。從所述基因組合成3' -同末端成套次基因組 RNA(SgRNA)并將其用作用于結構蛋白的轉譯的信使RNA。因此，巢狀病毒基因組RNA的復 制是基因組復制與sgRNA合成的一個組合過程。
[0004] 在1980年代后期，幾乎同時出現了所述病毒的兩種不同基因型，一種在北美洲而 另一種在歐洲。PRRS病毒現在是幾乎所有產豬國家的地方性病毒，并且被認為是影響全球 豬肉行業(yè)的經濟上最重要疾病之一。另外，已經在中國和周邊國家分離出毒性極強的基因 型，并且所述基因型一般與北美基因型相關。
[0005] 盡管在了解PRRSV的生物學方面取得了顯著進展，但是所述病毒的控制仍然困 難。已證實本領域中動物的疫苗接種基本無效。PRRS通常在經免疫的畜群中重新出現，并 且大部分農場上PRRSV疫苗接種運動最終未能控制所述疾病。
[0006] 不受理論限制，使豬感染野生型PRRSV或用這種病原體的活減毒形式對其進行疫 苗接種不幸地僅僅引發(fā)非中和抗體的大量產生。在這個時間間隔期間，舉例來說，產生了 僅有限數量的干擾素（IFN)-y分泌細胞。因此，PRRSV似乎本能地刺激以一貫豐富的體液 (基于抗體）免疫和可變并且有限但潛在保護性T輔助細胞（Th)I樣IFN-Y反應為特征的 不平衡的免疫反應。最可能有助于適應性免疫的不平衡發(fā)展的PRRSV感染的一個特征是缺 乏足夠的先天性免疫反應。通常，病毒感染的細胞分泌I型干擾素"IFN"（包括IFN-α和 IFN- β )，它保護鄰近細胞不被感染。另外，所釋放的I型IFN與一子組初始T細胞相互作 用以促進其轉化成病毒特異性II型IFN(IFN- 丫）分泌細胞。相比之下，豬對PRRSV暴露的 IFN-α反應幾乎不存在。病原體對IFN-α產生的如此低效的刺激預計將對宿主的適應性 免疫反應的性質具有顯著影響，因為IFN-α上調IFN-γ基因表達。因此，前一種細胞因子 控制促進適應性免疫（即，T細胞介導的IFN-γ反應和峰值抗病毒免疫防御）的發(fā)展的主 要路徑。
[0007] 就此而言，顯然病毒感染中的先天性與適應性免疫之間的可能聯(lián)系通過一種特殊 類型的樹突狀細胞發(fā)生，這種細胞具有產生大量I型干擾素的能力，并且它在T細胞功能 的極化中起關鍵作用。具體來說，一種罕見但顯著類型的樹突狀細胞漿細胞樣樹突狀細胞 (PDC)，也稱為天然的IFN- α / β產生細胞，借助于其引起初始T細胞分化成IFN- γ分泌細 胞的能力而在抗病毒免疫中起關鍵作用。雖然稀有，但是PDC是IFN- α的強有力生產者，每 一個細胞都能夠響應于病毒產生3-10 pgIFN-α。相比之下，單核細胞每一個細胞產生1/10 至Ij 1/5的IFN-α。已經描述了豬PDC的表現型和一些生物特性（薩默菲爾德（Summerfield) 等人，2003,免疫學（Immunology) 110:440)。最新的研究已經確定，PRRSV不刺激豬H)C 分泌IFN-α (卡爾扎達（Calzada)等人，2010,獸醫(yī)免疫學與免疫病理學（Veterinary Immunology and Immunopathology)135:20)〇
[0008] 這個事實與在接種疫苗時外源地添加 IFN-α的觀察結果的結合已被發(fā)現可以改 良PRRSV特異性IFN-γ反應的強度（W. Α.邁耶（W. A. Meier)等人，獸醫(yī)免疫學與免疫病 理學（Vet. Immunol. Immunopath.) 102，第 299 頁-第 314 頁，2004)，突出了 IFN- α 在豬感 染這種病毒期間所起的關鍵作用。鑒于IFN-α對保護性免疫的發(fā)展的明顯關鍵作用，確定 不同PRRS病毒儲備液刺激和/或抑制IFN-α的產生的能力是重要的。因此，存在對用于 保護對抗PRRS的新的并且改良的經修飾活疫苗的迫切需要。如下所述，顯然來源于新穎感 染性cDNA克隆、pCMV-S-P129-PK等的病毒的表現型不同于野生型Ρ129病毒或兩種市售經 修飾活PRRS疫苗。不受理論限制，本發(fā)明提供促進對抗病毒的基于細胞的免疫反應并且定 義PRRS疫苗的新的并且有效的產生的疫苗。

【發(fā)明內容】

[0009] 在第一實施例中，本發(fā)明提供一種包括編碼感染性RNA分子的DNA序列的經分離 多核苷酸分子，所述感染性RNA分子編碼PRRS病毒，所述病毒經遺傳修飾以使得作為一種 疫苗，它在豬科動物中引發(fā)對抗PRRS病毒的有效免疫保護性反應。在某些方面，本發(fā)明提 供一種如本文中所述的 DNA 序列，包括 SEQ ID NO. : 1、SEQ IDN0. :2、SEQ ID NO. :3、SEQ ID NO. :4或SEQ ID:NO:6,或與其至少70%-致，優(yōu)選地與其80%-致，并且更優(yōu)選地與其 85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%-致的序列。
[0010] 在某些實施例中，本發(fā)明提供一種質粒，它包括如本文中所述的經分離多核苷酸 分子和能夠在合適的宿主細胞中轉錄所述多核苷酸分子的啟動子。在另一個實施例中，質 粒的北美或中國PRRS編碼序列在本文中進一步編碼一或多種可檢測的異源抗原表位。本 發(fā)明提供一種包括本文中所述的質粒的經轉染宿主細胞。
[0011] 在另一方面，本發(fā)明提供一種用于保護豬科動物不被PRRS病毒感染的疫苗。所述 疫苗可以包括由感染性RNA分子編碼的北美或中國PRRS病毒、所述感染性RNA分子或質 粒，其中每一者都由本文中所述的經分離多核苷酸分子編碼。在又另一方面，所述疫苗包括 含有本文中的多核苷酸的病毒載體。本文中所述的疫苗可以任選地包括獸用可接受的疫苗 載劑。在一個重要方面，所述疫苗具有相比于野生型P129PRRS病毒有所降低的干擾素 -α 抑制作用（參見ATCC 203488、203489、美國專利第6,500,662號）。
[0012] 在一個實施例中，本發(fā)明提供包括多核苷酸分子的診斷試劑盒，它區(qū)分（所謂的 DIVA測試）自然感染有PRRS病毒的野外病毒株的豬科動物與接種本文中所述的經修飾活 疫苗的豬科動物。
[0013] 在其它實施例中，本發(fā)明提供一種保護豬科動物不感染PRRS病毒的病毒株的方 法，包括向所述動物投與免疫保護量的本文中所述權利要求書的疫苗。
[0014] 本發(fā)明的其它并且優(yōu)選的實施例包括一種經分離的豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (PRRS)或一種編碼所述病毒的多核苷酸序列，其中由ORFla編碼的蛋白質選自由含有以 下氨基酸序列中的任一者的蛋白質組成的群組，其中帶下劃線的殘基被認為是新穎的： AMANVYD(SEQ ID NO:9) ；IGHNAVM(SEQ ID NO:12) ；TVPDGNC(SEQ ID NO:15) ；CffffYLFD(SEQ ID NO:18) ；HGVHGKY(SEQ ID N0:21) ；AAKVDQY(SEQ ID N0:24) ；PSATDTS(SEQ ID N0:27)； LNSLLSK(SEQ ID NO:30) ；APMCQDE(SEQ ID NO:33) ；CAPTGMD(SEQ ID NO:36) ；PKVAKVS(SEQ IDN0:39);AGEIVGV(SEQIDN0:42);ADFMPEK(SEQIDN0:45);W&QTPILGR(SEQID NO: 48)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施例中，本發(fā)明提供一種經分離的北美或中國PRRS，它含有 從ORFla編碼的蛋白質內的以上所鑒別序列中的任一者，包括這些所鑒別序列的任何組合 (2、3、4......直到 17)。
[0015] 本發(fā)明進一步提供一種經分離豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRS)，其中其由ORFla 編碼的蛋白質選自由含有以下中的任一者的那些氨基酸序列組成的群組：AMV(參見SEQ ID NO:9) ；HNA(#BSEQ ID NO: 12) ；PDG(#BSEQ ID NO: 15) ；WYL(#BSEQ ID NO: 18)； VHG (參見 SEQ ID NO:21) ;KYD (參見 SEQ ID NO:24) ;AJ：D (參見 SEQ ID NO:27) ;SLL (參 見 SEQ ID N0:30) ;M￡Q(參見 SEQ ID N0:33) ;PJ：G(參見 SEQ ID N0:36) ;VAK(參見 SEQ ID NO :39) ;EIV (參見 SEQ ID NO :42) ;FMP (參見 SEQ ID NO :45);以及 PIL (參見 SEQ ID N0:48)，包括這些所鑒別序列的任何組合（2、3、4……直到17)。
[0016] 在另一優(yōu)選實施例中，本發(fā)明提供一種經分離北美或中國PRRS，其中不考慮編碼 病毒的多核苷酸或自其編碼的蛋白質中在任何指向的任何其它特定的核苷酸或氨基酸序 列位置的一致性，ORFla病毒蛋白含有：
[0017] (a)在指定序列中的以下特定氨基酸中的任一者，
[0018] 在氨基酸序列AP(參見SEQ ID NO:9)內的氨基酸N ;
[0019] 在氨基酸序列HM(參見SEQ ID NO: 12)內的氨基酸N ;
[0020] 在氨基酸序列PSG(參見SEQ ID NO: 15)內的氨基酸D ;
[0021] 在氨基酸序列WIL(參見SEQ ID NO: 18)內的氨基酸Y ;
[0022] 在氨基酸序列VHG(參見SEQ ID NO: 21)內的氨基酸H ;
[0023] 在氨基酸序列KYD (參見SEQ ID NO: 24)內的氨基酸V ;
[0024] 在氨基酸序列AID(參見SEQ ID NO:27)內的氨基酸T ;
[0025] 在氨基酸序列SLL(參見SEQ ID NO:30)內的氨基酸L ;
[0026] 在氨基酸序列M￡Q(參見SEQ ID NO:33)內的氨基酸C ;
[0027] 在氨基酸序列PIG(參見SEQ ID NO:36)內的氨基酸T ;
[0028] 在氨基酸序列VAK(參見SEQ ID NO: 39)內的氨基酸A ;
[0029] 在氨基酸序列EIV(參見SEQ ID NO:42)內的氨基酸I ;
[0030] 在氨基酸序列FNP (參見SEQ ID NO:45)內的氨基酸N ;以及
[0031] 在氨基酸序列PIL(參見SEQ ID NO:48)內的氨基酸I，包括這些所鑒別序列的任 何組合（2、3、4……直到17)，或
[0032] (b)含有在任何其它北美或中國PRRS病毒的對應于如上所指定的3-殘基序列的 指定3-殘基ORFla肽序列中的所述特定帶下劃線的單一氨基酸，這是考慮到所述其它特定 的3-殘基氨基酸序列可以顯示一個或兩個附加氨基序列改變，但是仍然認為對應于以上 所指定的序列。為了本發(fā)明的這個實施例，"對應"意指可以使用如在赫尼霍夫（Henikoff) 等人美國國家科學院院刊（Proc Natl. Acad. Sci.，USA)，89,第10915頁-第10919頁，1992 中所述的BLOSUM算法最佳地比對相對序列。
[0033] 在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施例中，提供一種經分離的豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (PRRS)，其中其由ORFla編碼的蛋白質具有含有變異（a)、（b)、（c)以及（d)中的一或多者 的氨基酸序列，其中每一種所述變異定義如下：
[0034] 變異（a)，
[0035] 在氨基酸序列AP(參見SEQ ID NO:9)內的氨基酸N ;
[0036] 在氨基酸序列HM(參見SEQ ID NO: 12)內的氨基酸N ;
[0037] 在氨基酸序列PQG(參見SEQ ID NO: 15)內的氨基酸D ;
[0038] 在氨基酸序列WIL(參見SEQ ID NO: 18)內的氨基酸Y ;
[0039] 在氨基酸序列VHG(參見SEQ ID NO: 21)內的氨基酸H ;或變異（a)的任何子組； [0040]變異（b)，
[0041] 在氨基酸序列KYD (參見SEQ ID NO: 24)內的氨基酸V ;
[0042] 在氨基酸序列AID(參見SEQ ID NO:27)內的氨基酸T ;
[0043] 在氨基酸序列SLL(參見SEQ ID NO:30)內的氨基酸L ;
[0044] 在氨基酸序列M￡Q(參見SEQ ID NO:33)內的氨基酸C ;或變異（b)的任何子組；
[0045] 變異（c)，
[0046] 在氨基酸序列PIG(參見SEQ ID NO:36)內的氨基酸T ;
[0047] 在氨基酸序列VAK(參見SEQ ID NO: 39)內的氨基酸A ;或變異（c)的任何子組； 以及
[0048] 變異（d)，
[0049] 在氨基酸序列EIV(參見SEQ ID NO:42)內的氨基酸I ;
[0050] 在氨基酸序列FM3 (參見SEQ ID NO:45)內的氨基酸N ;
[0051] 以及在氨基酸序列PIL (參見SEQ ID NO :20)內的氨基酸I ;或其變異（d)的任何 子組。
[0052] 所述PRRS病毒可以進一步含有在變異（a)中所鑒別的五個氨基酸序列中的兩個 或更多個，和/或在變異（b)中所鑒別的四個氨基酸序列中的兩個或更多個，和/或在變異 (c)中所鑒別的兩個氨基酸序列，和/或在變異（d)中所鑒別的三個氨基酸序列中的兩個或 更多個。
[0053] 本發(fā)明還提供了一種能夠直接轉染合適的宿主細胞并且從如此轉染的合適的宿 主細胞表達豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRS)的質粒，所述質粒包含：(a)編碼感染性RNA 分子的DNA序列，所述感染性RNA分子編碼PRRS病毒，和（b)能夠轉錄所述感染性RNA分 子的啟動子，其中由所述病毒的ORFla編碼的蛋白質具有含有以下的氨基酸序列：
[0054] (1)在氨基酸序列MV(參見SEQ ID NO:9)內的氨基酸N ;
[0055] 在氨基酸序列HM(參見SEQ ID NO: 12)內的氨基酸N ;
[0056] 在氨基酸序列P2G(參見SEQ ID NO: 15)內的氨基酸D ;
[0057] 在氨基酸序列WIL(參見SEQ ID NO: 18)內的氨基酸Y ;
[0058] 在氨基酸序列VHG (參見SEQ ID NO: 21)內的氨基酸H，或其任何子組；和/或
[0059] (2)在氨基酸序列KYD(參見SEQ ID NO:24)內的氨基酸V ;
[0060] 在氨基酸序列AID(參見SEQ ID NO:27)內的氨基酸T ;
[0061] 在氨基酸序列SLL(參見SEQ ID NO:30)內的氨基酸L ;
[0062] 在氨基酸序列M￡Q (參見SEQ ID NO: 33)內的氨基酸C，或其任何子組；和/或
[0063] (3)在氨基酸序列PIG(參見SEQ ID NO:36)內的氨基酸T ;
[0064] 在氨基酸序列VAK (參見SEQ ID NO: 39)內的氨基酸A，或其任何子組；和/或
[0065] (4)在氨基酸序列EIV(參見SEQ ID NO:42)內的氨基酸I ;
[0066] 在氨基酸序列FM3 (參見SEQ ID NO:45)內的氨基酸N ;
[0067] 在氨基酸序列PIL(參見SEQ ID NO:48)內的氨基酸I ;或其任何子組。
[0068] 應了解，ORFla編碼包含蛋白酶功能的多蛋白，并且ORFlb編碼包含復制酶（RNA聚 合酶）和解螺旋酶功能的多蛋白。關于從PRRS的各種ORF(開放閱讀框）編碼的蛋白質的 功能的附加信息可見于例如美國專利第7, 132, 106號中。關于0RF7和其它開放閱讀框的 功能，還參見美國專利第7, 544, 362號。如在本領域中應了解，預計ORFl編碼的蛋白質具 有已知和未知的附加功能，并且適用于本發(fā)明實踐中的新穎氨基酸改變通過其對ORFl編 碼的蛋白質的任何一種特定功能的作用而不受限制。
[0069] 在其它優(yōu)選實施例中，所述質粒含有一種啟動子，它是能夠允許目標真核細胞中 的DNA發(fā)射的真核啟動子，或能夠指導質粒的體外轉錄的原核或噬菌體啟動子。本發(fā)明類 似地提供一種產生PRRS病毒的方法，所述方法包含用適當的質粒轉染合適的宿主細胞并 且獲得由轉染細胞產生的PRRS病毒。
[0070] 因此，在特定并且優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明提供一種包含編碼感染性RNA分子的 DNA序列的經分離多核苷酸分子，所述感染性RNA分子編碼北美PRRS病毒，其中所述DNA序 列選自由以下組成的群組：
[0071] (a) SEQ ID NO: 6 ;
[0072] (b)與（a)的DNA序列至少85%-致的序列，其中其由ORFla編碼的蛋白質具有 含有以下的氨基酸序列：
[0073] 來自組（b)(1)
[0074] 在氨基酸序列AP(參見SEQ ID NO:9)內的氨基酸N ;
[0075] 在氨基酸序列HM(參見SEQ ID NO: 12)內的氨基酸N ;
[0076] 在氨基酸序列P2G(參見SEQ ID NO: 15)內的氨基酸D ;
[0077] 在氨基酸序列WIL(參見SEQ ID NO: 18)內的氨基酸Y ;
[0078] 在氨基酸序列VHG (參見SEQ ID NO: 21)內的氨基酸H，或其任何子組；和/或
[0079] 來自組（b)(2)
[0080] 在氨基酸序列KYD (參見SEQ ID NO: 24)內的氨基酸V ;
[0081] 在氨基酸序列AID(參見SEQ ID NO:27)內的氨基酸T ;