專利名稱：特效菌株處理合成制藥廢水的生物技術(shù)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種特效微生物Xhhh菌株處理合成制藥廢水的生物技術(shù)方法。
背景技術(shù)：
國際上已有多種處理廢水特效菌株，但是沒有應(yīng)用原生質(zhì)體融合特效菌株處理合成制藥廢水的專利。典型的如日本的EM，又如美國PARADISF公司的高智能微生物HIMP(High-Intelligence Microorganism Preparation)等.而國內(nèi)外應(yīng)用原生質(zhì)體融合特效菌株專用于處理合成制藥廢水目前仍是空白。如某公司合成生產(chǎn)神經(jīng)調(diào)節(jié)類藥物，廢水中含有機(jī)氯及其它苯環(huán)與雜環(huán)化等有機(jī)污染物，其中持久性有機(jī)污染物POPs(persistent organic pollutants)及環(huán)境激素EH(environmental hormone)類污染物多達(dá)16種以上。它們難以被土著微生物快速降解，對人類存在著致癌癥和降低精子數(shù)量與質(zhì)量的分子遺傳毒性，對環(huán)境潛在著破壞生物多樣性的分子生態(tài)毒性?，F(xiàn)有的菌種不能有效和長期穩(wěn)定的處理高濃度的制藥有機(jī)廢水。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供原生質(zhì)體融合特效菌株高效處理合成制藥廢水的方法。尤其是應(yīng)用本發(fā)明構(gòu)建的原創(chuàng)性的基因工程特效菌NJU-Xhhh1為出發(fā)菌株，具有白腐真菌的高降解性、土著細(xì)菌XZ1的高適應(yīng)性、釀酒酵母的高絮凝性，利于高效處理合成制藥有機(jī)廢水。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的將原創(chuàng)性特效菌株處理合成制藥有機(jī)廢水生物技術(shù)。(1).技術(shù)構(gòu)思以本發(fā)明構(gòu)建的原創(chuàng)性的基因工程特效菌NJU-Xhhh1為出發(fā)菌株，菌株具有白腐真菌的高降解性、土著細(xì)菌XZ1的高適應(yīng)性、釀酒酵母的高絮凝性，利于高效處理合成制藥有機(jī)廢水。配套相關(guān)的應(yīng)用技術(shù)，在國內(nèi)外具有原創(chuàng)性與持久性。
(2).技術(shù)構(gòu)成出發(fā)菌株NJU-Xhhh1特效菌是本發(fā)明的原創(chuàng)性科研成果。NJU-Xhhh1特效菌由白腐真菌(親株1)、土著細(xì)菌XZ1(親株2)、釀酒酵母(親株3)三個親株菌體的原生質(zhì)體融合，通過基因在同一個細(xì)胞內(nèi)的重組整合，構(gòu)建獲得的基因工程菌，即中國微生物菌種普通微生物中心的1087號微生物。NJU-Xhhh1特效菌集中了三個親株的高降解性、高適應(yīng)性、高絮凝性的三高優(yōu)勢，利于高效處理制藥有機(jī)廢水。國際公認(rèn)原生質(zhì)體融合構(gòu)建的新菌株，不存在基因污染問題，所以NJU-Xhhh1特效菌劑也不存在基因污染問題。
用所述基因工程菌處理制藥廢水的方法是廢水先經(jīng)調(diào)節(jié)池進(jìn)行酸堿調(diào)節(jié)，pH值，6.8-8.0；然后在反應(yīng)器中曝氣、沉淀，并將污泥池中污泥回流至曝氣反應(yīng)池，其處理工藝參數(shù)為處理溫度，30±2℃；反應(yīng)器中溶解氧≥2mg/L；菌體濃度，2-10g/L。
NJU-Xhhh1特效菌由親株1白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)、親株2土著細(xì)菌XZ1(Bacillus)、親株3釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)原生質(zhì)體融合而成。先經(jīng)原生質(zhì)體制備用蝸牛酶脫去真菌的細(xì)胞壁或用溶菌酶脫去細(xì)菌的細(xì)胞壁、生成原生質(zhì)體并經(jīng)離心收集原生質(zhì)體、緩沖液清洗后獲得，然后進(jìn)行二次融合，第一次融合等量的親株1白腐真菌細(xì)胞和親株2土著細(xì)菌YZ1細(xì)胞的原生質(zhì)體混合、并在聚乙二醇(PEG，MW＝6000)、和CaCl2、蔗糖配制的誘導(dǎo)液中融合，經(jīng)離心后收集融合產(chǎn)物、高滲緩沖液離心清洗后分別涂布于SIM1、SIM2、SIM3三種固體鑒別培養(yǎng)基上、30℃培養(yǎng)7天，同時能在三種培養(yǎng)基上長出的菌落，為第一次雙親跨界融合的產(chǎn)物Xhh；而親株1白腐真菌細(xì)胞和親株2土著細(xì)菌XZ1細(xì)胞，只能分別在SIM1和SIM2上生長；第二次融合上次得到的等量的Xhh和親株3釀酒酵母細(xì)胞的原生質(zhì)體混合、在聚乙二醇(PEG，MW＝6000)、和CaCl2、蔗糖配配制的誘導(dǎo)液中融合，經(jīng)離心后收集融合產(chǎn)物、含蔗糖高滲緩沖液離心清洗后、分別涂布于SIM1、SIM2、SIM3三種固體鑒別培養(yǎng)基上，同時能在SIM1、SIM2、SIM3三種培養(yǎng)基上長出的菌落為三親跨界融合的產(chǎn)物NJU-Xhhh1或Xhhh。
其中白腐真菌PC[真核細(xì)胞]、土著菌XZ1[原核細(xì)胞]、釀酒酵母SC[真核細(xì)胞]。
SIM1＝SM+100u鏈霉素/ml(streptomycin，Sm)；SIM2＝SM+100u制霉菌素/ml(nystatin，Nt)；SIM3＝SM+100u鏈霉素/ml+100u制霉菌素/ml(Sm+Nt)。
制備NJU-Xhhh1特效菌劑的液體培養(yǎng)基1000ml中K2HPO43g；KH2PO41g；NH4NO30.5g；Na2SO40.1g；MgSO4·7H2O 10mg；MnSO4·4H2O 1mg；CaCl20.5mg；FeSO4·7H2O 1mg；CH3COONa 5g；酵母浸膏5g；蛋白胨10g；葡萄糖10g；200g馬鈴薯浸出汁，調(diào)pH至7.0；121℃、103kPa、濕熱滅菌20min。最適培養(yǎng)溫度35±2℃；最適pH7.0。
制備NJU-Xhhh1特效菌劑的發(fā)酵工藝發(fā)酵設(shè)備全自控生物反應(yīng)器；發(fā)酵工藝連續(xù)穩(wěn)定發(fā)酵系統(tǒng)；發(fā)酵溫度，33±2℃；pH值，7.0±1；反應(yīng)器中溶解氧，≥2mg/L；，礦物鹽流量，0.001-0.005V/(V.d)；菌體濃度，2-10g/L；在含C、P、N培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
表1.NJU-Xhhh1特效菌劑發(fā)酵工藝參數(shù)

發(fā)明的有益效果(1)NJU-Xhhh1特效菌劑的生產(chǎn)成本低，僅為500元/噸左右，售價可以遠(yuǎn)低于進(jìn)口的菌劑；(2)NJU-Xhhh1特效菌劑具有三親株的三高優(yōu)勢；提高處理效率和節(jié)約費(fèi)用50％以上；(3)NJU-Xhhh1特效菌劑既可處理有毒有機(jī)廢水，也可處理常規(guī)有機(jī)廢水；(4)NJU-Xhhh1特效菌劑應(yīng)用原生質(zhì)體融合工程菌，不產(chǎn)生新基因，沒有基因污染問題。
總之，本發(fā)明菌劑比土著菌提高降解廢水效率和節(jié)約運(yùn)行費(fèi)用50％以上。本發(fā)明是應(yīng)用原生質(zhì)體融合的原創(chuàng)性特效菌，是制備處理合成制藥廢水特效菌劑的首例。尤其是應(yīng)用具有國際原創(chuàng)性的特效菌，制備的特效菌劑在成本和售價上具有國內(nèi)推廣的優(yōu)勢。降解合成制藥廢水具有高降解、高適應(yīng)、高絮凝優(yōu)勢，并有較好的穩(wěn)定適應(yīng)性。


圖1為本發(fā)明特效菌株NJU-Xhhh1處理合成制藥廢水工藝流程示意圖具體實(shí)施方式
參見圖1NJU-Xhhh1特效菌劑制備技術(shù)的發(fā)酵工藝流程尤其是通過多級曝氣池(如圖中三級)進(jìn)行曝氣，沉淀池中回流至第一曝氣池。經(jīng)過二至三級的反應(yīng)器曝氣。
實(shí)施例NJU-Xhhh1特效菌劑制備及其降解合成制藥廢水(1)NJU-Xhhh1特效菌劑制備物的保存配方(4℃)配方1NJU-Xhhh1特效菌劑發(fā)酵液，不加任何其它成份；
配方2NJU-Xhhh1特效菌劑發(fā)酵液+抗氧化劑巰基乙醇(SH)；(終濃度0.2‰)；配方3NJU-Xhhh1特效菌劑發(fā)酵液+Fe3+，(終濃度0.14％)；配方4NJU-Xhhh1特效菌劑發(fā)酵液+Fe3++巰基乙醇(SH)；(終濃度0.2‰)；(2)NJU-Xhhh1特效菌劑制備實(shí)例總結(jié)制備特效菌劑的發(fā)酵工藝控制條件是DO(溶解氧)＝2mg/L；pH＝7.0；T＝35℃；Sf(液體培養(yǎng)基流量)＝0.33(V/V)；攪拌轉(zhuǎn)速1000rpm；硅油除泡沫；礦物鹽流量0.003(V/V)；保存NJU-Xhhh1特效菌劑的最佳條件是4℃保存，特效菌發(fā)酵液+巰基乙醇(SH)；(3)NJU-Xhhh1特效菌株降解處理合成制藥廢水的水質(zhì)參數(shù)背景

(4)NJU-Xhhh1特效菌株(劑)降解合成制藥廢水動力學(xué)參數(shù)

(5)NJU-Xhhh1特效菌株(劑)降解合成制藥廢水生物技術(shù)優(yōu)化結(jié)果其主要控制參數(shù)為污泥回流濃度控制為5-5.5(kg/m3)；水力停留時間為0.6-0.65d；污泥停留時間為20-21d；


節(jié)約68％反應(yīng)器體積的建筑費(fèi)用；提高生物負(fù)荷效率56％。
本發(fā)明用的NJU-Xhhh1特效菌劑是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存的“白腐真菌、釀酒酵母和土著細(xì)菌三者原生質(zhì)體融合產(chǎn)物”，入冊編號是CGMCC No.1087號，2004、1、9發(fā)出。
權(quán)利要求
1.一種特效菌劑降解處理合成制藥廢水的方法，其特征是由白腐真菌(親株1)、土著細(xì)菌XZ1(親株2)、釀酒酵母(親株3)三個親株菌體的原生質(zhì)體融合，通過基因在同一個細(xì)胞內(nèi)的重組整合，構(gòu)建獲得的基因工程菌1087號；然后用所述基因工程菌處理制藥廢水的方法是廢水先經(jīng)調(diào)節(jié)池進(jìn)行酸堿調(diào)節(jié)，pH值，6.8-8.0；然后在反應(yīng)器中曝氣、沉淀，并將污泥池中污泥回流至曝氣反應(yīng)池，其處理工藝參數(shù)為處理溫度，30±2℃；反應(yīng)器中溶解氧≥2mg/L；菌體濃度，2-10g/L。
2.由權(quán)利要求1所述的特效菌劑的制備方法，其特征是；在含P、N營養(yǎng)元素中處理，所述P、N營養(yǎng)元素礦物鹽包括Na2SO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、CaCl2、FeSO4·7H2O。
3.由權(quán)利要求1所述的特效菌劑的制備方法，其特征是制備所述基因工程菌的液體培養(yǎng)基的組成是1000ml中K2HPO43g；KH2PO41g；NH4NO30.5g；Na2SO40.1g；MgSO4·7H2O 10mg；MnSO4·4H2O 1mg；CaCl20.5mg；FeSO4·7H2O 1mg；CH3COONa 5g；酵母浸膏5g；蛋白胨10g；葡萄糖10g；200g馬鈴薯浸出汁，調(diào)pH至7.0；培養(yǎng)方法是在121℃、103kPa、濕熱滅菌20min后，接種發(fā)酵，培養(yǎng)溫度33-37℃；最適pH7.0，發(fā)酵10-25小時。
4.由權(quán)利要求1所述的特效菌劑的制備方法，其特征是NJU-Xhhh1特效菌劑制備物的保存配方，在抗氧化劑巰基乙醇終濃度0.1-0.3‰+Fe3+終濃度0.1-0.14％的配方中保存。
5.由權(quán)利要求1所述的特效菌劑降解處理合成制藥廢水的方法，其特征是污泥回流濃度控制為5-5.5(kg/m3)；水力停留時間為0.6-0.65d；污泥停留時間為20-22d；回流量控制為100％。
6.由權(quán)利要求1所述的特效菌劑降解處理合成制藥廢水的方法，其特征是污泥回流濃度控制為5.395(kg/m3)。
7.由權(quán)利要求1所述的特效菌劑降解處理合成制藥廢水的方法，其特征是水力停留時間為0.6-0.65d。
8.由權(quán)利要求1所述的特效菌劑降解處理合成制藥廢水的方法，其特征是污泥停留時間為20-22d。
9.由權(quán)利要求1所述的特效菌劑降解處理合成制藥廢水的方法，其特征是經(jīng)過二至三次反應(yīng)器中曝氣。
全文摘要
一種特效菌株降解處理合成制藥廢水的方法，由白腐真菌(親株1)、土著細(xì)菌XZ1(親株2)、釀酒酵母(親株3)三個親株菌體的原生質(zhì)體融合，用所述基因工程菌處理制藥廢水廢水先經(jīng)調(diào)節(jié)池進(jìn)行酸堿調(diào)節(jié)，pH值，6.8－8.0；然后在反應(yīng)器中曝氣、沉淀，并將污泥池中污泥回流至曝氣反應(yīng)池，處理溫度，30±2℃；反應(yīng)器中溶解氧≥2mg/L；菌體濃度，2－10g/L。本發(fā)明降解合成制藥廢水的最大比降解率q
文檔編號C02F3/34GK1669952SQ20041004112
公開日2005年9月21日 申請日期2004年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月30日
發(fā)明者程樹培, 孫石磊, 張徐祥, 張力, 朱程軍, 魏國哲, 于洪峰, 萬玉秋, 李維新, 于紅霞, 孫成, 顧繼東 申請人:南京大學(xué)