專利名稱：一株高效脫氮除磷菌c18的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一株高效脫氮除磷菌C18，是利用微生物的方法提高廢水脫氮除磷工 藝的效率，適用于水污染控制及廢水生化處理工藝領域。
二背景技術：
長期以來，污水處理的目的側重于去除有機物和懸浮物，并不考慮氮、磷的去除。
隨著污水排放量的增大，尤其是化肥、農藥、合成洗滌劑的廣泛使用，污水中存在的氮、磷營
養(yǎng)物質對環(huán)境所造成的影響也逐漸引起了人們的高度重視。氮、磷植物營養(yǎng)型污染物的排
放對水體環(huán)境的影響最為突出的是水體的富營養(yǎng)化，表現為藻類的過量繁殖、水質惡化等
現象，最終導致湖泊退化；與此同時，氨、氮的耗氧性能夠使水體中的溶解氧降低，導致魚類
死亡、水體惡臭；當水中pH值較高時，氨對魚類等水生植物產生毒性。水環(huán)境污染和水質富
營養(yǎng)化問題迫使越來越多的國家制定嚴格的氮、磷排放標準，限制氮、磷的排放量，污水處
理過程中也必須考慮到相應的技術手段，有效地降低廢水中的氮、磷含量已成為現代廢水
處理技術的一項新課題?！段鬯C合排放標準》(GB18918-2002)對所有排放污水中的氮、磷
含量都做出了明確的規(guī)定，其中磷(以正磷酸鹽計)的排放要嚴格控制在O. 5mg/L(—級標
準)，因此今后大多數城市污水處理廠都要考慮采用除磷脫氮的技術措施。 近20年，污水脫氮除磷技術一直是水處理領域的熱點，也是難點，通過相應的國
際交流、技術探討及工程實踐經驗，加速了脫氮除磷技術的發(fā)展，重大的成就就是生物脫氮
除磷技術的發(fā)展以及生物處理和化學處理的有機結合。從脫氮除磷的原理上看，某些化學、
物理的方法可有效地去除污水中的氮、磷，但一般情況下，這兩種方式運行較為復雜，費用
很高，還需要另建構筑物才能保證處理效果，增加了基建費用，而脫氮除磷的生物處理具有
同時脫除C、N、P且處理成本低等優(yōu)越性。所以從環(huán)境中分離高效脫氮除磷菌，能大大提高
生物脫氮處理工藝的效率，在實際中得到了廣泛的應用。
三
發(fā)明內容
技術問題本發(fā)明的目的在于從環(huán)境中篩選出一株高效脫氮除磷菌，為生物脫氮
除磷工藝提供進一步的理論依據及技術支持。 技術方案 本發(fā)明的詳細實施步驟為 —株高效脫氮除磷菌，2009年12月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員
會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC No.3518，菌株為革蘭氏染色反應陰性菌C18，經
鑒定為假單胞菌(Pseudomonas grimontii)，主要生物學特性為G—，菌體為短桿狀，大小約
0.9X0.6ym，偏端單生鞭毛；V-P試驗陽性；噴哚試驗陽性；能水解淀粉。 所述的脫氮除磷菌C18可以用在水污染控制及廢水生化處理工藝中脫氮除磷。脫
氮除磷工藝條件為，溫度30°C， pH7. 5。 有益效果
3
該發(fā)明的菌株具有很好的脫氮除磷能力，該菌株在缺氧培養(yǎng)24h后，除磷率達 88. 3%，脫氮率達83. 4%。將其應用于生物脫氮除磷工藝，具有同時脫除C、 N、 P且處理成 本低等優(yōu)越性。
四

圖1 :不同菌株好氧培養(yǎng)除磷能力
圖2 :菌株C18缺氧培養(yǎng)同步脫氮除磷能力
圖3 :溫度對C18同步脫氮除磷能力的影響
圖4 :pH對C18同步脫氮除磷能力的影響
五具體實施例方式
以下敘述本發(fā)明的實施例
1.菌株的分離純化 吸取污泥樣品10mL置于含100mL無菌水的250mL三角瓶中，加入若干玻璃珠，于 3(TC搖床振蕩30min。取混合液0. 5mL于盛有4. 5mL無菌水的試管中，振蕩混勻，制成濃度 梯度為10—、 10—2， 10—3， 10—4， 10—5， 10—6的懸液。取不同梯度的懸液0. lmL涂布于YG平板上， 每個稀釋度各做三塊平板，3(TC培養(yǎng)2 3d。從平板中挑選出形態(tài)不同的菌落，在YG平板 上劃線純化；將純化的菌轉接至LB斜面培養(yǎng)基上，3(TC培養(yǎng)2d，于fC條件下保存。
2.菌株的篩選 (1)藍白斑初篩將從平板中挑出的形態(tài)不同的菌落，分別點接于限磷和過磷培 養(yǎng)基上，3(TC培養(yǎng)2d。選擇在限磷和過磷培養(yǎng)基上均呈藍斑的菌株。 限磷和過磷培養(yǎng)基的配制方法如下①先配制100mL的IOXMOPS培養(yǎng)基 8. 372gM0PS+0. 717g tricine+30mL去離子水，lOmol L—1的KOH調節(jié)pH至7. 4，總體積到 44mL，再加入0. 01% lmL新制的FeS04溶液，并按下列順序加溶液5mL 1. 9mol L—1 NH4C1， lmL 0.276mol L—1 K2S04， 0. 025mL 0. 02mol L—1 CaCl2 *2H20， 0. 21mL 2. 5mol L—^gC^ *6H20， 10mL 5mol L—、aCl， 0. 02mL微量元素混合液，38. 7mL去離子水，葡萄糖O. lg ;②分別取50mL 置于兩個500mL的三角瓶中，向一個三角瓶中加入O. 00866giyiP04，成為限磷培養(yǎng)基；向 另一個瓶中加入0. 1732g 1(2昍04，成為過磷培養(yǎng)基。③向兩種培養(yǎng)基中均加入0. lg/mL的 thiamine溶液O. OlmL，定容至500mL，用細菌濾器過濾后，取lOOmL分裝于已滅菌的150mL 的三角瓶中。微量元素配方(NH4)6(M07)24 0. 09g，H3B03 0.62g，CoCl2 0.18g，CuS04 0 . 06g， MnCl2 0. 40g， ZnS04 0 . 07g。 (2)將上述篩選出的菌株進行Albert異染粒染色，選擇具有異染粒顆粒的菌株。 Albert異染粒染色試劑①甲液甲苯胺藍O. 15g，孔雀綠0. 20g，冰醋酸lmL，酒
精(95% )2mL，蒸餾水100ml。②乙液碘2g，碘化鉀3g，蒸餾水300mL。 Albert異染粒染色方法按常規(guī)方法制片，用甲液染5min ;傾去甲液，用乙液沖去
甲液，并染lmin，水洗；吸干，備油鏡鏡檢；若有異染粒，則異染粒呈黑色，菌體其他部分呈綠色。 (3)菌株除磷效果研究將上述篩選出的菌株接入LB試管，30°C 、 180r *min—1振蕩 培養(yǎng)1211后，離心收集菌體，調整菌液006。。= l.O，即為種子液。再按1%的接種量接種于含
4lOOmL LB液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，3(TC、180r *min—1好氧培養(yǎng)24h， LB培養(yǎng)基配方為 蛋白胨質量比1%、酵母粉0. 5%、NaCl 1%， pH7.0-7.2。在不同的生長階段即0h、4h、8h、 12h、16h、20h、24h分別取培養(yǎng)后的菌液于12000g離心lmin，以大腸埃希氏菌Escherichia coli(來源中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號20658)為對照菌，測定上清液磷濃 度，由圖1可知，C18在好氧培養(yǎng)24h后上清液磷濃度從38. 7mg/L降低至2. 28mg/L，磷去除 率達到了 94. 1%。 (4)菌株反硝化能力研究將好氧除磷能力較強的菌株接種于硝酸鹽蛋白胨水培 養(yǎng)基(牛肉膏3g，蛋白胨5g，KN03 lg，蒸餾水1000mL，pH7.4)中，30。C培養(yǎng)24h，觀察結果， 凡在硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基中的小倒管內有氣體產生者，即為陽性，表明該菌可還原硝酸 鹽并將硝酸鹽分解產生氮氣，即該菌具有反硝化能力(表1)。
表1硝酸鹽還原產氣試驗結果
硝酸鹽還原產氣試驗結果菌株號
陽性C18、 C27、 C28、 C31
陰性C2、 C3、 C33 (5)菌株同步脫氮除磷能力研究將菌株C18、 C28、 C31按1 %的接種量接種于含 有l(wèi)OOmL缺氧培養(yǎng)基[KN03 5%、K2HP04 2. 5% 、微量元素混合液20% ，pH7. 2-7. 4 ;其中微量 元素混合液為制備為:(NH4)6(M07)24 0. 09g， H3B03 0. 62g， CoCl2 0. 18g， CuS04 0 . 06g， MnCl2 0. 40g，ZnS04 0 . 07g分別先溶于40mL水中，再定容至50mL]的250mL錐形瓶中，錐形瓶內通 N2維持缺氧條件，30°C 、 180r *min—1培養(yǎng)24h，在不同的生長階段即0h、4h、8h、 12h、 16h、20h、 24h分別取培養(yǎng)后的菌液于12000g離心lmin，測定上清液中磷和硝酸鹽氮濃度的變化，見 表2，圖2 (測定上清液中磷濃度鉬銻抗分光光度法；測定上清液中硝酸鹽氮濃度紫外分 光光度法)。由表2、圖2可知，在相同條件下，菌株C18同步脫氮除磷能力較強，除磷率及 脫氮率分別達88. 3%和83. 4%。缺氧培養(yǎng)基配方為
結合上述實驗結果，確定菌株C18為高效脫氮除磷菌。
表2缺氧培養(yǎng)實驗結果
上清液磷濃度(mgl—1) 上清液硝酸鹽濃度(mg'i;1)~~
起始結束去除量去除率(％)起始結束去除量去除率(％)
C18 44.5 5.21 39.29 88.3 184.2 30.6 136.9 83.4 C2844.542.6 1.9 4.17 184.2 18.6 165.6 89.9
C31 44.541.1 3.4 7.64 184.2 14.6 169.6 92.1 _ 3.對菌株C18的16S rRNA基因序列進行分析，結果表明，C18的16S rRNA基因序 列與Pseudomonas grimontii 16S rRNA基因序列同源性達99% 。并結合生理生化特性試 驗結果，將C18鑒定為假單胞菌Pseudomonas grimontii。菌株C18的主要生物學特性為 G—，菌體為短桿狀，大小約0.9X0.6ym，偏端單生鞭毛；V-P試驗陽性；噴哚試驗陽性；能水 解淀粉。 4.溫度對C18同步脫氮除磷效率的影響實驗設置15"、25"、30"、35"、45"幾 種不同的溫度，將C18按1%接種量接種至含有100mL缺氧培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，錐形 瓶內通N2維持缺氧條件，在不同溫度下180r 'min—1培養(yǎng)24h后，測定各上清液中磷和硝酸 鹽氮的濃度變化，結果如圖3所示，C18最適脫氮除磷溫度為3(TC，可為其在水污染控制及廢水生化處理工藝中的的應用提供依據。 5.pH對C18同步脫氮除磷效率的影響調節(jié)缺氧培養(yǎng)基pH為pH5.0、 pH6. 0、 pH7. 0、 pH7. 5、 pH8. 0、 pH9. O，將菌株C18按1%接種量接種至含有l(wèi)OOmL不同pH缺氧培養(yǎng) 基的250mL錐形瓶中，錐形瓶內通N2維持缺氧條件，30°C 、 180r min—1培養(yǎng)24h，測定各上 清液中磷和硝酸鹽氮的濃度變化，結果如圖4所示，C18最適脫氮除磷pH為pH7. 5，可為其 在水污染控制及廢水生化處理工藝中的的應用提供依據。
權利要求
一株高效脫氮除磷菌C18，2009年12月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC No.3518，該菌株為革蘭氏染色反應陰性菌，經鑒定為假單胞菌(Pseudomonas grimontii)，主要生物學特性為G-，菌體為短桿狀，大小約0.9×0.6μm，偏端單生鞭毛；V-P試驗陽性；吲哚試驗陽性；能水解淀粉。
2. 權利要求1所述的脫氮除磷菌C18在水污染控制及廢水生化處理工藝中脫氮除磷的 應用。
3. 權利要求2所述的應用，其特征在于，權利要求1所述的脫氮除磷菌C18脫氮除磷最 佳工藝條件為溫度30°C ， pH7. 5。
全文摘要
本發(fā)明提供一株高效脫氮除磷菌C18，屬于廢水生化處理工藝技術領域。菌株C18為革蘭氏染色反應陰性菌，經鑒定為假單胞菌(Pseudomonas grimontii)。該菌株主要生物學特性為G-，菌體為短桿狀，大小約0.9×0.6μm，偏端單生鞭毛；V-P試驗陽性；吲哚試驗陽性；能水解淀粉。菌株C18在缺氧培養(yǎng)24h后，除磷率達88.3％，脫氮率達83.4％，可將其應用于廢水生化處理工藝中，大大降低廢水中的氮磷含量。
文檔編號C02F3/34GK101735973SQ20101010057
公開日2010年6月16日 申請日期2010年1月25日 優(yōu)先權日2010年1月25日
發(fā)明者劉志偉, 吳守中, 李曉丹, 蔡天明, 蔡舒, 陳立偉 申請人:南京農業(yè)大學