專利名稱：用于干細(xì)胞富集的切向流過(guò)濾裝置和方法
相關(guān)申請(qǐng)的相互參照本申請(qǐng)要求2003年11月24日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/524,511的利益，其全部公開內(nèi)容在此引入作為參考。
背景技術(shù)：
在研究或治療中常?？释褂酶缓杉?xì)胞的細(xì)胞群體。干細(xì)胞的典型來(lái)源包括骨髓、全外周血、白細(xì)胞提取法或單采血液成分術(shù)的產(chǎn)物，特別是來(lái)自“動(dòng)員的”供體，或其它較不常見(jiàn)的來(lái)源，如臍帶血和組織或器官懸液。已經(jīng)用幾種方法進(jìn)行了干細(xì)胞的富集。典型的方法包括密度梯度法(例如FICOLL-HYPAQUE、膠態(tài)二氧化硅等等)、淘洗法、離心、低滲休克造成紅細(xì)胞裂解和這些方法的各種組合。舉例來(lái)說(shuō)，從骨髓純化干細(xì)胞需要除去紅細(xì)胞和粒細(xì)胞，這常常通過(guò)FICOLL-HYPAQUE密度梯度離心來(lái)完成。這些方法中的每一個(gè)都有缺點(diǎn)，其中之一是進(jìn)行富集步驟后需要艱苦的洗滌步驟，例如除去密度梯度離心介質(zhì)。
富集后，典型地通過(guò)重復(fù)方法洗滌細(xì)胞。該步驟通常包括將富集的細(xì)胞懸液放入離心管中和使用離心機(jī)使細(xì)胞沉淀至管底。從離心機(jī)中取出管子，并從沉淀細(xì)胞中傾倒出上清液。向管中添加洗液，并重懸細(xì)胞沉淀。這些步驟典型地重復(fù)2至4次。
這種洗滌方法的一個(gè)缺點(diǎn)是連續(xù)重懸和離心可降低細(xì)胞存活力并增加細(xì)胞裂解。離心洗滌的另一個(gè)缺點(diǎn)是細(xì)菌或其它傳染物污染細(xì)胞的機(jī)會(huì)。即使所有的材料保持無(wú)菌，離心管的重復(fù)開啟、吸管和洗液瓶暴露于空氣仍可以引起污染。污染風(fēng)險(xiǎn)足夠顯著，一些醫(yī)療管理機(jī)構(gòu)已經(jīng)要求只有“封閉”系統(tǒng)才能用于細(xì)胞操作。
過(guò)濾法也已經(jīng)用于從血液中除去細(xì)胞，同時(shí)保留其它血液成分用于隨后使用。這種方法通常以不可回收的形式將細(xì)胞截留于過(guò)濾器中，同時(shí)允許其它血液成分通過(guò)過(guò)濾器并進(jìn)入收集容器。例如，過(guò)濾器可以用來(lái)從血液中除去白細(xì)胞，因此使輸血后同種免疫反應(yīng)的發(fā)生率減到最小。白細(xì)胞的除去典型地是使用由織結(jié)的塑料纖維網(wǎng)制成的過(guò)濾器進(jìn)行的。通常安排該網(wǎng)將白細(xì)胞截留于具有足夠厚度的網(wǎng)狀基質(zhì)中，使得細(xì)胞截留遍及過(guò)濾器的厚度，因此保持過(guò)濾器不堵塞，因?yàn)槿绻准?xì)胞被截留于平面表面將發(fā)生堵塞。
除了細(xì)胞的物理截留之外，過(guò)濾器的材料和大表面面積允許白細(xì)胞不可逆地粘附于表面。這些粘附細(xì)胞中的很多正是一些醫(yī)療操作中渴望的細(xì)胞。所產(chǎn)生的截留和粘附于過(guò)濾器的組合建立了用于在輸血治療之前除去白細(xì)胞的高效率方法。然而，當(dāng)白細(xì)胞是期望的細(xì)胞時(shí)，這種過(guò)濾方法沒(méi)有益處。
各種顆粒的分級(jí)分離中有用的一種方法是切向流過(guò)濾(TFF)或“交叉流”過(guò)濾。TFF依靠與多孔膜過(guò)濾器表面平行的液體運(yùn)動(dòng)。膜的小孔允許液體和典型地小于小孔的液體內(nèi)的顆粒通過(guò)。此外，與過(guò)濾器平行的液體交叉流(或“切向”流)防止了大于過(guò)濾器表面上小孔的顆粒的集結(jié)。
TFF已被用于各種物質(zhì)的粗分離。Genovesi(J.Parenter.Aci.Technol.，3781，1983)已綜述了切向流過(guò)濾在藥物領(lǐng)域中的應(yīng)用，包括無(wú)菌注射用水的過(guò)濾、溶劑系統(tǒng)的澄清和從肉湯和細(xì)菌培養(yǎng)物過(guò)濾酶。Marinaccio等(WO 85/03011)報(bào)道了用于從血漿除去的血液中除去微粒血液成分的方法，和Robinson等(美國(guó)專利5,423,738)描述了使用TFF從血液中除去血漿，允許血細(xì)胞和血小板再輸注給患者。
在其它用途中，已報(bào)道TFF用于啤酒的過(guò)濾(EP 0 208 450)，具體而言是用于除去微粒如酵母細(xì)胞和其它懸浮固體。Kothe等(美國(guó)專利4,644,056)公開了TFF在從奶或初乳中純化免疫球蛋白中的用途，和Castino(美國(guó)專利4,420,398)描述了它在從含有抗病毒物質(zhì)以及病毒顆粒和細(xì)胞的肉湯中分離抗病毒物質(zhì)如干擾素中的用途。類似地，TFF已經(jīng)用于從細(xì)胞碎片中分離細(xì)菌酶。(Quirk等，Enzyme Microb.Technol.，6201，1984)。此外，切向流過(guò)濾裝置已經(jīng)用于懸浮于培養(yǎng)基中的細(xì)胞的濃縮。(參見(jiàn)例如Radlett，J；Appl.Chem.Biotechnol.，22495，1972)。
也已報(bào)道了TFF根據(jù)大小分離脂質(zhì)體和脂質(zhì)顆粒。(Lenk等，美國(guó)專利5,948,441)。TFF允許從脂質(zhì)體和脂質(zhì)顆粒的異質(zhì)群體形成和分離具有限定粒度范圍的脂質(zhì)體和脂質(zhì)顆粒。(參見(jiàn)Lenk等，前述)。
然而，盡管TFF已經(jīng)用于生物液體的粗分級(jí)分離和例如脂質(zhì)體的分離，但是本領(lǐng)域尚未認(rèn)識(shí)到TFF用于分離限定特征不同的活細(xì)胞群體的用途。尤其是，尚未提出與從其它骨髓細(xì)胞或從血細(xì)胞和組織或器官懸液中選擇性分離干細(xì)胞，同時(shí)保持無(wú)菌、細(xì)胞存活力和再生活性相關(guān)的獨(dú)特問(wèn)題。此外，目前的方法尚未解決其它細(xì)胞群體例如具有重疊粒度范圍的群體的除去。
因此，本領(lǐng)域還需要從其它骨髓或血液成分，包括血漿、紅細(xì)胞和/或血小板選擇性富集干細(xì)胞，同時(shí)保持無(wú)菌、細(xì)胞存活力以及再生和細(xì)胞活性的另外的裝置和方法。本發(fā)明滿足了這些和其它需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及從骨髓、血液和血液制品、組織和組織或器官制備物分離干細(xì)胞或祖細(xì)胞。特別是，使用切向流過(guò)濾裝置制備富含干細(xì)胞的細(xì)胞群體。提供了使用該裝置制備富含干細(xì)胞群體的方法。使用本發(fā)明的裝置和方法獲得的富含干細(xì)胞等的細(xì)胞群體可用于制備為了例如骨髓重構(gòu)或損傷組織包括心肌等等的修復(fù)的目的而適于輸注給個(gè)體的組合物。
本發(fā)明的切向流過(guò)濾裝置包括具有交叉流室、濾液室和在它們之間配置的過(guò)濾器的去除裝置。過(guò)濾器在一側(cè)-滲余物表面，與交叉流室處于液體互通，而在另一側(cè)-濾液表面，與濾液室處于液體互通。交叉流室具有適于將樣品，如包含干細(xì)胞的骨髓或血液成分引入交叉流室并且與過(guò)濾器的滲余物表面平行的入口。交叉流室也提供了出口，安排在該室與過(guò)濾器的滲余物表面相對(duì)部分的中心。適用于切向流過(guò)濾裝置的過(guò)濾器典型地具有范圍約1至約10微米的平均孔徑。在用于富集干細(xì)胞的某些實(shí)施方案中，過(guò)濾器具有約3至約7微米或約3至約5.5微米的平均孔徑。典型地，去除裝置以一次性使用可任意處理的部件提供。
此外，該裝置可以包括提供樣品進(jìn)入交叉流室入口的預(yù)定進(jìn)料速度的單元和控制濾液通過(guò)過(guò)濾器并進(jìn)入濾液室的過(guò)濾速度的單元。過(guò)濾速度控制單元將過(guò)濾速度限制于小于過(guò)濾器無(wú)壓迫的過(guò)濾速度。包含干細(xì)胞的樣品可以通過(guò)來(lái)源裝置如白細(xì)胞提取裝置或包含從例如白細(xì)胞提取裝置收集的樣品的容器等來(lái)提供。
切向流過(guò)濾裝置可以進(jìn)一步包括回收裝置。回收裝置包括可以以環(huán)形式與去除裝置的交叉流室相互連接的入口和出口。在該裝置的這個(gè)實(shí)施方案中，交叉流室入口與回收裝置出口處于液體互通，而交叉流室出口與回收裝置入口處于液體互通。回收裝置可以進(jìn)一步包括樣品入口和洗滌入口。在切向流過(guò)濾裝置的某些實(shí)施方案中，樣品入口和洗滌入口是單個(gè)共用入口。典型地，洗滌入口與替換物或洗液來(lái)源處于液體互通。替換物或洗液可以是例如等滲緩沖液或組織培養(yǎng)基。
回收裝置的樣品入口與樣品來(lái)源如包含干細(xì)胞的骨髓或血液成分處于液體互通。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，包含骨髓或血液成分的樣品來(lái)源是裝有針的注射器或特別設(shè)計(jì)用于從供體或患者取出骨髓的專門裝置。2002年6月19日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)編號(hào)60/390,730和WO 2004/000444中更詳細(xì)描述了TFF裝置和該裝置的操作，在此每篇申請(qǐng)文件全面引入作為參考。
本發(fā)明裝置的一個(gè)實(shí)施方案包括用于富集骨髓樣品中的干細(xì)胞的切向流過(guò)濾裝置。該裝置包括去除裝置，該去除裝置包括由過(guò)濾器隔開的交叉流室和濾液室，其中交叉流室具有入口和出口，出口安排在該室上部的中心，而其中入口安排在過(guò)濾器上方并將液體引入與過(guò)濾器基本上平行的交叉流室；用于提供樣品通過(guò)交叉流室入口的預(yù)定進(jìn)料速度的單元；和用于調(diào)節(jié)通過(guò)過(guò)濾器的過(guò)濾速度的單元；其中過(guò)濾器具有約5微米的孔徑大小；和由此樣品中的干細(xì)胞被富集于交叉流室的滲余物中。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于富集血液成分樣品中的干細(xì)胞的切向流過(guò)濾裝置，其中該裝置包括去除裝置，其中去除裝置包括濾液室之下并由過(guò)濾器隔開的交叉流室，交叉流室具有入口和出口，出口安排在該室下部的中心，而其中入口安排在過(guò)濾器之下并將液體引入與過(guò)濾器基本上平行的交叉流室；用于提供樣品通過(guò)交叉流室入口的預(yù)定進(jìn)料速度的單元；和用于保持通過(guò)過(guò)濾器的過(guò)濾速度的單元；其中過(guò)濾器具有約5微米的孔徑大小；和由此樣品中的干細(xì)胞被富集于交叉流室的滲余物中。
本發(fā)明還提供了用于從包含干細(xì)胞的骨髓成分、血液成分、組織或組織或器官制備物的樣品分離干細(xì)胞的方法。該方法步驟包括(1)將樣品通過(guò)去除裝置中的入口引入去除裝置；(2)使樣品經(jīng)受與具有約1至約10微米孔徑大小的過(guò)濾器基本上平行的交叉流；(3)使液體通過(guò)過(guò)濾器經(jīng)受過(guò)濾；和(4)從樣品中選擇性除去非干細(xì)胞成分，形成富含干細(xì)胞的細(xì)胞群體。在引入去除裝置之前，樣品可以經(jīng)受通過(guò)白細(xì)胞提取法、密度離心、差異裂解法、過(guò)濾或暗黃覆蓋層的制備的部分純化或富集。在一個(gè)實(shí)施方案中，誘導(dǎo)樣品流經(jīng)交叉流室中具有渦流運(yùn)動(dòng)的過(guò)濾器表面。另外，可以用洗液洗滌富含干細(xì)胞的細(xì)胞群體。
在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，使細(xì)胞樣品，如包含干細(xì)胞的骨髓成分樣品接觸包含引起樣品中具有類似干細(xì)胞公稱尺寸的細(xì)胞皺縮的試劑的預(yù)處理溶液。皺縮的細(xì)胞易于通過(guò)濾過(guò)膜提供含更豐富干細(xì)胞的細(xì)胞群體。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，誘導(dǎo)經(jīng)歷皺縮的細(xì)胞是粒細(xì)胞，如中性白細(xì)胞等等。對(duì)這個(gè)實(shí)施方案有用的一種特定溶液包括例如含含有效量二甲基亞砜(DMSO)的生理學(xué)可接受溶液。生理學(xué)可接受溶液可以是例如低滲鹽溶液如稀釋的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)?？晒┻x擇地，預(yù)處理溶液可以包括含有例如糖如甘露醇或葡萄糖的高滲溶液，或可以是高滲鹽溶液。在又一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)用防止皺縮的細(xì)胞膨脹的試劑處理或預(yù)處理細(xì)胞樣品來(lái)防止被誘導(dǎo)皺縮的細(xì)胞再膨脹。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗膨脹試劑是防止酪氨酸磷酸化的試劑，例如染料木素等等。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，抗膨脹試劑抑制鈉-氫交換的作用。在又一個(gè)實(shí)施方案中，其中懸浮有例如包含骨髓成分的細(xì)胞樣品的溶液不含阻斷通過(guò)防止誘導(dǎo)細(xì)胞再膨脹的鈉-氫交換劑進(jìn)行氫和鈉交換的鈉鹽。
在本發(fā)明的方法中，從細(xì)胞樣品中除去的非干細(xì)胞成分包括例如基質(zhì)、血漿、血小板、紅細(xì)胞等等。富集的細(xì)胞群體可以包含至少約10％干細(xì)胞，但是典型地包含至少約20％或更多干細(xì)胞。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(1)、(2)和(3)重復(fù)至少兩次以形成富含干細(xì)胞的細(xì)胞群體。富含干細(xì)胞的細(xì)胞群體可以用于輸注給需要干細(xì)胞治療的患者。
在另外的實(shí)施方案中，富含干細(xì)胞的細(xì)胞群體可以被誘導(dǎo)形成對(duì)治療有用的其它細(xì)胞類型，包括例如內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)元、樹突細(xì)胞和其它細(xì)胞類型。各種干細(xì)胞誘導(dǎo)方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
用于本發(fā)明方法中的細(xì)胞樣品典型地是從個(gè)體供體收集的。供體可以是接受干細(xì)胞治療的患者或另一個(gè)個(gè)體。在從供體收集細(xì)胞樣品之前，供體可以經(jīng)歷用干細(xì)胞動(dòng)員劑，例如M-CSF、G-CSF、GM-CSF，或高或低劑量環(huán)磷酰胺等等治療，以產(chǎn)生富含造血干細(xì)胞的細(xì)胞群體。干細(xì)胞動(dòng)員劑誘導(dǎo)釋放入外周血流的CD34+干細(xì)胞增殖。然后將來(lái)自個(gè)體供體的骨髓、血液例如除去白細(xì)胞的樣品、組織或組織或器官制備物引入本發(fā)明的切向流過(guò)濾(TFF)裝置。TFF裝置包括交叉流室、濾液室和與交叉流室和濾液室處于液體互通的過(guò)濾器。典型地，TFF裝置中使用的過(guò)濾器具有約3至約5.5微米的孔徑大小。富含造血細(xì)胞的細(xì)胞樣品通過(guò)TFF裝置以預(yù)定進(jìn)料速度和預(yù)定過(guò)濾速度再循環(huán)，預(yù)定進(jìn)料速度典型地是預(yù)定過(guò)濾速度的至少五倍；而預(yù)定過(guò)濾速度小于過(guò)濾器無(wú)壓迫的過(guò)濾速度；提供富含CD34+白細(xì)胞的分離的細(xì)胞群體。該方法可以產(chǎn)生基本上無(wú)非白細(xì)胞血液成分的富集細(xì)胞群體，非白細(xì)胞血液成分包括血漿、血小板和紅細(xì)胞。用這種方法產(chǎn)生的富集細(xì)胞群體可增加CD34+細(xì)胞的百分比以構(gòu)成細(xì)胞群體的約2％至約10％、約5％至約40％或更多。
參考說(shuō)明書的剩余部分，對(duì)本發(fā)明的性質(zhì)和優(yōu)點(diǎn)的進(jìn)一步理解將變得明顯。


圖1A直至1C描繪了從血液制品樣品中分離白細(xì)胞以及單核細(xì)胞的切向流過(guò)濾裝置的實(shí)施方案。圖1A提供了用于富集白細(xì)胞的裝置的實(shí)施方案，其中交叉流室在過(guò)濾室上方。圖1B描繪了該裝置的正面圖，其中樣品進(jìn)料在過(guò)濾器下面而濾液向上通過(guò)過(guò)濾器進(jìn)行單核細(xì)胞的富集。圖1C是圖1B中描繪的裝置的俯視圖。
具體實(shí)施方案的描述本發(fā)明提供了處理骨髓成分、血液成分、組織或組織或器官懸液的非均相混合物的細(xì)胞樣品以提供干細(xì)胞富集群體的方法。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了通過(guò)選擇性除去非干細(xì)胞成分例如基質(zhì)、血漿、血小板和/或紅細(xì)胞等等而富集干細(xì)胞的方法。在另一個(gè)方面，提供了從混合物中選擇性除去其它大細(xì)胞類型，包括多形核細(xì)胞例如粒細(xì)胞而富集干細(xì)胞的方法。在一個(gè)特定方法中，可以用皺縮近乎相同大小的非干細(xì)胞的試劑處理骨髓樣品使得皺縮的非干細(xì)胞通過(guò)TFF裝置的過(guò)濾器并與干細(xì)胞分離開來(lái)。
干細(xì)胞富集群體典型地是從包含骨髓成分的樣品或液體混合物制備的。在此使用的術(shù)語(yǔ)“骨髓成分”是指典型存在于骨髓中的任何物質(zhì)，包括典型地以患病以及非患病狀態(tài)存在的物質(zhì)。骨髓成分包括干細(xì)胞并可以包括例如淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、紅細(xì)胞、中性白細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞和/或血小板、可溶或不溶蛋白或蛋白復(fù)合物(例如酶、免疫球蛋白或免疫球蛋白-抗原復(fù)合物)，或其它大分子成分，例如脂質(zhì)或可以物理分離的全血的任何其它部分，不論它的精確分子或細(xì)胞組成，包括例如基質(zhì)、血漿或血清如何。
在進(jìn)行本發(fā)明的方法之前，可以部分富集樣品或液體混合物中的干細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“干細(xì)胞”與術(shù)語(yǔ)“前體細(xì)胞”“祖細(xì)胞”或“CD34+細(xì)胞”可互換使用。這些術(shù)語(yǔ)包括造血干細(xì)胞，造血干細(xì)胞包括例如淋巴樣、髓樣和類紅祖細(xì)胞，以及可以產(chǎn)生下列細(xì)胞的祖細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞；肌細(xì)胞，包括平滑肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞；神經(jīng)細(xì)胞和骨骼細(xì)胞，包括形成骨和軟骨的細(xì)胞。
在本發(fā)明的某些方面，使含有多形核細(xì)胞(PMNs)或粒細(xì)胞的細(xì)胞群體與干細(xì)胞分離開來(lái)。這個(gè)群體典型地含有中性白細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞和它們的前體，且在本申請(qǐng)中被稱為PMNs。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“干細(xì)胞群體”是指包括干細(xì)胞的任何細(xì)胞類群。干細(xì)胞群體可以包括如上那些，大量干細(xì)胞亞型或特定亞型，例如內(nèi)皮細(xì)胞或肌細(xì)胞前體或祖細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“富集”和“富含”意思是使用在此簡(jiǎn)單描述的和在2002年6月19日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)編號(hào)60/390,730和WO 2004/000444(每篇在此全面并入作為參考)中更充分描述的裝置處理骨髓成分的混合物，和遵循本發(fā)明方法產(chǎn)生相對(duì)于其它成分，有活力干細(xì)胞的百分比高于原始細(xì)胞樣品(即富集前)的細(xì)胞群體。在此使用的術(shù)語(yǔ)“有活力的”是指在合適的培養(yǎng)條件下或再輸注給患者或合適的動(dòng)物模型時(shí)能夠分化的干細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的裝置利用切向流過(guò)濾富集干細(xì)胞群體。術(shù)語(yǔ)“切向流過(guò)濾”和“交叉流過(guò)濾”可互換使用并且是指從液體混合物分離懸浮顆粒(例如細(xì)胞)，包括從液體混合物中顆粒的非均相混合物分離限定特征(例如期望的粒度范圍)的顆粒。使液體混合物(例如樣品液體)在與過(guò)濾器基本上平行或相切(例如過(guò)濾器表面面對(duì)樣品液體)的樣品室中通過(guò)或循環(huán)而分離顆粒，典型地在少許正壓下，包含濃縮顆粒或干細(xì)胞的液體混合物與膜表面相切持續(xù)流動(dòng)。
通常，對(duì)移入“濾液”中的顆粒，即，通過(guò)過(guò)濾器的那部分液體，和保留在“滲余物”中的顆粒的確定取決于各種因素。這類因素包括例如過(guò)濾器孔徑、進(jìn)料速度、過(guò)濾速度、液體混合物中顆粒的濃度、溫度和液體混合物的粘度。在此使用的“孔徑大小”是指過(guò)濾器中小孔的平均尺寸?！斑M(jìn)料速度”是指樣品(例如液體混合物)引入放置過(guò)濾器的室中的速度。在樣品通過(guò)過(guò)濾器再循環(huán)多次時(shí)(例如在根據(jù)本發(fā)明的裝置的一個(gè)特定實(shí)施方案中)，進(jìn)料速度也被稱為“再循環(huán)速度”?！敖徊媪鳌笔侵敢后w混合物基本上平行(即，在任何方向上都與過(guò)濾器表面平行)流過(guò)過(guò)濾器?！敖徊媪鲃?dòng)速度”是指樣品或液體混合物在過(guò)濾器上方或基本上平行于過(guò)濾器流動(dòng)的速度。液體混合物的交叉流動(dòng)速度通常取決于各種參數(shù)，包括例如進(jìn)料速度和放置過(guò)濾器的室的大小和形狀?！斑^(guò)濾速度”是指液體混合物通過(guò)過(guò)濾器的流動(dòng)速度。根據(jù)本發(fā)明的裝置和方法的過(guò)濾速度典型地是小于無(wú)壓迫(即空心管)的過(guò)濾速度?！芭懦鏊俣取笔侵敢后w混合物從交叉流室除去的速度，不同于通過(guò)過(guò)濾器的液體混合物(即濾液)。排出速度通常等于進(jìn)料速度減去過(guò)濾速度。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“過(guò)濾器”是指由任何材料或組合材料制成且具有很多小孔的任何物品，小孔允許樣品或液體混合物的一種或多種成分(例如血液和/或骨髓成分)經(jīng)受穿過(guò)該物品的交叉流而使它通過(guò)，由此將那些成分(例如非干細(xì)胞、蛋白質(zhì)、血漿、血清、血小板等等)與其它成分(例如干細(xì)胞)分開。過(guò)濾器表面可以具有任何合適的面積，例如直徑約42至約145mm，盡管可以使用更大或更小面積的過(guò)濾器。在某些實(shí)施方案中，TFF裝置中僅僅使用一個(gè)過(guò)濾器。在其它實(shí)施方案中，TFF裝置中可以使用另外的過(guò)濾器。
典型地在本發(fā)明TFF裝置中使用的過(guò)濾器可以選自各種有機(jī)聚合物過(guò)濾器。這種過(guò)濾器包括但不限于尼龍、聚偏1，1-二氟乙烯(PVDF)、醋酸/硝酸纖維素、聚砜、聚碳酸酯、聚乙烯、聚酯、聚丙烯和聚酰胺的微孔膜。還可以使用其它過(guò)濾器，如陶瓷過(guò)濾器和金屬過(guò)濾器。可以使用親水性和疏水性、帶電荷和不帶電荷的過(guò)濾器。在某些應(yīng)用中，可以優(yōu)選親水性過(guò)濾器。
本發(fā)明的過(guò)濾器典型地包括穿越過(guò)濾器區(qū)域分布的很多小孔。在某些實(shí)施方案中，過(guò)濾器具有孔徑大小細(xì)微變化的很多小孔。例如，孔徑大小的變化性可以是約±20％，或在約±0％至約±20％的范圍內(nèi)。在典型的實(shí)施方案中，使用“核微孔”或“徑跡蝕刻(track etched)”過(guò)濾器(例如，Poretics聚乙烯或聚碳酸酯徑跡蝕刻濾膜(Osmonics，Minnetonka，MN))。這些過(guò)濾器在材料中典型地具有嚴(yán)格控制的孔徑大小的光滑表面。這種過(guò)濾器典型地通過(guò)無(wú)孔塑料平片暴露于足夠有力穿透塑料薄片的放射性微粒源來(lái)制備。然后通過(guò)暴露于化學(xué)溶劑或蝕刻劑擴(kuò)大“徑跡”直徑。徑跡蝕刻條件可以控制孔徑大小。
本發(fā)明利用骨髓、血液、組織或組織或器官懸液中各種細(xì)胞類型之間的差異來(lái)富集干細(xì)胞。這樣的差異可以包括例如大小、形狀和/或可變形性的差異。人骨髓、血液、組織或組織或器官懸液中細(xì)胞的大小和可變形性典型地依據(jù)細(xì)胞類型而變化。紅細(xì)胞(紅血細(xì)胞)典型地是雙凹盤形、無(wú)核、大直徑約7微米尺寸和相對(duì)可變形的。多形核白細(xì)胞典型地是球狀的，同樣約7微米，但是比紅細(xì)胞可變形性小。單核的細(xì)胞中，淋巴細(xì)胞典型地是7至10微米，而單核細(xì)胞通常在10至15微米范圍之內(nèi)。干細(xì)胞通常與單核細(xì)胞尺寸范圍相同。
在各個(gè)實(shí)施方案中，選擇過(guò)濾器孔徑大小以富集干細(xì)胞，和/或分級(jí)分離骨髓、血液成分、組織或組織或器官懸液，從而富集收集的干細(xì)胞細(xì)胞群體。例如，在某些實(shí)施方案中，使用具有約5微米孔徑大小的過(guò)濾器通過(guò)TFF可以分離具有10至15微米公稱直徑的干細(xì)胞，和具有7微米公稱直徑的紅細(xì)胞。
在其它實(shí)施方案中，過(guò)濾器孔徑大小可以在約1至約10微米，約3至約8微米，或約3至約5.5微米的范圍內(nèi)?？讖酱笮≡诩s3微米范圍內(nèi)的過(guò)濾器可以保留大多數(shù)干細(xì)胞和白細(xì)胞，并致使從干細(xì)胞除去紅細(xì)胞的效率較低。相比之下，孔徑大小在約8微米范圍內(nèi)的過(guò)濾器可以實(shí)現(xiàn)紅細(xì)胞的更有效除去，但是增加濾液中干細(xì)胞和白細(xì)胞的損失。典型地使用約3至約5.5微米孔徑大小的過(guò)濾器富集干細(xì)胞。
從其它骨髓、血液、組織或組織或器官懸液成分富集干細(xì)胞還可能受進(jìn)料速度、過(guò)濾速度和/或樣品或液體混合物中細(xì)胞濃度的影響。例如，紅細(xì)胞比其它細(xì)胞類型更易變形，因此更容易通過(guò)孔徑大小小于紅細(xì)胞大直徑(例如小于約7微米)的過(guò)濾器。在具體實(shí)例中，使用孔徑大小約5.5微米的過(guò)濾器可以將紅細(xì)胞與白細(xì)胞分離。
從其它細(xì)胞骨髓成分或組織或器官懸液成分富集干細(xì)胞還可能受到在相同進(jìn)料或再循環(huán)速度下，保持小于無(wú)壓迫(即空心管)過(guò)濾速度的過(guò)濾速度的影響。在其它實(shí)施方案中，通過(guò)保持大于過(guò)濾速度的進(jìn)料或再循環(huán)速度可以減少白細(xì)胞至濾液的損失。在示例性實(shí)施方案中，進(jìn)料或再循環(huán)速度可以是過(guò)濾速度的至少約五倍，至少約10倍，至少約20倍，至少約50倍，或至少約100倍。
用于通過(guò)TFF進(jìn)行干細(xì)胞分級(jí)分離的包含各種骨髓成分、血液成分、組織或組織或器官懸液的樣品或液體混合物可以從各種來(lái)源獲得，并可以包括任何不同處理階段的血液制品的液體混合物。例如，骨髓和血液來(lái)源可以是人或非人。此外，液體混合物可以是例如骨髓、全血、全血的各種稀釋物、或已經(jīng)受例如除去血漿或其它血液成分的處理的全血或血液稀釋物、或組織或器官懸液。因此，液體混合物可以包括例如已至少部分富集干細(xì)胞的血細(xì)胞群體。
骨髓或血液成分、骨髓或血細(xì)胞的群體、或組織或器官懸液可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來(lái)制備。這類方法典型地包括收集肝素化骨髓或血液、單采血液成分術(shù)或白細(xì)胞提取法、暗黃覆蓋層的制備、玫瑰花結(jié)、離心、密度梯度離心(例如密度梯度材料包括FICOLL-HYPAQUE、PERCOLL、蔗糖等等)、非白細(xì)胞的差異裂解法、過(guò)濾等等。
包含骨髓或血液成分的液體混合物可以隨意任選被稀釋或濃縮。例如，在某些實(shí)施方案中，骨髓或血液成分以1∶2、1∶5、1∶10或任何其它合適的稀釋度稀釋。骨髓或血液成分可以稀釋于例如等滲緩沖液(例如PBS或HEPES緩沖鹽水)、組織培養(yǎng)基等等中。典型地，經(jīng)受TFF的骨髓或血液成分的樣品具有每毫升約106至約108個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞濃度，其中至少10至20％是干細(xì)胞。此外，PMNs數(shù)量從細(xì)胞數(shù)量的約60至約75％減少至約50％或更少。
骨髓或血細(xì)胞群體，或組織或器官懸液可以根據(jù)干細(xì)胞富集群體的期望用途，從各種類型的受試者獲得。例如受試者可以是健康受試者?？晒┻x擇地，細(xì)胞可以從需要骨髓重構(gòu)的受試者獲得，例如由于化療治療，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有受損骨髓的癌癥患者。骨髓或血細(xì)胞群體還可以從已經(jīng)給予干細(xì)胞動(dòng)員劑例如M-CSF、GM-CSF、G-CSF、或低或高劑量環(huán)磷酰胺的個(gè)體收集(Deliliers等，Leuk.Lymphoma 431957，2002)等等。該個(gè)體可以是將接受富集細(xì)胞群體的患者，親戚或HLA匹配個(gè)體。
如圖1A直至1C描繪的根據(jù)本發(fā)明的裝置典型地包括交叉流室(3)和濾液室(4)。過(guò)濾器(5)位于兩者之間并且一個(gè)表面與交叉流室(滲余物表面)進(jìn)行液體流通而另一個(gè)表面與濾液室(濾液表面)進(jìn)行液體流通。交叉流室、濾液室和過(guò)濾器包括去除裝置(1)。去除裝置可以以一次性使用可任意處理的部件提供、滅菌并為用于本發(fā)明的分離方法作準(zhǔn)備。去除裝置部件可以用于待富集干細(xì)胞的每個(gè)樣品。在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，交叉流室典型地具有約55ml的容積，而濾液室具有約25ml的容積。過(guò)濾器直徑典型地基本上與交叉流室的直徑相同。在用于證明本發(fā)明實(shí)用性的某些實(shí)施方案中，過(guò)濾器直徑為約140mm至約143mm。
在本發(fā)明的方法中，液體混合物通過(guò)典型地鄰近過(guò)濾器的滲余物表面的液體入口(6)進(jìn)入交叉流室(3)，使得液體混合物(例如樣品)進(jìn)入與過(guò)濾器的滲余物表面基本上平行的該室。典型地，液體通過(guò)液體出口(7)從交叉流室(3)除去，液體出口(7)通常位于垂直于過(guò)濾器的滲余物表面的一部分交叉流室。在某些示范性實(shí)施方案中，交叉流室入口(6)直徑約7mm至約8mm，而交叉流室出口(7)直徑約8mm至約10mm。濾液通過(guò)濾液室(4)中的出口(8)除去。
典型地，液體混合物以足夠的進(jìn)料速度引入交叉流室，該進(jìn)料速度足以使穿過(guò)過(guò)濾器表面(滲余物表面)的液體混合物交叉流處于足夠高的速度，以致在過(guò)濾器的接觸表面，即分界層，溫和地破裂和逆向混合液體和細(xì)胞。在此使用的“分界層”是指鄰近于和在過(guò)濾器的滲余物側(cè)的那個(gè)液體層，典型地由液體通過(guò)過(guò)濾器留下的那層。分界層的這種破裂通過(guò)防止過(guò)濾器接觸表面的物質(zhì)與過(guò)濾器粘結(jié)或變得停滯而促進(jìn)有效過(guò)濾，與過(guò)濾器粘結(jié)或變得停滯會(huì)阻礙有效過(guò)濾。然而，液體混合物的進(jìn)料速度通常不足以引起大量白細(xì)胞裂解。
在某些實(shí)施方案中，骨髓或血液成分通過(guò)將液體混合物泵入交叉流室(3)而通過(guò)過(guò)濾器的滲余物表面。用于驅(qū)動(dòng)液體交叉流穿過(guò)過(guò)濾器的泵稱為“交叉流泵”或“再循環(huán)泵”(14)。交叉流泵可以包括與交叉流室(3)進(jìn)行液體流通足以將液體混合物引入該室并以特定進(jìn)料速度穿過(guò)過(guò)濾器，不引起細(xì)胞實(shí)質(zhì)性破壞(例如細(xì)胞裂解)的任何泵送裝置。適合用于本發(fā)明的交叉流泵可以包括例如蠕動(dòng)泵、活塞泵、隔膜泵或滾柱泵。例如，在期望維持TFF裝置為“封閉”系統(tǒng)的一部分的情況下，可以使用蠕動(dòng)泵。
液體混合物典型地以超過(guò)過(guò)濾速度的進(jìn)料速度泵入交叉流室(3)。在示范性實(shí)施方案中，進(jìn)料速度約1680ml/分鐘，而過(guò)濾速度約15ml/分鐘。在其它示范性實(shí)施方案中，進(jìn)料速度約1600至約1800ml/分鐘，而過(guò)濾速度約10至約20ml/分鐘。非干細(xì)胞物質(zhì)(例如，紅細(xì)胞、免疫復(fù)合物、蛋白質(zhì)、PMNs等等)通過(guò)過(guò)濾器(5)進(jìn)入濾液室(4)。
如上所討論，過(guò)濾速度典型地小于無(wú)壓迫的(即空心管)速度。過(guò)濾速度可以通過(guò)例如降低或限制濾液室出口的大小、使用第二個(gè)泵單元(例如“過(guò)濾泵”)限制流動(dòng)等等來(lái)控制。
在另一個(gè)示范性實(shí)施方案中，液體混合物引入裝置導(dǎo)致液體內(nèi)產(chǎn)生渦流運(yùn)動(dòng)。這可以如下進(jìn)行，例如通過(guò)引入液體混合物，基本上平行于圓柱形交叉流室中的環(huán)形過(guò)濾器，以例如過(guò)濾速度的約5或約10至約100倍的進(jìn)料速度。流通物通過(guò)位于垂直于過(guò)濾器且典型地與過(guò)濾器表面中心相鄰的圓柱形室中的出口(7)除去。這種布置引起液流朝向過(guò)濾器的中心向內(nèi)螺旋。該液流典型地不洶涌或不處于使得引起干細(xì)胞實(shí)質(zhì)性裂解的高速度。如上所討論，“交叉流”也可以“擦洗”過(guò)濾器表面以防止粘結(jié)或停滯在分界層。通過(guò)校準(zhǔn)進(jìn)料速度使得它相對(duì)于過(guò)濾速度大(例如至少約5倍)，所產(chǎn)生的干細(xì)胞富集群體當(dāng)與相對(duì)于樣品細(xì)胞群體中總細(xì)胞數(shù)量的干細(xì)胞百分比相比時(shí)，可以為至少約5％，或至少約20％，或至少約60％或更多干細(xì)胞。
在另一個(gè)示范性實(shí)施方案中，使?jié)B余物再循環(huán)以提高分離效率。例如，可以將包含骨髓或血液成分、或組織或器官制備物的液體混合物引入交叉流室，和在過(guò)濾期間，滲余物可以通過(guò)交叉流室中的液體出口(7)收回到另一個(gè)室，例如最初提供液體的室(“回收裝置”；(2))?；厥昭b置中的液體混合物接著可以再次引入交叉流裝置。通過(guò)以“環(huán)形式”連接回收裝置(2)和去除裝置(1)，可以完成液體混合物的連續(xù)再循環(huán)和過(guò)濾?？晒┻x擇地，滲余物可以通過(guò)交叉流室(3)的液體出口(7)收回并直接再次引入交叉流室入口(即，不通過(guò)回收裝置或另一個(gè)室)。液體混合物可以通過(guò)交叉流裝置任何合適的一段時(shí)間。在某些實(shí)施方案中，液體混合物可以再循環(huán)約5至約60分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間，以達(dá)到期望的干細(xì)胞純度或富集。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，液體混合物的體積可以通過(guò)添加緩沖液、洗液或其它溶液(統(tǒng)稱為“替換液”)來(lái)調(diào)節(jié)。洗液可以例如在回收裝置中(例如通過(guò)溶液入口；(13))、在去除裝置中、在泵(14)中、在伸向或來(lái)自去除裝置的管線中、或在任何其它方便的位置與液體混合物合并。滲余物中的細(xì)胞因此可以以相同操作被富集和洗滌。典型地，洗液與細(xì)胞等滲。合適的緩沖液和洗液可以包括各種緩沖液(例如，磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或HEPES緩沖鹽水))、組織培養(yǎng)基等等。
在某些實(shí)施方案中，在封閉的無(wú)菌系統(tǒng)中富集包含來(lái)自，例如，骨髓、血液、組織、或組織或器官制備物的細(xì)胞群體的細(xì)胞樣品中的干細(xì)胞群體。這里使用的術(shù)語(yǔ)“封閉的無(wú)菌系統(tǒng)”或“封閉系統(tǒng)”是指其中使對(duì)非無(wú)菌、周圍或循環(huán)空氣或其它非無(wú)菌條件的暴露減到最少或消除的系統(tǒng)。富集細(xì)胞群體的封閉系統(tǒng)通常排除在開口管中離心、露天轉(zhuǎn)移細(xì)胞、在組織培養(yǎng)平板或未密封瓶中培養(yǎng)細(xì)胞等等。整個(gè)過(guò)濾裝置，包括，例如，任何細(xì)胞容器、培養(yǎng)箱、組織培養(yǎng)容器或用于細(xì)胞處理的其它裝置(下文)可以維持為“封閉”系統(tǒng)。在典型的實(shí)施方案中，封閉系統(tǒng)允許干細(xì)胞的無(wú)菌富集，和任選地，從初始收集容器轉(zhuǎn)移至可密封的組織培養(yǎng)容器中，不暴露于非無(wú)菌空氣。典型地，蠕動(dòng)泵(圖1A和1C；(15))單元用于封閉系統(tǒng)。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，通過(guò)從混合物選擇性除去非干細(xì)胞骨髓或血液成分，包括，例如，基質(zhì)、血漿、血小板、紅細(xì)胞等等，基本上富集骨髓或血液成分、或組織或器官懸液的非均相混合物中的干細(xì)胞。在此使用的術(shù)語(yǔ)“基本上富集”是指滲余物中回收的細(xì)胞群體，在如期望多的再循環(huán)周期后，包含典型地至少約5％，更典型地至少約20％，或至少約60％的期望細(xì)胞類型(例如干細(xì)胞)。在其它實(shí)施方案中，富集骨髓或血液成分等等的非均相混合物中的干細(xì)胞而形成基本上無(wú)非干細(xì)胞成分的干細(xì)胞群體。在此使用的術(shù)語(yǔ)“基本上無(wú)”是指干細(xì)胞富集群體包含至少約10％至約50％干細(xì)胞。
已經(jīng)確定了某些變量影響本裝置的性能。例如，過(guò)濾器的孔徑大小、液體的總體積、再循環(huán)和過(guò)濾速度，以及這兩個(gè)速度之間的比率和運(yùn)行時(shí)間可以影響干細(xì)胞的產(chǎn)量。為確定任選的干細(xì)胞分離條件，利用參數(shù)的變化進(jìn)行分離運(yùn)行，其中以定時(shí)的間隔對(duì)細(xì)胞濃縮物(滲余物)和濾液采樣以監(jiān)測(cè)隨時(shí)間推移的性能。由這些結(jié)果，可以確定任選的過(guò)濾器孔徑、總的系統(tǒng)容積、再循環(huán)和過(guò)濾速度。
在本發(fā)明這個(gè)方面的示范性實(shí)施方案中，TFF裝置包括約55ml容積的交叉流室(3)和約25ml容積的濾液室(4)。此外，該裝置包括下列具有約1至約10微米、更典型地約2至約8微米、或甚至更典型地約3至約5微米的孔徑大小的許多小孔的過(guò)濾器；過(guò)濾器直徑約142mm。在這個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)料速度設(shè)置為約1600至約1800ml/分鐘；和過(guò)濾速度約12至約17ml/分鐘。初始液體混合物典型地具有每毫升至少約107個(gè)細(xì)胞(例如白細(xì)胞和其它細(xì)胞)的細(xì)胞濃度。用本發(fā)明實(shí)施方案獲得的富集干細(xì)胞群體包含約1.1至約2千萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，干細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)量的約10％至約20％。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，通過(guò)從混合物選擇性除去非干細(xì)胞成分，包括例如從混合物除去基質(zhì)和淋巴細(xì)胞，基本上富集骨髓或血液成分的非均相混合物中的干細(xì)胞。在此使用的術(shù)語(yǔ)“選擇性除去”是指優(yōu)先除去一種細(xì)胞類型并富集另一種細(xì)胞類型。在這個(gè)方面的示范性實(shí)施方案中，TFF裝置包括約55ml容積的交叉流室(3)和約25ml容積的濾液室(4)。此外，該裝置包括下列具有約1至約10微米、或約2至約8微米、或約3至約5微米的孔徑大小的過(guò)濾器；約1600至約1800ml/分鐘的進(jìn)料速度；約12至約17ml/分鐘的過(guò)濾速度；過(guò)濾器直徑約142mm。初始液體混合物典型地具有每毫升至少約107個(gè)細(xì)胞(例如干細(xì)胞和其它細(xì)胞)的細(xì)胞濃度。在這個(gè)實(shí)施方案中，該裝置以逆向方式運(yùn)行。
在本發(fā)明又一個(gè)實(shí)施方案中，來(lái)自骨髓、血液、組織或來(lái)自組織或器官制備物的血液成分的非均相混合物被預(yù)處理以促進(jìn)與干細(xì)胞具有類似大小和可變形性的某些細(xì)胞類型的除去。這類細(xì)胞可以包括多形核粒細(xì)胞，包括中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞等等。在一個(gè)實(shí)施方案中，這種預(yù)處理包括使骨髓或血液成分接觸可以實(shí)現(xiàn)滲透壓梯度穿過(guò)細(xì)胞膜的試劑，從而通過(guò)水流出而誘導(dǎo)細(xì)胞皺縮。這種試劑可以包括并不限于二甲基亞砜、甘油、氯化鈉等等。當(dāng)使用DMSO時(shí)，DMSO的有效終濃度可以是約5％至約20％，或約10％至約15％。在特定實(shí)施方案中，有效DMSO濃度是約12.5％或約15％。DMSO可以溶于具有低離子強(qiáng)度的緩沖液或生理學(xué)可接受溶液?？梢允褂玫牧硪粋€(gè)試劑是甘油。甘油的有效量是0.5mol/L至約2.5mol/L。在具體實(shí)施方案中，甘油終濃度是約1mol/L。細(xì)胞與這些試劑的接觸可以導(dǎo)致不需要的粒細(xì)胞裂解。通過(guò)順序暴露于DMSO和甘油可以進(jìn)行裂解。使用的溶液可以包括具有低滲透強(qiáng)度的溶液介質(zhì)。誘導(dǎo)的非期望細(xì)胞皺縮使得這些細(xì)胞更易受通過(guò)過(guò)濾而除去的作用并允許通過(guò)切向流過(guò)濾選擇性除去這些細(xì)胞群體。還可以包括有效量的防止分離過(guò)程中細(xì)胞再膨脹的試劑。這種試劑可以包括但不限于防止酪氨酸磷酸化的試劑如染料木素，或抑制鈉-氫交換劑作用的試劑。
富集細(xì)胞群體的培養(yǎng)、擴(kuò)充和分化在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用于獲得可用于產(chǎn)生對(duì)例如同種異體或自體移植有用的組合物的干細(xì)胞富集群體。在特定實(shí)施方案中，遵循切向流分離操作，進(jìn)一步富集干細(xì)胞富集群體中的造血干細(xì)胞。從外周血白細(xì)胞來(lái)源富集造血干細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域已知的并可以被改動(dòng)而用于如在此所述分離的干細(xì)胞富集群體。例如，使用例如免疫磁性分離技術(shù)富集可以進(jìn)一步干細(xì)胞富集群體中的CD34+(參見(jiàn)例如Rowley等，Bone Marrow Transplant.211253，1998；Denning-Kendall et al.，Br.J.Haematol.105780，1999)。骨髓或血液供體可以從接受移植的患者、近親、HLA匹配個(gè)體等等分離。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法也用于獲得非干細(xì)胞亞型，例如富含祖細(xì)胞(例如造血或內(nèi)皮祖細(xì)胞)或分泌感興趣因子(例如造血或血管生成生長(zhǎng)因子)的細(xì)胞的細(xì)胞群體。例如，通過(guò)例如VEGFR-2和AC133(以及例如VE-鈣黏著蛋白和E-選擇蛋白)的共表達(dá)，循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞(CEPs)可以被鑒定為循環(huán)CD34+細(xì)胞亞型。(參見(jiàn)例如Peichev等，Blood 95952，2000.)?？梢允褂?，例如使用針對(duì)VEGFR-2和AC133的抗體的免疫磁性分離技術(shù)進(jìn)一步富集白細(xì)胞富集群體中的CEPs。同樣，在從供體分離細(xì)胞群體和使用TFF富集之前，可以動(dòng)員個(gè)體供體中的CEPs。在這個(gè)方法中，可以用細(xì)胞因子，例如VEGF治療供體。(參見(jiàn)例如，Gill等，Circ Res.，88167，2001)。此外，在其它實(shí)施方案中，通過(guò)白細(xì)胞富集群體與例如VEGF、bFGF、IGF-1、EGF和FBS一起在纖連蛋白覆蓋的表面上培養(yǎng)，然后棄去非粘附細(xì)胞而獲得內(nèi)皮樣循環(huán)血管發(fā)生細(xì)胞(CACs)(該細(xì)胞分泌例如VEGF、HGF、G-CSF和GM-CSF)(參見(jiàn)例如Rehman等，Circulation 1071164，2003)。
此外，可以培養(yǎng)干細(xì)胞富集群體以誘導(dǎo)多能祖細(xì)胞或干細(xì)胞的擴(kuò)充。例如，通過(guò)與造血生長(zhǎng)因子例如IL-1、IL-3、IL-6、干細(xì)胞因子(SCF)、粒細(xì)胞-單核細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和G-CSF(參見(jiàn)，例如Sun等，Haematologica 88561，2003)的組合一起培養(yǎng)，可以體外擴(kuò)充CD34+干細(xì)胞。隨后可以用任何各種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子處理祖細(xì)胞或干細(xì)胞以誘導(dǎo)分化為造血或非造血系的細(xì)胞。
在其它實(shí)施方案中，干細(xì)胞富集群體可以在適于誘導(dǎo)分化(例如祖細(xì)胞的分化或更分化細(xì)胞類型例如單核細(xì)胞或源自單核細(xì)胞的樹突細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化)的條件下培養(yǎng)。(這里使用的“轉(zhuǎn)分化”是指分化細(xì)胞的表型調(diào)節(jié)過(guò)程，通常無(wú)需任何細(xì)胞分裂，由此分化細(xì)胞分化為形態(tài)和/或功能上不同的細(xì)胞類型)。例如，除分化為樹突細(xì)胞之外，單核細(xì)胞可以被轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌煅蚍窃煅?xì)胞類型，包括例如巨噬細(xì)胞、破骨細(xì)胞和內(nèi)皮樣細(xì)胞，取決于培養(yǎng)條件(參見(jiàn)，例如Becker等，J.Immunol.1393703，1987；Nicholson等，Clin Sci.99133，2000；Havemann等，in Novel Angiogenic MechanismsRole of CirculatingProgenitor Endothelial Cells 47-57(Nicanor I.Moldovan編輯，2003))。而且，白細(xì)胞富集群體可以在使用任何各種細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)相對(duì)未分化細(xì)胞亞型(例如多能祖細(xì)胞和干細(xì)胞)分化為造血或非造血系的條件下培養(yǎng)。這種分化可以在用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法擴(kuò)充細(xì)胞之前或之后誘導(dǎo)。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，干細(xì)胞富集的細(xì)胞群體可以用于影響需要再生或種群恢復(fù)的人中細(xì)胞或組織的再生或種群恢復(fù)。這種人可以罹患給予干細(xì)胞將有益于患者的任何病情，包括帕金森氏病、糖尿病、慢性心臟病、腎病、肝衰竭、癌癥、脊髓損傷、多發(fā)性硬化、早老性癡呆，或可能需要基因治療以預(yù)防遺傳或外遺傳缺陷的患者的任何病情。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，干細(xì)胞的受體是自體的或可以是對(duì)供體同種異體的。受體可能需要骨髓再生，因?yàn)樵搨€(gè)體已經(jīng)歷重度骨髓抑制治療。在另一個(gè)實(shí)例中，該受體可能需要心臟組織修復(fù)，因?yàn)樵搨€(gè)體已經(jīng)歷心肌梗塞或正罹患充血性心力衰竭或心功能不全。在任何一種情況下，都可以將用本發(fā)明方法分離的富集干細(xì)胞群體輸入循環(huán)中。在已經(jīng)歷心肌梗塞或正罹患心功能不全或心力衰竭的受體中，可以將干細(xì)胞富集群體直接輸入冠狀動(dòng)脈或直接應(yīng)用于受損的心臟組織。給予干細(xì)胞和干細(xì)胞富集群體的方法和組合物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且認(rèn)為不是本發(fā)明的新穎性的一部分。
具體實(shí)施例方式
提供下列實(shí)施例僅僅作為本發(fā)明各個(gè)方面的例證且不應(yīng)被看作是以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1這個(gè)實(shí)施例簡(jiǎn)短描述了從自正常供體收集的骨髓樣品富集干細(xì)胞群體。在通過(guò)切向流過(guò)濾富集之前，用皺縮誘導(dǎo)劑處理骨髓樣品。簡(jiǎn)言之，從正常志愿者髖骨抽取50ml骨髓，添加15ml補(bǔ)充有組胺的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)防止凝固。貯存過(guò)夜后，這種制備物的三分之一(約33ml)與33ml 30％二甲基亞砜(DMSO)混合于水中。在室溫下孵育10分鐘后，添加3ml 25％人血清白蛋白(HSA)溶液并將混合物裝填到上面簡(jiǎn)單描述的，而在2002年6月19日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)編號(hào)60/390,730和WO 2004/000444(每篇在此引入作為參考)中充分描述的切向流過(guò)濾裝置的再循環(huán)室中。兩次容積調(diào)整后，混合物中的細(xì)胞受到切向流過(guò)濾，連續(xù)添加含0.625％HSA的PBS。在運(yùn)行結(jié)束時(shí)，收集細(xì)胞并分析。發(fā)現(xiàn)該制備物基本上清除了紅細(xì)胞和血小板。CD34+細(xì)胞百分比從總細(xì)胞數(shù)量的4.78％增加至18.2％，而熒光流分析測(cè)定的中性白細(xì)胞閘門中的細(xì)胞百分比從53.9％減少至51.7％。中性白細(xì)胞閘門中細(xì)胞的平均前向散射從大約400減少至大約250，表明細(xì)胞損害。迄今為止最佳的方法由用DMSO和PBS的混合物處理骨髓吸出物10-20分鐘，隨后在TFF裝置上過(guò)濾60分鐘組成。DMSO休克導(dǎo)致PMN′s皺縮，對(duì)存在的其它細(xì)胞群體無(wú)附帶損害。結(jié)果是CD34+/CD45+和CD133+細(xì)胞群體的濃縮，同時(shí)提供數(shù)量減少的PMN細(xì)胞和淋巴細(xì)胞群體。在一個(gè)方案中，用含DMSO的稀釋PBS處理骨髓吸出物20分鐘，隨后添加人血清白蛋白(為了細(xì)胞的穩(wěn)定)和隨后加載到TFF裝置上。結(jié)果可以變化，取決于進(jìn)料的具體細(xì)胞濃度。表I闡明了兩個(gè)運(yùn)行實(shí)例。
表I.來(lái)源于兩名志愿者骨髓吸出物的細(xì)胞制備物在TFF系統(tǒng)上進(jìn)行干細(xì)胞濃縮后的表征

表I顯示了由于細(xì)胞大小的減小和通過(guò)TFF系統(tǒng)的除去造成PMN′s的部分減少?gòu)淖畛醺哌_(dá)74％至53％。CD34+/45+細(xì)胞群體的富集是運(yùn)行1中從5％至18％，和運(yùn)行2中從4.2％至13％。此外，淋巴細(xì)胞群體有減少，運(yùn)行1中從16％至7％，和運(yùn)行2中從18％至10％?；厥盏淖婕?xì)胞數(shù)量是運(yùn)行1中1.1千萬(wàn)和運(yùn)行2中1.6千萬(wàn)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)這里參照的臨床試驗(yàn)中回收的數(shù)量。這些源自骨髓的干細(xì)胞能夠起正常干細(xì)胞作用，因?yàn)橐呀?jīng)進(jìn)行了集落形成試驗(yàn)，短時(shí)期內(nèi)顫動(dòng)集落形成。應(yīng)當(dāng)注意的是如運(yùn)行2中所示，CD133+細(xì)胞也存在于分離和濃縮的干細(xì)胞群體中，起始物質(zhì)中存在0.1％而最終制備物中存在1.3％。
實(shí)施例2這個(gè)實(shí)施例描述了如上所述的富含干細(xì)胞的細(xì)胞群體將如何用于治療已經(jīng)患有急性心肌梗塞的患者。簡(jiǎn)言之，在植入支架后，將TFF從骨髓純化的干細(xì)胞進(jìn)料已經(jīng)歷急性心肌梗塞患者的冠狀動(dòng)脈。隨后心肌重塑導(dǎo)致左心室最終容積增加并使死于隨后心力衰竭的機(jī)會(huì)降低。
在此提供的實(shí)施例意欲闡明而不是限制要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的其它變形對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的并且被附加權(quán)利要求所包含。在此引用的所有出版物、專利、專利申請(qǐng)和其它參考文獻(xiàn)也在此引入作為參考。
權(quán)利要求
1.一種從來(lái)自受試者的樣品分離干細(xì)胞的方法，其中該樣品包含干細(xì)胞和非干細(xì)胞成分，該方法包括通過(guò)下列步驟在切向流過(guò)濾裝置上分離(i)將樣品通過(guò)去除裝置(1)中的入口(6)引入包括交叉流室(3)的去除裝置；(ii)使樣品經(jīng)受與具有約1至約10微米孔徑大小的過(guò)濾器(5)基本上平行的交叉流；(iii)液體通過(guò)過(guò)濾器經(jīng)受過(guò)濾；和(iv)從樣品中選擇性除去非干細(xì)胞成分，形成富含干細(xì)胞的細(xì)胞群體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括用白細(xì)胞提取法、密度離心、差異裂解法、過(guò)濾或暗黃覆蓋層的制備從受試者制備樣品，用于引入去除裝置。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中樣品是骨髓、組織懸液、器官懸液或血液成分。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中非干細(xì)胞成分是基質(zhì)、紅細(xì)胞、血漿和血小板。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括重復(fù)步驟(i)、(ii)和(iii)至少兩次以形成富含干細(xì)胞的細(xì)胞群體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中干細(xì)胞是造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或多能干細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中造血干細(xì)胞是CD34+細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中干細(xì)胞是造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或多能干細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中造血干細(xì)胞是CD34+細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過(guò)給予干細(xì)胞動(dòng)員劑，該受試者已經(jīng)歷干細(xì)胞動(dòng)員。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中干細(xì)胞動(dòng)員劑是M-CSF、G-CSF、GM-CSF或環(huán)磷酰胺。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中切向流過(guò)濾裝置具有提供樣品進(jìn)入交叉流室入口的預(yù)定進(jìn)料速度的單元；控制通過(guò)過(guò)濾器和進(jìn)入濾液室的過(guò)濾速度的單元；并且其中過(guò)濾速度控制單元將過(guò)濾速度限制于小于過(guò)濾器無(wú)壓迫的過(guò)濾速度。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中樣品被預(yù)處理以誘導(dǎo)與干細(xì)胞基本上相同大小的細(xì)胞群體的細(xì)胞皺縮。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中基本上相同大小的細(xì)胞群體是粒細(xì)胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中預(yù)處理包括使細(xì)胞接觸包含二甲基亞砜(DMSO)的生理學(xué)可接受溶液。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中DMSO終濃度在5％和20％之間。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中DMSO終濃度在10％和15％之間。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中DMSO終濃度是12.5％。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中DMSO終濃度是15％。
20.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中生理學(xué)可接受溶液是低離子強(qiáng)度的。
21.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中預(yù)處理包括使細(xì)胞接觸包含甘油的生理學(xué)可接受溶液。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中甘油終濃度在0.5mol/L和2.5mol/L之間。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中甘油終濃度是1mol/L。
24.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中通過(guò)裂解從細(xì)胞混合物中優(yōu)先除去粒細(xì)胞。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中裂解是通過(guò)使樣品順序接觸有效量的DMSO和甘油來(lái)進(jìn)行的。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中樣品接觸的是具有低滲透強(qiáng)度的溶液。
27.一種富集骨髓或血液成分樣品中的干細(xì)胞的方法，包括(i)將樣品引入切向流過(guò)濾(TFF)裝置，TFF裝置包括交叉流室、濾液室和與交叉流室和濾液室進(jìn)行液體流通的過(guò)濾器，過(guò)濾器具有約1至約10微米的孔徑大小；(ii)使樣品以預(yù)定進(jìn)料速度和預(yù)定過(guò)濾速度通過(guò)TFF裝置再循環(huán)，預(yù)定進(jìn)料速度是預(yù)定過(guò)濾速度的至少五倍；其中預(yù)定過(guò)濾速度小于過(guò)濾器無(wú)壓迫的過(guò)濾速度；和(iii)分離富含干細(xì)胞的細(xì)胞群體。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中富集細(xì)胞群體基本上無(wú)非白細(xì)胞血液成分。
29.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括將富含干細(xì)胞的細(xì)胞群體給予個(gè)體的步驟。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中樣品來(lái)自于已經(jīng)用至少一種干細(xì)胞動(dòng)員劑處理的受試者。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中干細(xì)胞動(dòng)員劑是M-CSF、G-CSF、GM-CSF或環(huán)磷酰胺。
32.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中將干細(xì)胞再輸入受體。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中受體是受試者自體的。
34.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中受體是受試者同種異體的。
35.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中受體需要骨髓再生。
36.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中受體已經(jīng)歷重度骨髓抑制治療。
37.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中受體需要心臟組織修復(fù)。
38.權(quán)利要求32的方法，其中受體已經(jīng)歷心肌梗塞。
39.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中受體罹患充血性心力衰竭。
40.權(quán)利要求32的方法，其中受體罹患心功能不全。
41.權(quán)利要求32的方法，其中將干細(xì)胞富集群體輸入循環(huán)中。
42.權(quán)利要求32的方法，其中將干細(xì)胞富集群體輸入冠狀動(dòng)脈中。
43.權(quán)利要求32的方法，其中將干細(xì)胞富集群體直接應(yīng)用于受損的心臟組織。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過(guò)除去非干細(xì)胞成分富集骨髓或血液成分的非均相混合物中的干細(xì)胞的方法，包括使用切向流過(guò)濾裝置分離非干細(xì)胞成分。
文檔編號(hào)B01D61/00GK1886498SQ200480034667
公開日2006年12月27日 申請(qǐng)日期2004年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月24日
發(fā)明者M·L·博什, P·A·洛德格, J·A·麥克阿徹恩, A·L·博因頓, P·G·胡根霍爾茨 申請(qǐng)人:西北生物治療藥物公司