專(zhuān)利名稱(chēng)：一種分子烙印填料的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于分子烙印固相萃取的填料，具體涉及一種新型的分子烙印固相萃取填料用的載體，以及用此載體制備的分子烙印聚合物填料。本發(fā)明還涉及上述填料的制備方法。
背景技術(shù)：
分子烙印技術(shù)是進(jìn)行物質(zhì)分離的一種較先進(jìn)的手段，常與固相萃取方法結(jié)合來(lái)分離用常規(guī)手段難以分離的物質(zhì)，如在成分復(fù)雜的植物粗提物中分離特定的有效成分。1972年，Wullf等最先將分子烙印技術(shù)用于葡萄糖類(lèi)衍生物的手性分離(G.Wulff，A.Sarhan，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.341，1972，11)。
采用分子烙印技術(shù)進(jìn)行固相萃取時(shí)最為關(guān)鍵的是制備出分子烙印聚合物。分子烙印聚合物的用途是根據(jù)待分離物質(zhì)的分子形狀、大小及官能團(tuán)進(jìn)行分子識(shí)別，類(lèi)似于生物體系中酶對(duì)底物、抗體對(duì)抗原或受體對(duì)抑制劑的作用，具有一定的選擇性。
分子烙印聚合物的制備過(guò)程一般為將待分離的分子作為模板分子，加入到致孔劑(也同時(shí)作為溶劑)中，模板分子與加入的功能單體(如含烯基的有機(jī)酸、堿、酰胺類(lèi)化合物)通過(guò)化學(xué)識(shí)別作用，以共價(jià)或非共價(jià)形式形成某種復(fù)合物，再加入交聯(lián)劑(通常為多烯基化合物)，使形成的復(fù)合物通過(guò)交聯(lián)聚合反應(yīng)固化。模板分子通過(guò)體積和形狀識(shí)別被封閉在聚合物中，最后利用致孔劑形成的孔道通過(guò)酸堿洗滌將模板分子除去。這樣，聚合物中就產(chǎn)生了若干大小、形狀及功能基排列與模板分子互補(bǔ)的孔穴。這些孔穴可被稱(chēng)之為原來(lái)加入的模板分子形成的烙印。
現(xiàn)有技術(shù)制備分子烙印聚合物最常用的方法是本體聚合法(Jianchun Xie，Lili Zhu，Hongpeng Luo，et al.，J.Chromatogr.A.934，2001，1-11)，即直接讓前述聚合反應(yīng)液聚合成為一大塊分子烙印聚合物，再通過(guò)研磨、過(guò)篩和沉降分選以得到適用的分子烙印聚合物顆粒作為填料使用。
使用本體聚合方法制備聚合物顆粒時(shí)，模板分子等原料用量很大，而由于擴(kuò)散速度的影響，在實(shí)際過(guò)程中僅有顆粒表面較薄的一層起作用，整體的利用率不高。另外，此方法得到的聚合物顆粒往往粒徑分布較寬，使用前還需要進(jìn)行粒徑分選，使產(chǎn)率更低；而且由于形狀不規(guī)則，造成使用過(guò)程中的柱壓很大，限制了流速(與生產(chǎn)效率直接相關(guān))的提高。因此本方法成本很高，效率低，不適合于較大規(guī)模的應(yīng)用。
為了減少模板分子的用量，有人采用載體來(lái)替換其內(nèi)核部分，即僅在載體表面有分子烙印聚合物，方法有以下幾種一種方法是以大孔硅膠為載體，經(jīng)過(guò)表面改性(引入乙烯基)后，加入稀的聚合反應(yīng)溶液中，使其在溶液中捕集沉降聚合物微粒(Sean D.Plunkett，F(xiàn)rances H.Arnold，J.Chromatogr.A.708，1995，19-29)，即將分子烙印聚合物微粒附著在硅膠表面上，但此附著是很不牢固的，使用中容易發(fā)生微粒脫落，堵塞分離柱，而無(wú)法進(jìn)行繼續(xù)分離。
另一種方法是多步聚合法(Cacho C，Turiel E，Martin-Esteban A，et al.J.Chromatogr.B 802，2004，347-353)，使用的載體就是功能單體和交聯(lián)劑自身的聚合物顆粒。即先在不加模板分子的條件下讓聚合液反復(fù)進(jìn)行沉降聚合和沉降分選以得到粒徑均一的顆粒，然后再加入模板分子進(jìn)行聚合。但此制備工藝過(guò)于復(fù)雜，也不適合于較大規(guī)模的應(yīng)用。
這兩種使用載體的方法還有一個(gè)共同的缺點(diǎn)即在裝入分離柱使用時(shí)，都依賴(lài)分子烙印材料本身來(lái)承受壓力。而分子烙印聚合物從表面到內(nèi)核都是多孔性結(jié)構(gòu)，本身能夠承受的壓力不太大，尤其是對(duì)顆粒之間接觸壓力(反應(yīng)為局部高壓)的耐受性不強(qiáng)，在使用中容易破碎，造成識(shí)別位點(diǎn)的流失和柱壓升高。
此外還有人在電極表面制備分子烙印薄膜(Shoji R，Takeuchi T，Kubo I，Anal.Chem75，2003，4882-4886)，但由于其表面積太小，僅能用于微量檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是找到一種制備分子烙印聚合物填料的載體，該載體應(yīng)溶脹性很小，耐壓性好，避免聚合層在擠壓中破碎，適用于制備大型固相萃取柱，使用不同溶劑時(shí)能夠保持柱體的完整和均一性；該載體還應(yīng)近球性好，使聚合物在載體表面分布均勻、致密而且完整，結(jié)合牢固，在使用過(guò)程中不易脫落。
本發(fā)明的目的之二是提供一種在載體表面形成分子烙印聚合物的新方法，及用該方法制備分子烙印聚合物填料，使用該填料進(jìn)行萃取應(yīng)擴(kuò)散速度快、萃取效率高，以實(shí)現(xiàn)快速分離；還應(yīng)簡(jiǎn)單易行，適合于大規(guī)模制備。
為實(shí)現(xiàn)上述第一發(fā)明目的，本發(fā)明選用經(jīng)表面改性的玻璃微珠作為分子烙印固相萃取填料的載體。
所述經(jīng)表面改性，指使用含有乙烯基的硅烷化試劑進(jìn)行表面改性，以增強(qiáng)玻璃微珠與分子烙印聚合物之間的結(jié)合能力。所有含有乙烯基的硅烷化試劑均可使用。
上述玻璃微珠可用實(shí)心或空心的，粒徑在100-2500目均可，但每批使用時(shí)應(yīng)粒徑大小均勻。因此可在使用前將玻璃微珠進(jìn)行分選，使粒徑分布范圍盡可能窄。分選方法可采用在水中反復(fù)沉降或其它常規(guī)方法。
使用玻璃微珠作為載體的優(yōu)點(diǎn)是1.結(jié)構(gòu)強(qiáng)度高、近球性好、基本沒(méi)有溶脹性，所以在使用不同溶劑時(shí)能夠保持柱體的完整和均一性。
2.耐壓性好，使用時(shí)柱壓小，因而可以使用更長(zhǎng)的柱芯，提高分離效率。
3.與本體聚合法相比，由于替換掉了填料中心那些利用率很低的部分，從而大大減少了分子烙印材料(尤其是模板分子)的用量；為實(shí)現(xiàn)上述第二發(fā)明目的，本發(fā)明使用基于表面張力的液膜法，所制備的填料是在載體表面具有分子烙印聚合物薄膜層的顆粒。
用以下操作方式效果較好1.先用填料的載體預(yù)裝柱，搭建出將來(lái)填料的主體構(gòu)架，以保證產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)壓力絕大部分由載體承受，防止聚合層在擠壓中破碎；2.將聚合反應(yīng)液注入上述預(yù)裝柱中。
用高壓氮?dú)鈱⒍嘤嗟木酆戏磻?yīng)液吹出。在表面張力的作用下，載體表面僅余很薄且均勻的一層聚合反應(yīng)液，以節(jié)約模板分子等原料，并同時(shí)達(dá)到除氧目的。
3.將處理好的柱子兩端封口后，置水浴中進(jìn)行聚合反應(yīng)。通常反應(yīng)約24小時(shí)，即可得到高效分子烙印固相萃取填料。
本方法所述載體可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)使用的各種載體材料，如硅膠(無(wú)孔)、玻璃微珠等。
使用本發(fā)明液膜法來(lái)制備分子烙印固相萃取填料的有益效果是1.能使聚合物在載體表面分布更加均勻、致密而且完整，結(jié)合得更為牢固，在使用過(guò)程中不易脫落；2.因表面張力作用，得到的聚合物具有更大的平均孔徑，從而增大擴(kuò)散速度、提高萃取效率，可實(shí)現(xiàn)快速分離的目的；3.本方法簡(jiǎn)單易行，適合于大規(guī)模制備。
若將本發(fā)明前述的玻璃微珠作為載體材料，并使用本發(fā)明液膜法來(lái)制備分子烙印固相萃取填料，則效果更好，相得益彰1.由于在柱中先裝填空心玻璃微珠后才加入聚合反應(yīng)液，因此整個(gè)填料本身的結(jié)構(gòu)壓力主要由玻璃微珠來(lái)承擔(dān)，而玻璃微珠本身可以承受1000個(gè)大氣壓，所以不管是與本體聚合法、多步聚合法相比還是與使用大孔硅膠為載體相比(它們都依賴(lài)分子烙印材料本身來(lái)承受壓力，而分子烙印聚合物為多孔性結(jié)構(gòu)，本身能夠承受的壓力不太大)，制備得到的固相萃取填料其耐壓性能都要高得多(尤其適用于制備大型固相萃取柱)。
2.玻璃微珠的高近球性與表面張力的結(jié)合，能使得制備得到的聚合物表面光滑均勻，擁有更好的色譜性能(首先就是它的柱壓小，因而可以使用更長(zhǎng)的柱芯和更大的流速)。


圖1是液膜聚合物吸附速度實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖2是本體聚合物吸附速度實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
上述圖中，橫坐標(biāo)表示時(shí)間，縱坐標(biāo)表示溶液吸光度。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例通過(guò)分別示出了制備的分子烙印萃取填料本體聚合物和以空心玻璃微珠為載體的液膜聚合物，以進(jìn)行比較。
本實(shí)施例中的分子模板以大黃素作為舉例，但本發(fā)明并不限于此。實(shí)際上，只要應(yīng)用本發(fā)明的材料和方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以制備出各種所需的分子烙印萃取填料。
實(shí)施例1.實(shí)驗(yàn)材料1.1來(lái)源大黃素購(gòu)自淮安市久泰生物化學(xué)有限公司，純度大于98％。
丙烯酰胺(AA)、三甲基丙烯酸三羥甲基丙烷酯(TRIM)、偶氮二異丁腈(AIBN)購(gòu)自百靈威化學(xué)試劑公司。TRIM在使用前用下面方法處理TRIM用10％氫氧化鈉水溶液洗后，用無(wú)水硫酸鎂干燥，然后再減壓重新蒸餾。AIBN使用前用甲醇重結(jié)晶。
四氫呋喃(THF)為色譜純，使用前經(jīng)過(guò)鈉干燥，重蒸餾處理。甲醇、乙腈為色譜純，醋酸為分析純。
500目空心玻璃微珠、三乙氧基乙烯基硅烷、三乙氧基氨乙基硅烷購(gòu)自青島海大化學(xué)試劑公司。
0.75mm內(nèi)徑PEEK管及各種PEEK接頭(凹、凸)購(gòu)自迪馬公司。
半徑1/16英寸，孔徑10μm不銹鋼篩網(wǎng)購(gòu)自美國(guó)Valco Instruments Co.Inc.。
500μL及2.5mL進(jìn)樣針購(gòu)自美國(guó)Hamilton Co.。
500目不銹鋼篩為定制。
4.6×50mm空不銹鋼色譜柱為北京北化儀器試劑公司加工。
6mL聚乙烯固相萃取管為J.T.Baker的6mL C18固相萃取管掏空其中的C18填料得到。
ASAP2010快速比表面積孔徑測(cè)定儀為北京大學(xué)化學(xué)學(xué)院中級(jí)儀器實(shí)驗(yàn)室儀器。
1.2空心玻璃微珠的預(yù)處理取200克500目空心玻璃微珠，用清水反復(fù)沉降以除去其中半徑較小的粒子和底部的黑色雜質(zhì)。將沉降后得到的粒徑較為均一的空心玻璃微珠置于500mL大燒杯，在其中加入2M HCl，在電磁攪拌下加熱(約65度)反應(yīng)4小時(shí)，以除去玻璃微珠表面的金屬離子，并活化玻珠表面的硅羥基?；罨髢A去上清，用蒸餾水反復(fù)漂洗至中性，瀝干后置于烘箱中于110℃干燥2小時(shí)。
稱(chēng)取活化后的空心玻璃微珠50克置于250mL圓底燒瓶中，加入經(jīng)無(wú)水處理的甲苯50mL、三乙氧基乙烯基硅烷5mL(增強(qiáng)玻璃微珠與分子烙印聚合物之間的結(jié)合能力)、三乙氧基氨乙基硅烷0.5mL(增強(qiáng)玻璃微珠與模版分子之間的結(jié)合能力)，裝上回流冷凝裝置，于電磁攪拌下回流反應(yīng)72小時(shí)。反應(yīng)后傾去上清，用丙酮反復(fù)漂洗以去掉未反應(yīng)的溶液，瀝干后置于真空干燥器中干燥。
2.實(shí)驗(yàn)步驟和實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1用本體聚合法制備大黃素的分子烙印聚合物將27mg大黃素溶于700μL四氫呋喃中，加入28.8mg丙烯酰胺、700μL TRIM、6.5mg AIBN，在1.5mL艾登道夫管中混合后通氮除氧，封管聚合(60℃水浴24h)。聚合產(chǎn)物經(jīng)研磨過(guò)篩后用丙酮反復(fù)沉降，得到顆粒較為均一的產(chǎn)品約350mg。
2.2用液膜法制備以空心玻璃微珠為載體的大黃素分子烙印聚合物將經(jīng)表面修飾過(guò)的空心玻璃微珠裝入4.6×50mm空不銹鋼色譜柱中(裝入約800mg)，從一端用500μL進(jìn)樣針注入200μL聚合反應(yīng)液(組成同本體聚合)后，通氮除氧并使玻璃微珠表面形成一層反應(yīng)聚合液膜。用堵頭封住色譜柱兩端，在60℃水浴中聚合24h。最終得到的產(chǎn)物約850mg。從制備工藝的角度來(lái)看，本發(fā)明所用的方法甚至比本體聚合法還要簡(jiǎn)單。
2.3大黃素濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定配制1.00μg/mL、4.00μg/mL、8.00μg/mL、10.0μg/mL、12.0μg/mL的大黃素甲醇溶液，以甲醇為參比，用722型分光光度計(jì)于435nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定它們的吸光度值(1cm吸光度池)。
表1不同濃度下大黃素甲醇溶液在435nm波長(zhǎng)時(shí)的吸光度值(1cm吸光度池)

做圖得A＝0.0365C(μg/mL)，或C(μg/mL)＝27.4A。
2.4過(guò)飽和固相萃取實(shí)驗(yàn)固相萃取柱的填裝本體聚合法大黃素分子烙印固相萃取柱為232.8mg經(jīng)沉降后的產(chǎn)品裝于6mL聚乙烯固相萃取管；液膜聚合法(以玻珠為載體)大黃素分子烙印固相萃取柱為4.6×50mm不銹鋼色譜柱(即原始的制備體系)。
模版分子的去除先用20mL甲醇洗上述四種大黃素分子烙印固相萃取柱，再用10mL乙腈平衡。
上樣1.00mL 100μg/mL大黃素乙腈溶液。
清洗＞6mL乙腈(洗至流出液基本無(wú)色)。
洗脫6mL甲醇(洗至流出液基本無(wú)色)。
測(cè)定以甲醇為參比，用722型分光光度計(jì)于435nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定甲醇洗脫液的吸光度值(1cm吸光度池)，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出洗脫液中大黃素濃度，再計(jì)算出上述兩種大黃素分子烙印固相萃取柱的萃取量。
表2兩種方法制備的大黃素分子烙印聚合物固相萃取性能比較

*括號(hào)內(nèi)的數(shù)字是按照實(shí)際可用的產(chǎn)品(350mg)來(lái)折算時(shí)的結(jié)果。
過(guò)飽和固相萃取實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明了固相萃取填料實(shí)際可用的最大柱容量。從表2中可以看出液膜聚合物擁有比本體聚合物大得多(8.8倍)的柱容，這就突破了多步聚合法和使用大孔硅膠為載體時(shí)僅減少原料用量，但是不提高柱容的限制。此外在原料用量上本方法比本體聚合法節(jié)約了約97％。
液膜聚合法(以玻珠為載體)大黃素分子烙印固相萃取柱固相萃取回收率測(cè)定測(cè)量時(shí)上樣量均為20μg，但使用的樣品濃度不同，條件如下高濃度上樣0.500mL 40.0μg/mL大黃素乙腈溶液。
中濃度上樣3.00mL 6.67μg/mL大黃素乙腈溶液。
低濃度上樣10.0mL 2.00μg/mL大黃素乙腈溶液。
其余固相萃取及檢測(cè)步驟同上。
表3三種上樣濃度下液膜法分子烙印聚合物固相萃取的回收率

從表3中可以看到，即使上樣濃度低至2μg/mL，在上樣量為20μg時(shí)，液膜法制備的填料仍然能夠達(dá)到86％的回收率。
2.5兩種方法制備的大黃素分子烙印聚合物的BET實(shí)驗(yàn)將本體聚合大黃素分子烙印聚合物和液膜法制備的大黃素分子烙印聚合物(均已洗去模版分子)各取一定量于120℃真空干燥脫氣。BET實(shí)驗(yàn)由北京大學(xué)化學(xué)學(xué)院中級(jí)儀器實(shí)驗(yàn)室代為測(cè)定。脫附和吸附等溫線記錄采用了55點(diǎn)壓力表，孔徑分布使用了BJH模型計(jì)算。
表4兩種方法制備的大黃素分子烙印聚合物的比表面積和平均孔徑

從表4可以看出，本發(fā)明制備的填料其較大的柱容并不來(lái)自于比表面積的增加，而是在于表面張力作用下平均孔徑的擴(kuò)大。這一特征正是其它核心替代方法所沒(méi)有的，這也是本發(fā)明優(yōu)勢(shì)的核心基礎(chǔ)。
2.6本體聚合法和液膜法制備的大黃素分子烙印聚合物的吸附速度實(shí)驗(yàn)稱(chēng)取139mg本體聚合制備的大黃素分子烙印聚合物置于1cm吸光度池中，用340μL乙腈潤(rùn)濕，待聚合物沉降完畢后，沿壁加入1mL 6μg/mL大黃素乙腈溶液，以乙腈為參比測(cè)定混合不同時(shí)間時(shí)的吸光度值。
稱(chēng)取139mg液膜法制備的大黃素分子烙印聚合物置于1cm吸光度池中，用340μL乙腈潤(rùn)濕，待聚合物沉降完畢后，沿壁加入1mL 15μg/mL大黃素乙腈溶液，以乙腈為參比測(cè)定混合不同時(shí)間時(shí)的吸光度值。
吸附速度實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)附圖1和附圖2。這兩張圖表明本方法制備的聚合物擁有很快的吸附速度，而這也正是平均孔徑增大帶來(lái)的結(jié)果，是本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.一種分子烙印填料的制備方法，是用液膜法在載體表面形成分子烙印聚合物薄膜層。
2.如權(quán)利要求1所述的分子烙印填料的制備方法，具體操作是1)先用填料的載體預(yù)裝柱，搭建出將來(lái)填料的主體構(gòu)架；2)將聚合反應(yīng)液注入上述預(yù)裝柱中；3)將處理好的柱子兩端封口后，置水浴中進(jìn)行聚合反應(yīng)。
3.如權(quán)利要求2所述的分子烙印填料的制備方法，其中步驟2)中將聚合反應(yīng)液注入上述預(yù)裝柱后，用高壓氮?dú)鈱⒍嘤嗟木酆戏磻?yīng)液吹出。
4.如權(quán)利要求2所述的分子烙印填料的制備方法，其特征是所述載體是無(wú)孔硅膠或玻璃微珠。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分子烙印填料的制備方法，是用液膜法在載體表面形成分子烙印聚合物薄膜層。該方法能大大降低原料消耗，使聚合物在載體表面分布更加均勻、致密而且完整，結(jié)合得更為牢固，在使用過(guò)程中不易脫落；且得到的聚合物平均孔徑大，從而增大擴(kuò)散速度、提高萃取效率。該方法簡(jiǎn)單易行，適合于大規(guī)模制備。
文檔編號(hào)B01J19/30GK101024702SQ200710079539
公開(kāi)日2007年8月29日 申請(qǐng)日期2004年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月28日
發(fā)明者徐筱杰, 莊艷, 駱宏鵬, 陳麗蓉 申請(qǐng)人:北京大學(xué)