專利名稱：蛋白酶檢測(cè)的制作方法
蛋白酶檢測(cè)本發(fā)明涉及含有發(fā)色氨基酸的多肽，摻入了這種多肽的產(chǎn)物，以及制造這種多肽 的方法。本發(fā)明還涉及檢測(cè)蛋白酶的方法。在本技術(shù)領(lǐng)域中已知有大量反應(yīng)試劑或化合物可用于測(cè)量蛋白水解作用。其中 包括合成修飾的多肽底物，它們?cè)诒坏鞍姿庾饔们虚_(kāi)時(shí)，釋放出指示劑基團(tuán)或不穩(wěn)定分 子，例如已經(jīng)在其c-末端被對(duì)硝基苯胺或萘胺修飾的合成多肽。例如，EP-A-0864864公開(kāi) 了使用 Dnp-Pro- 3 -環(huán)己基-Ala-Gly-Cys (Mu) -His-Ala-Lys (N-Me-Abz) -NH2 檢測(cè)蛋白酶， Dnp-Pro- 3 -環(huán)己基-Ala-Gly-Cys (Mu) -His-Ala-Lys (N-Me-Abz) _NH2 是一種基于熒光的肽 而不是發(fā)色的肽。Plapinger等，J.Org.Chem 1965，30，1781報(bào)道了被胰蛋白酶切開(kāi)后發(fā)色 的物質(zhì)，它們是精氨酸的衍生物。在對(duì)硝基苯胺從這樣的肽底物的C-末端切下并釋放到溶液中后，可以測(cè)量到UV 吸收值的增加。在肽底物含有萘胺的情況下，釋放的發(fā)色部分可以被附加的報(bào)告分子捕獲， 產(chǎn)生可見(jiàn)的顏色變化。合成的胰蛋白酶底物Na-苯甲?；?DL-精氨酸萘胺(BANA) 常用于蛋白水解活性的分析測(cè)定，以例如幫助診斷牙周疾病。本技術(shù)領(lǐng)域已知的發(fā)色蛋白酶底物，例如BANA，它們的相應(yīng)發(fā)色部分位于多肽的 C-末端(除了硫代酯肽(Thiopeptolides)之外，參見(jiàn)下文)。這種發(fā)色蛋白酶底物的問(wèn)題 在于，發(fā)色部分位于多肽的C-末端，由于缺乏側(cè)翼氨基酸，多肽的格式受到限制，從而限制 了蛋白酶特異性。本技術(shù)領(lǐng)域已知的發(fā)色肽還具有不良的水溶解性，并且較長(zhǎng)多肽的合成 為合成過(guò)程增加了復(fù)雜性。這導(dǎo)致多肽配制困難，并增加了在商業(yè)化規(guī)模上多肽擴(kuò)大生產(chǎn) 的成本。此外，C-末端發(fā)色團(tuán)不能以直接方式連接到固相表面上，這限制了使用這些多肽 在診斷中可視化蛋白水解作用的方法的可能應(yīng)用。硫代酯肽(Thiopeptolides),正如在Weingarten 等，Biochem，1985，24， 6730-6734中描述的，具有位于肽序列內(nèi)部的發(fā)色部分，但是不使用酰胺鍵?；诹虼ル?的肽底物的問(wèn)題在于，由于它們?cè)诘鞍姿馇懈钗稽c(diǎn)處不含通常的酰胺鍵，它們不能提供 最大的底物識(shí)別或轉(zhuǎn)換(turnover)。本發(fā)明試圖緩解上述的一個(gè)或多個(gè)問(wèn)題。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了含有發(fā)色氨基酸的多肽，發(fā)色氨基酸在其N和C端 兩側(cè)帶有至少一個(gè)氨基酸。優(yōu)選情況下，發(fā)色氨基酸的胺基具有低于5的pKa，發(fā)色氨基酸能夠與共軛醛反應(yīng)。有利情況下，多肽包含靶蛋白酶的靶序列，該靶蛋白酶能夠切開(kāi)包含發(fā)色氨基酸 的氨基的肽鍵。根據(jù)本發(fā)明，還提供了含有發(fā)色氨基酸的多肽，其中發(fā)色氨基酸在其N和C端兩 側(cè)帶有至少一個(gè)氨基酸，發(fā)色氨基酸的胺基具有低于5的pKa，發(fā)色氨基酸能夠與共軛醛反 應(yīng)，并且其中多肽包含靶蛋白酶的靶序列，該靶蛋白酶能夠切開(kāi)包含發(fā)色氨基酸的氨基的 肽鍵。
方便的是，發(fā)色氨基酸含有直接鍵合到發(fā)色氨基酸的氨基的氮原子上的芳族環(huán)部 分。優(yōu)選情況下，發(fā)色氨基酸與天然氨基酸等排性(isosterically)匹配。方便的是，靶序列含有發(fā)色氨基酸。優(yōu)選情況下，當(dāng)靶序列被切開(kāi)時(shí)，發(fā)色氨基酸能夠與共軛醛反應(yīng)，給出可檢測(cè)信號(hào)。有利情況下，共軛醛是取代的苯甲醛或肉桂醛或反，反-苯基戊二烯醛。優(yōu)選情況下，共軛醛是DMAC或DMAB。方便的是，芳族部分是苯基或萘基部分。有利情況下，多肽是線性多肽。優(yōu)選情況下，多肽在多肽的C或N末端處或附近固定化在固相表面上。有利情況下，多肽共價(jià)結(jié)合到固相表面上。方便的是，多肽在多肽的C或N末端處或附近還含有第一個(gè)和第二個(gè)結(jié)合部分。優(yōu)選情況下，多肽的長(zhǎng)度在2到100個(gè)氨基酸之間，更優(yōu)選在3到40個(gè)氨基酸之 間。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了在樣品中檢測(cè)蛋白酶的方法，包括下列步驟(i)將樣品暴露于前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的多肽中，允許蛋白酶切開(kāi)多肽并產(chǎn)生片 段，在該片段的N-末端展現(xiàn)發(fā)色氨基酸；(ii)將共軛醛與含有發(fā)色氨基酸的片段反應(yīng)，產(chǎn)生有色加成物；以及(iii)檢測(cè)有色加成物，有色加成物的存在表明樣品中存在蛋白酶。方便的是，步驟(i)包括用蛋白酶切開(kāi)多肽的含有發(fā)色氨基酸的氨基的肽鍵。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了本發(fā)明的制造方法，包括下列步驟i.合成含有一個(gè)發(fā)色氨基酸的氨基酸二聚體；以及ii.在多肽合成過(guò)程中將二聚體摻入到多肽的剩余部分中。方便的是，步驟(ii)包含將二聚體與新生寡肽相連。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用于在樣品中檢測(cè)蛋白酶的產(chǎn)品，包含本發(fā)明的多肽；以及其上可以固定化多肽的固相支持物。優(yōu)選情況下，產(chǎn)品還包含共軛醛。有利情況下，固相支持物包含第一個(gè)和第二個(gè)鉸鏈連接的片層，多肽固定化在第 一個(gè)片層上，共軛醛位于第二個(gè)片層上，使得將片層折疊到一起時(shí)可以將材料從第一個(gè)片 層轉(zhuǎn)移到第二個(gè)片層上。方便的是，產(chǎn)品還包含可插入到固定化在第一個(gè)片層上的多肽與位于第二個(gè)片層 上的共軛醛之間的膜，膜阻止了尺寸大于閾值尺寸的物質(zhì)通過(guò)膜從第一個(gè)片層到達(dá)第二個(gè) 片層，多肽可以被蛋白酶切開(kāi)以釋放含有發(fā)色氨基酸的片段，片段小于閾值尺寸。或者，固相支持物包含色譜介質(zhì)。有利情況下，色譜介質(zhì)還包含片段結(jié)合分子，能夠結(jié)合含有在被蛋白酶切開(kāi)后可 以從多肽釋放的發(fā)色氨基酸的多肽片段，多肽可以固定化在色譜介質(zhì)上的標(biāo)記區(qū)域處，片 段結(jié)合分子固定化在色譜介質(zhì)上的可視化區(qū)域處。
方便的是，多肽可以被切開(kāi)成第一個(gè)和第二個(gè)片段，第一個(gè)片段含有發(fā)色氨基酸， 其中產(chǎn)品還包含可以與第二個(gè)片段結(jié)合的可檢測(cè)標(biāo)記物；以及固定化在色譜介質(zhì)中或其 上的第一種和第二種捕獲分子，第一種捕獲分子能夠結(jié)合第一個(gè)片段，第二種捕獲分子能 夠結(jié)合第二個(gè)片段或可檢測(cè)標(biāo)記物。優(yōu)選情況下，標(biāo)記物包含能夠結(jié)合第二個(gè)片段的結(jié)合成分。有利情況下，色譜介質(zhì)包括測(cè)試條?；蛘撸V介質(zhì)包括多孔材料柱。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了合成的多肽，含有大量原料氨基酸和至少一個(gè) 與天然氨基酸等排性匹配的發(fā)色氨基酸。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了本發(fā)明的合成多肽在檢測(cè)樣品中的蛋白酶中的應(yīng)用。將發(fā)色部分包埋在肽序列中，降低了疏水性對(duì)合成和使用的影響。因?yàn)楸景l(fā)明的 發(fā)色團(tuán)位于肽序列中，因此肽的C和N末端是游離的，可用于本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員熟知的 標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)化學(xué)。本說(shuō)明書中的“發(fā)色氨基酸”是指能夠改變顏色的氨基酸分子(含有氨基和羧 基)。更具體來(lái)說(shuō)，當(dāng)它在肽底物中位于蛋白酶切割位點(diǎn)的P1’位置，經(jīng)蛋白水解作用釋放 并隨后通過(guò)共價(jià)化學(xué)與第二種分子發(fā)生反應(yīng)時(shí)，它可以形成可以在400到900nm之間檢測(cè) 的有色加成物。本說(shuō)明書中的“靶蛋白酶”被定義為識(shí)別并切開(kāi)發(fā)色多肽上的靶區(qū)域的蛋白酶，其 中靶區(qū)域在切割位點(diǎn)的P1’位置上包含發(fā)色氨基酸。“天然氨基酸”是指任何一種下述氨基酸丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸， 半胱氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，甘氨酸，組氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨 酸，脯氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，色氨酸和纈氨酸。本說(shuō)明書中的“側(cè)翼”氨基酸是連接到至少一個(gè)其他氨基酸上的氨基酸，其中該連 接通過(guò)一個(gè)氨基酸的氨基末端與另一個(gè)氨基酸的羧基之間的肽鍵進(jìn)行。本說(shuō)明書中的“等排性”匹配與天然氨基酸和相應(yīng)的發(fā)色氨基酸相關(guān)。它意味著 匹配的取代的發(fā)色氨基酸與它所代替的天然氨基酸具有相似的空間占有率。如果對(duì)含有天 然氨基酸的肽序列特異的蛋白酶也能夠切開(kāi)其中天然氨基酸被發(fā)色氨基酸取代的多肽，那 么發(fā)色氨基酸可以被視為與天然氨基酸等排性匹配。

圖1顯示了本發(fā)明的多肽與蛋白酶的反應(yīng)。為了簡(jiǎn)化，序列Ala-[pABA]-Gly被用 作與胰彈性蛋白酶起反應(yīng)的例子，其中PABA代替了丙氨酸。圖2顯示了用于本發(fā)明的實(shí)施方案的發(fā)色氨基酸的選擇。圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，用于檢測(cè)蛋白酶的產(chǎn)品的透視圖。圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，用于檢測(cè)蛋白酶的產(chǎn)品的橫截面圖。圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，用于檢測(cè)蛋白酶的產(chǎn)品的頂視圖。圖6是流程圖，顯示了根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案合成多肽的方法。序列 Val-Arg-[p-ABA]-Gly被用作在固相(用圓圈描繪的樹脂)上合成的例子。分子合成中的 關(guān)鍵反應(yīng)是步驟iii)。利用標(biāo)準(zhǔn)的肽化學(xué)，使用輸入氨基酸的活化的酯，不容易實(shí)現(xiàn)該反 應(yīng)。但是，使用輸入氨基酸的?；然?，顯著改進(jìn)了反應(yīng)化學(xué)。
圖7(A)顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案使用用于檢測(cè)蛋白酶的產(chǎn)品和獲得的 陽(yáng)性發(fā)色反應(yīng)(陽(yáng)性蛋白酶樣品)的結(jié)果的圖片。(B)是在圖3描述的風(fēng)格的裝置中，使 用陽(yáng)性[上方線]和陰性[下方線]樣品時(shí)從電子讀數(shù)器獲得的數(shù)據(jù)的圖形表示。(C)是 與可商購(gòu)發(fā)色底物苯甲?；鵢精氨酰-萘胺(BANA)相比，同樣的陽(yáng)性蛋白酶樣品的圖形表 示。在相同條件下，與BANA相比，發(fā)色底物顯示出增加的酶轉(zhuǎn)換和顏色產(chǎn)生。圖8A顯示了平板分析測(cè)定結(jié)果，比較了作為彈性蛋白酶底物的AAPV-[pABA]_GGC 和AAPV-[ANA]-GGC。圖8B顯示了縱向流分析測(cè)定的結(jié)果，比較了作為彈性蛋白酶底物的 AAPV-[pABA]-GGC和 AAPV-[ANA]-GGC。圖9顯示了發(fā)色氨基酸ANA(2-氨基萘甲酸)和pABA(對(duì)氨基苯甲酸)的結(jié)構(gòu)比 較。圖10A顯示了 AAPV-[pABA]_GGC的電子濺射質(zhì)譜圖；預(yù)計(jì)質(zhì)量是692. 78，測(cè)量到 的質(zhì)量是692. 2。圖10B顯示了 AAPC-[ANA]-GGC的電子濺射質(zhì)譜圖；預(yù)計(jì)質(zhì)量是742. 84， 測(cè)量到的質(zhì)量是742.4。圖 11 顯示了 Fmoc-Val-pABA-OH 的屮 NMR 譜圖。圖12顯示了使用Fmoc-Val-pABA-GGC合成的AAPV- [pABA] -GGC的電子濺射質(zhì)譜 圖；預(yù)計(jì)質(zhì)量是692. 78，測(cè)量到的質(zhì)量是692. 3。在本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案中，提供了檢測(cè)樣品中的蛋白酶例如木瓜蛋白酶或胰 蛋白酶的方法。方法包括提供接受器，其中放置有可切開(kāi)的多肽的溶液?？汕虚_(kāi)的多肽從 N-端到C-端包含序列丙氨酸-[對(duì)氨基苯甲?；鵠-甘氨酸。也就是說(shuō)，多肽包含在其N和 C端側(cè)翼帶有兩個(gè)其他氨基酸(丙氨酸和甘氨酸)的發(fā)色氨基酸(對(duì)氨基苯甲酸)。例如 這種包含對(duì)氨基苯甲酸的多肽，在被切開(kāi)并與第二種試劑反應(yīng)之前，是無(wú)色的。在本實(shí)施方 案中使用的第二種試劑是共軛醛二甲基_氨基-肉桂醛(DMAC)。將樣品放置在小管中，與多肽混合足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以便靶酶切開(kāi)肽底物，典型情況 下少于10分鐘。在本實(shí)施例中，由于所選的氨基酸序列，蛋白酶在不到3分鐘內(nèi)快速切開(kāi) 了多肽序列。結(jié)果，蛋白酶在丙氨酸殘基的-CO-部分與對(duì)氨基苯甲酸殘基的-NH-基團(tuán)之 間的肽鍵處切開(kāi)多肽，如圖1中所示。該切割導(dǎo)致釋放了兩個(gè)分子；第一個(gè)分子是游離的丙 氨酸殘基，第二個(gè)分子包含與甘氨酸殘基相連的對(duì)氨基苯甲酸殘基。第二個(gè)分子是發(fā)色中 間體。在方法的下一個(gè)步驟中，向小管中加入DMAC并混合。如圖1中所示，DMAC與發(fā)色 中間體在酸性條件下反應(yīng)，形成了有色的加成物。跟具體來(lái)說(shuō)，在陽(yáng)性蛋白酶樣品中，新產(chǎn) 生的發(fā)色中間體與DMAC反應(yīng)，產(chǎn)生了紅色。相反，在陰性蛋白酶樣品中，底物保持完整，屏 蔽了 pABA基團(tuán)，使它不與輸入的DMAC反應(yīng)。DMAC分子本身在微酸性條件下是黃色化合物， 在不存在暴露的pABA的情況下產(chǎn)生黃色。因此，本發(fā)明的本實(shí)施方案的方法，導(dǎo)致對(duì)樣品中蛋白酶的存在(紅色)或不存在 (黃色)作出響應(yīng)而產(chǎn)生顏色。根據(jù)圖1中示例的實(shí)施方案，多肽中發(fā)色氨基酸的氨基一側(cè)上的肽鍵被靶蛋白酶 水解，因此暴露出發(fā)色氨基酸的胺基。在本實(shí)施方案中，共軛醛是DMAC，但是在其他實(shí)施方 案中可以使用可選的醛，例如取代的苯甲醛和肉桂醛，例如二甲基-氨基-苯甲醛(DMAB)。以下，將描述符合本發(fā)明的實(shí)施方案的多肽的合成。發(fā)色多肽通過(guò)常規(guī)的Fmoc化學(xué)在本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員熟悉的固相上合成。在某些實(shí)施方案中，每個(gè)氨基酸連接 通過(guò)使用輸入氨基酸的活化的酯來(lái)實(shí)現(xiàn)。在其他實(shí)施方案中，使用?；然飳⑤斎氚?基酸連接到發(fā)色殘基上。通過(guò)在肽合成之前合成含有P1氨基酸和發(fā)色團(tuán)(P1’)的構(gòu)件 (building block)，并將整個(gè)構(gòu)件作為單個(gè)部分導(dǎo)入，可以獲得效率的提高。這種構(gòu)件的例 子是Fmoc-丙氨酰-對(duì)氨基苯甲酸，可以以與氨基酸同樣的方式添加到新生多肽上。多肽的 長(zhǎng)度典型地在2到100個(gè)殘基的范圍內(nèi)。使用這種方法可以容易地合成不同長(zhǎng)度的發(fā)色多 肽，這種制造方法的自動(dòng)化也容易實(shí)現(xiàn)。這對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)用于商業(yè)化應(yīng)用來(lái)說(shuō)是有利的。 此外，本發(fā)明的發(fā)色多肽沒(méi)有已知的致癌性質(zhì)，因此在大規(guī)模制造中不存在安全性問(wèn)題。在第一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含發(fā)色氨基酸對(duì)氨基苯甲酸。但是，在可選實(shí)施方案 中，使用了不同的發(fā)色氨基酸，例如在圖2中顯示的之一。這些發(fā)色氨基酸含有芳族部分 (例如苯基或萘基)或其他雜環(huán)類似物，并且芳香環(huán)部分接近發(fā)色氨基酸的氨基(即它是苯 胺)。但是，應(yīng)該理解，在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，提供了不含芳香環(huán)部分的發(fā)色酸。重要 的是，發(fā)色氨基酸的胺基具有明顯低于(例如小于5)多肽中存在的任何其他氨基酸(氨基 末端或側(cè)鏈)的pKa。通過(guò)這種方式，在低pH條件下，發(fā)色胺至少部分去質(zhì)子化，而結(jié)構(gòu)中 存在的其他胺事實(shí)上是完全質(zhì)子化的。這使得與共軛醛的反應(yīng)主要發(fā)生在發(fā)色氨基酸上。 當(dāng)然，對(duì)于發(fā)色酸來(lái)說(shuō)，還必需使空間位阻不會(huì)阻止與共軛醛的相互作用。理想情況下，在多肽中使用的發(fā)色氨基酸與天然氨基酸等排性匹配，以便盡可能 接近地模擬靶蛋白酶的底物結(jié)構(gòu)。因此，合成了具有個(gè)體靶蛋白酶特異性靶區(qū)域的發(fā)色多 肽。發(fā)色氨基酸可以位于多肽中的任何位置，前提是它不位于氨基酸的C-末端。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽被摻入到用于檢測(cè)樣品中的蛋白酶的產(chǎn)品 中，該產(chǎn)品采用小冊(cè)子(booklet)的形式。適合的這種小冊(cè)子公開(kāi)在PCT申請(qǐng)No.PCT/ GB2007/000643中，該申請(qǐng)?jiān)诖艘秊閰⒖?。參考圖3，現(xiàn)在將描述符合本實(shí)施方案的小冊(cè)子 1。小冊(cè)子包含平面基材例如紙板的第一和第二個(gè)片層2、3，通過(guò)鉸鏈4相連。在第一個(gè)片 層中央，在吸附性襯墊5的頂部提供了薄的反應(yīng)薄膜25。反應(yīng)薄膜25浸有發(fā)色多肽并可以 由PVA制成。在第二個(gè)片層3的中央，提供了孔隙6，它與反應(yīng)薄膜25和吸附性襯墊5對(duì) 齊?？紫?被可視化薄膜7覆蓋，使得當(dāng)?shù)谝缓偷诙€(gè)片層2、3彼此壓在一起時(shí)可視化薄 膜7位于孔隙6與反應(yīng)薄膜25之間?？梢暬∧そ蠨MAC和HC1?？蛇x地，反應(yīng)薄膜25 和吸附性襯墊5在使用前用可移除薄膜(未顯示)覆蓋，以便反應(yīng)薄膜25和吸附性襯墊5 保持密封與環(huán)境隔離。在使用中，揭去覆蓋反應(yīng)薄膜25和吸附性襯墊5的任何可移除薄膜，將懷疑含有 蛋白酶的樣品沉積在反應(yīng)薄膜25上并吸入吸附性襯墊5。如果樣品中存在蛋白酶，那么蛋 白酶切開(kāi)發(fā)色多肽，釋放出發(fā)色中間體，正如在第一個(gè)實(shí)施方案中已描述的。然后將小冊(cè)子 1的第一和第二個(gè)片層2、3壓到一起，使得反應(yīng)薄膜25上的成分與可視化薄膜7、更具體來(lái) 說(shuō)DMAC相接觸。因此，某些發(fā)色中間體從反應(yīng)薄膜25和吸附性襯墊5傳遞到可視化薄膜7，在那里 它與DMAC反應(yīng)形成了有色加成物。正如前面描述的，有色加成物顏色為紅色，小冊(cè)子1的 用戶可以通過(guò)孔隙6觀察到它?；蛘?，如果樣品不含能夠切開(kāi)發(fā)色多肽的蛋白酶，那么不形成發(fā)色中間體，發(fā)色多 肽保持黃色的顏色。因此，可視化薄膜也保持其顏色或變成黃色。
在本實(shí)施方案的變體中，提供了膜，它覆蓋住可視化薄膜，不允許高于某個(gè)閾值尺 寸的物質(zhì)通過(guò)它。閾值的選擇使得樣品中任何天然具有顏色的物質(zhì)太大而不能通過(guò)膜，而 發(fā)色中間體小得足以通過(guò)膜，因此可以與與可視化薄膜、更具體來(lái)說(shuō)是其上的DMAC相接 觸?，F(xiàn)在參考圖4，將描述本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案。在本實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽 被摻入到用于檢測(cè)蛋白酶的產(chǎn)品中，該產(chǎn)品采用縱向流生化測(cè)定的形式。檢測(cè)裝置8包含 接受器9，它具有上層部分10，在其頂端具有開(kāi)口 11，在其底部具有漏斗12，連接到頸部13 上。頸部13由透明材料例如有機(jī)玻璃(perspex)或玻璃制成，通往倒置的漏斗14，漏斗14 反過(guò)來(lái)位于下層部分15的頂部。頸部13圍住了基質(zhì)16，基質(zhì)16中固定化有大量本發(fā)明 的發(fā)色多肽。例如，在某些實(shí)施方案中，基質(zhì)16含有大量顆粒，發(fā)色多肽在其C-末端處或 附近使用酰胺鍵或通過(guò)巰基相互作用(形成硫醚)共價(jià)鍵合到顆粒上。在這種情況下，“附 近”意味著C-末端的10或20個(gè)氨基酸殘基之內(nèi)。在使用中，通過(guò)接受器9的上層部分10的開(kāi)口端11加入懷疑含有蛋白酶的樣品， 使得它流入漏斗12，并緩慢釋放到基質(zhì)16中。樣品通過(guò)重力和毛細(xì)作用以恒定速率通過(guò)基 質(zhì)16。樣品中的蛋白酶在發(fā)色氨基酸的-NH-部分與在N-端方向上緊鄰的氨基酸的-CO-部 分之間的肽鍵處，切開(kāi)基質(zhì)16中的發(fā)色多肽。因此，釋放出發(fā)色多肽的N-端片段，而發(fā)色 中間體保持固定化在基質(zhì)16中。任選地，使用緩沖液將樣品洗過(guò)，以便確保所有N-端片段 都被洗過(guò)基質(zhì)16，進(jìn)入接受器9中的下層部分15中。然后，將裝有包含DMAC的緩沖液的容器(未顯示)放置在接受器9的上層部分10 的開(kāi)口端11上，并將其下端刺穿，以便將緩沖液釋放到接受器9的漏斗12中。含有DMAC 的緩沖液流過(guò)基質(zhì)16，在那里它與發(fā)色中間體相接觸，與其反應(yīng)形成有色加成物。任何過(guò)量 的DMAC流過(guò)基質(zhì)16，進(jìn)入接受器9的下層部分15。正如前面已經(jīng)解釋的，有色加成物顏色 為紅色，因此樣品中存在蛋白酶將導(dǎo)致基質(zhì)16變紅。這可以通過(guò)頸部13觀察到?；蛘?，如果樣品不含能夠在靶序列處切開(kāi)發(fā)色肽的蛋白酶，那么基質(zhì)16中的發(fā)色 肽保持未切開(kāi)，因而沒(méi)有發(fā)色中間體用于與DMAC反應(yīng)。DMAC顏色為黃色，有一部分通過(guò)非 特異性吸附保留在基質(zhì)16中。因此對(duì)蛋白酶陰性樣品作出反應(yīng)，基質(zhì)16顏色變?yōu)辄S色。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在發(fā)色多肽合成過(guò)程中，天然氨基酸與發(fā)色氨基酸的-NH2_部分的酰胺 連接反應(yīng)是合成的相對(duì)低效的部分。因此，合成反應(yīng)經(jīng)常產(chǎn)生一部分不完整的多肽，其中沒(méi) 有氨基酸連接到發(fā)色氨基酸的N-端。如果這種不完整多肽的比例明顯，那么可能導(dǎo)致假陽(yáng) 性結(jié)果，因?yàn)椴煌暾嚯木哂信c發(fā)色中間體相同的結(jié)構(gòu)，并與完整的多肽一起結(jié)合到基質(zhì) 16上。因此，不完整多肽將與DMAC反應(yīng)，即使在樣品中不存在蛋白酶的情況下也產(chǎn)生顏色 變化。因此，在某些可選實(shí)施方案中，發(fā)色多肽通過(guò)它們的N-末端固定化(即共價(jià)鍵合) 到基質(zhì)16上。通過(guò)這種方式，任何不完整多肽將不與基質(zhì)結(jié)合，因?yàn)樗鼈內(nèi)鄙儆糜谶B接到 基質(zhì)16上的N-末端氨基酸。在這樣的實(shí)施方案中，當(dāng)施加含有活性蛋白酶的樣品時(shí)，發(fā)色 中間體從基質(zhì)16上釋放，并在基質(zhì)16下方提供吸附性集液器(例如棉塞)，以便捕獲釋放 的發(fā)色中間體，并顯示顏色變化。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)色多肽在兩個(gè)末端各包含第一和第二個(gè)結(jié)合部 分。這種多肽的合成的例子提供在實(shí)施例2中。在該具體實(shí)施方案中，生物素連接到多肽 的C-末端，熒光素連接到N-末端上。發(fā)色多肽用于包含側(cè)向流的雙功能配體捕獲蛋白酶檢測(cè)分析中。側(cè)向流分析測(cè)定的進(jìn)一步詳細(xì)情況，提供在PCT申請(qǐng)NO.PCT/GB2007/000637 和GB0716492.4中，這些申請(qǐng)?jiān)诖艘秊閰⒖?。參考圖5，側(cè)向流裝置17包含硝酸纖維素條 18，它具有上游末端22和下游末端23?？拷嫌文┒?2置有由吸附性材料制成的樣品接 受區(qū)19。進(jìn)一步朝向下游末端23有第一個(gè)可視化區(qū)20。再進(jìn)一步朝向下游末端23是第 二個(gè)可視化區(qū)21。第一個(gè)可視化區(qū)20包含大量固定化在條18表面上的多肽結(jié)合分子。每 個(gè)多肽結(jié)合分子能夠結(jié)合到發(fā)色多肽的C-末端上。因此，在該具體實(shí)施方案中，第一種結(jié) 合分子是鏈親和素，可以與多肽C-末端上的生物素結(jié)合。第二個(gè)可視化區(qū)21包含大量固 定化在條18表面上的抗小鼠抗體。在使用時(shí)，將懷疑含有蛋白酶的樣品與上面描述的大量發(fā)色多肽混合。允許蛋白 酶切開(kāi)多肽，釋放出對(duì)應(yīng)于多肽的C-末端的發(fā)色中間體，以及對(duì)應(yīng)于多肽的N-末端的片 段。然后向混合物加入與連接到N-末端片段上的熒光素基團(tuán)結(jié)合的小鼠抗FITC-金抗體。 將樣品混合物放置在樣品接受區(qū)19上。然后樣品混合物由于毛細(xì)作用沿著硝酸纖維素條 18的長(zhǎng)度吸附，以箭頭24的方向朝向下游末端23。因此，它通過(guò)第一個(gè)可視化區(qū)20，然后 通過(guò)第二個(gè)可視化區(qū)21。當(dāng)樣品混合物通過(guò)第一個(gè)可視化區(qū)20時(shí)，生物素標(biāo)簽與鏈親和素結(jié)合，將發(fā)色中 間體固定化在第一個(gè)可視化區(qū)20上。發(fā)色中間體保持與第一個(gè)可視化區(qū)結(jié)合，而N-末端片 段進(jìn)一步沿著硝酸纖維素條20吸附到第二個(gè)可視化區(qū)21?？剐∈罂贵w與小鼠抗FITC-金 抗體結(jié)合，從而將N-末端片段固定化在第二個(gè)可視化區(qū)21處。然后，將DMAC添加到樣品接受區(qū)19，它沿著條以箭頭24的方向吸附。當(dāng)DMAC到 達(dá)第一個(gè)可視化區(qū)時(shí)，它與固定化的發(fā)色中間體反應(yīng)，形成了紅色加成物。此外，與抗FITC 抗體結(jié)合的金顆粒，由于它們?cè)谙跛崂w維素條18上的第二個(gè)檢測(cè)區(qū)21處形成可見(jiàn)的線，可 以被觀察到?；蛘?，如果樣品中不存在蛋白酶，那么當(dāng)整個(gè)多肽沿著硝酸纖維素條18吸附時(shí)， 它被固定化在第一個(gè)檢測(cè)區(qū)處。隨后，當(dāng)DMAC被加入到樣品接受區(qū)19時(shí)，它沿著硝酸纖 維素條18吸附，但是因?yàn)榘l(fā)色氨基酸沒(méi)有暴露在多肽上，DMAC沒(méi)有反應(yīng)地通過(guò)第一個(gè)檢測(cè) 區(qū)。因此，在第一個(gè)檢測(cè)區(qū)20處沒(méi)有顏色形成(除了任何殘留的DMAC之外，它的顏色是黃 色)，此外，金顆粒濃縮在第一個(gè)檢測(cè)區(qū)20處。因此，通過(guò)在第一個(gè)檢測(cè)區(qū)20處出現(xiàn)由金顆 粒形成的可見(jiàn)的線而不是紅色，并且在第二個(gè)檢測(cè)區(qū)21不出現(xiàn)可見(jiàn)的線，可以表明樣品中 不存在有功能的蛋白酶。因此，本實(shí)施方案能夠進(jìn)行兩波反應(yīng)性檢測(cè)，一次使用DMAC，另一次使用金顆粒檢 測(cè)。
實(shí)施例實(shí)施例l-Val-Arg-「pABAl_Gly 的合成參考圖6，現(xiàn)在將描述Val-Arg-[pABA]_Gly的合成。肽合成在固相上(WangResin Merck Biosciences)使用 Fmoc 化學(xué)方 法進(jìn)行(((Fmoc 固相合成實(shí)用方法〉〉(Fmoc solid phase synthesis-apractical approach. )2000Chan，WC和White，PD Oxford UniversityPress)。在典型的合成中，將50mg 樹脂(載量0.91mmol/g)在20 y m過(guò)濾柱(Kinesis)中，在二甲基甲酰胺(DMF) (2ml)中溶脹1小時(shí)。將樹脂用DMF進(jìn)一步清洗(2x2ml)，在真空下排流至干燥。第一個(gè)氨基酸的連接 使用溶解在2ml無(wú)水DMF中的0. 23mmol PYB0P (苯并三唑基-氧基三吡咯烷基磷鐺六 氟磷酸酯)和0. 23mmol H0BT(羥基苯并三唑)和0. 23mmol保護(hù)的甘氨酸殘基來(lái)進(jìn)行。向 溶液加入0.46mmol DIPEA( 二異丙基乙胺)，然后分配到樹脂中。將樹脂漿液在室溫?cái)嚢?90分鐘，然后在真空下排液并用DMF清洗(2x2ml)。進(jìn)行了重復(fù)反應(yīng)，以確保完全覆蓋樹脂 的反應(yīng)性位點(diǎn)。在用DMF(3x2ml)、(二氯甲烷)DCM(3x2ml)清洗并用DMF(2ml)再清洗一次 后，通過(guò)加入20%哌啶在DMF中的溶液(5ml)并攪拌5分鐘，對(duì)樹脂進(jìn)行了 Fmoc去保護(hù)。 然后將樹脂用DMF(2x2ml)清洗，并將反應(yīng)重復(fù)一次。將樹脂在DMF(3x2ml)、DCM(3x2ml)、 然后最后在DMF(2ml)中充分清洗。然后對(duì)于其余的氨基酸殘基重復(fù)該反應(yīng)。為了添加 發(fā)色基團(tuán)后的氨基酸，在如下進(jìn)行連接之前制備了?；然铩⑷鈿?Triphosgene) (0. 077mmol)和Fmoc保護(hù)的氨基酸(0. 23mmol)溶解在lml四氫呋喃(THF)中。向溶液逐 滴加入0. 76mmol三甲基吡啶，產(chǎn)生了白色懸液。然后將其加入到樹脂中，在室溫下混合1 小時(shí)。將反應(yīng)混合物排液，用THF(2x2ml)和DCM(3x2ml)清洗。重復(fù)反應(yīng)以確保完全，然后 將樹脂排液，并用1冊(cè)(2口1111)、0〔11(3口1111)、然后用01^(21111)充分清洗。按照上面的描述， 去保護(hù)得到促進(jìn)。從樹脂上切下和側(cè)鏈的去保護(hù)，通過(guò)加入TFA 水三乙基硅烷(TES) (95% 2.5% 2.5%)來(lái)進(jìn)行。將漿液劇烈攪拌90分鐘。為了完成合成，通過(guò)使用 0. 1% TFA水(2x5ml)進(jìn)一步洗滌，從樹脂漿液除去粗品肽混合物。然后將混合物蒸發(fā)至 干，通過(guò)用溶劑小心地沖洗肽殘?jiān)缓髢A析，用無(wú)水乙醚(2x10ml)進(jìn)行清洗。將殘?jiān)諝?干燥1小時(shí)，然后溶解在盡可能少量的水(3_5ml)中，通過(guò)0.2pm濾器過(guò)濾。將濾液注射 到Phenomenex Jupiter proteo柱上進(jìn)行分析，然后進(jìn)行制備HPLC。將純的級(jí)份合并，蒸發(fā) 至干，然后重新溶解在純水(0.5-lml)中，在微量離心(印pendorf)管中速凍并冷凍干燥， 以獲得白色/無(wú)色的粉末狀固體。使用陽(yáng)離子濺射質(zhì)譜通過(guò)LC-MS對(duì)肽進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)施例2-木瓜蛋白酶的檢測(cè)在分析測(cè)定中使用發(fā)色多肽Val-Arg-[pABA]-Gly來(lái)檢測(cè)樣品溶液中木瓜蛋白酶 的存在。將含有蛋白酶木瓜蛋白酶的樣品施加到圖3中描述的實(shí)施方案的小冊(cè)子的第一個(gè) 片層上(參見(jiàn)圖8A)。小冊(cè)子的第一個(gè)片層事先已經(jīng)用發(fā)色多肽浸漬過(guò)。5分鐘后，將小冊(cè) 子的第一和第二個(gè)片層折疊到一起。小冊(cè)子的第二個(gè)片層事先已用DMAC浸漬過(guò)，10分鐘 后，DMAC從黃色變?yōu)榧t色，正如可以通過(guò)小冊(cè)子的第二個(gè)片層上的孔隙觀察到的。作為對(duì) 照，也使用水代替樣品重復(fù)了分析測(cè)定，顏色變化的結(jié)果顯示在圖8B的圖中。也在相同的條件下使用BANA而不是發(fā)色多肽重復(fù)了蛋白酶分析測(cè)定。對(duì) 于分析測(cè)定過(guò)程中檢測(cè)到的顏色變化速率進(jìn)行了比較，結(jié)果用圖形顯示在圖8C中。 Val-Arg-[pABA]-Gly與BANA(苯甲?；滨］涟?相比，顯示出引發(fā)了更快的可檢測(cè)的 顏色變化，這對(duì)于原位檢測(cè)裝置來(lái)說(shuō)是有利的。^MM 3A-用于檢測(cè)丨彈件存在的i舌合的發(fā)代底4勿的石角定合成了兩種肽 AAPV- [pABA] -GGC 和 AAPV- [ANA] -GGC,其中 pABA 是對(duì)氨基苯 甲酸，ANA是2-氨基萘甲酸。測(cè)試了兩種肽作為嗜中性彈性蛋白酶的底物的適合性。 AAPV-[pABA]-GGC和AAPV-[ANA]-GGC的電子濺射質(zhì)譜圖分別顯示在圖10A和10B中。在獨(dú)立的板孔中，向0. 5mg/ml肽(5 yl)添加不同濃度的彈性蛋白酶(18、9、6和3單位/ml的稀釋液，5 ill)。將混合物用20 u 1緩沖液(50mM磷酸鹽，5mM EDTA ；pH 7. 4)稀 釋，在37°C溫育30分鐘。向每個(gè)板孔加入15 ill DMAC工作溶液(0. 3mg/ml DMAC, 50mMHCl), 充分混合，以進(jìn)行可視化。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示在圖8A中。當(dāng)孔中彈性蛋白酶終濃度為3、1. 5或1單位/ml時(shí)，使用AAPV-[pABA]-GGC 的分析測(cè)定給出了彈性蛋白酶活性的陽(yáng)性結(jié)果(即孔變?yōu)榧t色/橙色(Pantone 136U))。這種顏色變化表明存在彈性蛋白酶。含有0.5單位/ml彈性蛋白酶的孔當(dāng)與 AAPV-[pABA]-GGC(Pantone 108U)混合時(shí)，給出了弱陽(yáng)性結(jié)果。對(duì)照孔給出陰性結(jié)果。相反，含有AAPV-[ANA]-GGC的孔都沒(méi)有明顯改變顏色，它們保持黃色(Pantone 394U)。因此，盡管孔中存在彈性蛋白酶，但彈性蛋白酶活性沒(méi)能檢測(cè)到。實(shí)施例3B 使用了另一種格式來(lái)測(cè)試嗜中性彈性蛋白酶在存在兩種肽AAPV- [pABA] -GGC和 AAPV-[ANA]-GGC的情況下的活性。肽的C-末端半胱氨酸基團(tuán)被用作與固相結(jié)合的手段。 將用碘乙?；鶊F(tuán)功能化的燒結(jié)聚乙烯玻璃料在50mM磷酸鈉，5mM EDTA，pH 7. 4溶液中清洗 10分鐘。然后將玻璃料轉(zhuǎn)移到0. 5mg/ml肽溶液(在PBS)中敏化30分鐘。然后將玻璃料 再一次在磷酸鹽EDTA緩沖液中清洗10分鐘。將玻璃料裝在空柱中，加入200 yl彈性蛋白 酶，流動(dòng)接觸時(shí)間大約30秒。為了使測(cè)定顯色，將100 ill DMAC工作溶液(0. 3mg/ml DMAC, 50mM HC1)通過(guò)柱子。該分析測(cè)定的結(jié)果顯示在圖8B中。含有AAPV-[pABA]-GGC和彈性蛋白酶的測(cè)定 柱給出了陽(yáng)性結(jié)果(Pantone 參比值1505U*)，含有AAPV-[pABA]-GGC但不含彈性蛋白酶 的柱給出了陰性結(jié)果(Pantone 參比值3945U*)。含有AAPV-[ANA]-GGC的柱子，一種具有 存在的彈性蛋白酶，另一種不含，都給出了陰性結(jié)果(Pantone 參比值3945U*)。實(shí)施例3A和3B的結(jié)論根據(jù)在它們存在時(shí)檢測(cè)到的彈性蛋白酶活性，在兩種肽之間觀察到了明顯的差 異。彈性蛋白酶底物優(yōu)選在P1’位置具有絲氨酸、蘇氨酸(二者都具有親水側(cè)鏈)或甘氨 酸(來(lái)源MER0PS數(shù)據(jù)庫(kù))。因此，具有大的疏水表面的大體積發(fā)色氨基酸不可能與這些優(yōu) 選氨基酸空間匹配合適。萘甲酸(ANA)比對(duì)氨基苯甲酸(pABA)體積更大并且更加疏水，因 此AAPV-[ANA]-GGC不是良好的彈性蛋白酶底物。這兩種分子的結(jié)構(gòu)都顯示在圖9中。pABA 發(fā)色氨基酸與絲氨酸和蘇氨酸的空間匹配好得多，因此AAPV-[pABA]-GGC明顯更適合作為 彈性蛋白酶的底物，在底物與酶混合時(shí)產(chǎn)生彈性蛋白酶活性。因此，AAPV- [pABA] -GGC可用 于檢測(cè)彈性蛋白酶的存在。實(shí)施例4 :AAPV- [pABA] -GGC 的合成制造了一種新類型的構(gòu)件，它們被開(kāi)發(fā)用于改進(jìn)含有發(fā)色氨基酸的肽的合成，其 中所述構(gòu)件的合成與自動(dòng)化合成相容。用于合成這種構(gòu)件的方法不需要使用在實(shí)施例1中 描述的BTC/三甲基吡啶(collidine)步驟。BTC/三甲基吡啶步驟是有效的，但是需要嚴(yán)苛 的條件，并產(chǎn)生不溶性沉淀，使得它不適合與自動(dòng)化肽合成組合使用。新類型的構(gòu)件離線合成，并摻入P1氨基酸和P1’發(fā)色氨基酸。它可以使用用于序 列中所有其他氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)條件，方便地?fù)饺氲胶铣芍?。避免了困難的連接步驟中不想要 的副反應(yīng)，導(dǎo)致了快速、整潔的步驟。
將 Fmoc-Val-OH(lOmmol)和叔丁基 pABA(lOmmol)溶解在無(wú)水吡啶中(30ml)。將 溶液在乙二醇/干冰浴中冷卻到_15°C，逐滴加入三氯氧磷(1ml，llmmol)，同時(shí)劇烈攪拌。 30分鐘后將反應(yīng)用TLC終止。加入碎冰(100ml)，將水性混合物用乙酸乙酯(3x50ml)抽提。 然后將該有機(jī)提取物用飽和NaHC03(3x50ml)和鹽水(3x50ml)洗滌。然后將有機(jī)提取物在 無(wú)水硫酸鈉上干燥。將粗混合物蒸發(fā)至干，然后相繼用甲苯、乙酸乙酯和甲醇共蒸發(fā)。將產(chǎn) 物在硅膠上純化，使用19 1的二氯甲烷/甲醇洗脫。純化的叔丁基酯用1 1的TFA/ 二氯甲烷去保護(hù)1小時(shí)并蒸發(fā)，以獲得淺黃色固體。將該化合物代替單獨(dú)的pABA和纈氨酸 連接步驟，直接用于合成AAPV- [pABA] -GGC，成功地生產(chǎn)了預(yù)計(jì)的肽。粗品純度通過(guò)HPLC分 析典型地為70%，與使用原始步驟時(shí)觀察到的35%形成對(duì)比。Fmoc-Val-pABA-0H的咕NMR 波譜顯示在圖11中，使用Fmoc-Val-pABA-OH合成的AAPV-[pABA]-GGC的電子濺射質(zhì)譜圖
顯示在圖12中。
序列表的自由內(nèi)容
<210>1
<223> 發(fā)色多肽 Ala-[pABA]-Gly
<210>2
<223> 發(fā)色多肽 Val-Arg-[pABA] -Gly
<210>3
<223> 發(fā)色多肽 AAPV-[pABA]-GGC
<210>4
<223> 發(fā)色多肽 AAPV-[ANA]-GGC
<210>5
<223> 發(fā)色多肽 Val-[pABA] -GGC
權(quán)利要求
含有發(fā)色氨基酸的多肽，其中發(fā)色氨基酸在其N和C端兩側(cè)連有至少一個(gè)氨基酸，發(fā)色氨基酸的胺基具有低于5的pKa，發(fā)色氨基酸能夠與共軛醛反應(yīng)，并且其中多肽包含靶蛋白酶的靶序列，該靶蛋白酶能夠切開(kāi)包含發(fā)色氨基酸的氨基的肽鍵。
2.權(quán)利要求1的多肽，其中發(fā)色氨基酸含有直接鍵合到發(fā)色氨基酸的氨基的氮原子上 的芳香環(huán)部分。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的多肽，其中發(fā)色氨基酸與天然氨基酸等排性匹配。
4.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的多肽，其中靶序列包含發(fā)色氨基酸。
5.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的多肽，其中當(dāng)靶序列被切開(kāi)時(shí)，發(fā)色氨基酸能夠與共軛醛反 應(yīng)，給出可檢測(cè)信號(hào)。
6.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的多肽，其中共軛醛是取代的苯甲醛或肉桂醛或反，反-苯基 戊二烯醛。
7.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的多肽，其中共軛醛是DMAC或DMAB。
8.權(quán)利要求2的多肽，其中芳族部分是苯基或萘基部分。
9.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的多肽，其中多肽在多肽的C或N末端處或附近固定化在固相 表面上。
10.權(quán)利要求9的多肽，其中多肽共價(jià)結(jié)合到固相表面上。
11.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的多肽，在多肽的C或N末端處或附近還含有第一個(gè)和第二個(gè) 結(jié)合部分。
12.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的多肽，其中多肽的長(zhǎng)度在2到100個(gè)氨基酸之間，更優(yōu)選在 3到40個(gè)氨基酸之間。
13.在樣品中檢測(cè)蛋白酶的方法，包括下列步驟(i)將樣品暴露于前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的多肽中，允許蛋白酶切開(kāi)多肽并產(chǎn)生片段，在 該片段的N-末端顯示發(fā)色氨基酸；(ii)將共軛醛與含有發(fā)色氨基酸的片段反應(yīng)，產(chǎn)生有色加成物；以及(iii)檢測(cè)有色加成物，有色加成物的存在表明樣品中存在蛋白酶。
14.權(quán)利要求13的方法，其中步驟(i)包括用蛋白酶切開(kāi)多肽的含有發(fā)色氨基酸的氨 基的肽鍵。
15.制備權(quán)利要求1到12任一項(xiàng)的多肽的方法，包括下列步驟i.合成含有一個(gè)發(fā)色氨基酸的氨基酸二聚體；以及ii.在多肽合成過(guò)程中將二聚體摻入到多肽的剩余部分中。
16.權(quán)利要求15的方法，其中步驟(ii)包含將二聚體與新生寡肽相連。
17.用于在樣品中檢測(cè)蛋白酶的產(chǎn)品，包含權(quán)利要求1到12任一項(xiàng)的多肽；以及其上可以固定化多肽的固相支持物。
18.權(quán)利要求17的產(chǎn)品，還包含共軛醛。
19.權(quán)利要求18的產(chǎn)品，其中固相支持物包含第一個(gè)和第二個(gè)鉸鏈連接的片層，多肽 固定化在第一個(gè)片層上，共軛醛位于第二個(gè)片層上，使得將片層折疊到一起時(shí)可以將材料 從第一個(gè)片層轉(zhuǎn)移到第二個(gè)片層上。
20.權(quán)利要求19的產(chǎn)品，還包含可插入到固定化在第一個(gè)片層上的多肽與位于第二個(gè)片層上的共軛醛之間的膜，所述膜阻止了尺寸大于閾值尺寸的物質(zhì)從第一個(gè)片層到達(dá)第二 個(gè)片層，多肽可以被蛋白酶切開(kāi)以釋放含有發(fā)色氨基酸的片段，所述片段小于閾值尺寸。
21.權(quán)利要求17或18的產(chǎn)品，其中固相支持物包含色譜介質(zhì)。
22.權(quán)利要求21的產(chǎn)品，其中色譜介質(zhì)還包含片段結(jié)合分子，能夠結(jié)合含有在被蛋白 酶切開(kāi)后可以從多肽釋放的發(fā)色氨基酸的多肽的片段，多肽能固定化在色譜介質(zhì)上的標(biāo)記 區(qū)域處，片段結(jié)合分子固定化在色譜介質(zhì)的可視化區(qū)域處。
23.權(quán)利要求21的產(chǎn)品，其中多肽可以被切開(kāi)成第一個(gè)和第二個(gè)片段，第一個(gè)片段含 有發(fā)色氨基酸，其中產(chǎn)品還包含能與第二個(gè)片段結(jié)合的可檢測(cè)標(biāo)記物；以及固定化在色 譜介質(zhì)中或其上的第一種和第二種捕獲分子，第一種捕獲分子能夠結(jié)合第一個(gè)片段，第二 種捕獲分子能夠結(jié)合第二個(gè)片段或可檢測(cè)標(biāo)記物。
24.權(quán)利要求23的產(chǎn)品，其中標(biāo)記物包含能夠結(jié)合第二個(gè)片段的結(jié)合成分。
25.權(quán)利要求21到24任一項(xiàng)的產(chǎn)品，其中色譜介質(zhì)包括測(cè)試條。
26.權(quán)利要求21到24任一項(xiàng)的產(chǎn)品，其中色譜介質(zhì)包括多孔材料柱。
27.合成的多肽，含有大量原料氨基酸和至少一個(gè)與天然氨基酸等排性匹配的發(fā)色氨 基酸。
28.權(quán)利要求27的合成多肽在檢測(cè)樣品中的蛋白酶中的應(yīng)用。
全文摘要
含有發(fā)色氨基酸的多肽。發(fā)色氨基酸在其N和C端兩側(cè)具有至少一個(gè)氨基酸。發(fā)色氨基酸的氨基具有至少為5的pKa。發(fā)色氨基酸能夠與共軛醛反應(yīng)。多肽含有靶蛋白酶的靶序列，該靶蛋白酶能夠切開(kāi)含有發(fā)色氨基酸的氨基的肽鍵。
文檔編號(hào)B01L3/00GK101896272SQ200880115836
公開(kāi)日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2008年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月13日
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