專利名稱：同時(shí)檢測(cè)葡萄糖、尿酸、甘油三酯及膽固醇的微流控紙芯片及制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明設(shè)計(jì)一種三維微流控紙芯片，用于同時(shí)檢測(cè)葡萄糖、尿酸、甘油三酯及膽固醇。
背景技術(shù)：
血液生化指標(biāo)，能夠反映人體的健康情況，也是醫(yī)生診斷和治療的重要依據(jù)。隨著人們生活水平的提高，糖尿病、高血脂以及痛風(fēng)等疾病的發(fā)病率顯著上升，嚴(yán)重危害人類健康。因此，血液中葡萄糖、甘油三酯、膽固醇以及尿酸的檢測(cè)已成為醫(yī)院中常規(guī)的檢測(cè)項(xiàng)目。大型的生化分析儀通常能夠同時(shí)完成上述物質(zhì)的血液濃度測(cè)定，但是比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，成本較高，并且依賴專業(yè)的操作人員。由于糖尿病、高血脂以及痛風(fēng)均屬慢性病，需要長(zhǎng)期的較頻繁的復(fù)查，所以儀器分析法給患者帶來(lái)了諸多不便，也不利于患者病情的早發(fā)現(xiàn)和早診斷。雖然，目前針對(duì)血液中葡萄糖、甘油三酯、膽固醇以及尿酸，已發(fā)展出快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，但沒(méi)有一種方法能夠同時(shí)高通量地檢測(cè)上述四種物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)目前葡萄糖、甘油三酯、膽固醇以及尿酸檢測(cè)的實(shí)際情況，適應(yīng)家庭檢測(cè)的發(fā)展趨勢(shì)，本發(fā)明將酶法檢測(cè)體系同微流控技術(shù)相結(jié)合，建立了一種能夠同時(shí)檢測(cè)葡萄糖、甘油三酯、膽固醇以及尿酸的高通量三維微流控紙芯片。此芯片無(wú)需儀器設(shè)備和專業(yè)操作人員，靈敏度高，特異性好，操作簡(jiǎn)單，現(xiàn)象直觀，是一種非常適合病人家庭及各型醫(yī)療機(jī)構(gòu)使用的高效尿液尿酸檢測(cè)方法。本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種同時(shí)檢測(cè)葡萄糖、尿酸、甘油三酯及膽固醇的微流控紙芯片，紙芯片是由光刻濾紙和打孔雙面膠疊加組成的三維微孔道體系，內(nèi)含特異性氧化酶、、過(guò)氧化物酶、4-氨基安替比林以及N-乙基-N-(3-磺基醋酸)-3甲氧基苯胺。特異性氧化酶為葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、甘油磷酸氧化酶和膽固醇酯酶-膽固醇氧化酶。微流控紙芯片的制備方法，包括以下步驟I)通過(guò)光刻技術(shù)，在光刻紙上制做芯片孔道；2)將帶有孔道的濾紙與雙面膠進(jìn)行疊層組裝，組裝過(guò)程中在孔內(nèi)填充纖維素粉/水混合物；3)將葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、甘油磷酸氧化酶、膽固醇酯酶-膽固醇氧化酶、過(guò)氧化物酶、4-氨基安替比林以及N-乙基-N- (3-磺基醋酸)-3甲氧基苯胺溶液，分別加入到紙芯片的指定位置A、B、C、D區(qū)域，避光室溫風(fēng)干。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的將特異性氧化酶(葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、甘油磷酸氧化酶、膽固醇酯酶-膽固醇氧化酶)和過(guò)氧化物酶酶固定在紙芯片上，用海藻糖保護(hù)酶的活性。葡萄糖、尿酸、甘油三酯以及膽固醇在各自氧化酶的催化下生成H2O2，而H2O2又在4-氨基安替比林和N-乙基-N-(3-磺基醋酸)_3甲氧基苯胺參與下生成紅色醌亞胺色素。微流控紙芯片可過(guò)濾樣品，并實(shí)現(xiàn)樣品的分流檢測(cè)。三維微流控紙芯片制造方法的全過(guò)程包括以下步驟I)在刷有光刻膠的濾紙上覆蓋上設(shè)計(jì)好通道的遮光蓋子，通過(guò)紫外曝光，未被通道掩蓋的區(qū)域光刻膠發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，被通道掩蓋的區(qū)域光膠通過(guò)顯影液的洗滌除去，使該區(qū)域恢復(fù)親水性；2)按照掩膜上通道的設(shè)計(jì)，在兩面都有油光紙的普通雙面膠上打孔。所有的雙面膠和紙?jiān)诮M裝之前切割成相同尺寸以便于組裝。按照溶液的流動(dòng)方向從入口開(kāi)始組裝，揭去一面油光紙，對(duì)準(zhǔn)入口通道的相應(yīng)位置粘貼牢固。在孔內(nèi)填充適量的纖維素粉/水混合物，再撕去另一層油光紙，與緊鄰的一層紙芯片粘緊。按照紙芯片與雙面膠反復(fù)交替的過(guò)程進(jìn)行粘貼，最后將帶有檢測(cè)試劑的一層紙芯片貼上；3)采用磷酸鹽緩沖液分別配制含有海藻糖的氧化酶(葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、甘油磷酸氧化酶、膽固醇酯酶-膽固醇氧化酶)溶液和過(guò)氧化物酶-底物顯色溶液。將上述溶液依次加在紙芯片上，避光室溫風(fēng)干。根據(jù)所加氧化酶種類不同，在紙芯片正面和反面進(jìn)行數(shù)字標(biāo)記(添加葡萄糖氧化酶的孔所在區(qū)域標(biāo)記數(shù)字“A” ;添加尿酸氧化酶的孔所在區(qū)域標(biāo)記數(shù)字“B” ;添加甘油磷酸氧化酶的孔所在區(qū)域標(biāo)記數(shù)字“C” ;添加膽固醇酯酶-膽固醇氧化酶的孔所在區(qū)域標(biāo)記數(shù)字 “D，，)。4)檢測(cè)時(shí)，將樣品滴加在紙芯片正面的加樣孔中，如樣品中含有待測(cè)物，則背面的顯色孔呈現(xiàn)紅色。通過(guò)毛細(xì)作用帶動(dòng)液體流動(dòng)、試劑吸附以及過(guò)濾樣品，不需要昂貴的泵或壓力控制閥等外援設(shè)備；樣品滴加在加樣面，如樣品中含有待測(cè)物，則背面的顯色孔呈現(xiàn)紅色。


圖1三維微流控紙芯片的構(gòu)造圖；圖2三維微流控紙芯片的正面檢測(cè)示意圖；圖3三維微流控紙芯片的反面檢測(cè)示意圖；其中A葡萄糖檢測(cè)區(qū)，B尿酸檢測(cè)區(qū)，C甘油三酯檢測(cè)區(qū)，D膽固醇檢測(cè)區(qū)，I孔，2膠帶，3光敏膠，4濾紙，5加樣孔，6顯色孔。
具體實(shí)施例實(shí)施例1具體制備、組裝、檢測(cè)過(guò)程如下I本發(fā)明中光刻微通道的制備過(guò)程如下在TX609紙上涂刷SU-8光刻膠，于電熱板上130°C烘烤lOmin，室溫冷卻，覆蓋上設(shè)計(jì)好圖案的掩模，紫外曝光14s，于電熱板上130°C烘烤lOmin，室溫冷卻。未被通道掩蓋的區(qū)域光刻膠發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，被通道掩蓋的區(qū)域光刻膠通過(guò)丙酮洗滌除去，采用氧等離子清洗機(jī)清洗3s，使通道區(qū)域恢復(fù)親水性。
2本發(fā)明中三維微流控紙芯片的組裝過(guò)程如下按照掩膜上通道的設(shè)計(jì)，在兩面都有油光紙的普通雙面膠上打孔。所有的雙面膠和紙?jiān)诮M裝之前切割成相同尺寸以便于組裝。按照溶液的流動(dòng)方向從入口開(kāi)始組裝，揭去一面油光紙，對(duì)準(zhǔn)入口通道的相應(yīng)位置粘貼牢固。在孔內(nèi)填充適量的纖維素粉/水混合物，再撕去另一層油光紙，與緊鄰的一層紙芯片粘緊。按照紙芯片與雙面膠反復(fù)交替的過(guò)程進(jìn)行粘貼，最后將帶有檢測(cè)試劑的一層紙芯片貼上。3本發(fā)明中三維微流控紙芯片的檢測(cè)體系構(gòu)建過(guò)程如下分別配制葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、甘油磷酸氧化酶、膽固醇酯酶-膽固醇氧化酶的磷酸鹽緩沖液溶液(各種氧化酶120U/mL，0. 3mol/L海藻糖)，過(guò)氧化物酶-底物顯色溶液(辣根過(guò)氧化物酶30U/mL，4-氨基安替比林0. 82mmol/L, N-乙基-N- (3-磺基醋酸)_3甲氧基苯胺14mmol/L)。將上述兩種溶液各2 y L依次加在紙芯片上，避光室溫風(fēng)干。4微流控紙芯片使用方法如下將5 10 ii L待測(cè)液加入微流控紙芯片正面的加樣孔中，靜置5min。如果待測(cè)液中只含葡萄糖，那么微流控紙芯片反面A區(qū)顯色孔呈現(xiàn)紅色；如果待測(cè)液中只含尿酸，那么微流控紙芯片反面B區(qū)顯色孔呈現(xiàn)紅色；如果待測(cè)液中只含甘油三酯，那么微流控紙芯片反面C區(qū)顯色孔呈現(xiàn)紅色；如果待測(cè)液中只含膽固醇，那么微流控紙芯片反面D區(qū)顯色孔呈現(xiàn)紅色；如果待測(cè)液中同時(shí)含有葡萄糖和尿酸，那么微流控紙芯片反面A和B區(qū)顯色孔呈現(xiàn)紅色；同理，如果待測(cè)液中同時(shí)含有葡萄糖、尿酸、甘油三酯及膽固醇，那么微流控紙芯片反面A、B、C、D四個(gè)區(qū)的顯色孔均呈現(xiàn)紅色。
權(quán)利要求
1.同時(shí)檢測(cè)葡萄糖、尿酸、甘油三酯及膽固醇的微流控紙芯片，其特征在于紙芯片是由光刻濾紙和打孔雙面膠疊加組成的三維微孔道體系，內(nèi)含特異性氧化酶、過(guò)氧化物酶、4-氨基安替比林以及N-乙基-N-(3-磺基醋酸)-3甲氧基苯胺。
2.如權(quán)利要求1所述的微流控紙芯片，其特征在于特異性氧化酶為葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、甘油磷酸氧化酶和膽固醇酯酶-膽固醇氧化酶。
3.如權(quán)利要求1所述的微流控紙芯片的制備方法，其特征在于包括以下步驟 1)通過(guò)光刻技術(shù)，在光刻紙上制做芯片孔道； 2)將帶有孔道的濾紙與雙面膠進(jìn)行疊層組裝，組裝過(guò)程中在孔內(nèi)填充纖維素粉/水混合物； 3)將葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、甘油磷酸氧化酶、膽固醇酯酶-膽固醇氧化酶、過(guò)氧化物酶、4-氨基安替比林以及N-乙基-N- (3-磺基醋酸)-3甲氧基苯胺溶液，分別加入到紙芯片的指定位置A、B、C、D區(qū)域，避光室溫風(fēng)干。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于同時(shí)檢測(cè)血液中葡萄糖、尿酸、甘油三酯及膽固醇的微流控紙芯片及其制造方法。這種紙芯片是一種新型的個(gè)性化診斷器件，可快速、廉價(jià)、簡(jiǎn)便地進(jìn)行多組分檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)無(wú)需儀器設(shè)備和專業(yè)人員，病人或其家人即可操作，能隨時(shí)快速檢測(cè)血液中葡萄糖、尿酸、甘油三酯及膽固醇的濃度。
文檔編號(hào)B01L3/00GK102998439SQ20111027021
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2011年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月14日
發(fā)明者邱洪斌, 張強(qiáng), 鄭佳昕, 王躍新, 祝麗玲 申請(qǐng)人:佳木斯大學(xué)