專利名稱：親和性膜系統(tǒng)及其應(yīng)用方法
背景技術(shù)：
總的來說，本發(fā)明是關(guān)于為凈化血液而設(shè)計(jì)的治療方法，更具體地說，本發(fā)明是關(guān)于設(shè)計(jì)用于從血液中清除特殊溶解物的親和性膜系統(tǒng)。
親和性分離是依賴于溶液中的一種分子和一種固相化配體之間的高度特異性結(jié)合，而達(dá)到高度純化的目的。按常規(guī)方法，分離是在以多孔小珠裝填的親和柱上進(jìn)行，并在小珠上固相化有配體。這種配體深深地位于多孔小珠的微孔中。此親和性分離過程是借助于泵送蛋白質(zhì)溶液，使之通過含有多孔小珠的填充床來進(jìn)行。
這些目前用于吸附性血漿處理的柱系統(tǒng)是基于在多數(shù)情況下適合于其它類型分離過程，如工業(yè)分離的裝置吸附量。當(dāng)然，促使工業(yè)分離方法發(fā)展的目的可能完全不同于那些與治療過程有關(guān)的目的。這種差別可能導(dǎo)致所采用的技術(shù)雖然是有效的，但決不是最佳的。見Kessler，“吸附性血漿處理體外裝置和系統(tǒng)的最優(yōu)化”Blood purification，Vol.11，pp.150-157(1993)(下面省略為Kessler，“吸附性血漿處理”)。
為了設(shè)計(jì)和最優(yōu)化血漿處理的體外(extracorporeal)系統(tǒng)，已經(jīng)提出了多種預(yù)定目標(biāo)?；灸繕?biāo)之一是，盡量減少用于捕捉靶分子的昂貴配體，通常是抗體的用量。通過盡量減少配體的用量，每次處理的費(fèi)用可以相應(yīng)地降低。另一個(gè)目標(biāo)是盡量減少系統(tǒng)的容積，從而使操作過程對(duì)病人的沖擊變得最小。這樣的容積最小化作用既能減少急性反應(yīng)，又能減少慢性作用如蛋白質(zhì)的損失。見Kessler，“吸附性血漿處理”P.150(1993)。從市場(chǎng)的觀點(diǎn)出發(fā)，親和性裝置的另一些理想的特征是易于放大和制造，其操作僅需要少量的輔助設(shè)備。
如上面所顯示，目前用于除去靶分子的治療裝置是由以多孔小珠裝填的柱組成。這種裝置存在許多缺點(diǎn)。例如，這種裝置的捕捉效率受顆粒內(nèi)緩慢的擴(kuò)散作用所限制，特別是對(duì)于大分子靶溶解物，并且也受具有較高流速的高壓降低(drop)的限制。見Suen & Etget，“對(duì)親和性膜生物分離的數(shù)學(xué)分析”chemical Engineering Science，Vol.47，No.6，pp.1355-1364(1992)(下面省略為Suen & Etget“數(shù)學(xué)分析”)。這種擴(kuò)散限制性吸附作用導(dǎo)致昂貴配體的低效率利用，因?yàn)橄喈?dāng)大量的配體也許不能與靶溶解物接近。
除了與擴(kuò)散限制性吸附作用有關(guān)的問題之外，還存在其它的缺點(diǎn)。為了限制分離裝置的大小和價(jià)格，通常都采用二個(gè)柱，一個(gè)柱用于吸附，而靶溶解物從另一個(gè)柱上被洗脫。采用二個(gè)柱不但增加了方法的費(fèi)用，而且也增加了實(shí)施分離和除去溶解物所需要的處理時(shí)間。并且，為了避免過度高壓降低通過這種柱床而采用的緩慢流速，將導(dǎo)致增加裝載次數(shù)。
更進(jìn)一步的問題是，由于這種柱基質(zhì)材料的生物不相容性，有必要先使血漿與血液的其它細(xì)胞成分分離開，然后將血漿導(dǎo)入填充床。通過被稱為血漿除去法的處理，首先可將血液分離成細(xì)胞成分和血漿成分?？山柚谶^濾或離心來完成血漿除去法。膜血漿除去法是應(yīng)用膜進(jìn)行分離，這種膜具有比血漿蛋白質(zhì)粒度大、但比血液細(xì)胞成分小的孔徑，因此可分離出血漿。離心法對(duì)各成分的分離是基于密度不同，可分批或連續(xù)地進(jìn)行處理。下一步是泵吸血漿，使之通過裝填柱，以便除去靶溶解物如毒素。然后再將處理過的血漿與細(xì)胞成分合并，并輸回給病人。這種多步驟的處理過程是很費(fèi)時(shí)間的，并且需要利用大量的體外體積。該處理過程還需要許多設(shè)備，并需要對(duì)血液成分進(jìn)行大量的處理，這些都將導(dǎo)致增加感染的可能性。
近年來，已有人提議將空心纖維膜用作親和性基質(zhì)，作為對(duì)多孔小珠令人注目的替代物。在纖維壁液流通路中存在的大量表面積，可消除由于與多孔小珠相關(guān)的吸附作用所造成的擴(kuò)散性限制。改變靶溶解物和膜結(jié)合配體之間的吸附動(dòng)力學(xué)速度限制性步驟，從而允許使用較高的流速，并且可能更有效地利用配體，因?yàn)樗挠信潴w都可以用于結(jié)合靶溶解物。
已計(jì)劃制作親和型系統(tǒng)用于便利從血液中除去靶溶解物。例如，Shettigar er al的專利U.S.Patent No.5,211,850，是關(guān)于一種空心纖維(hollow fiber)系統(tǒng)，其中的吸著劑小珠是放置在一個(gè)特別設(shè)計(jì)的U-形裝置之中。在此裝置中，血漿溶解物被優(yōu)先過濾通過多孔空心纖維膜而進(jìn)入血漿室中，在此，不需要的成分將借助吸附結(jié)合技術(shù)被除去。然后，使血漿和未結(jié)合的溶解物再次進(jìn)入空心纖維，并被輸回給病人。
Parham er al的專利U.S.Patent No.5,258,149，是關(guān)于從全血中除去低密度脂蛋白膽固醇復(fù)合物。這個(gè)在Parham er al的專利中所述的系統(tǒng)致力于利用一種微孔的血漿除去膜，其中有固相化的親和性試劑整合在此膜中。用一個(gè)血液泵將全血泵入這種親和性膜中。然后用另一個(gè)泵，即血漿泵，吸引血漿通過微孔纖維的通路，并且使血漿與血液細(xì)胞成分分離。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種改進(jìn)的親和性膜裝置，用于從血液中除去靶溶解物。本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，為了使該裝置能在體外裝置的運(yùn)行制約下充分地發(fā)揮功能，對(duì)用于親和性膜裝置的纖維必須進(jìn)行特殊地設(shè)計(jì)。在設(shè)計(jì)這種親和性膜裝置時(shí)，必須考慮到纖維的各種相互制約特性，包括內(nèi)徑，長(zhǎng)度，微孔的大小和壁的厚度。同樣，為了防止病人體內(nèi)血液容量過度改變或者血中細(xì)胞成分的過度損傷，在體外血流循環(huán)中必須細(xì)心控制血流速度和其流體切應(yīng)變速率(shear rate)等操作條件。
本發(fā)明者認(rèn)為，在本發(fā)明之前，還沒有人對(duì)如何成功地制備適合于治療運(yùn)用的親和性膜裝置進(jìn)行研究和確定。雖然空心纖維膜已被用于分離過程，并且平面(flat sheef)親和性膜片也容易得到，但是，對(duì)空心纖維親和性系統(tǒng)有嚴(yán)格控制要求的許多治療運(yùn)用在以前的工作中尚未著手進(jìn)行。本發(fā)明提供了一種親和性膜裝置，它可用于治療以血中具有過高濃度具體溶解物為特征的許多病癥。
本發(fā)明的親和性膜裝置可用于選擇性地除去包含在血漿或血液中的靶分子。本發(fā)明簡(jiǎn)便而有效的親和性膜裝置具有一個(gè)細(xì)長(zhǎng)的外套腔(housing)，此腔備有供血液進(jìn)出的入口和出口。此外，這種膜裝置還包括有封裝在外套腔內(nèi)的空心纖維。這些空心纖維具有適當(dāng)孔徑的微孔，適合于把血液分離成血漿和其細(xì)胞成分。在微孔的內(nèi)表面還具有固相化的配體，在一個(gè)實(shí)施方案中，該配體對(duì)被傳輸進(jìn)入空心纖維微孔的血漿中存在的靶分子具有親和性，并且能結(jié)合靶分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，配體可能是一個(gè)酶，它能修飾并釋放靶分子。值得注意的是，血液的細(xì)胞成分并不進(jìn)入空心纖維的微孔，而血漿是在不存在外部泵產(chǎn)生越過空心纖維的血漿流的情況下，借助于正向和反向過濾作用被傳輸進(jìn)入微孔。
在實(shí)施方案中，微孔的孔徑范圍是從大約0.2到0.6微米。
在實(shí)施方案中，這種空心纖維具有的壁厚度，使之有足夠的表面積用于附著配體，從而有可能充分地結(jié)合靶分子。為此，空心纖維壁厚度的優(yōu)選范圍是從大約300到3500微米。
在實(shí)施方案中，該空心纖維具有大約70至140微米的內(nèi)徑。
本發(fā)明還提供了一種用于選擇性地除去存在于血液血漿中靶分子的方法。首先，此方法包括提供一套按照本發(fā)明制備的親和性膜裝置。其次是將血液泵入外套腔的入口。然后借助于正向和反向過濾作用，血液的血漿被傳輸進(jìn)入空心纖維的微孔，而不允許細(xì)胞成分進(jìn)入空心纖維壁。使血漿中的靶分子達(dá)到與配體緊密接近持續(xù)一段有臨床意義的時(shí)間，以便有可能對(duì)靶分子發(fā)生結(jié)合或進(jìn)行修飾。最后，在一個(gè)實(shí)施方案中，借助于正向和反向過濾作用，血漿中的非靶分子被傳輸通過空心纖維的微孔，而與血液的細(xì)胞成分重新結(jié)合(reunit)，并通過出口退出此裝置。在另一個(gè)實(shí)施方案中，血漿中的非靶分子是借助于現(xiàn)存的壓力梯度，經(jīng)過一個(gè)血漿導(dǎo)管與細(xì)胞成分重新結(jié)合。
更進(jìn)一步地，本發(fā)明提了一套具有特定尺寸和傳輸特性的空心纖維裝置。此空心纖維裝置包含有許多細(xì)長(zhǎng)的空心纖維。每一根空心纖維都有環(huán)繞著一個(gè)腔隙的外周壁。外周壁上具有許多延伸貫通的微孔。這種微孔的數(shù)量和空間構(gòu)型都便于有效地將血液分離成血漿和細(xì)胞成分。微孔的內(nèi)表面結(jié)合有配體。外周壁具有的壁厚度(充分的微孔長(zhǎng)度)使之可提供足夠的表面積用于附著配體，以便確保配體能捕獲足夠量的靶分子。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，可通過對(duì)空心纖維膜的精心設(shè)計(jì)，從而不需要特殊的血漿除去步驟。如前面所顯示，以前的方案要求與血漿接觸而不是與全血接觸，因此需要使用分離膜同時(shí)進(jìn)行血漿除去處理。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，這種膜裝置的接觸表面與本領(lǐng)域中以前使用的親和性柱相比較，具有更高的生物相容性。改進(jìn)的生物相容性在治療過程中將導(dǎo)致較低的補(bǔ)體激活作用。
更進(jìn)一步地，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，它應(yīng)用化學(xué)固相化技術(shù)，使之能夠借助于簡(jiǎn)易、連貫的過程附著廣泛多種的配體。這種方法表現(xiàn)出優(yōu)于以前制備親和性膜嘗試的重大改進(jìn)。本發(fā)明的化學(xué)結(jié)合技術(shù)可容易地用于結(jié)合多種配體，與結(jié)合單一配體顯然不同。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，當(dāng)靶溶解物大于固相化的配體時(shí)，所采用的一種化學(xué)固相化技術(shù)，顯示出比以前嘗試制備更高的配體利用率。
更進(jìn)一步地，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是提供了比現(xiàn)有親和性柱顯著的費(fèi)用降低。實(shí)現(xiàn)費(fèi)用降低是由于容易制造，配體需要量減少，以及使用設(shè)備的簡(jiǎn)便。
本發(fā)明還有另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，與類似的親和性柱相比較它非常容易使用。本發(fā)明需要較少的支持設(shè)備，并且醫(yī)療專業(yè)人員對(duì)其僅需較少的監(jiān)察。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，它具有改進(jìn)的容量傳遞特性，這樣可以導(dǎo)致縮短處理時(shí)間，提高對(duì)昂貴配體的利用，或者二者兼而有之。
并且，本發(fā)明還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，它提供了一套比本領(lǐng)域以前推薦的膜裝置簡(jiǎn)便和更有效的膜裝置。關(guān)于這點(diǎn)，本發(fā)明的膜裝置獨(dú)創(chuàng)地不需要使用外加的泵來產(chǎn)生跨越裝置中空心纖維的血漿流。而且，按照本發(fā)明，細(xì)長(zhǎng)的外套腔是用于封裝空心纖維，并且在裝置內(nèi)促進(jìn)正向和反向的過濾作用。不同于以前的系統(tǒng)，本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，為了促進(jìn)正向和反向過濾作用并不需要U-形的設(shè)計(jì)。
本發(fā)明的另一些特征和優(yōu)點(diǎn)，將在目前優(yōu)選實(shí)施方案以及附圖的詳述中被描述和顯示。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是本發(fā)明親和性膜裝置一個(gè)實(shí)施方案的平面圖。
圖2是本發(fā)明親和性膜裝置另一個(gè)實(shí)施方案的平面圖。
圖3是代表單根空心纖維的放大示意圖，說明借助于在親和性裝置內(nèi)腔中發(fā)生的正向和反向過濾作用而產(chǎn)生穿過纖維壁的血漿流。
圖4是顯示空心纖維單一纖維壁的放大示意圖，顯示穿過纖維壁內(nèi)微孔的血漿流和靶分子結(jié)合在固相化的配體上。
圖5簡(jiǎn)略地顯示本發(fā)明的生物素-抗生物素蛋白固相化模式。
對(duì)目前優(yōu)選實(shí)施方案的詳述本發(fā)明提供了一種設(shè)計(jì)用于清除血中特殊有害溶解物(靶溶解物)的親和性膜裝置。此親和性膜裝置被設(shè)計(jì)用于體外血液循環(huán)，并可與其它血液凈化的治療過程如血液透析同時(shí)使用。本發(fā)明的裝置由如下部分組成具有特殊尺寸和傳輸特性的空心纖維膜，固相化在膜微孔表面的配體，以及一個(gè)封裝空心纖維并使血液和濾液能夠適當(dāng)?shù)剡M(jìn)入和排出的外套腔。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，配體是借助特定的化學(xué)固相化作用，以最佳功能狀態(tài)結(jié)合在膜上。
工作時(shí)，固相化配體結(jié)合或修飾特定的靶溶解物，因而可以從流過空心纖維腔隙的血液中有效地除去這種溶解物。配體的定位配置，以及本發(fā)明所采用的獨(dú)特的化學(xué)固相化技術(shù)，導(dǎo)致所構(gòu)成的親和性膜裝置具有改進(jìn)的配體活性存留，具有系統(tǒng)適應(yīng)性和標(biāo)準(zhǔn)化的膜制造工藝，并具有全面提高效率的潛力。值得注意的是，本發(fā)明的親和性膜裝置可用于治療以血中某一特殊溶解物過高含量為特征的許多病癥。
圖1顯示本發(fā)明親和性膜裝置的一個(gè)實(shí)施方案。該親和性膜裝置可用于選擇性地除去血中的多種靶溶解物。例如，此裝置可用于除去低密度脂蛋白(“LDL”)，β2-微球蛋白，免疫球蛋白，自身抗體等等。
膜裝置10具有一個(gè)界定內(nèi)腔13的細(xì)長(zhǎng)的外套腔12。入口14與入口導(dǎo)管18連接，使血液能進(jìn)入此親和性膜裝置10。在親和性膜裝置10對(duì)血液發(fā)揮作用之后，經(jīng)過處理的血液通過與出口導(dǎo)管20連接的出口16被排出該系統(tǒng)。
膜裝置10還包括多個(gè)空心纖維膜22，實(shí)際上是一束構(gòu)成空心纖維膜濾器的膜，它們被封裝在由細(xì)長(zhǎng)的外套腔12形成的內(nèi)腔13中。如在下面將進(jìn)一步詳述，空心纖維膜22具有許多微孔，其孔徑適合于把流過此膜22的血液分離成血漿和其細(xì)胞成分。如圖所示，血漿從血液中與細(xì)胞成分分離，并通過空心纖維膜22纖維壁中的微孔流出。
由于在這種膜裝置10內(nèi)存在跨膜壓力，血漿最后又通過空心纖維膜22纖維壁中的微孔流回，并且與血液中的細(xì)胞成分重新結(jié)合。關(guān)于這點(diǎn)，由于纖維內(nèi)存在軸向壓力下降，沿著裝置10的長(zhǎng)度方向，跨膜壓力不同?？拷肟?4跨膜壓力是正向，導(dǎo)致血漿從纖維腔隙流向延伸外套腔12的套管(shell)空間?？拷隹?6的跨膜壓力是負(fù)向，因此導(dǎo)致血漿從套管空間又流回到腔隙中。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案顯示在圖2中，也是使血漿通過微孔進(jìn)行有效地傳輸。圖2顯示出本發(fā)明利用血漿出口23的一個(gè)實(shí)施方案，其中與圖1類似的裝置用同樣的數(shù)字標(biāo)號(hào)。與在圖1中描述的實(shí)施方案不同，在此裝置中血漿是通過出口23排出。但是，與圖1的實(shí)施方案相類似，由于親和性膜裝置內(nèi)的軸向壓力梯度將導(dǎo)致產(chǎn)生跨越空心纖維的濾液(血漿)流。由于此裝置10的設(shè)計(jì)，整個(gè)裝置內(nèi)跨膜壓力都是正向。出口23經(jīng)過血漿導(dǎo)管25與出口導(dǎo)管20連接，從而允許借助于現(xiàn)存的壓力梯度，使血漿中的非靶分子與血液的細(xì)胞成分重新結(jié)合。
圖3和圖4具體地顯示在本發(fā)明中所應(yīng)用的血漿除去和溶解物清除的原理。圖3顯示親和性裝置中的單獨(dú)一根空心纖維24。它具體地顯示在本發(fā)明的親和性膜裝置中，血漿與血液細(xì)胞成分的分離過程。
空心纖維24具有中央腔隙28，在此僅描畫出了纖維束的一根纖維。從病人取出的全血從裝置的入口進(jìn)入通過此腔隙28，到達(dá)裝置的出口。纖維24的壁上具有一連串開口或微孔，通過它們，尺寸比微孔30小的血漿，毒素，藥物或其它溶解物可穿過微孔進(jìn)入纖維24的壁內(nèi)。其它細(xì)胞成分如紅細(xì)胞，白細(xì)胞和血小板，具有不能穿過微孔30的尺寸，而遺留在纖維24的腔隙28中。
借助于正向和反向過濾作用，血漿成分可流入和流出空心纖維24。起初，當(dāng)待處理的血液傳輸進(jìn)入該膜裝置時(shí)，空心纖維24內(nèi)部的血液壓力使血漿借助于對(duì)流作用從腔隙28流向內(nèi)腔壁，或者換句話說，是流向細(xì)長(zhǎng)外套腔套管空間。然后，在靠近裝置的出口附近，空心纖維膜24內(nèi)部的壓力比纖維外部的血漿壓力更低(在內(nèi)腔壁的壓力)。結(jié)果血漿再流回進(jìn)入腔隙28。
穿過纖維24壁26流回的血漿已受到固相化在纖維24微孔30表面的配體處理或修飾。因此，經(jīng)處理的血漿可在纖維腔隙內(nèi)安全地與細(xì)胞成分重新結(jié)合，并通過出口排出。使病人的血液通過此裝置反復(fù)循環(huán)，直到靶溶解物的濃度被充分降低為止。
結(jié)合在微孔30表面的配體將對(duì)血漿發(fā)揮作用，除去血漿中的靶溶解物，或者，在另一個(gè)實(shí)施方案中是對(duì)此靶溶解物進(jìn)行修飾。將配體固相化于親和膜微孔表面的方法，取決于配體的類型(例如抗體，抗原)以及所使用的膜材料。應(yīng)該采用選擇性固相化方案，這樣才能通過膜以最少量配體捕獲到最大量靶溶解物。本領(lǐng)域的專業(yè)人員都能意識(shí)到，應(yīng)該予以考慮的某些普遍性問題是，采用溫和的反應(yīng)條件進(jìn)行固相化，而對(duì)生理狀態(tài)和洗脫條件的結(jié)合穩(wěn)定性，以及為保持活性位點(diǎn)完整性的位點(diǎn)定向性化學(xué)方法。
按照本發(fā)明，可采用多種固相化技術(shù)將配體結(jié)合在空心纖維膜中微孔的表面。除了在本發(fā)明中所詳述的經(jīng)改進(jìn)的固相化方法之外，用于活性膜的某些固相化方法也能經(jīng)修改用于本發(fā)明的親和性裝置。例如，某些活性膜是作為商品買來直接用于固相化蛋白質(zhì)配體。但是，值得注意的是，所有的這些膜都是以唯一的平面膜片的形式購得。例如包括ImmobilonTM(從AV Millipore Corporation，Bedford，MA購得)，ImmunodyneTM(購自Pall Biosupport Corporation，Glen Cove，NY)，和Ultra BindTM(購自Gelman Sciences，Ann Arbor，MI)。
如在下面將要更詳細(xì)地?cái)⑹龅?，本發(fā)明提出了改進(jìn)的固相化技術(shù)，它比以前的方法顯示出明顯的優(yōu)越性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗生物素蛋白/生物素復(fù)合物被用于將配體固相化在微孔表面。另一種方法是，聚乙烯醇固相化技術(shù)可單獨(dú)采用，或者與抗生物素蛋白/生物素復(fù)合物配合使用。
與在血漿小室內(nèi)使用吸著劑的其它系統(tǒng)不同，本發(fā)明獨(dú)特地使用了直接固相化在微孔30表面的配體，用于除去來自血漿的靶溶解物。圖3中圈出的部分，粗略地描繪了配體被固相化在微孔30的表面。這種方法不但排除了對(duì)位于外部血漿小室內(nèi)吸著劑材料的需要，而且增加了溶解物清除過程的效率，并縮短了治療的時(shí)間。由于配體存在于微孔表面，而血漿和血漿成分正是通過這些微孔被直接傳輸，因此，配體與靶溶解物相互作用的機(jī)率將會(huì)增加，從而導(dǎo)致對(duì)昂貴配體的更高效率地利用。
圖4顯示了本發(fā)明所應(yīng)用的清除溶解物的原理。圖4是空心纖維膜的纖維壁34中單個(gè)微孔32的放大示意圖。當(dāng)血漿通過纖維膜的纖維壁34時(shí)，特定的靶分子36能夠與固相化在微孔32表面的配體38接觸。配體38能如此有效地結(jié)合靶溶解物36，以致于可從血漿中除去靶溶解物36。使血漿通過纖維壁34持續(xù)具臨床意義的一段時(shí)間，基本上可從血漿中除去全部靶溶解物36。
本發(fā)明的空心纖維膜是由無害的血液相容性材料制成，這樣在治療過程中僅產(chǎn)生較低的補(bǔ)體激活作用。適合的纖維材料有三醋酸纖維素，聚砜，聚丙烯腈，乙烯/乙烯醇共聚物，聚甲基丙烯酸甲酯，聚酰胺，聚丙烯，醋酸纖維素，再生纖維素，聚碳酸酯，聚乙烯，聚乙烯醇，聚氯乙烯等。空心纖維必須具有適當(dāng)?shù)目讖?，以便允許血漿成分，包括靶溶解物通過空心纖維壁。同時(shí)，這種孔徑還必須能夠阻止血細(xì)胞和血小板進(jìn)入纖維壁的微孔?？招睦w維中適當(dāng)?shù)奈⒖卓讖?其徑)可以在大約0.2至0.6微米的范圍內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種親和性膜裝置，它包含有具有特定尺寸和傳輸特性的空心纖維膜。如上提及，在設(shè)計(jì)適合用于治療應(yīng)用的空心纖維裝置時(shí)，必須考慮到多種因素。本發(fā)明的發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)，對(duì)用于親和性膜裝置的纖維必須特別地設(shè)計(jì)，使該裝置能在體外裝置的操作限制之下充分地發(fā)揮功能。為了確定適當(dāng)?shù)目招睦w維膜，對(duì)相互影響的纖維特征，包括內(nèi)徑，長(zhǎng)度，微孔孔徑和壁厚度，都必須進(jìn)行測(cè)算。
本發(fā)明者在計(jì)算機(jī)模擬的基礎(chǔ)上，確定了空心纖維膜裝置的適當(dāng)尺寸。已開發(fā)了一套描繪該親和性膜裝置運(yùn)行特性的計(jì)算機(jī)模型。關(guān)于這點(diǎn)，計(jì)算機(jī)模型以有限差分形式，為空心纖維膜內(nèi)血流的徑向和縱向剖面，解開了某些守恒方程式。不象其它已有的系統(tǒng)，本發(fā)明者已確定，空心纖維的各種相互作用特征必須如何配合才能構(gòu)成適合的空心纖維膜裝置。
空心纖維親和性膜裝置的尺寸，在很大的程度上取決于必須從病人清除的靶溶解物的量。為了設(shè)計(jì)一個(gè)滿足這些標(biāo)準(zhǔn)的裝置首先必須構(gòu)成一種膜，它具有特別適合于用親和性膜裝置治療的各種尺寸(長(zhǎng)度，內(nèi)徑，纖維壁厚度)。盡管用于親的性治療的膜也能有效地使血液的細(xì)胞成分與血漿除去，但是，它們的主要功能是通過提供在其表面能結(jié)合配體的最大表面積的基質(zhì)來參與清除靶物質(zhì)，此功能主要取決于這種膜的最佳尺寸，并且使其設(shè)計(jì)不同于完全為分離目的而設(shè)計(jì)的膜的尺寸。
一般的情況是，膜被用于根據(jù)分子大小從溶液中分離出靶物質(zhì)。為了清除由膜所施加的對(duì)質(zhì)量傳遞的抗性，這些膜通常被設(shè)計(jì)成盡可能地薄(對(duì)于透析膜薄至8微米，而超濾膜達(dá)到幾百微米)。
相反，對(duì)于親和性裝置中的膜，較厚的膜壁是有利的，因?yàn)檫@種膜本身是提供用于附著配體的基質(zhì)，此配體又將結(jié)合靶溶解物。因?yàn)椋捎糜诟街潴w的膜面積是纖維內(nèi)徑，厚度和長(zhǎng)度的函數(shù)，所以，通過增加增加膜壁的厚度，來提供足夠的用于在此裝置中固相化配體的表面積，是有意義的。如此增加壁厚度將可以最大限度地結(jié)合或修飾靶溶解物，同時(shí)裝置中血液分隔室的容積可減到最小。根據(jù)靶溶解物和配體之間的結(jié)合動(dòng)力學(xué)，對(duì)于任何給定的濾液流速(圖3中箭頭所指示)，厚膜可提供靶溶解物在膜微孔或“多孔基質(zhì)”中有最長(zhǎng)的滯留時(shí)間。結(jié)果是，這將增加靶溶解物與固相化的配體接觸并被捕獲的可能性。
空心纖維親和性膜裝置的尺寸還取決于為實(shí)現(xiàn)使血漿濃度達(dá)到治療改變所需的濾液流量。對(duì)于某一給定的治療目的所需要的特殊濾液流量，取決于靶溶解物的分布容積和血漿濃度，以及進(jìn)行該治療的處理時(shí)間。以前對(duì)通過膜的溶解物流量的關(guān)系曲線已有描述，其中濾出液流量是受在膜表面紅細(xì)胞的濃度極化作用所控制。見Zydney et al，“在微粒懸液的交叉流超濾過程中濾出液流量的濃度極化模型”，ChemicalEngineering Communication，Vol.47，pp.1-21(1986)(下面省略為Zydney et al，“濃度板化模型”)。這種流量依賴于血液通過裝置的切應(yīng)變速率，裝置的長(zhǎng)度和細(xì)胞的極化程度。
被設(shè)計(jì)用于為臨床療效提供充分的靶物質(zhì)容量和足夠的濾液流量的空心纖維親和性膜裝置，必須同時(shí)滿足基于物理學(xué)原理的許多系統(tǒng)制約。
在空心纖維膜裝置中，流動(dòng)液體的切應(yīng)變速率必須不是太大而足以損害流動(dòng)液體中的成分，值得注意的是紅細(xì)胞，它對(duì)切應(yīng)變作用較敏感。因?yàn)榭招睦w維裝置中的切應(yīng)變速率是由血流速度，纖維的內(nèi)徑，以及纖維的數(shù)量所決定的，所以這些參數(shù)可以通過對(duì)系統(tǒng)切應(yīng)變速率的制約來限定。
在空心纖維膜裝置中，通過纖維腔隙的血流將經(jīng)受沿著腔隙軸向的壓力降低。實(shí)際上，這種軸向壓力降的大小受材料和設(shè)備條件的限制。這種制約可能將纖維的內(nèi)徑，纖維長(zhǎng)度和纖維的數(shù)量限制到可接受的尺寸。
在空心纖維膜裝置內(nèi)，通過膜纖維壁內(nèi)微孔的濾液流將經(jīng)受沿著微孔軸向的壓力降低。實(shí)際上，這種跨膜壓力降的大小也受材料和設(shè)備條件的限制，并且，這種制約可能將纖維壁的厚度限制到可接受的尺寸。
更進(jìn)一步地，在空心纖維膜裝置中，以對(duì)流占優(yōu)勢(shì)傳輸比以擴(kuò)散占優(yōu)勢(shì)傳輸更優(yōu)選。對(duì)流傳輸以一種便于最優(yōu)化未被占據(jù)的結(jié)合位點(diǎn)與靶溶解物之間相互作用的方式，促進(jìn)靶溶解物均勻地在整個(gè)膜多孔基質(zhì)中傳遞。值得注意的是，由對(duì)流占優(yōu)勢(shì)傳輸?shù)挠H和性膜設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致形成了更有效的裝置(即治療可以在盡可能最短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行)。對(duì)流和擴(kuò)散作用的相對(duì)貢獻(xiàn)可以通過系統(tǒng)的Peclet系數(shù)(number)來表示，其數(shù)值大于40表明傳輸是由對(duì)流占優(yōu)勢(shì)。見Suen & Etzel“數(shù)學(xué)分析”。
并且，在空心纖維親和性膜裝置中，制造條件可能限制該裝置的物理尺寸，并隨后可能對(duì)某些參數(shù)形成制約。例如，如下參數(shù)可能受到制約纖維壁厚度，纖維內(nèi)徑，纖維長(zhǎng)度和纖維數(shù)量。
對(duì)于用作體外治療的空心纖維膜裝置，為了病人的安全，將嚴(yán)格控制體外血液總?cè)萘?。因此，纖維壁厚度，纖維內(nèi)徑，纖維長(zhǎng)度和纖維數(shù)量可能受到這種約束的限制。
除了設(shè)計(jì)最佳的纖維膜之外，還必須仔細(xì)選擇化學(xué)連接技術(shù)，并使之最優(yōu)化(另有敘述)，以便得到盡可能最高的結(jié)合能力。這將導(dǎo)致對(duì)膜和配體的最有效地利用。
如果按圖1構(gòu)成本裝置，必須有足夠的纖維長(zhǎng)度，這樣除了為滿足在前進(jìn)方向(血漿從纖維腔隙流向套管側(cè))充分地捕獲靶溶解物的需要之外，血漿還能返回纖維腔隙并排出本裝置。必須增加的纖維長(zhǎng)度取決于所采用的多聚體膜的滲透性和厚度。
對(duì)于給定的一系列治療要求，以單通道模型(single pass mode)運(yùn)行的單一裝置設(shè)計(jì)參數(shù)，有可能不能滿足受上述系統(tǒng)制約所支配的治療要求。在這樣一些情況下，通過在治療過程中周期性地洗脫靶溶解物而使膜裝置再生的方法，有可能使該裝置能滿足受系統(tǒng)制約的治療要求。為了避免在再生過程中中斷治療，在治療中可采用二臺(tái)裝置，這樣可以一臺(tái)用于結(jié)合或修飾溶解物，而另一臺(tái)可同時(shí)進(jìn)行再生處理。
本發(fā)明者用表示上述要求和制約的如下公式，計(jì)算了適合于各種靶溶解物的空心纖維尺寸，用以作為范例而不是限制。
適當(dāng)尺寸的范例待清除靶溶解物的量由治療要求控制待清除量＝V(Co-Cf)在此V＝靶溶解物的分布容積Co＝靶溶解物的起始濃度Cf＝靶溶解物的最后濃度親和性膜裝置的總?cè)萘康扔诒热萘?Cp)乘以膜容積總?cè)萘浚絒(r+d)2-r2]πLNCp在此r＝空心纖維半徑d＝空心纖維壁厚度L＝空心纖維長(zhǎng)度N＝空心纖維數(shù)量對(duì)于親和性膜裝置尺寸的首位要求是，親和性膜裝置的總?cè)萘勘仨毐却宄看骩(r+d)2-r2]πLNCp＞V(Co-Cf)(1)為在某一治療時(shí)間(t)內(nèi)達(dá)到最后靶溶解物濃度所要求的容積流速(Qf)，可從對(duì)靶溶解物的質(zhì)量平衡來計(jì)算。
假定在單通道設(shè)計(jì)中(即一種優(yōu)選設(shè)計(jì)的膜)溶解物被完全吸附，這種要求可借助如下公式給出Qf=-VClnCfCo----(2)]]>假定通過膜的流速是濃度極化作用限制性的，理想的濾液流速可從如下關(guān)系式預(yù)測(cè)(見Zydney et al，“濃度極化作用模型”)QfQb=1·HCwe[ln0.95He·B]----(3a)]]>在此B=2.0×10-5[Lr3]2/3----(3b)]]>并且Qb＝入口血流速度H＝入口血液血細(xì)胞比容(B的單位與L和r一致，以cm表示)通過適當(dāng)?shù)剡x擇結(jié)合靶物質(zhì)的配體，膜材料和將配體附著于膜所采用的化學(xué)方法，可以使對(duì)某一給定靶溶解物的比容量(Cp)達(dá)到最大值。
在公式(1)至(3)中出現(xiàn)的其余設(shè)計(jì)參數(shù)是裝置的尺寸r，d和L，以及纖維的數(shù)量(N)。如前面已論述，這些設(shè)計(jì)參數(shù)將服從于許多制約因素。
對(duì)r的制約因素之一是可容許的最大壁切應(yīng)變速率，由下式給出
對(duì)r的另一個(gè)制約因素是可容許的最大軸向壓力降
在此 μb＝血液粘度L不僅受制于上述的壓力降限度，而且受制于如下對(duì)裝置整體物理尺寸的實(shí)際制約因素Nπ(r+d)2＜78.5cm2(6)厚度(d)不僅受制于上述的制約因素，而且受制于Peclet系數(shù)制約因素和跨膜壓力制約因素vdD>40----(7)]]>在此D是靶溶解物的擴(kuò)散系數(shù)，而濾液速度V由下式給出v=Qf2πrNL----(8)]]>跨膜壓力差可以借助用于填充床的Blade-Kozeny公式來確定(見Bird，Stewart，Lighfoot，“傳輸現(xiàn)象”(1960))。此公式是如下ΔPtransmembrane=150vdμf(1-∈)2DP2∈2----(9)]]>在此μf＝濾液的粘度Dp＝膜孔直徑＝0.25微米ε＝膜孔隙度＝0.7將上述各公式用于設(shè)計(jì)要求和制約因素，本發(fā)明者已確定，親和性膜裝置的空心纖維應(yīng)具有的壁厚度大約為300-3500微米，內(nèi)徑大約為70-140微米。
除了確定用于設(shè)計(jì)適當(dāng)空心纖維膜的最佳設(shè)計(jì)程序外，本發(fā)明的發(fā)明者還確定了一種改進(jìn)的方法，用于將配體結(jié)合在親和性膜裝置中微孔的表面。這種改進(jìn)的方法導(dǎo)致增加了裝置的效率，對(duì)配體更高的利用率，更高的膜標(biāo)準(zhǔn)化程度，更簡(jiǎn)便，并導(dǎo)致了對(duì)市場(chǎng)的適應(yīng)性和系統(tǒng)的靈活性。膜標(biāo)準(zhǔn)化程度指的是，對(duì)可得到的多種配體采用的固相化方法，使之標(biāo)準(zhǔn)化的能力。
如前面已提及到，以前開發(fā)的溶解物清除裝置，膜形式的或者是微珠柱形式的，都著眼于清除單一的靶溶解物。以這樣一種目的，開發(fā)者通常是使他們的清除系統(tǒng)僅對(duì)感興趣的專一配體-靶對(duì)最佳化，而忽略了對(duì)其它配體-靶對(duì)是否適用的問題。用于將配體偶聯(lián)于支持基質(zhì)的化學(xué)固相化技術(shù)也是非常專一，實(shí)際上不能轉(zhuǎn)向用于其它配體。
根據(jù)本發(fā)明，在實(shí)施方案中，采用了包括抗生物素蛋白和生物素的固相化程序。使用特殊的化學(xué)固相化技術(shù)將抗生物素蛋白偶聯(lián)在膜表面。這種方法可標(biāo)準(zhǔn)化地用于許多可得到的配體。在通過將生物素分子連接于配體的連接化學(xué)中保持了系統(tǒng)的靈活性。
本發(fā)明獨(dú)特的抗生物素蛋白/生物素化學(xué)固相化技術(shù)按如下進(jìn)行。使一個(gè)或多個(gè)生物素分子與配體共價(jià)連接。將抗生物素蛋白共價(jià)地連接于膜微孔的表面?？股锼氐鞍缀蜕锼氐倪@種各自相應(yīng)的連接可用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。然后，使生物素化的配體與包含固相化抗生物素蛋白的膜發(fā)生反應(yīng)，從而導(dǎo)致將生物素化的配體固相化在膜上。
圖5用圖解法顯示用抗生物素蛋白/生物素復(fù)合物固相化配體，以及捕捉靶溶解物。將生物素化的配體40被連接于固相化在膜微孔表面44的抗生物素蛋白。如圖中所示，生物素化的配體40然后能夠自由地從血漿液中捕捉靶分子46。
值得注意的是，形成的抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物表現(xiàn)出相當(dāng)大的穩(wěn)定性。抗生物素蛋白和生物素之間的相互作用，是已知的蛋白質(zhì)和配體之間最強(qiáng)的非共價(jià)生物學(xué)相互作用(Ka＝1015M-1)。而且，生物素和抗生物素蛋白之間的鍵形成非?？?，并且，一旦形成就不受相差甚遠(yuǎn)極端pH的影響，也不易受到溫度，有機(jī)溶劑和其它變性劑的影響。例如，生物素-抗生物素蛋白復(fù)合物可經(jīng)受高達(dá)80℃的溫度，以及2-13的pH范圍。
關(guān)于生物素對(duì)配體的結(jié)合，許多可購得的生物素衍生物都能使生物素通過多種功能基團(tuán)共價(jià)地與配體偶聯(lián)。例如，生物素可被偶聯(lián)至蛋白質(zhì)配體中的特異性位點(diǎn)，包括含有末端氨基的(賴氨酸)，含有咪唑基的(組氨酸)，含有苯酚基的(酪氨酸)，或者含有巰基的(半胱氨酸)特異性氨基酸殘基。此外，生物素衍生物還可用于偶聯(lián)存在于糖或哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)中的糖基。這種化學(xué)技術(shù)，能夠有效地將生物素偶聯(lián)于例如免疫球蛋白G(IgG)不干擾抗原結(jié)合的位點(diǎn)。這種化學(xué)靈活性為將生物素結(jié)合于配體提供了許多可能的方法，并且對(duì)所研究的配體增加了得到適當(dāng)方法的機(jī)會(huì)。
由于其分子結(jié)構(gòu)，抗生物素蛋白對(duì)膜表面的結(jié)合可保證對(duì)配體的有效利用?？股锼氐鞍资且环N四聚體蛋白質(zhì)，并且每個(gè)分子能夠以同等的親和性結(jié)合最多可達(dá)四分子生物素。這種存在于每個(gè)抗生物素蛋白分子的多功能度，可保證被固相化的抗生物素蛋白仍然保留一些結(jié)合生物素的能力。蛋白質(zhì)非特異性固相化到固體基質(zhì)，通過或者是與蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)反應(yīng)，或者是活性位點(diǎn)與溶液中靶分子的空間屏蔽作用，通常導(dǎo)致在此表面的蛋白質(zhì)的某些部分失活。如果抗生物素蛋白分子是對(duì)稱的，對(duì)固體表面的固相化作用將使一個(gè)或幾個(gè)可能的生物素結(jié)合位點(diǎn)失活；但是，這也能保證一個(gè)或幾個(gè)結(jié)合位點(diǎn)將仍然有活性，并且能夠自由地結(jié)合生物素或生物素化配體。
通向制備活性親和性膜的最后步驟是形成抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物。優(yōu)選地，這種形成過程可通過使含有固相化抗生物素蛋白的膜與含有生物素化配體的溶液反應(yīng)來進(jìn)行。這種反應(yīng)進(jìn)行迅速，并且可在溫和的條件下進(jìn)行，例如在室溫下在透析緩沖液中進(jìn)行。特別是，因?yàn)榇朔磻?yīng)步驟既簡(jiǎn)單又直接，所以本發(fā)明者相信，可以想象，任何一個(gè)使用者都可能以所選擇的生物素化配體來活化抗生物素蛋白膜。
使最終使用者都能活化親和性裝置膜的能力，提供了顯著優(yōu)于以前系統(tǒng)的優(yōu)越性。除了方法的簡(jiǎn)便性之外，本發(fā)明的這方面還提供了更高的系統(tǒng)靈活性和膜標(biāo)準(zhǔn)化程度，這樣又進(jìn)步導(dǎo)致對(duì)市場(chǎng)的適應(yīng)性。按照本發(fā)明，最終使用者都能得到一種單一的抗生物素蛋白膜和多種含有不同的生物素化配體的溶液。于是，取決于將被治療的病癥，使用者可以用適當(dāng)?shù)呐潴w活化抗生物素蛋白膜，并用生理鹽水或透析液洗去剩余的配體。
除了在化學(xué)固相化過程中發(fā)揮作用之外，抗生物素蛋白還有作為膜表面和固相化配體之間的親水性隔離物的作用。使用分子隔離物將固體基質(zhì)表面與配體的活性位點(diǎn)作物理學(xué)上的分離，是化學(xué)固相化技術(shù)中熟知的。關(guān)于這方面，分子隔離物通常是相對(duì)較短的脂肪鏈(長(zhǎng)度4-10個(gè)碳原子)，這對(duì)促進(jìn)表面的相互作用，或者促進(jìn)涉及小配體或靶溶解物的相互作用是適宜的。但是，當(dāng)這種相互作用涉及到一個(gè)或多個(gè)大分子時(shí)，這些短鏈隔離物是相當(dāng)無能為力的。另一方面，使用更長(zhǎng)的脂肪鏈令其不利地改變膜表面的疏水性。因此，按本發(fā)明使用抗生物素蛋白，不但提供了改進(jìn)的固相化程序，并且它還具有作為隔離物分子而不表現(xiàn)上述隔離物缺點(diǎn)的雙重作用。
在絕大多數(shù)情況下，抗生物素蛋白將是適合的隔離物分子，但是，使用抗生物素蛋白的潛在缺點(diǎn)是，當(dāng)配體和靶分子都相當(dāng)小時(shí)抗生物素蛋白引起的密度限制。在這種情況之下，抗生物素蛋白的飽和單層可能是膜結(jié)合溶解物的比容量有關(guān)的限制因素。但是，在絕大多數(shù)情況下，無論配體還是它的靶分子，或者它們二者都是足夠大，以至使抗生物素蛋白的飽和限制對(duì)膜容量不是限制因素。
在本發(fā)明中，本發(fā)明者還公開了用于在親和性膜裝置中將配體結(jié)合于微孔表面的第二種改進(jìn)方法。這種改進(jìn)的方法導(dǎo)致形成了更高效率的裝置，對(duì)配體更大的利用率，以及更高的裝置容量。
如上面所述，使用分子隔離物便利了固相化配體和靶溶解物之間的分子相互作用。相對(duì)較短的脂肪鏈(長(zhǎng)度4-10個(gè)碳原子)對(duì)涉及一個(gè)或幾個(gè)大分子的相互作用是無能為力的，而較長(zhǎng)的脂肪鏈又會(huì)不期望地改變膜表面的疏水性。
按照本發(fā)明，在一個(gè)實(shí)施方案中，其固相化程序使用了聚乙二醇(PEG，也稱為聚乙烯氧化物)。應(yīng)用特殊的化學(xué)固相化技術(shù)，可將適當(dāng)鏈長(zhǎng)度的聚乙二醇，通常是50至250個(gè)碳原子之間長(zhǎng)度的聚乙二醇共價(jià)地固相化在膜表面。在封閉剩余的活性位點(diǎn)之后，接著可以應(yīng)用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)方法將所需要的配體與聚乙二醇共價(jià)偶聯(lián)。聚乙二醇作為分子隔離物的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)是它的親水性和生物學(xué)惰性，這二點(diǎn)對(duì)于接觸血液或血漿的裝置都非常有利。
作為范例而不是限制，下面將對(duì)簡(jiǎn)便的雜官能(heterofunctional)PEG固相化方法進(jìn)行描述，雜官能PEG可從供應(yīng)商購得，它的一端具有氨基末端，另一端具有羧基末端。應(yīng)用與氨基反應(yīng)的許多適合的化學(xué)固相化方法中的任何一種，可以將雜官能PEG通過它的氨基末端固相化在膜表面。如上面所述，這些方法包括那些應(yīng)用溴化氰，N，N′-羰基二咪唑等的方法。在封閉剩余的活性基團(tuán)之后，應(yīng)用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)方法將所需要的配體共價(jià)地偶聯(lián)于此雜官能PEG的羧基末端。能促進(jìn)在羧基和胺之間形成酰胺鍵的這樣一種試劑，是1 乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺。
應(yīng)用PEG的固相化方法具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。首先是，使用一個(gè)非常長(zhǎng)的分子鏈可減少在表面的空間干擾，并可使大分子在表面分成多層。例如，據(jù)我們應(yīng)用抗生物素蛋白-生物素化學(xué)法的經(jīng)驗(yàn)，抗生物素蛋白的存在將抗體-LDL的相互作用投射至遠(yuǎn)離膜表面，但是膜的總?cè)萘咳匀皇艿娇捎糜谠谄浔砻娼Y(jié)合LDL顆粒的表面面積的限制。通過從膜表面延伸長(zhǎng)而易揉曲的鏈，抗體被伸出遠(yuǎn)離膜表面，按這樣一種方式可允許靶大分子堆積起來。鄰近的鏈可能是相同長(zhǎng)度的，但是通過伸展程度不同，與LDL結(jié)合的部分卷曲的鏈，不可能干擾LDL對(duì)附近完全伸展鏈的結(jié)合。
盡管抗生物素蛋白也能使抗體伸出遠(yuǎn)離膜表面，但是，一個(gè)長(zhǎng)而向易揉曲的隔離物可能更有效地使抗體伸入到流動(dòng)的液體之中，從而提高結(jié)合的動(dòng)力學(xué)，并增加容量。
值得注意的是，盡管PEG途徑顯得具有許多優(yōu)勢(shì)，但是使用PEG的化學(xué)途徑本身可能不具有抗生物素蛋白-生物素模式的化學(xué)適應(yīng)性。因此，既使用PEG的同時(shí)使用抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物可能是有益的。按照這樣一種途徑，抗生物素蛋白將被偶聯(lián)于已固相化在膜表面的PEG。然后將如上所述的抗生物素蛋白-生物素化學(xué)技術(shù)用于配體的固相化。
作為范例而不是限制，下面將列舉可說明某些示范性固相化技術(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。值得注意的是，這些范例顯示了各種在平面膜片上進(jìn)行的固相化作用，不同于在空心纖維膜上的固相化作用。在此引入這些范例，用于證明按照本發(fā)明開發(fā)改進(jìn)的固相化模式。如下的范例主要是用于化學(xué)連接的材料不同(1)抗生物素蛋白，(2)鏈霉抗生物素蛋白，和(3)聚乙二醇。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1針對(duì)人載脂蛋白B(apo B)的綿羊免疫球蛋白G(IgG)，通過親和層析法分離后用偏高碘酸鈉(Sigma Chemical Co.，St.Louis.MO)氧化。用甘油使反應(yīng)淬滅，并通過凝膠滲透層析法從反應(yīng)產(chǎn)物中分離出氧化的IgG。通過與生物素-LC-酰肼(Pierce，Rockford，IL)反應(yīng)使氧化的IgG生物素化。
按照廠商說明書中的擴(kuò)散性固相化程序，將抗生物素蛋白(Pierce)固相化在Immobilon AV膜(Millipore)上。末反應(yīng)的位點(diǎn)以脫脂干乳溶液(1％ w/w)掩蓋。將包含有固相化抗生物素蛋白的膜浸泡在含有生物素化IgG的溶液中。被固相化在膜上的IgG量，可以從溶液中在280毫微米光吸收度的改變來確定。IgG的密度是每ml膜容積143μg。
靜止膜容量是通過將該膜在含有過量apoB的人血漿溶液中溫育來確定。用緩沖液(磷酸鹽緩沖鹽水，pH7.4)粗略地漂洗之后，以0.04M檸檬酸緩沖液在pH2.9從膜上洗脫apoB。借助于總蛋白測(cè)定法(從BioRad可購得試劑盒)測(cè)定存在于洗脫緩沖液中的apoB含量。
所形成的膜容量是每ml膜容積31μg apoB。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2如實(shí)施例1中所述制備氧化的IgG。按照廠商說明書中的擴(kuò)散性固相化程序，將鏈霉抗生物素蛋白(Pierce)固相化在Immobilon AV膜(Millipore Corporation，Bedford，MA)上。末反應(yīng)的位點(diǎn)以無脂干乳液(1％w/w)掩蓋。將包含有固相化鏈霉抗生物素蛋白的膜浸泡在含有生物素化IgG的溶液中。被固相化在膜上的IgG量，可以從溶液中在280毫微米光吸收度的改變來確定。IgG的密度是每ml膜容積1.39mg。
按在實(shí)施例1中所述，對(duì)靜止膜容量進(jìn)行測(cè)定。所形成的膜容量是每ml膜容積30μg apoB。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3如實(shí)施例1中所述制備氧化的IgG。按照廠商說明書中的斑點(diǎn)固相化程序，將雜官能聚(乙二醇)(NH2-PEG-COOH，從ShearweterPolymer，Huntsville，AL購得)固相化在Immobilon AV膜上。未反應(yīng)的位點(diǎn)以乙醇胺(7％ v/v)掩蓋。在1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺(“EDC”)存在下使固相化的聚(乙二醇)(“PEG”)與己二酰肼反應(yīng)，產(chǎn)生用于連接氧化IgG的功能位點(diǎn)。使用氧化的IgG與PEG-酰肼隔離物偶聯(lián)，再將生成的Schiff堿以氰基氫硼化鈉還原。此膜在使用前以蒸餾水和1M NaCl溶液漂洗。
可通過使人血漿液流過一個(gè)包含有一疊膜園片的膜園片小盒(從Amicon購得)來測(cè)定動(dòng)態(tài)膜容量。提供給膜園片的人血漿內(nèi)包含有過量的apoB。一疊膜園片的數(shù)量范圍是5-20片。根據(jù)從小盒流出的樣品和起始樣品之間血漿apoB的濃度之差，可確定與膜結(jié)合的apoB量。血漿apoB的濃度可用商購檢測(cè)試劑盒(可從Boehringer MannheimCorporation，Indianapolis，IN購得)測(cè)定。
所形成的膜容量范圍為每ml膜容積0.39-2.03mg apoB。
本發(fā)明還提供了一種用于治療某些疾病的方法，而這些疾病是以血中某一特殊溶解物過高含量為特征的。如以前已提及，本發(fā)明的親和性膜裝置是設(shè)計(jì)用于體外血液循環(huán)的，并可同用于凈化血液的其它治療過程，如血液透析同時(shí)應(yīng)用。通過應(yīng)用本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)的免疫吸附治療，對(duì)某些病癥可作為有效的治療方案。具體地說，本發(fā)明可用于治療與血漿中存在某一特殊的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)的病癥，對(duì)這種分子的清除是對(duì)此病癥作暫時(shí)治療或根治的基礎(chǔ)。除了識(shí)別血漿中的靶分子之外，根據(jù)其對(duì)能夠從血漿中結(jié)合并清除這種靶分子的適合配體的識(shí)別能力，還預(yù)示本發(fā)明可用于治療這類病癥。
作為范例而不是限制，根據(jù)本發(fā)明可能治療的病癥實(shí)例包括血膽固醇過多癥，與IgG或IgM相關(guān)的移植排斥反應(yīng)，Goodpastures氏綜合癥，全身性脈管炎，以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡。這些病癥的每一種都與血中含有過量的某種特殊溶液物為特征。例如，患有家族性血膽固醇過多癥的病人，其特征是血中具有高濃度的低密度脂蛋白(LDL)，清除LDL將對(duì)這種病癥發(fā)揮有效的治療作用。
根據(jù)本發(fā)明，這種親和性膜裝置不但可用于清除待治療病人血中的靶溶解物，而且還可以與其它分離過程(如血液透析)同時(shí)應(yīng)用。關(guān)于這方面，對(duì)于正在接受血液透析治療晚期腎病(ESRD)病人，某些治療應(yīng)用可以優(yōu)選地采用。這些治療應(yīng)用包括例如，體外清除LDL，β2-微球蛋白，以及同種異體移植接受者的IgG。這些病人理想地適合這種體外治療，因?yàn)樵S多病人已經(jīng)接受了每周3次，每次3-4小時(shí)的。體外血液透析治療。并且，許多這種病人已經(jīng)接受了外科手術(shù)，對(duì)他們的血管系統(tǒng)形成了允許使用高血液流速(＞200ml/min)的進(jìn)出通道。
本發(fā)明與血液透析過程同時(shí)應(yīng)用的能力必然顯示出許多優(yōu)點(diǎn)。通常，體外治療要求病人有專用的時(shí)間保證，需要醫(yī)務(wù)人員準(zhǔn)備好血管進(jìn)出通道并操縱儀器，還涉及與血管進(jìn)出通道有關(guān)的醫(yī)療危險(xiǎn)。通過把本發(fā)明的溶解物清除過程與血液透析結(jié)合起來，既不增加總的治療時(shí)間，也沒有任何附加的要求，或承擔(dān)比血液透析治療本身更多的危險(xiǎn)。
因?yàn)閷?shí)施親和性膜治療需要血流的進(jìn)出通道，所以，可能特別適合于定期接受體外血液處理如血液透析的病人。而且，如下面所述，透析處理病人患有的嚴(yán)重病癥，通過用親和性膜裝置治療可能會(huì)有改善。對(duì)于尚沒有血液進(jìn)出通道可容易利用的病人，使用親和性膜治療應(yīng)限于那樣一些病癥，對(duì)其實(shí)施治療的好處勝于血液進(jìn)出通道的危險(xiǎn)。下面將對(duì)這種非透析應(yīng)用的實(shí)例作更詳細(xì)論述。
作為范例而不是限制，下面將列舉顯示應(yīng)用本發(fā)明親和性膜裝置方法的一個(gè)實(shí)例。
在開始透析之前，實(shí)施外科手術(shù)，形成一個(gè)永久性的血液進(jìn)出通道位置(人工動(dòng)靜脈移植，或者動(dòng)靜脈吻合，即動(dòng)脈和靜脈的手術(shù)接合)。透析過程典型地是采用雙針程序進(jìn)行，具有分開的線路供血液抽取和返回。將親和性裝置與透析器串聯(lián)相連，并與透析循環(huán)的剩余部分一起注入生理鹽水。根據(jù)病人一貫的抗凝方式對(duì)血液進(jìn)行抗凝處理。在透析過程中，用蠕動(dòng)泵以200-500ml/nin的流速將血液泵入透析器。因?yàn)橛H和性膜裝置是與透析器串聯(lián)相連，它的血流速度與病人規(guī)定用于透析的血流速度相等。為了盡量減小與正常透析程序的差異，使親和性裝置按照病人通常透析治療的時(shí)間運(yùn)行，一般是一周3次，每次3-4小時(shí)。取決于待清除的靶配體量，親和性裝置可能在部分或者全部透析過程中使用。
作為范例而不是限制，可能借助于親和性膜裝置改善的透析病人病癥的例子是，淀粉樣變性，血膽固醇過多癥，以及移植排斥反應(yīng)。
長(zhǎng)期透析的病人令遭受關(guān)節(jié)痛和其它淀粉樣變性癥狀之后，據(jù)認(rèn)為是由于在關(guān)節(jié)和其它組織中β-2微球蛋白長(zhǎng)期積累所致。β-2微球蛋白是一種小分子量蛋白質(zhì)，正常情況下它是從體內(nèi)所有具核細(xì)胞的細(xì)胞膜流出。通常，在從血漿中清除過多的β-2微球蛋白的過程中，腎起了決定性的作用。在腎功能缺乏的情況下，血漿中β-2微球蛋白的濃度逐漸上升，最高達(dá)到其正常值的50倍。高血漿濃度導(dǎo)致β-2微球蛋白轉(zhuǎn)移進(jìn)入各種組織。對(duì)透析病人，通過用親和性膜處理，定期清除β-2微球蛋白，將使血漿中β-2微球蛋白的濃度降低。較低的平均血漿濃度將減少從血漿向組織的轉(zhuǎn)移，并可能導(dǎo)致從組織中被清除。
導(dǎo)致透析病人死亡的原因是心血管病，而不是腎臟病。在一般的人群中，已知高LDL濃度是心血管病的危險(xiǎn)因素。因?yàn)橄喈?dāng)大部分透析病人具有高LDL濃度，所以本發(fā)明者相信，透析病人心血管病發(fā)病率和死亡率的高危險(xiǎn)，可部分地歸因于它們的高LDL濃度。對(duì)于具有高LDL濃度值的病人，通過在透析過程中用親和性膜處理，將降低LDL濃度，從而降低發(fā)病率和死亡率的危險(xiǎn)。
典型的腎移植受者在等待得到供體器官時(shí)，需靠透析維持幾個(gè)月之久。對(duì)于同種異體移植(即人器官對(duì)人受者)，清除免疫球蛋白G(IgG)可以降低急性器官排斥反應(yīng)發(fā)生率和/或嚴(yán)重程度，從而改善整體移植存活率。因此，使用親和性膜在臨移植之前清除IgG，將降低移植時(shí)的IgG水平，從而減少移植排斥反應(yīng)的危險(xiǎn)性。
對(duì)于沒有制備永久性血液進(jìn)出通道的病人，可在適當(dāng)?shù)牟课恢苽渑R時(shí)性血流進(jìn)出通道(例如，通過在鎖骨下靜脈插入雙通(dual lumen)導(dǎo)管)。將親和性裝置的腔隙端與蠕動(dòng)泵相連接，并注入生理鹽水。在腔隙端被灌注之后，將濾出液出口打開，使之對(duì)套管端進(jìn)行灌注。然后，當(dāng)裝置注入血液時(shí)，將濾出液導(dǎo)管夾住。為防止血液凝結(jié)，在步驟開始時(shí)應(yīng)以大丸劑加入抗凝劑(用注射器或泵)，并且/或者在整個(gè)操作過程中持續(xù)地加入抗凝劑(通過泵)。因?yàn)檠毫魉偈芘R時(shí)性進(jìn)出通道的容量所限制，最大的血液流速應(yīng)在100-300ml/min的范圍內(nèi)。為了按照?qǐng)D2中描繪的本發(fā)明實(shí)施方案運(yùn)行，可在血液充滿腔隙端之后將濾出液出口打開。如前面所述，靶物質(zhì)在血漿和血液中的濃度將降低。處理過程的時(shí)間和使用頻率取決于待清除靶配體的含量。
作為范例而不是限制，對(duì)于未進(jìn)行透析的病人，可使用親和性膜的三種病癥實(shí)例是，嚴(yán)重的血膽固醇過多癥，嚴(yán)重的移植排斥反應(yīng)，以及嚴(yán)重的自身免疫疾病。
血膽固醇過多癥的最嚴(yán)重形式是純合的家族性血膽固醇過多癥。如果不治療，這種病人通常在20歲左右致死。而較輕型的血膽固醇過多癥可能也沒有理由使用侵害性體外血液處理，患有純合的家族性血膽固醇過多癥的病人以前是用復(fù)雜和昂貴的親和性柱系統(tǒng)進(jìn)行治療。與親和性柱相比較，親和性膜提供了操作簡(jiǎn)便，費(fèi)用較低的潛在性優(yōu)點(diǎn)。通過使用本親和性裝置本發(fā)明者預(yù)期，降低LDL水平將導(dǎo)致增加概率壽命。
象透析病人一樣，其它器官移植的接受者也可以通過在移植之前清除免疫球蛋白而受益。如上所述，在進(jìn)行同種異體移植之前清除免疫球蛋白G(IgG)，可以降低急性器官排斥反應(yīng)的發(fā)生率和/或嚴(yán)重程度，從而改善總體移植存活率。
由于供移植的人器官非常缺乏，當(dāng)前正在研究異種移植(例如將豬的器官用于人受者)。清除引起超急性排斥反應(yīng)的免疫球蛋白M亞類(異種反應(yīng)性IgM)，可能是異種移植成功的關(guān)鍵所在。
對(duì)于自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡，是由于病人產(chǎn)生了針對(duì)其自身細(xì)胞的抗體。自身免疫性疾病的多種癥狀可能是由于自身抗體對(duì)特異性組織的作用，或者是由于從這些自身抗體形成的免疫復(fù)合物的積累。因此，通過使用親和性膜清除自身抗體和/或免疫復(fù)合物，將減少自身免疫性疾病的癥狀和并發(fā)癥。對(duì)于針對(duì)于腎臟的自身免疫性疾病，例如Goodpasture氏病和全身性脈管炎，清除自身抗體將延緩腎病的進(jìn)程，延緩或阻止對(duì)透析的需要。
應(yīng)該理解到，對(duì)于本領(lǐng)域的專業(yè)人員，在此所述的優(yōu)選實(shí)施方案的各種變化和修改形式將是顯然的。可能產(chǎn)生這些變化和修改形式而不脫離本發(fā)明的精髓和范圍，并且不減少其伴隨的優(yōu)越性。因此我們打算通過附加的權(quán)利要求來包括這些變化和修改形式。
權(quán)利要求
1.一種用于選擇性清除血液血漿中靶分子的親和性膜裝置包括一個(gè)細(xì)長(zhǎng)的外套腔，它具有供血液由此進(jìn)出的入口和出口，封裝在內(nèi)腔中的空心纖維，這些空心纖維具有的微孔具有適合于將血液分離成血漿和細(xì)胞成分的孔徑，這些微孔在其內(nèi)表面有固相化的配體，這些配體對(duì)血漿中的靶分子具有親和性，其中，在沒有外部泵存在用于產(chǎn)生橫跨空心纖維的血漿流的情況下，血液的細(xì)胞成分不能流入空心纖維的微孔，而血漿可借助于正向和反向過濾作用被傳輸進(jìn)入微孔。
2.權(quán)利要求1的裝置，其中的微孔孔徑范圍大約從0.2至0.6微米，
3.權(quán)利要求1的裝置，其中的空心纖維具有的壁厚度具有足夠表面積，用于連接配體，使之能充分地結(jié)合靶分子。
4.權(quán)利要求3的裝置，其中空心纖維壁厚度的范圍大約是300至3500微米。
5.權(quán)利要求1的裝置，其中的空心纖維具有大約70-140微米的內(nèi)徑。
6.權(quán)利要求1的裝置，其中的空心纖維是由選自如下種類的材料制成三醋酸纖維素，聚砜，聚丙烯腈，乙烯/乙烯醇共聚物，聚甲基異丁烯酸酯，聚酰胺，聚丙烯，醋酸纖維素，再生纖維素，聚碳酸酯，聚乙烯，聚乙烯醇，和聚氯乙烯。
7.權(quán)利要求1的裝置，其中是借助于抗生物素蛋白-生物素分子復(fù)合物將配體固相化在微孔的表面。
8.權(quán)利要求1的裝置，其中是借助于聚乙二醇將配體固相化在微孔的表面。
9.權(quán)利要求1的裝置，其中的配體是修飾靶分子的酶，并且當(dāng)靶分子一經(jīng)修飾時(shí)，能釋放出靶分子。
10.權(quán)利要求1的裝置，其中細(xì)長(zhǎng)的外套腔具有單獨(dú)的出口和單獨(dú)的入口。
11.權(quán)利要求1的裝置，還進(jìn)一步包括一根與細(xì)長(zhǎng)的外套腔連接的導(dǎo)管，使血漿中的非靶分子能借助于現(xiàn)存的壓力梯度與細(xì)胞成分重新結(jié)合。
12.一種用于選擇性地清除血漿中靶分子的方法，包括如下步驟提供一個(gè)空心纖維膜裝置，它配有(a)具有單獨(dú)入口和單獨(dú)出口供血液從此進(jìn)出的一個(gè)細(xì)長(zhǎng)的外套腔，以及(b)被封裝在此外套腔內(nèi)側(cè)的空心纖維，此空心纖維具有適當(dāng)孔徑的微孔，適合于將血液分離成血漿和細(xì)胞成分，此微孔具有結(jié)合于其內(nèi)表面的配體，此配體對(duì)血漿中的靶分子具有親和性，使血液傳輸進(jìn)入外套腔的入口，借助于正向和反相過濾作用，使血液中的血漿流入空心纖維的微孔，而不允許細(xì)胞成分流入微孔中，使血漿中的靶分子與配體接觸持續(xù)具有臨床意義的一段時(shí)間，使靶分子能夠與配體結(jié)合，以及使血漿中的非靶分子與血液的細(xì)胞成分重新結(jié)合。
13.權(quán)利要求12的方法進(jìn)一步還包括借助于正向和反向過濾作用，使非靶分子通過空心纖維的微孔流回與細(xì)胞成分重新結(jié)合，并通過出口排出此裝置。
14.權(quán)利要求12的方法另外還包括借助于現(xiàn)存的壓力梯度，使非靶分子經(jīng)過血漿導(dǎo)管與細(xì)胞成分重新結(jié)合。
15.權(quán)利要求12的方法，其中空心纖維中微孔孔經(jīng)的范圍為大約0.2至0.6微米。
16.權(quán)利要求12的方法，其中空心纖維壁厚度的范圍為大約300至3500微米。
17.權(quán)利要求12的方法，其中空心纖維具有大約70-140微米的內(nèi)徑。
18.權(quán)利要求12的方法，其中的空心纖維是由選自如下種類的材料制成三醋酸纖維素，聚砜，聚丙烯腈，乙烯/乙烯醇共聚物，聚甲基異丁烯酸酯，聚酰胺，聚丙烯，醋酸纖維素，再生纖維素，聚碳酸酯，聚乙烯，聚乙烯醇，和聚氯乙烯。
19.一種空心纖維膜包括許多細(xì)長(zhǎng)的空心纖維，每條纖維具有環(huán)繞形成一個(gè)腔隙的外周壁，此外周壁具有許多延伸貫通的微孔，微孔的數(shù)量和構(gòu)型對(duì)將血液分離成血漿和細(xì)胞成分是有效的，每個(gè)微孔具有結(jié)合于其內(nèi)表面的配體，并且具有提供足夠表面積用于結(jié)合配體的長(zhǎng)度尺寸，保證配體能基本上捕獲所有的靶分子。
20.權(quán)利要求19的空心纖維膜，其中的外周壁具有范圍大約300至3500微米的厚度。
21.權(quán)利要求19的空心纖維膜，其中的空心纖維具有大約70-140微米的內(nèi)徑。
22.權(quán)利要求19的空心纖維膜，其中的空心纖維是由選自如下種類的材料制成三醋酸纖維素，聚砜，聚丙烯腈，乙烯/乙烯醇共聚物，聚甲基異丁烯酸酯，聚酰胺，聚丙烯，醋酸纖維素，再生纖維素，聚碳酸酯，聚乙烯，聚乙烯醇，和聚氯乙烯。
23.權(quán)利要求19的空心纖維膜，其中的配體是借助于抗生物素蛋白/生物素分子復(fù)合物結(jié)合于微孔。
24.權(quán)利要求19的空心纖維膜，其中的配體是借助于聚乙二醇固相化在微孔的表面。
25.一種用于降低病人血中靶溶解物濃度水平的方法，此種病人患有以含有過高濃度靶溶解物為特征的病癥，此方法包括從病人取出全部血液，提供一個(gè)空心纖維膜裝置，它配有(a)具有單獨(dú)入口和單獨(dú)出口供血液從此進(jìn)出的一個(gè)細(xì)長(zhǎng)的外套腔，以及(b)被封裝在此外套腔內(nèi)側(cè)的空心纖維，此空心纖維具有許多延伸貫通的微孔，微孔的數(shù)量和構(gòu)形對(duì)將血液分離成血漿和細(xì)胞成分是有效的，這些微孔具有結(jié)合于其內(nèi)表面的配體，此配體對(duì)血漿中的靶溶解物具有親和性，使血液傳輸通過該空心纖維膜裝置，持續(xù)具有臨床意義的一段時(shí)間，以便基本上降低血漿中靶溶解物的濃度水平，并形成經(jīng)處理的血液產(chǎn)品，將這種經(jīng)處理的血液產(chǎn)品輸回病人。
26.權(quán)利要求25的方法，其中的配體是一種多克隆抗體。
27.權(quán)利要求25的方法，其中的配體是一種能結(jié)合自身抗體的自身抗原。
28.權(quán)利要求25的方法，其中的配體是一種酶。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于有效地清除血漿中靶分子的改進(jìn)的親和性膜裝置和方法。此親和性膜裝置被設(shè)計(jì)用于體外血液循環(huán),并且能夠與其它凈化血液的治療過程同時(shí)使用。本發(fā)明的裝置由如下結(jié)構(gòu)組成:具有特定尺寸和傳遞特性的空心纖維膜,固相化在空心纖維微孔表面的配體,以及一個(gè)封裝空心纖維,并允許血液適當(dāng)?shù)剡M(jìn)入和排出的外套腔。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,特定的化學(xué)固相化技術(shù)被用于將配體連接于空心纖維,達(dá)到最佳的功能效果。
文檔編號(hào)B01J20/28GK1196688SQ97190752
公開日1998年10月21日 申請(qǐng)日期1997年6月16日 優(yōu)先權(quán)日1996年6月20日
發(fā)明者N·J·奧夫蘇恩, P·J·索爾泰斯, K·A·格雷成 申請(qǐng)人:巴克斯特國(guó)際有限公司