用于體外溶血栓藥物效果分析的雙層微流控芯片及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于體外溶血栓藥物效果分析的微流控芯片及制備方法。該芯片以彈性聚二甲基硅氧烷為材料，采用塑模法制備，芯片為雙層結(jié)構(gòu)，含有一條主管道、四個(gè)進(jìn)液孔和兩個(gè)微閥門。通過在芯片主管道內(nèi)模擬人血管中血栓團(tuán)塊的真實(shí)狀態(tài)，僅需要微量的血液和溶血栓藥物即可實(shí)現(xiàn)對藥物溶栓效果的分析。本發(fā)明具有結(jié)構(gòu)簡單、制造成本低、樣品消耗少和檢測精度高的特點(diǎn)，適合于溶血栓藥物的溶栓效果分析及藥物篩選的應(yīng)用。
【專利說明】
用于體外溶血栓藥物效果分析的雙層微流控芯片及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)檢測分析領(lǐng)域，具體涉及一種用于體外溶血栓藥物效果分析的雙層微流控芯片及制備方法，并提供了該芯片的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]血栓為血管內(nèi)表面由于血液的凝固或血液成分相互粘結(jié)而形成的固體質(zhì)塊，血栓類疾病一般是由于凝血、抗凝和纖溶系統(tǒng)失衡或凝血機(jī)制被過度激活而形成的。血管內(nèi)產(chǎn)生的血栓會導(dǎo)致血流速度變慢或瘀滯、心血管內(nèi)膜損傷甚至血液性質(zhì)的改變，從而導(dǎo)致多種嚴(yán)重疾病的發(fā)生如心肌梗塞和腦卒中等，極大地危害著人類健康。因此，針對體內(nèi)已形成的血栓，就需要盡快利用藥物進(jìn)行溶栓治療?，F(xiàn)有的溶栓藥物多為纖維酶原激活物或類似物，被激活的纖維酶可以將血栓中的纖維蛋白從精氨酸-賴氨酸鍵上分解成可溶性產(chǎn)物，如鏈激酶和組織纖維溶酶原激活劑等。
[0003]為了研究血栓的形成機(jī)制以及對溶栓藥物進(jìn)行直觀的藥效評價(jià)，就需要建立有效的體外血栓及溶栓模型，用以在活體外模擬血栓的形成和溶栓過程。通過向血栓模型中施加溶栓藥物，再利用已有的溶栓產(chǎn)物檢測方法，如重量測定法、長度測定法、溶解產(chǎn)物D-二聚體濃度測定法和體外測定儀法等，就可以快速、高效地對藥物的溶栓效果進(jìn)行分析。
[0004]當(dāng)前已有的體外血栓模型均是采用合適的動物或人類的血液為原料，將血液進(jìn)行靜置自凝或加入凝血酶處理使其形成血液凝塊，相應(yīng)的技術(shù)方法主要分為靜止模型法和流體模型法，對應(yīng)的設(shè)備有血栓環(huán)(環(huán)形塑料管)和硅膠管(人工血管)等。但目前已有的這些血栓及溶栓模型技術(shù)方法均存在較大的缺陷:(I)靜止模型法將靜置凝固后的血液凝塊放置在特定容器中，滴加溶栓藥物進(jìn)行處理后，使其干燥再計(jì)算重量的差值。但是，這種方法在稱重過程中產(chǎn)生的誤差極大。此外，體積巨大的血液凝塊和靜態(tài)溶栓過程也與人體血管內(nèi)的真實(shí)流體內(nèi)環(huán)境有很大區(qū)別，靜態(tài)的血栓溶解反應(yīng)與處在血流流體狀態(tài)下的溶栓反應(yīng)有很大不同，很難考慮到影響血栓的多種因素，進(jìn)而影響整體溶栓評價(jià)結(jié)果的可信度；(2)流體模型法采用蠕動栗、硅膠管或聚乙烯袋及血栓裝置，可以初步模擬人體血液循環(huán)的動力學(xué)模型，但該類模型的組成和制作較為復(fù)雜、操作繁瑣且重復(fù)性較差，不利于臨床上的大規(guī)模普及應(yīng)用。因此，為了滿足現(xiàn)代溶栓機(jī)制及溶栓藥效研究的需要，目前亟需建立一種操作便捷和精確度高的新型體外血栓及溶栓模型。
[0005]近年來，微流控芯片技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域發(fā)展迅速，通過在芯片內(nèi)構(gòu)建微型反應(yīng)單元和操控單元，可以突破很多常規(guī)方法的技術(shù)瓶頸，開發(fā)出實(shí)用性很強(qiáng)的產(chǎn)品。目前，利用微流控芯片來進(jìn)行體外微血管血栓模擬和溶栓分析的研究尚處于空白。本發(fā)明的微流控芯片具有結(jié)構(gòu)簡單、操作便利和試劑消耗少的特點(diǎn)，可以滿足溶栓藥物效果評價(jià)的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種用于體外溶血栓藥物效果分析的雙層微流控芯片及制備方法，并提供該芯片的制備方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案為:
[0008]—種用于體外溶血栓藥物效果分析的雙層微流控芯片，該雙層微流控芯片包括液體流通管道層和微閥門控制層;所述的液體流通管道層包括一個(gè)氟化油/溶栓藥物進(jìn)液孔
1、一個(gè)血液進(jìn)液孔2、一個(gè)氟化油/溶栓藥物出液孔3、一個(gè)血液出液孔4和一條主管道5;進(jìn)液孔I和進(jìn)液孔2位于主管道5—側(cè)，出液孔3和出液孔4位于主管道5另一側(cè);所述的主管道5為光滑平直凹槽，長度為15.0mm，寬度為1.5mm，深度為40.0ym；所述的微閥門控制層包括兩個(gè)微閥門6，兩個(gè)微閥門6通過控制氣壓控制液體流通層中主管道5的開啟或閉合，微閥門6的閥門管道長度為3.0mm，寬度為400μηι，深度為40.Ομπι。
[0009]所述的雙層微流控芯片的材料為玻璃或光學(xué)透性良好且具有彈性的聚二甲基硅氧烷聚合物(PDMS)。所述的液體流通管道層和微閥門控制層的兩層PDMS分別經(jīng)過紫外照射I小時(shí)滅菌后，采用等離子體處理90秒，再相互對接進(jìn)行不可逆的封接鍵合而成。所述的微流控芯片內(nèi)的主管道和微閥門的數(shù)量均可根據(jù)待分析溶血栓藥物的檢測通量需要而增加或減少。
[0010]利用氟化油和新鮮血液(無需添加抗凝劑)，在微閥門的控制下，在微流控芯片的主管道內(nèi)形成如下狀態(tài):管道的半側(cè)是血液凝塊而另半側(cè)是空腔，以此可以模擬人血管內(nèi)血栓團(tuán)塊的真實(shí)狀態(tài)。將待分析的溶血栓藥物流動注入芯片主管道對血栓團(tuán)塊進(jìn)行溶解，由于微流控芯片內(nèi)的管道與人血管的尺寸接近，因此在芯片管道內(nèi)的藥物溶栓效果更接近于人血管內(nèi)的真實(shí)情況。將溶血栓產(chǎn)物進(jìn)行洗脫收集，從而對藥物的溶血栓效果進(jìn)行分析。
[0011]本發(fā)明的微流控芯片可以顯著降低試劑、血液和藥品的消耗量;芯片內(nèi)的微閥門可與計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)相連接對芯片內(nèi)的液體進(jìn)行精確操控。
【附圖說明】
[0012]圖1為微流控芯片結(jié)構(gòu)圖。
[0013]圖中:I氟化油/溶栓藥物進(jìn)液孔;2血液進(jìn)液孔;3氟化油/溶栓藥物出液孔;4血液出液孔;5主管道;6微閥門。
【具體實(shí)施方式】
[0014]圖1所示為用于體外溶血栓藥物效果分析的微流控芯片結(jié)構(gòu)圖，主要包含一條液體流通主管道和兩個(gè)微閥門。通過將氟化油和新鮮血液(血液中無需加入抗凝劑)分別由附圖1所示的I號孔和2號孔注入芯片內(nèi)，并充滿整個(gè)主管道(圖1中標(biāo)號為5)，兩種液體在管道內(nèi)保持層流狀態(tài)，待充滿整個(gè)管道并分別到達(dá)3號孔和4號孔后，向兩個(gè)微閥門(圖1中標(biāo)號為6)中增加氣壓(不超過20psi )，使得主管道被閥門封閉。室溫靜置15分鐘待血液凝固后，同時(shí)開啟兩個(gè)微閥門，通過I號向主管道內(nèi)增加氣壓，使得氟化油經(jīng)由3號孔排出芯片，即形成主管道的半側(cè)為凝固后的血液凝塊(圖1中標(biāo)號為5中的陰影部分)，而另半側(cè)為空氣(圖1中標(biāo)號為5中的空白部分)。將待檢測的溶栓藥物溶液通過I號孔注入充滿主管道并充滿整個(gè)管道后，向兩個(gè)微閥門(圖1中標(biāo)號為6)中增加氣壓封閉主管道，置于37°C靜置，使得溶栓藥物與血液凝塊發(fā)生溶栓作用。待反應(yīng)完成后，重新開啟兩個(gè)微閥門，通過I號孔注入空氣，將溶栓藥物與血液凝塊作用后的產(chǎn)物溶液排出主管道并收集，收集的溶液可進(jìn)行纖維蛋白原降解產(chǎn)物測定等后續(xù)的常規(guī)檢測，從而分析溶栓藥物的溶栓效果。
[0015]芯片所有的管道和微閥門均以PDMS為材料進(jìn)行制備，具體方法為:
[0016]1.硅片制備:將單晶硅片置于Piranha溶液(30%雙氧水和98 %濃硫酸按體積比3:7體積混合)，煮沸清洗30分鐘后，置于180°C烘焙10分鐘。
[0017]2.PDMS涂膠:將負(fù)光刻膠傾倒于硅片表面的中心位置，利用旋涂機(jī)進(jìn)行I分鐘甩涂，甩涂轉(zhuǎn)速為1800轉(zhuǎn)/分鐘。
[0018]3.前烘焙:將單晶硅片先于95°C靜置6分鐘，再于63°C靜置3分鐘。
[0019]4.紫外曝光:將帶有液體流通通道和微閥門結(jié)構(gòu)的掩膜板分別置于硅片表面，紫外曝光5分鐘(曝光波長365nm)。
[0020]5.硅片顯影:利用丙二醇甲醚酯酸酯對曝光后的單晶硅片進(jìn)行顯影10分鐘后，用異丙醇和去離子水清洗表面，氮?dú)獯蹈伞?br>[0021 ] 6.液體流通層構(gòu)建:將聚二甲基硅氧烷單體和固化劑按照體積比5:1混合，傾倒在經(jīng)三甲基氯硅烷處理后的液體流通層硅片模具表面，在恒溫加熱器上進(jìn)行80°C烘烤固化40分鐘，形成液體流通層芯片。
[0022]7.微閥門控制層構(gòu)建:將聚二甲基硅氧烷單體和固化劑按照體積比20:1混合，傾倒在經(jīng)三甲基氯硅烷處理后的微閥門控制層硅片模具表面，80°C烘烤固化40分鐘，形成微閥門控制層芯片。
[0023]8.芯片鍵合:將固化后的兩層PDMS分別與硅片模具剝離，經(jīng)打孔后，用氧離子體處理表面2分鐘后，進(jìn)行對合封接，再與玻璃基片貼合，80°C烘烤12小時(shí)，可形成鍵合牢固的完整芯片。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種用于體外溶血栓藥物效果分析的雙層微流控芯片，其特征在于，該雙層微流控芯片包括液體流通管道層和微閥門控制層； 所述的液體流通管道層包括一個(gè)氟化油/溶栓藥物進(jìn)液孔(I)、一個(gè)血液進(jìn)液孔(2)、一個(gè)氟化油/溶栓藥物出液孔(3)、一個(gè)血液出液孔(4)和一條主管道(5);氟化油/溶栓藥物進(jìn)液孔(I)和血液進(jìn)液孔(2)位于主管道(5)—側(cè)，氟化油/溶栓藥物出液孔(3)和血液出液孔(4)位于主管道(5)另一側(cè)；所述的主管道(5)為光滑平直凹槽，長度為15.0mm，寬度為1.5mm，深度為40.0ym ； 所述的微閥門控制層包括微閥門(6)，微閥門(6)通過控制氣壓控制液體流通層中主管道(5)的開啟或閉合;所述的微閥門(6)的閥門管道長度為3.0mm，寬度為400μηι，深度為40.0ym; 所述的雙層微流控芯片的材料為玻璃或聚二甲基硅氧烷聚合物PDMS; 所述的微流控芯片內(nèi)的主管道(5)和微閥門(6)的數(shù)量根據(jù)待分析溶血栓藥物的檢測通量確定。2.制備權(quán)利要求1所述的雙層微流控芯片的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)制備硅片:將單晶硅片置于Piranha溶液中煮沸清洗30分鐘后，在180°C條件下烘焙10分鐘;所述的Piranha溶液為30 %雙氧水和98 %濃硫酸按照體積比3:7混合而成的溶液； 2)PDMS涂膠:將負(fù)光刻膠傾倒于硅片表面的中心位置，用旋涂機(jī)進(jìn)行I分鐘甩涂，甩涂轉(zhuǎn)速為1800轉(zhuǎn)/分鐘； 3)前烘焙:將步驟2)得到的單晶硅片在95°C條件下靜置6分鐘后，再在63°C條件下靜置3分鐘； 4)紫外曝光:將帶有液體流通通道和微閥門結(jié)構(gòu)的掩膜板分別置于硅片表面，紫外曝光5分鐘，所述的紫外波長為365nm; 5)硅片顯影:利用丙二醇甲醚酯酸酯對曝光后的單晶硅片進(jìn)行顯影10分鐘后，用異丙醇和去離子水清洗表面，氮?dú)獯蹈桑?6)構(gòu)建液體流通層:將聚二甲基硅氧烷單體和固化劑按照體積比5:1混合后，傾倒在經(jīng)三甲基氯硅烷處理后的液體流通層硅片模具表面，在80°C條件下烘烤固化40分鐘，形成液體流通層芯片； 7)構(gòu)建微閥門控制層:將聚二甲基硅氧烷單體和固化劑按照體積比20:1混合后，傾倒在經(jīng)三甲基氯硅烷處理后的微閥門控制層硅片模具表面，在80°C條件下烘烤固化40分鐘，形成微閥門控制層芯片； 8)芯片鍵合:將固化后的液體流通層和構(gòu)建微閥門控制層分別與硅片模具剝離，經(jīng)打孔后，用氧離子體處理表面2分鐘后，進(jìn)行對合封接;再與玻璃基片貼合，80°C烘烤12小時(shí)，形成鍵合牢固的雙層微流控芯片。
【文檔編號】B01L3/00GK105944774SQ201610318026
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月12日
【發(fā)明人】蔣西然, 李靈, 李文利, 劉丹梅, 王旭東, 周曉婭
【申請人】大連理工大學(xué)