專利名稱：探測蛋白質(zhì)的改進方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用一種檢測系統(tǒng)測定含水流體，如尿液中，的蛋白質(zhì)，該檢測系統(tǒng)含有蛋白質(zhì)致誤指示劑和緩沖劑。在幾種影響腎臟、呼吸和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理狀態(tài)的診斷中，確定尿樣中存在著蛋白質(zhì)是很重要的。通常需要定性或定量地測定尿液中的蛋白質(zhì)，尤其是與糖尿病或腎臟疾病的診斷有關(guān)時。尿液中與糖尿病有關(guān)的主要蛋白質(zhì)是白蛋白，它是分析中最常用的蛋白質(zhì)。
人們已經(jīng)知道幾種確定尿液中存在著蛋白質(zhì)的方法。最方便的是以少量尿液浸濕一種吸收條，該吸收條以蛋白質(zhì)致誤指示劑和緩沖劑飽和過。蛋白質(zhì)致誤指示劑是含有可電離基團的pH指示劑，該可電離基團在蛋白質(zhì)存在時，可被置換，產(chǎn)生可測定的顏色變化。該指示劑在pH發(fā)生變化時，會產(chǎn)生同樣的顏色變化，所以，在檢測系統(tǒng)中包括有緩沖劑很重要，藉此避免pH上升，因為這種pH的上升會使指示劑在無蛋白質(zhì)存在的情況下發(fā)生顏色變化，而導(dǎo)致假陽性結(jié)果。
以蛋白質(zhì)致誤指示劑，如酚磺酞，的結(jié)合為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)測定方法，是相對非特異性的蛋白質(zhì)測定方法，本發(fā)明包括使用一些競爭性抑制劑，以提高建立在蛋白質(zhì)致誤指示劑的結(jié)合基礎(chǔ)上的方法的特異性。
美國專利第5187104號討論了蛋白質(zhì)測定方法中DIDNT染料的使用，并且提到將顏色促進聚合物與試劑聯(lián)用。其中提到的特定聚合物有聚丙二醇、聚丙烯醚碳酸酯和聚乙烯醚，也提到了Bayer AG標明為KOK10002的聚醚碳酸酯、來自Bayer AG的1，6-二甲基-4-壬基酚的環(huán)氧丙烷和環(huán)氧乙烷加成物，其商品名為Fenoil D4030，以及來自BASF，標明為Lutonal ISO的聚乙烯醚。
美國專利第5124266號提到使用一種檢測條檢測尿液中蛋白質(zhì)，該檢測條包括吸水載體基質(zhì)，其中含蛋白質(zhì)致誤指示劑和緩沖劑，以基于聚氨基甲酸乙酯的化合物處理之，以防止背景顏色出現(xiàn)，藉以提高檢測條之敏感性。
Pugia等的美國專利第5424125號提到使用聚乙烯醇和聚乙烯羧酸作為結(jié)合物，以防止緩沖劑由反應(yīng)板流出。然而，沒有人討論過以下問題能否用這些復(fù)合物加以提高或改變該方法對一種蛋白質(zhì)相對其它蛋白質(zhì)的特異性。
在1983年的Bunseki(32)379-386頁中，Y.Fujiti談到了在基于金屬螯合染料的蛋白質(zhì)檢測中，使用聚乙烯醇。這篇文章談到，聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮適合作為單細胞形成過程中的非離子表面活性劑，但未提到對白蛋白特異性的提高。
關(guān)于長鏈烷烴對蛋白質(zhì)致誤指示劑結(jié)合蛋白質(zhì)的影響，已開展了一些研究。長鏈烷基羧酸，如軟脂酸，對蛋白質(zhì)致誤指示劑的結(jié)合的影響，已有Kragh-Hansen在1974年的Biophysics Acta(365)360-371頁中論及。軟脂酸酯對酚紅與白蛋白的結(jié)合，顯示出中度抑制效果，其它蛋白質(zhì)沒有被研究過?；诖耍瑹o法預(yù)料長鏈烷基能改變蛋白質(zhì)結(jié)合的特異性。
其他研究表明，長鏈烷基磺酸，如十二烷基磺酸鈉，影響蛋白質(zhì)致誤指示劑的結(jié)合。Marcart等在1984年的Clinica Chimica Acta(141)77-84頁中，Perini等在1984年的Clinica Chimica Acta(143)321-3238頁中發(fā)表的研究結(jié)果表明，十二烷基磺酸鈉平衡了考馬斯亮藍(CBB)對幾種蛋白質(zhì)的敏感性的差異，并且降低了檢測白蛋白的特異性?；诖私Y(jié)果，可以預(yù)料長鏈烷基能降低系統(tǒng)對白蛋白的特異性。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及含水測試樣品中人血清白蛋白的半定量分析，通過將被懷疑含有該蛋白質(zhì)的流體與檢測試劑接觸，該檢測試劑包括一種蛋白質(zhì)致誤指示劑染料，該指示劑與蛋白質(zhì)接觸會產(chǎn)生可測定的顏色變化而完成。本發(fā)明公開了一種改進方法，它包括向檢測試劑中加入競爭性抑制劑，抑制劑可用以下化學(xué)式A表示
其中
是一連接基團，A和B可以是一單鍵或氧原子。當(dāng)A是氧原子，B是單鍵時，該聚合物為聚乙烯烷基酯；當(dāng)A是單鍵B是氧原子時，聚合物是聚烷基丙烯酸酯；當(dāng)A和B均為氧原子時，聚合物是碳酸酯；當(dāng)A和B均為單鍵時，聚合物為聚乙烯烷基酮。R取代基為1-20個碳原子的直鏈、分支或環(huán)狀的烷基，其中0-10個氫原子可被羥基取代。聚合物骨架包括重復(fù)的烷基或碳酸酯亞單位，如纖維素或葡萄糖胺這些亞單位可與非反應(yīng)性封閉單位共聚合，通過連接基團連接到重復(fù)的聚合物亞單位上的烷基數(shù)可從10％到理論上的最大值90％。
根據(jù)本發(fā)明，在考慮中的蛋白質(zhì)致誤指示劑的檢測中，已發(fā)現(xiàn)有一些聚合物抑制劑降低蛋白質(zhì)致誤指示劑對蛋白質(zhì)的反應(yīng)性。某些特定的聚合物對蛋白質(zhì)致誤指示劑與人血清白蛋白(HSA)的反應(yīng)，抑制作用較弱，而對指示劑與其它尿液中常見蛋白質(zhì)的反應(yīng)，抑制作用較強。它們是測定HSA濃度的試劑的理想添加物，因為這樣一種系統(tǒng)對HSA的特異性會得到提高。本發(fā)明中有用的聚合物抑制劑可用化學(xué)式A表示，這一化學(xué)式表示的聚合物，可以是聚乙烯烷基酯、聚烷基丙烯酸酯、聚乙烯烷基碳酸酯或聚乙烯烷基酮。本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)的幾種有用的聚合物列出于表5。聚合物為聚乙烯烷基酯，即前述化學(xué)式中A是氧原子，B是單鍵時，除了表5中列出者外，還包括一些特定的聚合物，其烷基分別為cyclohexenoate，反-5-癸酸酯，10-羥基癸酸酯和5-羥基癸酸酯，而且不限于以上情形。當(dāng)使用聚烷基丙烯酸酯，即A是單鍵，B是氧原子時，除了表5中列出者外，合適的聚合物還包括其烷基為辛基、環(huán)已基、雙環(huán)已基和5-甲基已基的聚合物。特定的聚乙烯烷基碳酸酯，即根據(jù)前述化學(xué)式，A和B均為氧原子時，除了表5中列出者外，還包括其烷基為十九烷基、癸基、4-羥基庚基、環(huán)戊二烯的聚合物。而A和B均為單鍵時表示的聚乙烯酮、包括烷基為丁基、癸基、新癸酸酯和十八烷基的聚合物，以及列出于表5中的聚合物。本發(fā)明中，這些聚合物是否有用，其分子量不是關(guān)鍵因素，但聚合度(n)為20-40000的聚合物較為可取，因為它們能吸附于HSA分子表面。
本發(fā)明的目的之一是用于一種分析檢測條，它能測定尿液中的HSA，該檢測條包括吸收載體，載體先以合適的蛋白質(zhì)致誤指示劑、緩沖劑和聚合物抑制劑飽和過。合適的蛋白質(zhì)致誤指示劑包括四溴酚藍(TBPB)、5，5″-二硝基-3′，3″-二碘-3，4，5，6-四溴酚磺酞(DIDNTB)、考馬斯亮藍、堅牢綠FCF、淡綠SF、焦棓酚紅、鄰苯二酚紫、除此之外，也可使用美國專利第5279790號公開的部花青和硝基或亞硝基取代的聚鹵代酚磺酞。
檢測條吸收載體優(yōu)先選用濾紙，其它可用作吸收載體的材料在美國專利第3846247號中提到過，包括毛氈、多孔瓷條和編織或纏結(jié)的玻璃纖維，合適的材料還包括木頭、布、海綿狀物和陶土，這些在美國專利第3552928號中提到過?；蛘呶蛰d體可采用非多孔性材料，如聚合物膜或玻璃。
制備檢測條時，吸收載體以含蛋白質(zhì)致誤指示劑、緩沖劑和聚合物抑制劑的溶液飽和。這種飽和過程通常包括兩步浸漬過程，首次浸漬液包括水或水/極性有性溶劑混合物，其中溶有緩沖劑。干燥后，檢測條于二次浸漬液中浸漬。二次浸漬液為有機溶劑，其中溶有蛋白質(zhì)致誤指示劑和聚合物抑制劑，指示劑濃度通常為約0.2-5.0mM。
浸漬干燥后，檢測條即可使用。使用時通常包括將檢測條浸入尿樣中，觀察指示劑的顏色變化。觀察可手工進行，也可使用反射分光計，以便更準確地定量。
進行分析的pH取決于試劑體系中所用的特定染料，最適合特定染料的緩沖劑是已知的，或可通過常規(guī)試驗方便地確定。
實施本發(fā)明的方法詳見以下實施例，這些實施例和其中包括的數(shù)據(jù)證實正如前面的簡要說明所指出的那樣，使用聚合物提高染料結(jié)合方法對人血清白蛋白(HSA)的特異性是理想的。這種方法提高了尿液中HSA測定的診斷價值，使腎臟健康狀況的評價更為準確。實施例I在無聚合物存在和幾種聚合物的濃度逐漸升高的情況下，分別測定了酚磺酞染料[5′，5″-二硝基-3′，3″-二碘-3，4，5，6-四溴酚磺酞(DIDNTB)]和HSA特異性，對幾種長鏈取代烷烴也進行了測定，被測添加物的通式表示于下面的圖解式I中
R名稱 R 名稱 R名稱C9H19癸酸C15H31十六烷酸 C17H35聚乙烯硬脂酸酯H聚乙烯醇
名稱聚苯乙烯馬來酸共聚物R 名稱CO2H 聚丙烯酸SO3H 聚乙烯磺酸CONC(CH3)2CH2SO3H聚(2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙基磺酸)C6H4SO3Na 聚(4-苯乙烯磺酸鈉)圖解式I測定按以下方法進行DIDNTB蛋白質(zhì)試劑由Alhstorm204濾紙經(jīng)兩次飽和制得。其中首次飽和采用含水乙醇混合物，其中含有酒石酸作為緩沖劑，甲基紅作為背景染料，pH調(diào)至2.1。二次飽和采用甲苯/四氫呋喃混合物，其中含有DIDNTB指示劑染料和Lutanot M 40(一種聚乙烯甲基醚)，后者作為顏色促進聚合物。
水溶性聚合物，如聚乙烯醇、聚乙烯磺酸和聚(2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙基磺酸)，加入首次混合物。而水不溶性添加物，如癸醇、癸酸、十六烷酸、聚乙烯硬脂酸酯、聚苯乙烯/馬來酸酐和聚(4-苯乙烯磺酸鈉)，加入二次混合物。
混合物溶液用于飽和濾紙。每次飽和后，濾紙于105℃干燥7分鐘。所得干燥試劑切成試劑條，將試劑條浸入含0或30mg/dL人血清白蛋白的尿液，或含40mg/dL其它尿液中蛋白質(zhì)的尿液中，用來自BagerDiagnostics的Clinitek-200+反射分光光度計檢測，每次浸漬液的詳細成分列出于表3。
加入HSA之前，尿樣用超濾膜過濾，該超濾膜能攔截分子量為10KDa(千道爾頓)以上的分子，因而能除去天然出現(xiàn)的蛋白質(zhì)。尿樣中總蛋白的測定，采用免疫HSA分析和上文引述過的Perini等的考馬斯亮藍(CBB)方法。篩選了175個臨床樣品以提供不含白蛋白而含其他尿液中蛋白質(zhì)的樣品。經(jīng)測定，175個樣品中有4個樣品其總蛋白/HSA比率大于10，一個樣品的比率為242。將這些尿液收集起來，用陰性尿液稀釋至終濃度為以CBB方法測定為40mg/dL，免疫HSA分析測定為1.2mg/dL，試劑反應(yīng)性在CLINITEK-200+儀器上測定，結(jié)果為1000x％Reflectance@610nm/％reflectance@690nm。陰性尿液和含蛋白質(zhì)的尿液間的差別為蛋白質(zhì)反應(yīng)性，這一試驗獲得的數(shù)據(jù)列出于表1。其中不含聚合物或被取代的烷烴添加物的對照體系的蛋白質(zhì)反應(yīng)性。與含有聚合物或烷烴的體系的蛋白質(zhì)反應(yīng)性進行了比較，以確定反應(yīng)性的變化百分率。負數(shù)表明蛋白質(zhì)反應(yīng)性的損失較大。
在這些添加物存在下，將HSA反應(yīng)性與其它尿液中蛋白質(zhì)的反應(yīng)性進行了比較，尿液中其他蛋白質(zhì)包括Tamm Horsefall糖蛋白。Bence-Jones蛋白，2-1-微珠蛋白、血紅蛋白和幾種低分子量蛋白片段。添加物的使用濃度為0.1％(w/w)，以使各種情況下都可測到HSA反應(yīng)性，獲得的數(shù)據(jù)列出于表2。0.1％的濃度相當(dāng)于添加物濃度為10-20μM，超過了被測蛋白4.4μM的濃度。只有聚乙烯硬脂酸酯對其他尿液中蛋白質(zhì)的抑制作用較強，而對HSA的抑制作用較弱，這表明，它能提高酚磺酞法對白蛋白的特異性，因而聚乙烯硬脂酸酯能提高酚磺酞法測定尿液中HSA的特異性。由表1可以確定，其他添加物或者沒有效果，與對照相比在10％以內(nèi)，或者同等地抑制HSA和其他尿液中蛋白質(zhì)。由于存在6mM替代烷烴，如癸醇、癸酸和十六烷酸，不影響蛋白質(zhì)反應(yīng)性，可以確定聚乙烯硬脂酸酯的效果不能僅歸于聚合物中的烷基。
表1反應(yīng)性變化百分率尿液蛋白 HSA40mg/dL 30mg/dL無添加物 0％ 0％癸醇6mM 8％ 3％癸酸6mM 2％ 7％十六烷酸6mM 1％ -2％聚乙烯醇 0.10％-4％ -7％聚乙烯丙烯酸 0.10％-5％ -6％聚乙烯硬脂酸酯 0.10％-42％-15％聚乙烯磺酸 0.10％-51％-51％聚(2-丙烯酰胺-2-甲基- 0.10％-38％-39％1-丙基磺酸)聚苯乙烯/馬來酸酐 0.10％-12％-13％聚(4-苯乙烯磺酸鈉) 0.10％-38％-40％只有聚乙烯硬脂酸酯較大幅度地降低蛋白質(zhì)致誤指示劑對HSA外的尿液中蛋白質(zhì)的敏感性，而較小幅度地降低指示劑對HSA的敏感性，因而只有它被選用作有效的抑制劑。含磺酸、烷基或芳香基的聚合物，使指示劑對HSA和其它尿液中蛋白質(zhì)的敏感性同等地降低，如表1所示。聚乙烯磺酸和聚(4-苯乙烯磺酸鈉)使指示劑的敏感性，包括對HSA和其它尿液中蛋白質(zhì)的敏感性，降低的幅度最大。敏感性的降低隨聚合物濃度上升而增加。另一方面，含羥基和羧酸鹽團的聚合物，即使在高濃度下，也不降低指示劑對HSA和其它尿液中蛋白質(zhì)的敏感性，如表2所示。這些結(jié)果表明，一些聚合物能降低蛋白質(zhì)指示劑的蛋白質(zhì)反應(yīng)性。然而，為了使聚合物能有效地提高特異性，HSA反應(yīng)性受到的影響，應(yīng)當(dāng)小于其他類型蛋白質(zhì)的反應(yīng)性受到的影響。
表2聚合物濃度對HSA敏感性的影響30mg/dL HSA的抑制百分率濃度 2.00％ 1.00％ 0.75％ 0.50％ 0.40％ 0.25％ 0.20％ 0.10％ 0.05％聚(2-丙烯酰胺-2-甲基-1 62％ 61％ 61％44％37％19％-丙基磺酸)聚(4-苯乙烯磺酸鈉) 92％69％42％18％聚乙烯磺酸 71％ 71％55％44％聚乙烯醇 10％-3％ 3％聚丙烯酸 3％ -4％-6％聚乙烯硬脂酸酯 36％ 26％20％15％聚苯乙烯/馬來酸酐 54％36％ 24％11％
表3DIDNTB蛋白質(zhì)試劑組分成分 功能使用濃度允許范圍首次處理水溶劑 1000mL ---甲基紅 背景染料9.5mL 0-10mg乙醇 溶劑 100g 0-40g％酒石酸 緩沖劑 64g(280mM)50-750mM水溶性添加物 見表1 0.01to4g％pH -- 2.1 1.5-3.5二次處理甲苯 溶劑 95mL---THF 溶劑 5mL 0-50mLDIDNTB 指示劑 65.7mg(0.6mM) 0.2-5.0mMLutonal M40 聚合物促進劑0.143g％0-1.0g％水不溶性添加物 見表1 0.01to4g％實施例II圖解式H中所示一系列烷基聚合物存在及不存在的情況下，測定了DIDNTB染料的特異性。
圖解式II見原文P14R名稱R 名稱CH3聚乙烯乙酸酯H 聚乙烯醇C2H5聚乙烯丙酸酯CH3聚乙烯甲醚(LUTANOLM-40)C3H7聚乙烯丁酸酯(CH2)5CH(CH3)2聚乙烯新癸酸酯 C2H5聚乙烯乙醚C5H11聚乙烯已酸酯CH2CH(CH3)2聚乙烯異丁醚C9H17聚乙烯癸酸酯C11H23聚乙烯月桂酸酯C17H35聚乙烯硬脂酸酯
R 名稱COCH3聚甲基乙烯酮
R 名稱C4H9聚丁基丙烯酸酯C4H8OH 聚(4-羥基丁基丙烯酸酯)C6H13聚已基丙烯酸酯C10H21聚癸基丙烯酸酯C12H25聚月桂基丙烯酸酯C18H37聚十八烷基丙烯酸酯
R 名稱CH2CH(CH3)2聚乙烯異丁基碳酸酯圖解式II為了將該實施例與常規(guī)操作聯(lián)系起來，采用蛋白質(zhì)試劑中常用的其他聚合物，對DIDNTB染料的特異性進行了分析，這些聚合物包括LutanolM40(見U.S.5424215)，KOK10071聚合物(見U.S.5424215)和聚乙烯醇。這些聚合物不能提高DIDNTB染料對白蛋白的特異性。KOK10071和Lutanol M40聚合物提高所有蛋白質(zhì)的檢測敏感性，而PVA沒有明顯效果，這一點可以從美國專利第5187104號和5424125號的內(nèi)容中預(yù)料到。比較這些聚合物獲得的數(shù)據(jù)列出于表4。
表4代表性聚合物的比較610nm處反應(yīng)性變化百分率0-80-20 0-200-300體系包括 mg/dL mg/dLmg/dL mg/dL μg/pad濃度HSA Hb TRANS LYS Uptake無聚合物0.000％ 12.88.6 7.011.217.2聚丙烯醚碳酸酯0.250％ 21.628.423.430.415.8(KOK 10071)聚乙烯醇(PVA) 0.250％ 10.87.1 5.4 7.616.8聚乙烯甲基醚 0.100％ 22.128.623.126.215.8(Lutanol M40)對照(LUTANOL 同上20.033.424.216.215.3&KOK 10071&
PVA)將四組烷基聚合物加入至含常用聚合物的對照配方中，對它們進行了比較。這些聚合物分別含醚、酯、丙烯酸酯和碳酸酯連接基團，對這些配方的白蛋白(HSA)、血紅蛋白(Hb)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRANS)和溶菌酶(LYS)敏感性進行了比較，結(jié)果見表5。HSA特異性提高表現(xiàn)為對血紅蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白或溶菌酶的敏感性下降較大(即0％)，而對HSA的敏感性下降較小(即理想情況為≥100％。
表5實施例2中烷基聚合物的比較相對反應(yīng)性百分率對照8 20 20 300體系含有 mg/dL mg/dL mg/dL mg/dL μg/pad濃度 Id HSA Hb TRANS LYS Uptake醚基團聚乙烯乙醚0.025％6a 92％88％ 85％ 91％ 12.30.100％6b 70％80％ 75％ 8.8聚乙烯異丁醚0.025％ 7a 75％ 80％ 50％ 76％5.00.100％ 7b 32％ 28％ 10％ 5.4酯基團聚乙烯乙酸酯0.025％ 8a 98％ 99％ 84％ 42％ 12.10.100％ 8b 120％ 98％ 92％ 13.0聚乙烯丙酸酯0.025％ 9a 98％ 99％ 109％ 46％ 12.50.100％ 9b 41％ 53％ 33％ 9.3聚乙烯丁酸酯0.025％ 10a 149％ 108％ 68％ 60％9.60.100％ 10b 22％ 20％ 6％ 7.0聚乙烯已酸酯0.025％ 11a 128％ 50％ 10％ 23％8.10.100％ 11b 111％ 19％ 14％ 5.1聚乙烯新癸酸酯 0.025％ 12a 58％ 61％ 16％ -12％ 8.30.100％ 12b 31％ 54％ 26％ 8.9聚乙烯癸酸酯0.025％ 25a 45％ 15％ 15％ -4％ 11.20.100％ 25b 25％ 22％ 22％ 7.4聚乙烯月桂酸酯 0.025％ 13a 92％ 76％ 55％ 17％ 12.60.100％ 13b 0％8％ 16％ 11.1聚乙烯硬脂酸酯 0.025％ 14a 111％ 102％ 94％ 43％ 13.60.100％ 14b 104％ 94％ 99％ 12.9酮基團聚甲基乙烯酮0.025％ 15a 92％ 91％ 95％ 27％ 9.30.100％ 15b 110％ 96％ 101％ 7.1丙烯酸酯基團聚丁基丙烯酸酯 0.025％ 18a 92％ 59％ 82％ 23％ 12.50.100％ 18b 64％ 46％ 12％12.1聚(4-羥基丁基丙 0.025％ 19a 125％ 107％ 101％ 68％ 7.9烯酸酯0.100％ 19b 77％ 99％ 93％ 4.8聚已基丙烯酸酯 0.025％ 20a 78％ 74％ 96％ 30％ 5.70.100％ 20b 43％ 39％ 38％ 5.6聚癸基丙烯酸酯 0.025％ 21a 56％ 50％ 65％1％ 9.10.100％ 21b 25％ 42％ 32％ 6.9聚月桂基丙烯酸酯 0.025％ 22a 113％ 94％ 100％ 27％ 10.90.100％ 22b 63％ 78％ 65％ 9.9聚十八烷基丙烯酸 0.025％ 23a 92％ 88％ 91％ 47％ 7.0酯0.100％ 23b 91％ 77％ 71％ 5.4碳酸酯基團聚乙烯異丁基碳酸 0.025％ 24a 29％ -9％ -9％ 9％ 8.3酯0.100％ 24b 6％ 0％ -9％ 7.2碳水化合物中酯基團纖維素丁酸酯0.105％ 25a 88％ 82％ 78％ 43％ 8.7纖維素丙酸酯0.105％ 26a 83％ 79％ 73％ 39％ 9.3由表5可以確定，醚不影響染料的特異性、酯、酮和碳水化合物都提高其特異性，表現(xiàn)為溶菌酶敏感性下降，而HSA敏感性不變或下降較少。最佳特異性見于已酸酯、新癸酸酯，去特異性見于已酸酯，新癸酸酯、癸基和癸酸酯烷基，具有這些基團的聚合物也降低血紅蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白的敏感性，分支的和含羥基的烷基以及具有酯烷基的碳水化合物骨架也有效果。
表5中所示反應(yīng)性是相對于無任何烷基聚合物的對照配方的，由于測定結(jié)果偏差，只有大于10％的結(jié)果才被認為是顯著的。所有體系中均含Lutanol，KOK和PVA。其濃度在表4中提及。
同前一實施例一樣，實施例II的試驗步驟包括對濾紙進行兩次飽和。首次飽和采用含水乙醇混合物，其中含有酒石酸緩沖劑和PVA，后者作為結(jié)合聚合物，混合物pH調(diào)至2.1。二次飽和采用甲苯混合物，其中含有蛋白質(zhì)指示劑染料(DIDNTB)和促進劑聚合物(Lutanol M40和KOK 10071)，混合溶液用來飽和濾紙。每次飽和后，濾紙于105℃干燥7分鐘。試劑配方中各成分的功能、適用濃度和允許范圍于表6中列出。
表6成分 功能 使用濃度 允許范圍首次處理水 溶劑 1000mL ---乙醇 溶劑 40.75mL 0-40g％PVA聚合物 結(jié)合物 0.25g％ 0-5g％檸檬酸鈉 緩沖劑 41.7g50-750mM酒石酸 緩沖劑 45.1g50-750mMpH --2.25 1.5-3.5二次處理甲苯 溶劑 96.5mL ---THF 溶劑 3.5mL 0-50mLDIDNTB指示劑0.329g(3mM)0.2-5.0mLLutonal M40 聚合物促進劑 0.100g％ 0-1.0g％KOK 10071 聚合物促進劑 0.250g％ 0-10.0g％水不溶性抑制劑見表4 0.025％and0.1％ 0.01to4g％
權(quán)利要求
1.對含水測試樣品中人血清白蛋白的半定量分析，該測試樣品被懷疑含有人血清白蛋白以及其他蛋白質(zhì)，該分析通過將被懷疑含有蛋白質(zhì)的流體與檢測試劑接觸，該檢測試劑包括蛋白質(zhì)致誤指示劑染料和緩沖劑，染料與蛋白質(zhì)接觸時，會產(chǎn)生可測定的顏色變化而完成，改進方法包括向檢測試劑中加入競爭性抑制劑，抑制劑為以下化學(xué)式所表示的聚合物
其中
是一連接基團，A和B可以是一單鍵或氧原子，當(dāng)A是氧原子，B是鍵時，該聚合物為聚乙烯烷基酯，當(dāng)A是單鍵，B是氧原子時，聚合物是聚烷基丙烯酸酯，當(dāng)A和B均為氧原子時，聚合物是聚乙烯烷基碳酸酯，當(dāng)A和B均為鍵時，聚合物為聚乙烯烷基酮，R為1-20個碳原子的直鏈，分支或環(huán)狀烷基，其中0-10個氫原子為羥基取代，聚合物骨架包括重復(fù)的烷基或碳水化合物亞單位，這些亞單位能與非反應(yīng)性封閉單位共聚合，通過連接基團連接到重復(fù)的聚合物亞單位的烷基數(shù)，或達到理論上的最大值10％-90％。
2.權(quán)利要求1的方法，其中聚合物骨架由重復(fù)的烷基單位組成。
3.權(quán)利要求2的方法，其中重復(fù)的烷基單位為1，2-亞乙基，1，2-亞丙基，或亞丁基。
4.權(quán)利要求1的方法，其中聚合物骨架由重復(fù)的碳水化合物單位組成。
5.權(quán)利要求4的方法，其中重復(fù)的碳水化合物單位為丙烯酰胺，纖維素或葡萄糖胺。
6.權(quán)利要求1的方法，其中非反應(yīng)性封閉單位為乙烯醇、環(huán)氧乙烯、丙二醇、1，2-亞乙基乙醚(ethylene ethyl ether)、乙烯基甲醚、馬來酸酐、丙烯酸、己二酸酯或碳酸酯。
7.權(quán)利要求1的方法，其中蛋白質(zhì)致誤指示劑是酚磺酞染料。
8.權(quán)利要求1的方法，其中蛋白質(zhì)致誤指示劑是四溴酚藍、5′，5″-二硝基-3′，3″-二碘-3，4，5，6，-四溴酚磺酞、考馬斯亮藍、堅牢綠FCF、淡綠SF、焦棓酚紅或鄰苯二酚紫。
9.權(quán)利要求1的方法，其中競爭性抑制劑為聚乙烯基烷基酯。
10.權(quán)利要求9的方法，其中聚乙烯烷基酯為聚乙烯已酸酯、聚乙烯新癸酸酯或聚乙烯癸酸酯。
11.權(quán)利要求9的方法，其中競爭性抑制劑為聚烷基丙烯酸酯。
12.權(quán)利要求11的方法，其中聚烷基丙烯酸酯為聚已基丙烯酸酯或聚癸基丙烯酸酯。
13.權(quán)利要求1的方法，其中競爭性抑制劑為聚乙烯基烷基碳酸酯。
14.權(quán)利要求13的方法，其中聚乙烯基烷基碳酸酯為聚乙烯基異丁基碳酸酯。
15.權(quán)利要求1的方法，其中競爭性抑制劑為聚乙烯基烷基酮。
16.權(quán)利要求15的方法，其中聚乙烯基烷基酮為聚甲基乙烯酮。
17.權(quán)利要求1的方法，其中含水流體是尿液。
18.半定量分析尿液中人血清白蛋白的檢測裝置，該裝置包括吸收載體，載體中吸收有蛋白質(zhì)致誤指示劑染料，緩沖劑和權(quán)利要求1描述的競爭性抑制劑。
全文摘要
尿液中人血清白蛋白(HSA)的測定如下完成將尿液接觸含緩沖劑和蛋白質(zhì)致誤指示劑的試劑系統(tǒng)，在與蛋白質(zhì)致誤指示劑的反應(yīng)中，其它通常發(fā)現(xiàn)于尿液中的蛋白質(zhì)能夠與HSA進行競爭，因而它們影響HSA檢測的敏感性。本發(fā)明包括加入一些聚合物競爭性抑制劑至試劑系統(tǒng)中，這些抑制劑對蛋白質(zhì)致誤指示劑與HSA外的尿液中蛋白質(zhì)的反應(yīng)，抑制作用較強，而對指示劑與HSA的反應(yīng)，抑制作用較弱，因而能提高試劑對HSA的敏感性。合適的聚合物抑制劑包括聚乙烯烷基酯、聚烷基丙烯酸酯、聚乙烯烷基碳酸酯和聚乙烯烷基酮。
文檔編號G01N33/493GK1165301SQ9710254
公開日1997年11月19日 申請日期1997年2月26日 優(yōu)先權(quán)日1996年3月1日
發(fā)明者J·P·阿爾巴雷拉, S·E·卡布爾, G·M·約翰遜, M·J·普吉亞 申請人:美國拜爾公司