專利名稱：分析血清中酶原形式的前列腺特異抗原以提高前列腺癌檢測的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
總的來說，本發(fā)明涉及檢測和鑒定蛋白以及蛋白的各種形式和亞基，其作為診斷標(biāo)記具有潛在的用途。具體而言，本發(fā)明涉及檢測血清中失活前體形式的前列腺特異抗原以及前列腺癌檢測改進(jìn)的方法。
背景技術(shù)：
血清前列腺特異抗原(PSA)的測量廣泛用于篩選和早期診斷前列腺癌(1-3)。通過當(dāng)今臨床免疫分析可測量的血清PSA主要以游離“非復(fù)合的”形式(游離PSA)存在或以與α1-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)的復(fù)合物形式存在(4-5)。血清中游離PSA與總PSA的比例已表明可顯著提高PCa與BPH的辨別，以較高的比例相關(guān)于較低風(fēng)險(xiǎn)的前列腺癌(6-7)。
游離PSA水平在血清中變化的生物學(xué)機(jī)理是未知的。已經(jīng)變成復(fù)合的血清PSA可能是相對均一的，因?yàn)樗砹嗣富钚缘耐暾腜SA。從PAS-ACT復(fù)合物釋放的PSA在前列腺癌(PCa)和良性前列腺增生(BPH)血清中發(fā)現(xiàn)與精漿PSA是不可區(qū)分的，正確認(rèn)了這種假設(shè)(8)。由此得出結(jié)論，游離PSA可提供更好的生化指標(biāo)(insight)，以及表征游離PSA的分子形式可幫助闡明其前列腺起源和釋放到血清中的機(jī)理。然而，在診斷相關(guān)的范圍接近10ng/ml時(shí)，利用目前技術(shù)努力從血清中純化和表征低水平的PSA一般尚未被視為可行。迄今為止，研究主要集中在PSA水平非同尋常高，100s或1000s的ng/ml PSA的男人血清上。本發(fā)明人報(bào)道了在收集的含有63ng/ml總PSA的PCa血清中存在截短形式的proPSA(pPSA)(9)。但是，其他組在含有更高水平的PSA的血清中沒有鑒定到pPSA。盡管建議采用高水平血清PSA進(jìn)行研究，但是共同缺點(diǎn)在于該P(yáng)SA可能不反映的通常存在于疾病的早期階段PSA的種類或百分比，其中PSA為10ng/ml或更低。從大的原發(fā)性腫瘤損傷或轉(zhuǎn)移性疾病中釋放的PSA比從早期可能是低級疾病中釋放的PSA具有不同的生化特性。因此，為了用作臨床檢測早期前列腺癌中的助手，截短的pPSA形式必須在診斷上相關(guān)水平的總PSA接近10ng/ml的血清中，以顯著水平存在。
當(dāng)總PSA水平接近10ng/ml時(shí)，游離PSA比例或百分比較高的男人更有可能患有良性疾病。研究已經(jīng)表征了這些水平的游離PSA，并且例如已經(jīng)建議總PSA以游離PSA存在大于25％的男人不必對癌癥進(jìn)行活檢，因?yàn)榘┌Y在這些病例中只有8％的可能性。然而，沒有已知的診斷方法可用于幫助在8％癌癥可能性的男人群體中進(jìn)一步檢測前列腺癌。此外，當(dāng)總PSA為2.5-4ng/ml，許多癌癥存在，但出現(xiàn)的概率低于總PSA為4-10ng/ml的情形。目前，利用游離PSA的比例在2.5-4ng/ml范圍中提高癌癥檢測的努力還未建立診斷價(jià)值。
所以，仍需要開發(fā)用于改進(jìn)檢測和確定患者中早期前列腺癌的試驗(yàn)。
發(fā)明概述本發(fā)明基于下列意料之外的發(fā)現(xiàn)pPSA異型，例如[-2]pPSA形式，在游離PSA與總PSA的比例顯著提高的特定亞群的男人，尤其在游離PSA大于25％的男人中具有升高的癌癥預(yù)測值。此外，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)患者樣品中的總PSA為2-4ng/ml范圍時(shí)，pPSA在鑒定高百分比的患有前列腺癌的男人中可能也是有效的，在所述范圍中，存在許多癌癥，但是出現(xiàn)率較低。因此，本發(fā)明提供了手段，以幫助在癌癥更稀罕的男人的特別群體中，以及在當(dāng)前利用免疫試驗(yàn)無法檢測前列腺癌的地方檢測前列腺癌。
因此，基于本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的一方面提供診斷方法，以幫助檢測和/或確定個(gè)體中前列腺癌的存在，或幫助區(qū)分個(gè)體中的前列腺癌和BPH。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，這種方法包括下列步驟a)確定患者生物樣品中所含的總PSA的量；b)確定樣品中游離PSA的量；以及計(jì)算游離PSA與總PSA的比例；c)確定樣品中pPSA的量；以及d)基于總PSA的水平和游離PSA％，通過將pPSA的量與用已知癌癥和良性疾病診斷的對照樣品所確立的預(yù)定值進(jìn)行比較，使樣品中所含的pPSA的量與患者中前列腺癌的存在相關(guān)。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，總PSA的范圍可以為2-10。游離PSA與總PSA的比例大于10％-25％?；蛘?，總PSA的范圍可以為2.5-4ng/ml，而游離PSA的比例小于15％。pPSA可以為[-2]pPSA，[-4]pPSA或[-5/-7]pPSA。特別地，pPSA為[-2]pPSA。樣品為血清或血漿。
用于診斷或區(qū)分前列腺癌和BPH的試劑盒也包括在本發(fā)明的實(shí)施方案中。
附圖簡述

圖1示出了接受者操作特征(ROC)分析[2，4，5，7]pPSA/游離PSA(％[2，4，5，7]pPSA，％[-2]+[-4]+[-5]+[-7]pPSA的和)，與患有癌癥和BPH以及總PSA為4-10ng/ml的男人中的游離PSA/總PSA(％F)比較。
圖2示出了ROC分析[2]pPSA/游離PSA(％[-2]pPSA)，與患有癌癥或BPH以及總血清PSA為4-10ng/ml的男人中游離PSA/總PSA(％F)的比較。
圖3示出了ROC分析[-2]pPSA，與患有癌癥或BPH以及總血清PSA為4-10ng/ml的男人中游離PSA/總PSA(％F)的比較。
圖4示出了ROC分析[-2]pPSA，與患有癌癥或BPH，總血清PSA為4-10ng/ml以及游離PSA大于20％的男人中游離PSA/總PSA(％F)的比較。
圖5示出了ROC分析[-2]pPSA，與患有癌癥或BPH，總血清PSA為4-10ng/ml以及游離PSA大于25％的男人中游離PSA/總PSA(％F)的比較。
圖6為圖5的[-2]pPSA數(shù)據(jù)的點(diǎn)印跡，顯示界限為0.053ng/ml。
圖7示出了ROC分析[2，4，5，7]pPSA/游離PSA(％[2，4，5，7]pPSA，％[-2]+[-4]+[-5]+[-7]pPSA的和)，與患有癌癥和BPH以及總血清PSA為2.5-4ng/ml的男人中的游離PSA/總PSA(％F)的比較。
圖8示出了ROC分析[2，4，5，7]pPSA/游離PSA(％[2，4，5，7]pPSA，％[-2]+[-4]+[-5]+[-7]pPSA的和)，與患有癌癥和BPH，總血清PSA為2.5-4ng/ml以及游離PSA小于15％的男人中游離PSA/總PSA(％F)的比較。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳述本發(fā)明的一個(gè)方面提供了診斷方法，以幫助檢測和/或確定個(gè)體中前列腺癌的存在，或者幫助區(qū)分個(gè)體中前列腺癌和BPH。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，這種方法包括下列步驟a)確定患者生物樣品中所含的總PSA的量；b)確定樣品中游離PSA的量；以及計(jì)算游離PSA與總PSA的比例；c)確定樣品中pPSA的量；以及d)基于總PSA的水平和游離PSA％，通過將pPSA的量與用已知癌癥和良性疾病診斷的對照樣品所確立的預(yù)定值進(jìn)行比較，使樣品中所含的pPSA的量與患者中前列腺癌的存在相關(guān)。
總PSA和游離PSA的測量方法是本領(lǐng)域眾所周知的，在此不再贅述。對于本發(fā)明而言，術(shù)語“總PSA”是指免疫學(xué)上可用的PSA形式，包括游離PSA和PSA與ACT的復(fù)合物。本發(fā)明所用的術(shù)語“游離PSA”是指不與其他任何蛋白復(fù)合但在溶液中以30kDa蛋白形式存在的PSA。
如本發(fā)明所用，術(shù)語“proPSA”，“pPSA”，“proPSA多肽”，以及“pPSA多肽”可以互換，并且優(yōu)選包括所有失活前體形式的PSA，包括但不限于[-2]proPSA，[-4]proPSA，[-7]proPSA以及[-5]proPSA。
pPSA的量可通過本發(fā)明所述，或本領(lǐng)域公知，或?qū)黹_發(fā)的任何方法測量，只要它們能夠進(jìn)行這種測量。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，樣品中所含的pPSA可通過包括下列步驟的方法進(jìn)行測量將特異性結(jié)合于proPSA的因子與樣品在允許形成包含proPSA和因子的二元復(fù)合物的條件下接觸，以及檢測和確定復(fù)合物的量。
對于本發(fā)明而言，因子可以是能夠以足夠特異性結(jié)合于pPSA的任何分子種類。如果結(jié)合使得包含因子和pPSA的復(fù)合物形成并且確定復(fù)合物的量，則結(jié)合特異性就是足夠的。潛在分子種類的例子包括但不限于抗體，衍生自抗體的抗原結(jié)合片段以及抗體等同物，諸如但不限于適體(aptamer)等。對于本發(fā)明而言，特異于pPSA的因子可通過本領(lǐng)域公知的方法加以選擇。例如，任何已知的結(jié)合試驗(yàn)均可用于確定任何給定因子的特異結(jié)合活性。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，proPSA可通過免疫測定方法進(jìn)行測量。可用于確定本發(fā)明的proPSA的量的抗體和免疫測定描述在在審U.S.申請No.09/251,686，09/302,965，09,792,692；和09,792,534中，內(nèi)容在此以其全文引作參考。具體而言，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)PSA以及制備特異于PSA的抗體的細(xì)節(jié)提供在在審U.S.專利申請No.09/251,686和09/302,965中。如該在審申請所述，proPSA多肽或?qū)?yīng)于proPSA區(qū)的肽可表達(dá)和分離自哺乳動(dòng)物細(xì)胞。一旦分離，proPSA肽可用于制備抗pPSA抗體。
怎樣制備抗-pPSA抗體的詳細(xì)方法還描述在在審U.S.申請No.09,792,692中。簡而言之，根據(jù)本發(fā)明，用于生成抗體的proPSA多肽包括但不限于-7，-5，-4和-2proPSA。對應(yīng)于proPSA區(qū)域的肽也可用于生成抗pPSA抗體，并且包括所有含有任何部分的pPSA多肽前區(qū)的肽。這些肽優(yōu)選含有約8-15個(gè)氨基酸，并且包括免疫原性表位。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，通過本發(fā)明產(chǎn)生的抗體優(yōu)選與本發(fā)明的proPSA特異性免疫反應(yīng)和結(jié)合。如本發(fā)明所用的“特異性免疫反應(yīng)或特異性結(jié)合”表示本發(fā)明的抗體識別和結(jié)合proPSA的交叉反應(yīng)性，與識別和結(jié)合其他形式的PSA，諸如其他截短或非截短的成熟形式的PSA相比低10％。特異性結(jié)合proPSA的單克隆抗體的例子包括但不限于PSIZ134，PSIZ120，PSIZ125，PSIZ80，PS2P206，PS2P309，PS2P446，PS2X094，PS2X373，PS2V411和PS2V476。例如，單克隆抗體PS2P446特異于[-7]/[-4]pPSA。PS2X373特異于[-2]pPSA。PS2V476特異于[-4]pPSA。
本發(fā)明的抗體可用于檢測和確定樣品中proPSA的存在及其量，還可用于檢測和確定樣品中不同形式的proPSA的存在及其量。用于檢測和確定proPSA或不同形式的proPSA的量的免疫測定的詳細(xì)描述提供在在審U.S.專利申請No.09,792,534中，在此不再贅述。
本發(fā)明用于確定生物樣品中所含的任何目的PSA的量的典型免疫測定包括下列步驟將特異性與目的PSA結(jié)合的抗體與樣品在允許形成含有PSA和抗體的二元復(fù)合物的條件下接觸；以及(b)檢測和確定復(fù)合物的量。對于本發(fā)明而言，任何能夠與proPSA形成可檢測復(fù)合物的因子可視為抗體的等同物。
通常，本發(fā)明的任何PSA在樣品中的定性和/或定量確定都可通過競爭或非競爭性免疫測定步驟以直接或間接方式完成。這種免疫測定的例子有放射性免疫測定(RIA)和夾心(免疫測定(immunometricassay))試驗(yàn)。利用本發(fā)明的單克隆抗體檢測抗原可以通過以正向，反向或雙向的方式運(yùn)行的免疫測定，包括對生理學(xué)樣品進(jìn)行的免疫組織化學(xué)試驗(yàn)來實(shí)施。本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員會知道，或者可容易地辨別其他免疫測定方式而無需過多的實(shí)驗(yàn)。
術(shù)語“免疫測定試驗(yàn)”或“夾心免疫測定”包括雙向夾心，正向夾心以及反向夾心的免疫測定。這些術(shù)語為本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員所熟知。本領(lǐng)域的專業(yè)人員還會意識到，本發(fā)明的抗體在試驗(yàn)的其他變體和形式中將是有用的，這些變體和形式無論是現(xiàn)今公知的還是將來有待開發(fā)的，都欲包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
對于本發(fā)明而言，生物樣品可以是任何含有本發(fā)明的proPSA的人生理流體樣品。人生理生理流體樣品的例子包括但不限于血清，精液，尿和血漿。此外，單克隆和多克隆抗體均可使用，只要這種抗體對本發(fā)明所提供的抗原具有必要的特異性。優(yōu)選的是采用單克隆抗體。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，免疫測定包括特異于[-2]pPSA，[-4]pPSA和[-5/-7]pPSA的試驗(yàn)。在患有已知前列腺癌或BPH的男人的血清中測量特異形式的pPSA，以及這些分析物的水平用來開發(fā)算法以區(qū)分前列腺癌和良性前列腺病。本發(fā)明免疫測定可用來檢測人生理樣品，諸如血清和組織中的pPSA，其目的是幫助診斷和監(jiān)測前列腺癌。本發(fā)明的試驗(yàn)也可用來幫助區(qū)分前列腺癌和良性前列腺增生。
本發(fā)明令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，當(dāng)分析總PSA為4-10ng/ml以及游離PSA％大于20％，或尤其大于25％的血清樣本時(shí)，pPSA，例如[-2]pPSA，或[-2]，[-4]和[-5/-7]pPSA的和具有顯著升高的癌癥預(yù)測值。此外，在總PSA介于2.5-4ng/ml以及游離PSA低于15％的血清樣本中，pPSA顯示增加的癌癥預(yù)測值。因此，在特定亞群的總PSA和游離PSA％內(nèi)，pPSA異型具有顯著升高的癌癥預(yù)測值。在系列樣品的整個(gè)游離PSA％的范圍中，pPSA異型也可顯示增加的癌癥區(qū)分。當(dāng)選擇選定的游離PSA％范圍或界限時(shí)，這種效果得以顯著增強(qiáng)。下述實(shí)施例顯示在游離PSA大于25％的血清中，一定界限以上的％[-2]pPSA能夠從13個(gè)錯(cuò)失的癌癥中檢測出11個(gè)。
因此，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，樣品中總PSA約2-10ng/ml。當(dāng)總PSA的量介于2-4ng/ml的范圍時(shí)，樣品中游離PSA與總PSA的比例可大于10-25％，或小于15％。在特殊的實(shí)施方案中，總PSA為4-10ng/ml，而游離PSA的比例為大于20％，或25％。
對于本發(fā)明而言，在患者樣品中檢測的pPSA的量可以以任何生成診斷值用于確定前列腺癌存在的方式與前列腺癌的存在相關(guān)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，將pPSA的量與預(yù)定值比較用于確定前列腺癌的存在。鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)，本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)可容易地確定“預(yù)定的界限值”(或閾值)或其他對pPSA的水平用于確定前列腺癌存在所必需的分析參數(shù)。例如，可在診斷有前列腺癌的個(gè)體與沒患有前列腺癌或BPH的個(gè)體中比較上述pPSA的比例，以確定界限值。接受者操作特征(ROC)分析可以以要求的特異性和靈敏度用來確定界限值。ROC分析在本領(lǐng)域中是公知的，并且詳細(xì)描述在參考文獻(xiàn)13(13)中，相關(guān)內(nèi)容在此以其全文引作參考。然后，樣品中pPSA的量可與預(yù)定的界限值進(jìn)行比較，以確定個(gè)體中前列腺癌的存在，其中較高水平的pPSA可以指示前列腺癌。以要求的特異性和靈敏度確定界限值的這種方法和其他方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，無需在此重復(fù)(14-21)。
參照下列實(shí)施例進(jìn)一步對本發(fā)明加以描述。
實(shí)施例I分析患有癌癥和良性疾病的總PSA為4-10ng/ml的血清材料和方法開發(fā)針對pPSA的單克隆抗體(mAbs)通過小鼠免疫有附著于匙孔血藍(lán)蛋白(Pierce Chemical Co.Rockford，IL)的肽開發(fā)針對[-2]和[-4]pPSA的mAbs。對于[-2]pPSA而言，前肽為SRIVGGWECEK，而對于[-4]pPSA而言，肽為ILSRIVGGWECEK。通過常用方法學(xué)19生產(chǎn)雜交瘤，而由與上述各自肽的反應(yīng)性挑選抗體克隆，與對照肽成熟PSA，IVGGWECEK，沒有反應(yīng)性。依據(jù)在Western印跡上識別純化的[-2]和[-4]pPSA蛋白的能力，進(jìn)一步篩選克隆。當(dāng)在還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE電泳時(shí)，通過Western印跡，PS2X373與成熟PSA蛋白顯示出約20％的交叉反應(yīng)性。然而，在非還原條件下，交叉反應(yīng)性降低至5％或更少，因此這些條件用于檢測結(jié)果中的[-2]pPSA。通過標(biāo)準(zhǔn)免疫測定技術(shù)在微滴定板中利用肽免疫原生成的克隆沒有一個(gè)能夠識別溶液中的天然[-2]或[-4]pPSA蛋白。
通過小鼠免疫有附著到人激肽釋放酶2的由PSA prepro前導(dǎo)肽組成的純化的重組嵌合蛋白，獲得針對全長[-7]pPSA的mAbs 16，20。依據(jù)識別天然重組pPSA，以及不識別天然成熟PSA，篩選克隆。通過免疫測定，發(fā)現(xiàn)這些mAbs識別[-7]pPSA和[-5]pPSA，并因此這些抗體在試驗(yàn)形式中可交替的稱為[-7]pPSA或[-5，-7]pPSA的試驗(yàn)。
從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分離重組pPSA如前所述，重組PSA表達(dá)在哺乳動(dòng)物AV12細(xì)胞中。用盡的培養(yǎng)基傳遞到PSA特異mAb，PSM773上。PSM773先前已經(jīng)顯示對成熟PSA，截短形式的PSA和前體形式的PSA具有特異性(10-12)。用40倍體積的含有0.1％還原Triton-X 100的PBS沖洗柱子，結(jié)合蛋白用含有200mM氯化鈉的100mM甘氨酸pH 2.5洗脫。洗脫液立即用10％％vol/vol IM Tris pH8.0中和。純化的PSA不含有成熟的PSA，但含有通過HIC-HPLC純化(12)的[-5/-7]，[-4]和[-2]pPSA分子異型的pPSA。
免疫測定PSAPSA在血清和純化的制劑中的濃度通過Tandem-MP PSA和Tandem-MP游離PSA試驗(yàn)(Hybritech Incorporated，San Diego，CA；Beckman Coulter，Inc.，F(xiàn)ullerton，CA)確定。
免疫測定[-2]，[-4]和[-5/-7]pPSA本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了如下用于測量pPSA形式的免疫測定。將50ul生物素?；目筆SA Ab PSM 773的TandemPSA零cal稀釋劑(5ug/ml)加入EG&G Wallac鏈親和素包被的微滴定板，并且在室溫下振蕩反應(yīng)1小時(shí)。然后，用TandemE洗滌液洗滌板5次。接著將50ul的TandemPSA零cal稀釋劑加入板中，隨后加入50ul的待測血清或抗原。如上讓混合物室溫下反應(yīng)2小時(shí)。用TandemE洗滌液洗滌板5次。向板中加入100ul合適的銪標(biāo)記的檢測mAb的ImA溶液，用于測量各種形式的pPSA。對于[-2]pPSA，檢測mAb為PS2X373；對于[-4]pPSA，為PS2V 411；以及對于[-5/-7]pPSA，為PS2P309。同上讓混合物室溫下反應(yīng)1小時(shí)。然后用TandemE洗滌液洗滌板5次，并且在EG&G Wallac Victor儀上讀數(shù)。
接受者操作特征(ROC)曲線分析采用MedCalc軟件程序(MedCalc Software，Belgium，(info@medcalc.be))生成ROC分析和圖。理論和實(shí)踐描述在Zwieg和Campbell，接受者操作特征(ROC)臨床醫(yī)學(xué)中的基本評價(jià)工具(Receiver operating characteristic(ROC)a fundamental evaluation toolin clinical medicine)，Clinical Chemistry，39，561-577，1993。
結(jié)果在303個(gè)血清樣品上，對總PSA，游離PSA和[-2]pPSA，[-4]pPSA和[-5/-7]pPSA免疫試驗(yàn)進(jìn)行測量，所述樣品含有已知診斷為107個(gè)癌癥和196個(gè)良性疾病。計(jì)算各個(gè)組分的值，并且表示成ng/ml的血清。為了生成ROC曲線分析，將各個(gè)PSA異型的血清值輸入MedCalc程序。ROC是統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，其對一群中的各個(gè)樣品賦予癌癥的陽性和陰性預(yù)測值，并且是最廣泛使用的方法以評價(jià)作為癌癥預(yù)測器的PSA以及游離PSA試驗(yàn)的值和性能。以最簡單的術(shù)語，對于各個(gè)ROC分析曲線下面積AUC用于評價(jià)試驗(yàn)預(yù)測值。較高的AUC值指示更好的總預(yù)測值。ROC值范圍從0.5(隨機(jī)機(jī)會上沒有改進(jìn))到1.0(100％預(yù)測值的完全試驗(yàn))。
在大多數(shù)情況下，ROC分析的目的是使辨別患有癌癥的男人的最大化，以及使對那些沒患有癌癥，即假陽性的男人活檢最小化。當(dāng)分析諸如血清中PSA的生物樣品時(shí)，在真陽性和假陽性的檢測之間存在平衡。例如，取決于所需的結(jié)果，最期望的是檢測95％的癌癥，而對那些患有良性疾病的男人，這不可避免地伴隨著高的假陽性率。在游離PSA％的情形下，例如，為了檢測95％的癌癥，它要求游離PSA小于25％的所有男人進(jìn)行活檢。然而，這卻伴隨著80％的假陽性率。在不同情形下，最期望的是使假陽性率最小化，在此僅有小百分比的真正癌癥會得以檢測。當(dāng)用癌癥發(fā)生率相對小的大群體處理時(shí)，這第二種范例可能是期望的。對整個(gè)群體進(jìn)行活檢不是可行的，因此人們確立了平衡并且檢測如對給定數(shù)目的活檢可行的一樣多的癌癥。這些假設(shè)的例子表示ROC分析的評價(jià)和值不是絕對的，并且在本發(fā)明采用pPSA的情形下，將需要試驗(yàn)以建立有待在實(shí)踐中使用的真正參數(shù)。但是，鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該能夠容易地確定必要的參數(shù)，而無需過多的試驗(yàn)。下文給出的實(shí)施例表明pPSA在檢測給定群體中以及在給定組的標(biāo)準(zhǔn)下的癌癥的值和功效，但是pPSA的用途和界限不限于這些實(shí)施例。
在PSA測試領(lǐng)域，已知游離PSA％與只有總PSA比較在早期癌癥檢測范圍為4-10ng/ml的總PSA中提高了癌癥檢測。在圖1所示的樣品組中，游離PSA％比PSA也具有較高的預(yù)測值，因此在這些樣品中的pPSA測量與游離PSA％比較對提高癌癥預(yù)測值的能力加以評價(jià)。圖1示出了％F(游離PSA％，或游離/總PSA)和％[2，4，5，7]pPSA(所有pPSA形式的和除以游離PSA，即由所有pPSA形式組成的游離PSA的百分比)的比較。在這種情形下，％[2，4，5，7]pPSA比％F示出了適度的提高，正如所見，相對％F，其AUC較高，為0.698對0.631。
圖2使用稍微不同的范例，并且比較了單個(gè)pPSA組分％[-2]pPSA與％F。這種比較的AUC顯示兩種分析物均具有幾乎同等的檢測癌癥的能力。圖3示出[-2]pPSA與％F的比較。在此種情形下，[-2]pPSA表示了這種前體形式在血清中的ng/ml，而非游離PSA％。AUC分析表明[-2]pPSA本身比游離PSA％預(yù)測癌癥的能力較小。
然而，圖4中，對303個(gè)全部樣品群中的子集進(jìn)行了分析。只有那些游離PSA大于20％的男人才篩選出來用于ROC分析。這代表了303個(gè)樣品中的120個(gè)。盡管整個(gè)群含有35％癌癥，但這120個(gè)樣品亞組僅含有23％癌癥，這與隨著％F增加癌癥相對百分比降低的總趨勢一致。圖4中，在游離PSA大于20％的男人中，測量％F幾乎沒有預(yù)測癌癥的能力，AUC為0.504。相比之下，在同樣范圍內(nèi)，[-2]pPSA顯示了顯著提高的預(yù)測癌癥的能力，如AUC為0.674所示。因此，在游離PSA％升高的群體中，[-2]pPSA顯示了癌癥檢測的更高的特異性，其中癌癥更少和更難以檢測。
更迅速和實(shí)際應(yīng)用這種現(xiàn)象可見于圖5中。在該圖中，只對游離PSA大于25％的男人進(jìn)行了分析。在真正隨機(jī)篩選群中，建議游離PSA大于25％的男人不對癌癥進(jìn)行活檢，這是因?yàn)榘┌Y發(fā)現(xiàn)的可能性僅約有8％。由于在該組中沒有常規(guī)血檢預(yù)測癌癥，因此該組男人中的癌癥在正常情形下往往保持不被檢測。圖5顯示[-2]pPSA對該組中癌癥具有高度增強(qiáng)的預(yù)測值，AUC為0.743。游離PSA大于25％處比在游離PSA界限大于20％中，[-2]pPSA的AUC甚至更高，該事實(shí)證實(shí)了下列全部觀察結(jié)果隨著游離PSA％升高，[-2]pPSA變成癌癥的更好的預(yù)測器。難以預(yù)料的是pPSA形式會在特定范圍或界限的游離PSA％中，顯示選擇性癌癥預(yù)測。
如何使用pPSA試驗(yàn)的實(shí)際例子可見于圖6中，顯示了在圖5中單個(gè)值的點(diǎn)陣圖，從生成圖5的同一程序中繪制。在游離PSA大于25％的群體中，有13個(gè)癌癥和51個(gè)非癌癥，假設(shè)主要是BPH。使用界限0.053ng/ml[-2]pPSA，人們可檢測13個(gè)癌癥中的11個(gè)(85％靈敏度)，而活檢僅在該組中測出51個(gè)非癌癥中的含17個(gè)(67％特異性)。再者，給出這作為pPSA如何可用于檢測前列腺癌的例子，但不暗含0.053ng/ml[-2]pPSA為用于這些類型的樣品的最終界限。對患有已知癌癥和BPH的較大對照群體進(jìn)行更廣泛分析，會用于確定適當(dāng)?shù)慕缦拗?。如早先所述，這不是采用不同群體患者的可以期望的唯一方法。
雖然未示出游離PSA大于25％的樣品，其他pPSA形式諸如％[-2]pPSA，[-2]pPSA/總PSA，％[2，4，5，7]pPSA和其他形式與％F比較示出了改進(jìn)的ROC AUCs。
實(shí)施例II分析患有癌癥和良性疾病的男人的含有總PSA為2.5-4ng/ml的血清如實(shí)施例1一樣，在這群總PSA值為2.5-4ng/ml的患者中對同樣系列的PSA試驗(yàn)進(jìn)行測量。在總共286個(gè)樣品中有109個(gè)癌癥和177個(gè)良性疾病樣品。范圍2.5-4ng/ml為一區(qū)域，其中存在許多癌癥，但在隨機(jī)篩選群體中比4-10ng/ml患者的發(fā)生率較低。目前試圖使用％F提高該范圍中的癌癥檢測尚未建立診斷值。
圖7示出了％[2，4，5，7]pPSA與％F的ROC比較。％[2，4，5，7]pPSA對癌癥示出了顯著提高的預(yù)測值。在圖8中，只有游離PSA低于15％的樣品進(jìn)行ROC分析。％[2，4，5，7]pPSA比％F顯示甚至更顯著的AUC增加，指示改進(jìn)的癌癥預(yù)測值。這是下列情形的一個(gè)例子，其中存在癌癥概率低的大群體，并且在此情形下通過設(shè)定參數(shù)以僅挑選癌癥概率非常高，即特異性高的那些樣品，使假陽性最小化是最期望的。
討論這些例子表明，總體上pPSA異型的游離PSA與游離PSA比較充當(dāng)癌癥檢測的獨(dú)立標(biāo)記。這在當(dāng)今診斷目的PSA為2.5-10ng/ml的整個(gè)范圍中是真實(shí)的。所有pPSA異型或單個(gè)異型的pPSA的和提高了患者群體中的癌癥檢測，如早先在下列申請中提出的一樣1999年4月30日提交的申請No.09/302,965(其是1999年2月17日提交的申請No.09/251,686的部分繼續(xù)申請，而這又是1997年4月30日提交的申請No.08/846,408的繼續(xù)申請)。
然而，不可預(yù)料的是，迅速增加的預(yù)測值在由其％F分層抽樣的樣品中將是如此顯著。這是新的發(fā)現(xiàn)，并且暗示pPSA和游離PSA在血清中的總百分比之間的復(fù)雜關(guān)系。為了提高癌癥檢測和減少不必要的活檢，pPSA的測量可應(yīng)用在早期診斷為2-10ng/ml PSA的整個(gè)范圍中。結(jié)果中所給出的例子表明pPSA異型對前列腺癌檢測的實(shí)用性，并且暗示一些相關(guān)例子，但是這些例子并不表示采用不同范圍的PSA，游離PSA％或pPSA界限來限制其他潛在的應(yīng)用。
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權(quán)利要求
1.一種幫助檢測或確定患者中前列腺癌的存在的方法，包括下列步驟a)確定患者生物樣品中所含的總PSA的量；b)確定樣品中游離PSA的量；以及計(jì)算游離PSA與總PSA的比例；c)確定樣品中pPSA的量；以及d)基于總PSA的水平和游離PSA％，通過將pPSA的量與用已知癌癥和良性疾病診斷的對照樣品所確立的預(yù)定值進(jìn)行比較，使樣品中所含的pPSA的量與患者中前列腺癌的存在相關(guān)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述樣品為血清或血漿。
3.權(quán)利要求1的方法，其中總PSA為2.5-10ng/ml，游離PSA與總PSA的比例大于20％，以及pPSA的量高于預(yù)定值指示前列腺癌的存在。
4.權(quán)利要求3的方法，其中總PSA為4-10ng/ml。
5.權(quán)利要求4的方法，其中游離PSA與總PSA的比例大于25％。
6.權(quán)利要求1的方法，其中總PSA為2.5-10ng/ml，游離PSA與總PSA的比例選自5％-25％，以及pPSA的量高于預(yù)定值指示前列腺癌的存在。
7.權(quán)利要求6的方法，其中總PSA為4-10ng/ml。
8.權(quán)利要求1的方法，其中pPSA選自[-2]pPSA，[-4]pPSA，[-5]pPSA和[-7]pPSA。
9.權(quán)利要求1的方法，其中pPSA為選自[-2]pPSA，[-4]pPSA，[-5]pPSA和[-7]pPSA的任意組合。
10.權(quán)利要求8的方法，其中pPSA為[-2]pPSA。
11.權(quán)利要求1的方法，其中總血清PSA為2.5-4ng/ml。
12.權(quán)利要求11的方法，其中游離PSA與總PSA的比例選自5％-25％。
12.權(quán)利要求11的方法，其中游離PSA與總PSA的比例小于15％。
13.權(quán)利要求1的方法，其中總PSA選自增量從2.0到10.0ng/ml的任意組合。
全文摘要
本發(fā)明提高了檢測和確定前列腺癌存在的試驗(yàn)。所述試驗(yàn)?zāi)軌驒z測游離PSA與總PSA的比例顯著高的男人群體中的前列腺癌。所述試驗(yàn)?zāi)軌驒z測低量總PSA，即范圍為2－4ng/ml的男人群體中的前列腺癌。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述試驗(yàn)包括下列步驟(a)確定患者生物樣品中所含的總PSA的量，(b)確定同一樣品中游離PSA的量，并且計(jì)算游離PSA與總PSA的比例，(c)確定同一樣品中pPSA的量，以及(d)基于總PSA的水平和游離PSA％，通過將pPSA的量與采用已知癌癥和良性疾病診斷的對照樣品所確立的預(yù)定值進(jìn)行比較，使樣品中所含的pPSA的量與患者中前列腺癌的存在相關(guān)。
文檔編號G01N33/574GK1656379SQ03811902
公開日2005年8月17日 申請日期2003年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月24日
發(fā)明者史蒂芬·D·米科瓦伊奇克, 哈里·G·里滕豪斯 申請人:海布里特克有限公司