專(zhuān)利名稱(chēng)：草花粉過(guò)敏原Phl p4 的 DNA 序列和用重組方法進(jìn)行的制備的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及提供主要的草花粉過(guò)敏原Phl p4的基因序列。本發(fā)明還包括具有低過(guò)敏反應(yīng)的片段、部分序列的新組合和點(diǎn)突變體。重組DNA分子和衍生出的多肽、片段、部分序列的新組合以及變體能用于治療花粉過(guò)敏性疾病。由重組方法制備的蛋白能用于花粉過(guò)敏癥的體外和體內(nèi)診斷。
1型過(guò)敏癥在世界范圍內(nèi)都是重要的。在工業(yè)化國(guó)家中有高達(dá)20％的人群患有例如過(guò)敏性鼻炎、結(jié)膜炎或支氣管哮喘等疾病。這些過(guò)敏癥由空氣中的過(guò)敏原(空氣過(guò)敏原)導(dǎo)致，它們從不同的起始源釋放，例如植物花粉、微粒、貓或狗。這些1型過(guò)敏癥患者中有高達(dá)40％依次表現(xiàn)出對(duì)草花粉過(guò)敏原的特異性IgE反應(yīng)(Freidhoff等，1986，J.Allergy Clin.Immunol.78，1190-2001)。
引發(fā)1型過(guò)敏癥的物質(zhì)是蛋白、糖蛋白或多肽。從粘膜攝入后，這些過(guò)敏原與結(jié)合在致敏個(gè)體的肥大細(xì)胞表面上的IgE分子反應(yīng)。如果兩個(gè)IgE分子通過(guò)過(guò)敏原彼此交聯(lián)，就會(huì)導(dǎo)致效應(yīng)細(xì)胞釋放介質(zhì)(例如組胺、前列腺素)和細(xì)胞因子，從而產(chǎn)生相應(yīng)的臨床癥狀。
根據(jù)各過(guò)敏原分子與過(guò)敏癥患者的IgE抗體反應(yīng)的相對(duì)頻率，將它們分為主要的和次要的過(guò)敏原。
到目前為止，梯牧草(Phleum pratense)、Phl p1(Petersen et al.，1993，J.Allergy Clin.Immunol.92789-796)、Phl p5(Matthiesen andLowenstein，1991，Clin.Exp.Allergy 21297-307；Petersen et al.，1992，Int.Arch.Allergy Immunol.98105-109)、Phl p6(Petersen et al.，1995，Int.Arch.Allergy Immunol.10849-54)、Phl p2/3(Dolecek et al.，1993，F(xiàn)EBS，335(3)299-304)、Phl p4(Haavik et al.，1985，Int.Arch.AllergyAppl.Immunol.78260-268；Valenta et al.，1992，Int.Arch.AllergyImmunol.97287-294，F(xiàn)ischer et al.，1996，J.Allergy Clin.Immunol.98189-198)和Phl p13(Suck et al.，2000，Clin.Exp.Allergy 30324-332；Suck et al.，2000，Clin.Exp.Allergy 301395-1402)已經(jīng)被認(rèn)為是主要過(guò)敏原。
Phl p4已經(jīng)作為分子量為50-60kDa的基礎(chǔ)糖蛋白來(lái)提及(Haaviketal.，1985，Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.78260-268).Phl p4分子是胰蛋白酶抗性的(Fischer et al.，1996，J.Allergy Clin.Immunol.98189-198)，70-88％的草花粉過(guò)敏癥患者具有針對(duì)該分子的IgE抗體(Valenta et al.，1993，Int.Arch.Allergy Immunol.97287-294；Rossi etal，2001，Allergy 561180-1185；Mari，2003，Clin.Exp.Allergy3343-51)。還描述了來(lái)自相關(guān)草種的同源分子(Su et al.，1991，Clin.Exp.Allergy 21449-455；Jaggi et al.，1989，Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.89342-348；Jaggi et al.，1989，J.Allergy Clin.Immunol.83845-852；Leduc-Brodard et al.，1996，J.Allergy Clin.Immunol.981065-1072；14-17)。這些禾本科(Poaceae)的同源分子形成第4組過(guò)敏原，這些分子對(duì)單克隆小鼠抗體和人IgE抗體具有較高的免疫學(xué)上的彼此交叉反應(yīng)(Fahlbusch et al.，1993 Clin.Exp.Allergy2351-60；Leduc-Brodard et al.，1996，J.Allergy Clin.Immunol.981065-1072；Su et al.，1996，J.Allergy Clin.Immunol.97210；Fahlbusch et al.，1998，Clin.Exp.Allergy 28799-807；Gavrovic-Jankulovic et al.，2000，Invest.Allergol.Clin.Immunol.10(6)361-367；Stumvoll et al.2002，Biol.Chem.3831383-1396；Grote et al，2002，Biol.Chem.3831441-1445；Andersson and Lidholm，2003，Int.Arch.Allergy Immunol.13087-107；Mari，2003，Clin.Exp.Allergy，33(1)43-51)。
與上面提及的梯牧草主要過(guò)敏原(Phl p1，Phl p2/3，Phl 5a和5b，Phl p6和Phl p13)相反，Phl p4的基本結(jié)構(gòu)尚未闡明。類(lèi)似地，也沒(méi)有其它草種的第4組中的分子的完整序列。
迄今還未能成功地測(cè)定N-端氨基酸序列。但是，其原因尚不清楚。Fischer等人(J.Allergy Clin.Immunol.，1996；98189-198)猜想是N-端封閉，但是用賴氨?；鶅?nèi)肽酶降解后能夠純化出內(nèi)部肽并測(cè)定其序列IVALPXGMLK(SEQ ID NO.7)。
該肽與豚草過(guò)敏原Amb a1和Amb a2的肽序列具有同源性，而且類(lèi)似于來(lái)自玉米(Zm58.2)、西紅柿(lat 59，lat 56)和煙草(G10)(Fischer et al.，1996，J.Allergy Clin.Immunol.98189-198)的蛋白的序列。關(guān)于黑麥草(Lolium perenne)，在基本的第4組過(guò)敏原中已經(jīng)描述了具有下述序列的肽片段FLEPVLGLIFPAGV(SEQ ID NO.8)和GLIEFPAGV(SEQ ID NO.9)(Jaggi et al.，1989，Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.89342-348)。
通過(guò)酶降解類(lèi)似地得到了來(lái)自鴨茅(Dactylus glomerata)的第4組過(guò)敏原的肽，并予以測(cè)序DIYNYMEPYVSK(P15，SEQ ID NO 10)，VDPTDYFGNEQ(P17，SEQ ID NO 11)，ARTAWVDSGAQLGELSY(P20，SEQ ID NO 12)，和GVLFNIQYVNYWFAP(P22，SEQ ID NO13)(Leduc-Brodard etal.，1996，J.Allergy Clin.Immunol。981065-1072)。
還通過(guò)蛋白水解得到了亞熱帶狗牙根(Bermuda grass)(Cynodondactylon)的第4組過(guò)敏原的肽，并予以測(cè)序KTVKPLYIITP(S，SEQ ID NO 14)，KQVERDFLTSLTKDIPQLYLKS(V49L，SEQ ID NO 15)，TVKPLYIITPITAAMI(T33S，SEQ ID NO 16)，LRKYGTAADNVIDAKWDAQGRLL(T35L，SEQ ID NO 17)，KWQTVAPALPDPNM(P2，SEQ ID NO 18)，VTWIESVPYIPMGDK(V26L，SEQ ID NO 19)，GTVRDLLXRTSNIKAFGKY(L25L，SEQ ID NO 20)，TSNIKAFGKYKSDYVLEPIPKKS(T22L，SEQ ID NO 21)，YRDLDLGVNQWG(P3，SEQ ID NO 22)，SATPPTHRSGVLFNI(V20L，SEQ ID NO 23)，和AAAALPTQVTRDIYAFMTPYVSKNPRQAYVNYRDLD(V14L，SEQ ID NO 24)(Liaw et al.，2001，Biochem.Biophys.ResearchCommunication 280738-743)。
但是，這些描述的Phl p4肽序列和第4組過(guò)敏原至今還沒(méi)有導(dǎo)致第4組過(guò)敏原完整基本結(jié)構(gòu)的闡述。
因此，本發(fā)明的目的包括提供Phl p4的完整DNA序列和相應(yīng)的重組DNA，Phl p4過(guò)敏原可以由它們表達(dá)為蛋白，并使這樣的或其修飾過(guò)的形式在藥理學(xué)上的重要應(yīng)用成為可能。


圖1由基因組DNA獲得的Phl p4基因擴(kuò)增子的內(nèi)部DNA序列(SEQ ID NO 25)用顯示為斜體的降解引物NO.30(有義)和NO.37(反義)進(jìn)行克隆，并測(cè)序。顯示出的序列代表來(lái)自6個(gè)克隆的共有序列。從該序列產(chǎn)生的特異性有義引物No.82標(biāo)有下劃線。
圖2Phl p4基因的3’端核酸序列(SEQ ID NO 26)用特異性有義引物No.82(顯示為斜體)得到擴(kuò)增子，用梯牧草cDNA得到3’-RACE PCR中的錨定引物，并測(cè)序。顯示出的序列代表來(lái)自3個(gè)測(cè)序過(guò)程的共有序列，包括了Phl p4基因的3’端至終止密碼子(雙下劃線)。用于構(gòu)建反義引物No.85和No.86的序列區(qū)域標(biāo)有下劃線。
圖3Phl p4過(guò)敏原的推導(dǎo)氨基酸序列中的Phl p4肽的定位(SEQID NO2)從純化的成片段的Phl p4過(guò)敏原的氨基酸測(cè)序得到的肽P1-P6(SEQ ID NO’s 27-32)能明確地與從核酸序列衍生出的Phl p4基因的氨基酸序列比對(duì)。
圖4通過(guò)Western印跡、使用對(duì)nPhl p4特異性的單克隆抗體5H1(印跡A)和3C4(印跡B)測(cè)定重組Phl p4(rPhl p4)的身份。
第1道含有rPhl p4片段1-200的E.coli總細(xì)胞提取物第2道含有rPhl p4片段185-500的E.coli總細(xì)胞提取物第3道含有rPhl p4的E.coli總細(xì)胞提取物第4道從梯牧草純化出的nPhl p4(←)C-端rPhl p4片段或rPhl p4完整分子的終止或降解片段圖5通過(guò)Western印跡、使用來(lái)自草花粉過(guò)敏癥患者血清的IgE測(cè)定重組Phl p4(rPhl p4)的反應(yīng)性。
用SDS-PAGE分離表達(dá)完整Phl p4基因或N-端片段1-200或C-端片段185-500的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞的提取物，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。印跡與來(lái)自草花粉過(guò)敏癥供體A、B或C的血清一起孵育，隨后通過(guò)與堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗-人IgE抗體比色檢測(cè)結(jié)合的IgE。
第1道含有rPhl p4片段1-200的大腸桿菌總細(xì)胞提取物第2道含有rPhl p4片段185-500的大腸桿菌總細(xì)胞提取物第3道含有rPhl p4的大腸桿菌總細(xì)胞提取物第4道從梯牧草純化出的nPhl p4
上文和下文中使用的核苷酸或氨基酸序列“SEQ ID NO”的編號(hào)是指說(shuō)明書(shū)所附的序列表。

發(fā)明內(nèi)容
現(xiàn)在，本發(fā)明首次提供了主要的草花粉過(guò)敏原Phl p4的基因序列，并發(fā)現(xiàn)了從單核苷酸多態(tài)性(SNPs)產(chǎn)生的3個(gè)顯性序列(SEQ IDNO1、3和5)。
因此，本發(fā)明涉及一種DNA分子，它相應(yīng)于選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 5的核苷酸序列，或者一種DNA分子，它相應(yīng)于編碼梯牧草的主要過(guò)敏原Phl p4的核苷酸序列。
本發(fā)明還包括具有低過(guò)敏反應(yīng)的片段、部分序列的新組合和點(diǎn)突變體。
因此本發(fā)明還涉及編碼免疫調(diào)節(jié)的、T-細(xì)胞反應(yīng)性的禾本科第4組過(guò)敏原片段的相應(yīng)的部分序列、部分序列的組合或交換、缺失或添加突變體。
除其它草種的第4組過(guò)敏原外，第13組過(guò)敏原也是本發(fā)明的目的，因?yàn)樗鼈冊(cè)赟DS-PAGE中表現(xiàn)出與第4組過(guò)敏原非常相似的分子量，并且難以通過(guò)生化技術(shù)進(jìn)行分離(Suck et al.，2000，Clin.Exp.Allergy 30324-332；Suck et al.，2000，Clin.Exp.Allergy 301395-1402)。在本發(fā)明的蛋白和DNA序列的幫助下，它現(xiàn)在首次可以獲得，但是，可以明確地證明第4和13組具有明顯不同的氨基酸序列。
利用關(guān)于天然過(guò)敏原的DNA序列的知識(shí)，現(xiàn)在可能把這些過(guò)敏原制成用于診斷和治療過(guò)敏性疾病的重組蛋白(Scheiner and Kraft，1995，Allergy 50384-391)。
有效治療過(guò)敏癥的傳統(tǒng)方案是特異性免疫治療或脫敏(Fiebig，1995，Allergo J.4(6)336-339，Bousquet et al.，1998，J.Allergy Clin.Immunol.102(4)558-562)。在該方法中，以遞增的劑量對(duì)患者皮下注射天然過(guò)敏原提取物。但是，該方法有過(guò)敏反應(yīng)或甚至過(guò)敏性休克的風(fēng)險(xiǎn)。為了使這些風(fēng)險(xiǎn)最小化，采用了類(lèi)過(guò)敏原形式的創(chuàng)新制品。它們是化學(xué)修飾的過(guò)敏原提取物，它們具有顯著降低的IgE反應(yīng)性，但是與未處理的提取物相比有等同的T-細(xì)胞反應(yīng)性(Fiebig，1995，Allergo J.4(7)377-382)。
關(guān)于重組方法制備的過(guò)敏原甚至還可能有更多的實(shí)質(zhì)性的治療優(yōu)化。通過(guò)重組方法制備的高純度過(guò)敏原的確定的雞尾酒，任選地與患者的各個(gè)敏化模式相匹配，可以替換來(lái)自于天然過(guò)敏原來(lái)源的提取物，因?yàn)樗鼈兂撕胁煌倪^(guò)敏原以外，還含有相對(duì)大量的免疫原性的、但非過(guò)敏性的次要蛋白。
通過(guò)特異性的突變重組過(guò)敏原提供了現(xiàn)實(shí)的前景，這可以導(dǎo)致用表達(dá)產(chǎn)物可靠的脫敏，該突變重組過(guò)敏原中的IgE表位被特異性地去除，而未消弱治療所必須的T-細(xì)胞表位(Schramm et al.，1999，J.Immunol.1622406-2414)。
其它的在過(guò)敏癥患者體內(nèi)治療性的影響紊亂的TH-細(xì)胞平衡的可能是免疫治療性DNA疫苗。這包括用編碼相關(guān)過(guò)敏原的可表達(dá)的DNA治療。通過(guò)給嚙齒動(dòng)物注射編碼過(guò)敏原的DNA，已經(jīng)提供了過(guò)敏原特異性的影響免疫反應(yīng)的初步實(shí)驗(yàn)證據(jù)(Hsu et al.，1996，NatureMedicine 2(5)540-544)。
本發(fā)明因此還涉及作為藥物的上文或下文所述的DNA分子、或相應(yīng)的重組表達(dá)載體。
通過(guò)重組方法制備的相應(yīng)蛋白可以用于花粉過(guò)敏癥的治療和體外、體內(nèi)診斷。
為了制備重組過(guò)敏原，將克隆的核酸連接到表達(dá)載體上，該構(gòu)建體在合適的宿主生物體中表達(dá)。生化純化后，該重組過(guò)敏原可以通過(guò)已經(jīng)建立的方法用于檢測(cè)IgE抗體。
本發(fā)明因此還涉及含有上文或下文所述的DNA分子的重組表達(dá)載體，該DNA分子功能性地連接到表達(dá)控制序列上，以及用所述的DNA分子或所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主生物體。
本發(fā)明類(lèi)似地涉及至少一種上述的DNA分子或至少一種上述的表達(dá)載體在制備用于過(guò)敏癥患者的免疫治療性DNA接種和/或預(yù)防該過(guò)敏癥的藥物中的應(yīng)用，其中禾本科的第4組過(guò)敏原參與該過(guò)敏癥的誘發(fā)。
如已經(jīng)陳述的，本發(fā)明能用作含有重組過(guò)敏原或核酸的用于特異性免疫治療的制品的主要組分。這里有許多種可能。首先，未改變基本結(jié)構(gòu)的蛋白可以作為制品的組分。其次，通過(guò)特異性地去除整個(gè)分子或編碼T-細(xì)胞表位的各片段制品的IgE表位，低過(guò)敏原性(類(lèi)過(guò)敏原)形式可以根據(jù)本發(fā)明用于治療，以防止不希望的副作用。最后，核酸本身，如果與真核表達(dá)載體連接，提供了一種制品，它的直接應(yīng)用會(huì)在治療意義上改善過(guò)敏免疫狀態(tài)。
因此本發(fā)明涉及與SEQ ID NO 1、3或5相應(yīng)的重組DNA分子，其中1-69位的核苷酸序列源自Phl p4 N-端的氨基酸序列。這里使用了大腸桿菌中常見(jiàn)的密碼子。從70位，該DNA序列與已經(jīng)在梯牧草的基因組和cDNA中識(shí)別鑒定的序列相同。
因此本發(fā)明還涉及含有從SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 3或SEQ IDNO 5的70位開(kāi)始的核苷酸序列的DNA分子，該DNA分子編碼具有梯牧草的主要過(guò)敏原Phl p4的性質(zhì)的多肽。
而且，本發(fā)明涉及由一個(gè)或多個(gè)上述的DNA分子編碼的多肽，優(yōu)選地它們的性質(zhì)是作為藥物。
更具體地說(shuō)，它們是SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 6的多肽，其中已經(jīng)通過(guò)分離的天然Phl p4過(guò)敏原的N-端氨基酸序列分析確定了氨基酸1-33位。24-500位源自SEQ ID NO 1、3和5的DNA序列。6、7、8和9位的可變氨基酸源自對(duì)天然Phl p4的不同制品N-端蛋白序列分析(表1)。
因此，本發(fā)明還涉及一種通過(guò)培養(yǎng)權(quán)利要求11的宿主生物體、從培養(yǎng)物中分離相應(yīng)的多肽來(lái)制備這種多肽的方法。
本發(fā)明類(lèi)似地涉及至少一種上述的多肽在制備用于診斷和/或治療過(guò)敏癥和用于預(yù)防該過(guò)敏癥的藥物中的應(yīng)用，其中禾本科的第4組過(guò)敏原參與該過(guò)敏癥的誘發(fā)。
本發(fā)明的這些作為人過(guò)敏原的多肽或蛋白存在于梯牧草的花粉顆粒中。其它禾本科(例如黑麥草(Lolium perenne)，鴨茅(Dactylisglomerata)，早熟禾(Poa pratensis)，狗牙根(Cynodon dactylon)，絨毛草(Holcus lanatus)等)的花粉顆粒含有同源的過(guò)敏原分子(第4組過(guò)敏原)。
這些分子的同源性已經(jīng)通過(guò)它們與鼠單克隆抗體和人IgE抗體的免疫學(xué)交叉反應(yīng)性進(jìn)行了證實(shí)。
因此，本發(fā)明還涉及與Phl p4 DNA序列同源的序列和其它禾本科(例如黑麥草，鴨茅，早熟禾，狗牙根，絨毛草，小麥(Triticumaestivum)和大麥(Hordeum vulgare))第4組過(guò)敏原的相應(yīng)的DNA分子，由于它們存在序列同源性，它們?cè)趪?yán)格條件下會(huì)與Phl p4 DNA雜交，或者對(duì)Phl p4具有免疫學(xué)的交叉反應(yīng)性。
進(jìn)行下面的操作來(lái)測(cè)定Phl p4的蛋白和DNA序列。
根據(jù)已知的方法(Fahlbusch et al.1998，Clin.Exp.Allergy28799-807，Suck et al.2000，Clin.Exp.Allergy 301395-1402)純化并分離天然過(guò)敏原Phl p4。根據(jù)Suck等人(2000，Clin.Exp.Allergy301395-1402)所述的方法進(jìn)行微純化，并去除第13組過(guò)敏原的痕跡。通過(guò)Edman降解測(cè)定從梯牧草分離的該P(yáng)hl p4的N-端氨基酸序列。用不同批次的Phl p4測(cè)定的N-端序列(P1a-f)如表1所示。前15位的共有序列被認(rèn)為是下述序列YFPP′P′AAKEDFLGXL(SEQ ID NO33)。14位不能測(cè)定；它可能是被半胱氨酸占據(jù)。不同批次在6、7、8和9位的不同氨基酸暗示異構(gòu)意義上的變化。4和5位被羥基脯氨酸(P′)占據(jù)，它在分析制品p1-a和-b時(shí)通過(guò)特異性分析清楚地予以確定。
用內(nèi)肽酶Glu-C(Promega，Heidelberg，Germany)處理SDS-變性的Phl p4產(chǎn)生不同的肽。對(duì)兩種肽(P2和P3)測(cè)定的氨基酸序列如表1所示。用內(nèi)肽酶Lys-C(Roche，Mannheim，Germany)切割來(lái)純化兩種肽(P4和P5)并測(cè)序(表1)。通過(guò)CNBr切割分離另一種肽(P6)，測(cè)定其氨基酸序列(表1)。
N-端序列的氨基酸序列和內(nèi)部肽2和6用作構(gòu)建退火引物的基礎(chǔ)。使用梯牧草基因組DNA，用有義引物No.30和反義引物No.37(表2)制備擴(kuò)增子。對(duì)從這些擴(kuò)增子得到的克隆進(jìn)行測(cè)序(圖1)，并用于構(gòu)建特異性有義引物No.82(表2)。使用從梯牧草花粉的代表性mRNA群體制備出的cDNA、本發(fā)明的特異性有義引物No.82和錨定引物AUAP(Life Technologies，Karlsruhe，Germany)，在嚴(yán)格條件下進(jìn)行PCR。對(duì)約450kb的擴(kuò)增子進(jìn)行測(cè)序，這樣識(shí)別出直到Phl p4基因的3’端的缺失序列(圖2)。以按照本發(fā)明確定的C-端Phl p4序列為基礎(chǔ)，構(gòu)建了特異性反義引物No.85和No.86(表2)。以Phl p4肽P1-a的N-端氨基酸序列(表1)為基礎(chǔ)，構(gòu)建了源自編碼氨基酸24-33位(LYAKSSPAYP(SEQ ID NO 34))的DNA的退火有義引物No.29。
使用梯牧草基因組DNA，用引物No.29和No.86進(jìn)行PCR。該P(yáng)CR產(chǎn)物用作用引物No.29和No.85進(jìn)行的第二次PCR(嵌套的PCR)的基礎(chǔ)。將擴(kuò)增子插入載體pGEM T-easy(Promega，Heidelberg，Germany)，克隆，測(cè)序。該序列開(kāi)始于從N-端計(jì)算的24位或SEQ IDNO 1、3或5的DNA序列的70位，并延伸到引物No.85(SEQ ID NO1、3或5中的1402位)，它位于已經(jīng)確定的Phl p4基因的C-端部分。使用這些數(shù)據(jù)，Phl p4分子的完整氨基酸序列可以從第一個(gè)33氨基酸位置開(kāi)始構(gòu)建，通過(guò)蛋白序列分析和推定的氨基酸序列(477個(gè)位置)進(jìn)行測(cè)定，該氨基酸序列可以源自用引物No.29/No.85和No.82/錨定引物制備的克隆。這兩個(gè)克隆的核苷酸序列在197個(gè)位置重疊。通過(guò)直接氨基酸序列分析進(jìn)行測(cè)定，克隆No.29/No.85編碼的肽與Phl p4的N-端序列(1-33位)在10個(gè)氨基酸位置重疊，這兩種方法測(cè)定的氨基酸相應(yīng)。
基于直接測(cè)定的N-端氨基酸和推導(dǎo)的氨基酸序列的Phl p4的氨基酸序列相應(yīng)于序列表中SEQ ID NO 2、4和6列出的序列相同。
用特異性有義引物No.88(表2)和特異性反義引物No.86制備PCR產(chǎn)物，二者都使用梯牧草的基因組和cDNA，并直接測(cè)序。
這樣可以排除PCR錯(cuò)誤，發(fā)現(xiàn)遺傳變異(單核苷酸多態(tài)性)。
在DNA序列SEQ ID NO 1中發(fā)現(xiàn)的單核苷酸多態(tài)性如表3所示。一些這樣的單核苷酸多態(tài)性導(dǎo)致修飾的氨基酸。這些如表4所示。而且，對(duì)產(chǎn)生相對(duì)于顯性序列SEQ ID NO 2、4和6發(fā)生偏離的氨基酸的DNA克隆進(jìn)行測(cè)序(表5)。這些氨基酸變體認(rèn)為是Phl p4分子的異構(gòu)體。猜測(cè)這些異構(gòu)體的存在是歸因于天然Phl p4的不同等電行為。迄今已知的所有花粉過(guò)敏原都有這樣的異構(gòu)體。通過(guò)發(fā)現(xiàn)了對(duì)于天然Phlp4的已經(jīng)識(shí)別出的內(nèi)部肽P3、P4和P5(表1)的本發(fā)明重組Phl p4分子的推導(dǎo)氨基酸序列中的同源肽序列(圖3)這一事實(shí)，可以證明另一事實(shí)，即引物No.29和86確定的DNA片段實(shí)際上編碼與天然Phl p4過(guò)敏原相同的蛋白。所述的Phl p4氨基酸序列表明，它是由500個(gè)氨基酸組成的基礎(chǔ)分子，具有計(jì)算出的等電點(diǎn)8.99(SEQ ID NO 2)、8.80(SEQ ID NO 4)或9.17(SEQ ID NO 6)。定量的氨基酸組合物如表6所示。計(jì)算出的重組Phl p4的分子量是55.762(SEQ ID NO 2)、55.734(SEQ ID NO 4)或55.624(SEQ ID NO 6)道爾頓。該計(jì)算出的分子量與通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定的55kDa天然Phl p4的分子量非常吻合(Fahlbusch et al.，1998，Clin.Exp.Allergy 28799-807和Suck et al.，2000，Clin.Exp.Allergy 301395-1402)。
已經(jīng)描述了分子量為50-60kDa的相關(guān)草物種的第4組過(guò)敏原(Suet al.，1991，Clin.Exp.Allergy 21449-455；Jaggi et al.，1989，Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.89342-348；Jaggi et al.，1989，J.Allergy Clin.Immunol.83845-852；LeducBrodard et al.，1 996，J.Allergy Clin.Immunol.981065-1072；14-17)。
為了制備重組Phl p4蛋白，將編碼Phl p4的SEQ ID NO 1、3和/或5的DNA序列插入表達(dá)載體(例如pProEx，pλCro，pSE380)。關(guān)于從蛋白測(cè)序獲知的N-端氨基酸，使用了大腸桿菌優(yōu)化密碼子。
轉(zhuǎn)入大腸桿菌后，表達(dá)，用不同的分離方法純化重組Phl p4，得到的蛋白再經(jīng)歷重新折疊過(guò)程。
這樣方法得到的rPhl p4蛋白在SDS-PAGE中出現(xiàn)一條帶，它包括了與天然Phl p4相同分子量的區(qū)域。通過(guò)與鼠單克隆抗體5H1和3C4的反應(yīng)，該抗體5H1和3C4已經(jīng)用天然Phl p4誘導(dǎo)并且與禾本科的同源蛋白(第4組)交叉反應(yīng)(Fahlbusch et al.，1998，Clin.Exp.Allergy28799-807；Gavrovic-Jankulovic et al.，2000，Invest.Allergol.Clin.Immunol.10(6)361-367)(圖4)，已經(jīng)證明了rPhl p4的免疫學(xué)反應(yīng)性。rPhl p4與已經(jīng)證實(shí)了與天然rPhl p4的IgE反應(yīng)性的過(guò)敏癥患者體內(nèi)的IgE抗體反應(yīng)。該IgE反應(yīng)性和作為過(guò)敏原的作用已經(jīng)在點(diǎn)實(shí)驗(yàn)、Western印跡和聚苯乙烯微量滴定板上的過(guò)敏原吸附中予以證實(shí)。Western印跡的檢測(cè)如圖5所示。rPhl p4與第4組過(guò)敏原反應(yīng)性的草花粉過(guò)敏癥患者的嗜堿性細(xì)胞的反應(yīng)時(shí)，刺激它們?cè)黾踊罨瘶?biāo)記CD203c的表達(dá)。這種rPhl p4的嗜堿性細(xì)胞活化清楚地表明，該分子也作為過(guò)敏原起作用。該rPhl p4過(guò)敏原這樣就可以用于草花粉過(guò)敏癥患者的高特異性診斷。該診斷可以在體外通過(guò)檢測(cè)特異性抗體(IgE，IgG1-4，IgA)和與攜帶IgE的效應(yīng)細(xì)胞(例如來(lái)自血液的嗜堿性細(xì)胞)反應(yīng)來(lái)進(jìn)行，或者在體內(nèi)通過(guò)皮試反應(yīng)和對(duì)反應(yīng)器官的刺激來(lái)進(jìn)行。
利用新鮮制備的血液淋巴細(xì)胞中的T細(xì)胞和建立的nPhl p4反應(yīng)性T細(xì)胞系和克隆，通過(guò)過(guò)敏原特異性刺激T淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增和細(xì)胞因子的合成，已經(jīng)檢測(cè)了rPhl p4與草花粉過(guò)敏癥患者的T-淋巴細(xì)胞的反應(yīng)。
以所述的rPhl p4 DNA序列為基礎(chǔ)，將編碼具有50-350個(gè)氨基酸的肽的部分序列克隆入表達(dá)載體。這些部分序列依次包括了rPhl p4的完整序列，有至少12氨基酸的重疊。表達(dá)的肽相應(yīng)于Phl p4片段。單個(gè)的或混合的Phl p4片段與過(guò)敏癥患者的IgE抗體不反應(yīng)，或者僅僅是小范圍的反應(yīng)，因此它們可以歸入低過(guò)敏原類(lèi)。相反，這些片段的混合物能夠以與完整的重組的或天然的Phl p4相同的方式刺激具有Phl p4反應(yīng)性的草花粉過(guò)敏癥患者的T淋巴細(xì)胞。
圖4顯示了作為實(shí)例的通過(guò)與Phl p4特異性單克隆鼠抗體結(jié)合而表征相應(yīng)于氨基酸1-200和185-500的兩個(gè)這樣的Phl p4片段。C-端片段185-500僅僅與單克隆抗體5H1反應(yīng)，而N-端片段1-200清楚地與單克隆抗體3C4反應(yīng)。從圖5可以看出，片段185-500與來(lái)自過(guò)敏癥患者B和C的血清的IgE的反應(yīng)強(qiáng)度較低，即過(guò)敏原性不如片段1-200，它具有降低的IgE反應(yīng)性(低致敏性)，至少對(duì)患者血清C如此。
本發(fā)明因此還涉及上文或下文所述的DNA分子，它編碼具有Phlp4的氨基酸1-200的片段1-200，以及DNA分子，它編碼具有Phl p4的氨基酸285-500的片段285-500。
通過(guò)位點(diǎn)特異性的謗變修飾編碼半胱氨酸的三聯(lián)密碼子，使其編碼其它的氨基酸，優(yōu)選絲氨酸。已經(jīng)制備了這樣的兩種突變體其中各半胱氨酸被替換，其中2個(gè)半胱氨酸基團(tuán)的不同組合或所有的5個(gè)半胱氨酸被修飾。這些半胱氨酸點(diǎn)突變體表達(dá)的蛋白對(duì)過(guò)敏癥患者的IgE抗體具有降低的或零反應(yīng)性，但是與這些患者的T-淋巴細(xì)胞反應(yīng)。本發(fā)明因此還涉及上文或下文所述的DNA分子，其中相應(yīng)多肽的一個(gè)、多個(gè)或所有的半胱氨酸基團(tuán)已經(jīng)通過(guò)定點(diǎn)誘變替換為其它氨基酸。
相應(yīng)于具有T-細(xì)胞表位的多肽的低過(guò)敏原性片段的免疫調(diào)控活性和低過(guò)敏原性點(diǎn)突變體(例如半胱氨酸多態(tài)性)的免疫調(diào)控活性已經(jīng)通過(guò)其與草花粉過(guò)敏癥患者的T細(xì)胞的反應(yīng)予以證實(shí)。
這種低過(guò)敏原性片段或半胱氨酸點(diǎn)突變體可以用作過(guò)敏癥患者的脫敏制品，因?yàn)樗鼈兣cT-細(xì)胞等效反應(yīng)，但是由于降低了或完全沒(méi)有IgE反應(yīng)性，因而減少了IgE介導(dǎo)的副作用。
如果將編碼低過(guò)敏原性Phl p4變體的核酸或未修飾的編碼Phl p4的DNA與人表達(dá)載體連接，這些構(gòu)建體可以同樣用作免疫治療的制品(DNA接種)。
最后，本發(fā)明涉及藥物組合物，它含有至少一種上述的DNA分子或至少一種上述的表達(dá)載體，任選地含有其它用于過(guò)敏癥患者的免疫治療性DNA接種和/或預(yù)防該過(guò)敏證的活性成分和/或佐劑，其中禾本科的第4組過(guò)敏原參與該過(guò)敏癥的誘發(fā)。
另外一組本發(fā)明的藥物組合物含有至少一種上述的多肽，而不是DNA，它適用于診斷和/或治療所述的過(guò)敏癥。
本發(fā)明意義上的藥物組合物含有作為活性成分的本發(fā)明的多肽或表達(dá)載體和/或各自的藥學(xué)上可有用的衍生物，包括它們所有比例的混合物。根據(jù)本發(fā)明的活性成分在這里可以與至少一種固體、液體和/或半液體賦形劑或佐劑，任選地與一種或多種其它的活性成分相組合，制成合適的劑型。
特別合適的佐劑是免疫刺激性DNA或具有CpG效果的寡核苷酸。
這些組合物可以用作人用藥或獸用藥中的治療劑或診斷劑。合適的賦形劑是適合于腸胃外施用且對(duì)本發(fā)明的活性成分不產(chǎn)生負(fù)面影響的有機(jī)物或無(wú)機(jī)物。特別適合腸胃外施用的是溶液，優(yōu)選基于油的或水性溶液，以及懸浮液、乳狀液或灌注液。本發(fā)明的活性成分也可以凍干，得到的凍干物用于，例如，制備注射制品。所指的組合物可以是滅菌的，和/或含有佐劑，例如潤(rùn)滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑和/或潤(rùn)濕劑、乳化劑、用于調(diào)節(jié)滲透壓的鹽、緩沖物和/或多種其它的活性成分。
而且，用本發(fā)明的活性成分的相應(yīng)制劑可以得到持續(xù)釋放的制品。
因此本發(fā)明也用于提高體外診斷，該診斷作為過(guò)敏原組分誘發(fā)的對(duì)患者特異性敏感圖譜的識(shí)別的一部分。本發(fā)明同樣用于制備用于草花粉過(guò)敏癥的特異性免疫治療的顯著改善的制品。
表1 Phl p4肽的氨基酸序列

表2以Phl p4肽序列和DNA序列為基礎(chǔ)構(gòu)建的退火的和特異性有義引物和反義引物

引物82、85、86和88的核苷酸序列以通常的3字母密碼顯示。至于引物29、30和37，則使用IUPAC-IUB DNA碼；這里的字母“N”代表次黃嘌呤核苷。
表3測(cè)得的單核苷酸多態(tài)性



表4單核苷酸多態(tài)性引起的氨基酸交換


表5各重組Phl p4克隆與SEQ ID NO 2相比發(fā)生偏離的氨基酸位置


*[SEQ ID NO 2的氨基酸/在序列中的位置/偏離的氨基酸]表6 Phl p4的氨基酸組成

*包括羥基脯氨酸按照SEQ ID NO 2/SEQ ID NO 4/SEQ ID NO 6的順序給出三個(gè)顯性序列的值。
序列表<110>Merck Patent GmbH<120>草花粉過(guò)敏原Phl p4的DNA序列和用重組方法進(jìn)行的制備<130>P 02/101<140>EP 02 013953.1<141>2002-06-25<160>52<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1503<212>DNA<213>梯牧草(Phleum pratense)<220>
<221>人工DNA序列<222>(1)..(69)<223>來(lái)源于測(cè)序過(guò)的蛋白的DNA序列<220>
<221>天然DNA序列<222>(70)..(1503)<223>
<220>
<221>CDS<222>(1)..(1503)<223>
<400>1tac ttc ccg ccg ccg gct gct aaa gaa gac ttc ctg ggt tgc ctg gtt48Tyr Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Cys Leu Val1 5 10 15aaa gaa atc ccg ccg cgt ctg ttg tac gcg aaa tcg tcg ccg gcg tat96Lys Glu Ile Pro Pro Arg Leu Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro Ala Tyr20 25 30ccc tca gtc ctg ggg cag acc atc cgg aac tcg cgg tgg tcg tcg ccg 144Pro Ser Val Leu Gly Gln Thr Ile Arg Asn Ser Arg Trp Ser Ser Pro35 40 45gac aac gtg aag ccg atc tac atc gtc acc ccc acc aac gcc tcc cac 192Asp Asn Val Lys Pro Ile Tyr Ile Val Thr Pro Thr Asn Ala Ser His50 55 60atc cag tcc gcc gtg gtg tgc ggc cgc cgg cac ggt gtc cgc atc cgc 240Ile Gln Ser Als Val Val Cys Gly Arg Arg His Gly Val Arg Ile Arg65 70 75 80gtg cgc agc ggc ggg cac gac tac gag ggc ctc tcg tac cgg tcc ctg 288Val Arg Ser Gly Gly His Asp Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr Arg Ser Leu85 90 95cag ccc gag gag ttc gcc gtc gtc gac ctt agc aag atg cgg gcc gtg 336Gln Pro Glu Glu Phe Ala Val Val Asp Leu Ser Lys Met Arg Ala Val100 105 110tgg gtg gac ggg aag gcc cgc acg gcg tgg gtc gac tcc ggc gcg cag 384Trp Val Asp Gly Lys Ala Arg Thr Ala Trp Val Asp Ser Gly Ala Gln115 120 125ctc ggc gag ctc tac tac gcc atc cac aag gcg agt cca gtg ctg gcg 432Leu Gly Glu Leu Tyr Tyr Ala Ile His Lys Ala Ser Pro Val Leu Ala130 135 140ttc ccg gcc ggc gtg tgc ccg acc atc ggc gtg ggc ggc aac ttc gcg 480Phe Pro Ala Gly Val Cys Pro Thr Ile Gly Val Gly Gly Asn Phe Ala145 150 155 160ggc ggc ggc ttc ggc atg ctg ctg cgc aag tac ggc atc gcg gcc gag 528Gly Gly Gly Phe Gly Met Leu Leu Arg Lys Tyr Gly Ile Ala Ala Glu165 170 175aac gtc atc gac gtg aag ctc gtc gac gcc aac ggc acg ctg cac gac 576Asn Val Ile Asp Val Lys Leu Val Asp Ala Asn Gly Thr Leu His Asp180 185 190aag aag tcc atg ggc gac gac cat ttc tgg gcc gtc agg ggc ggc ggg 624Lys Lys Ser Met Gly Asp Asp His Phe Trp Ala Val Arg Gly Gly Gly195 200 205
ggc gag agc ttc ggc atc gtg gtc gcg tgg aag gtg agg ctc ctg ccg 672Gly Glu Ser Phe Gly Ile Val Val Ala Trp Lys Val Arg Leu Leu Pro210 215 220gtg ccg ccc acg gtg acc gtg ttc aag atc ccc aag aag gcg agc gag 720Val Pro Pro Thr Val Thr Val Phe Lys Ile Pro Lys Lys Ala Ser Glu225 230 235 240ggc gcc gtg gac atc atc aac agg tgg cag gtg gtc gcg ccg cag ctc 768Gly Ala Val Asp Ile Ile Asn Arg Trp Gln Val Val Ala Pro Gln Leu245 250 255ccc gac gac ctc atg atc cgc gtc atc gcg cag ggc ccc acg gcc acg 816Pro Asp Asp Leu Met Ile Arg Val Ile Ala Gln Gly Pro Thr Ala Thr260 265 270ttc gag gcc atg tac ctg ggc acc tgc caa acc ctg acg ccg atg atg 864Phe Glu Ala Met Tyr Leu Gly Thr Cys Gln Thr Leu Thr Pro Met Met275 280 285agc agc aag ttc ccc gag ctc ggc atg aac gcc tcg cac tgc aac gag 912Ser Ser Lys Phe Pro Glu Leu Gly Met Asn Ala Ser His Cys Asn Glu290 295 300atg tcg tgg atc cag tcc atc ccc ttc gtc cac ctc ggc cac agg gac 960Met Ser Trp Ile Gln Ser Ile Pro Phe Val His Leu Gly His Arg Asp305 310 315 320aac atc gag gac gac ctc ctc aac cgg aac aac acc ttc aag ccc ttc 1008Asn Ile Glu Asp Asp Leu Leu Asn Arg Asn Asn Thr Phe Lys Pro Phe325 330 335gcc gaa tac aag tcg gac tac gtc tac gag ccg ttc ccc aag gaa gtg 1056Ala Glu Tyr Lys Ser Asp Tyr Val Tyr Glu Pro Phe Pro Lys Glu Val340 345 350tgg gag cag atc ttc agc acc tgg ctc ctg aag ccc ggc gcg ggg atc 1104Trp Glu Gln Ile Phe Ser Thr Trp Leu Leu Lys Pro Gly Ala Gly Ile355 360 365atg atc ttc gac ccc tac ggc gcc acc atc agc gcc acc ccg gag tgg 1152Met Ile Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Thr Ile Ser Ala Thr Pro Glu Trp370 375 380gcg acg ccg ttc cct cac cgc aag ggc gtc ctc ttc aac atc cag tac 1200Ala Thr Pro Phe Pro His Arg Lys Gly Val Leu Phe Asn Ile Gln Tyr385 390 395 400gtc aac tac tgg ttc gcc ccg gga gcc ggc gcg gcg cca ttg tcg tgg 1248Val Asn Tyr Trp Phe Ala Pro Gly Ala Gly Ala Ala Pro Leu Ser Trp405 410 415agc aag gag atc tac aac tac atg gag cca tac gtg agc aag aac ccc 1296Ser Lys Glu Ile Tyr Asn Tyr Met Glu Pro Tyr Val Ser Lys Asn Pro420 425 430agg cag gcc tac gcc aac tac agg gac atc gac ctc ggg agg aac gag 1344Arg Gln Ala Tyr Ala Asn Tyr Arg Asp Ile Asp Leu Gly Arg Asn Glu435 440 445gtg gtg aac gac gtc tcc acc ttc agc agc ggt ttg gtg tgg ggc cag 1392
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<211>1503<212>DNA<213>梯牧草<220>
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<221>CDS<222>(1)..(1503)<223>
<400>3tao ttc ccg ccg ccg gct gct aaa gaa gac ttc ctg ggt tgc ctg gtt48Tys Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Cys Leu Val1 5 10 15aaa gaa atc ccg ccg cgt ctg ttg tac gcg aaa tcg tcg ccg gcg tat96Lys Glu Ile Pro Pro Arg Leu Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro Ala Tyr20 25 30ccc tca gtc ctg ggg cag acc atc cgg aac tcg cgg tgg tcg tcg ccg 144Pro Ser Val Leu Gly Gln Thr Ile Arg Asn Ser Arg Trp Ser Ser Pro35 40 45gac aac gtg aag ccg atc tac atc gtc acc ccc acc aac gcc tcc cac 192Asp Asn Val Lys Pro Ile Tyr Ile Val Thr Pro Thr Asn Ala Ser His50 55 60atc cag tcc gcc gtg gtg tgc ggc cgc cgg cac ggt gtc cgc atc cgc 240Ile Gln Ser Ala Val Val Cys Gly Arg Arg His Gly Val Arg Ile Arg65 70 75 80gtg cgc agc ggc ggg cac gac tac gag ggc ctc tcg tac cgg tcc ctg 288Val Arg Ser Gly Gly His Asp Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr Arg Ser Leu85 90 95cag ccc gag gag ttc gcc gtc gtc gac ctt agc aag atg cgg gcc gtg 336Gln Pro Glu Glu Phe Ala Val Val Asp Leu Ser Lys Met Arg Ala Val100 105 110tgg gtg gac ggg aag gcc cgc acg gcg tgg gtc gac tcc ggc gcg cag 384Trp Val Asp Gly Lys Ala Arg Thr Ala Trp Val Asp Ser Gly Ala Gln115 120 125ctc ggc gag ctc tac tac gcc atc cac aag gcg agt aca gtg ctg gcg 432Leu Gly Glu Leu Tyr Tyr Ala Ile His Lys Ala Ser Thr Val Leu Ala130 135 140ttc ccg gcc ggc gtg tgc ccg acc atc ggc gtg ggc ggc aac ttc gcg 480Phe Pro Ala Gly Val Cys Pro Thr Ile Gly Val Gly Gly Asn Phe Ala145 150 155 160ggc ggc ggc ttc ggc atg ctg ctg cgc aag tac ggc atc gcg gcc gag 528Gly Gly Gly Phe Gly Met Leu Leu Arg Lys Tyr Gly Ile Ala Ala Glu165 170 175aac gtc atc gac gtg aag ctc gtc gac gcc aac ggc acg ctg cac gac 576Asn Val Ile Asp Val Lys Leu Val Asp Ala Asn Gly Thr Leu His Asp180 185 190aag aag tcc atg ggc gac gac cat ttc tgg gcc gtc agg ggc ggc ggg 624Lys Lys Ser Met Gly Asp Asp His Phe Trp Ala Val Arg Gly Gly Gly195 200 205
ggc gag agc ttc ggc atc ttg gtc gcg tgg aag gtg agg ctc ctg ccg 672Gly Glu Ser Phe Gly Ile Val Val Ala Trp Lys Val Arg Leu Leu Pro210 215 220gtg ccg ccc acg gtg acc gtg ttc aag atc ccc aag aag gcg agc gag 720Val Pro Pro Thr Val Thr Val Phe Lys Ile Pro Lys Lys Ala Ser Glu225 230 235 240ggc gcc gtg gac atc atc aac agg tgg cag gtg gtc gcg ccg cag ctc 768Gly Ala Val Asp Ile Ile Asn Arp Trp Gln Val Val Ala Pro Gln Leu245 250 255ccc gac gac ctc atg atc cgc gtc atc gcg cag ggc ccc acg gcc acg 816Pro Asp Asp Leu Met Ile Arg Val Ile Ala Gln Gly Pro Thr Ala Thr260 265 270ttc gag gcc atg tac ctg ggc acc tgc caa acc ctg acg ccg atg atg 864Phe Glu Ala Met Tyr Leu Gly Thr Cys Gln Thr Leu Thr Pro Met Met275 280 285agc agc aag ttc ccg gag ctc ggc atg aac gcc tcg cac tgc aac gag 912Ser Ser Lys Phe Pro Glu Leu Gly Met Asn Ala Ser His Cys Asn Glu290 295 300atg tcg tgg atc cag tcc atc ccc ttc gtc cac ctc ggc cac agg gac 960Met Ser Trp Ile Gln Ser Ile Pro Phe Val His Leu Gly His Arg Asp305 310 315 320aac atc gag gac gac ctc ctc aac cgg aac aac acc ttc aag ccc ttc 1006Asn Ile Glu Asp Asp Leu Leu Asn Arg Asn Asn Thr Phe Lys Pro Phe325 330 335gcc gaa tac aag tcg gac tac gtc tac gag ccg ttc ccc aag agg gtg 1056Ala Glu Tyr Lys Ser Asp Tyr Val Tyr Glu Pro Phe Pro Lys Arg Val340 345 350tgg gag cag atc ttc agc acc tgg ctc ctg aag ccc ggc gcg ggg atc 1104Trp Glu Gln Ile Phe Ser Thr Trp Leu Leu Lys Pro Gly Ala Gly Ile355 360 365atg atc ttc gac ccc tac ggc gcc acc atc agc gcc acc ccg gag tgg 1152Met Ile Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Thr Ile Ser Ala Thr Pro Glu Trp370 375 380gcg acg ccg ttc cct cac cgc aag ggc gtc ctc ttc aac atc cag tac 1200Ala Thr Pro Phe Pro His Arg Lys Gly Val Leu Phe Asn Ile Gln Tyr385 390 395 400gtc aac tac tgg ttc gcc ccg gga gcc ggc gcg gcg cca ttg tcg tgg 1248Val Asn Tyr Trp Phe Ala Pro Gly Ala Gly Ala Ala Pro Leu Ser Trp405 410 415agc aag gag atc tac aac tac atg gag cca tac gtg agc aag aac ccc 1296Ser Lys Glu Ile Tyr Asn Tyr Met Glu Pro Tyr Val Ser Lys Asn Pro420 425 430agg cag gcc tac gcc aac tac agg gac atc gac ctc ggg agg aac gag 1344Arg Gln Ala Tyr Ala Asn Tyr Arg Asp Ile Asp Leu Gly Arg Asn Glu435 440 445gtg gtg aac gac gtc tcc acc ttc agc agc ggt ttg gtg tgg ggc cag 1392
Val Val Asn Asp Val Ser Thr Phe Ser Ser Gly Leu Val Trp Gly Gln450 455 460aaa tac ttc aag ggc aat ttc cag agg ctc gcc atc acc aag ggc aag 1440Lys Tyr Phe Lys Gly Asn Phe Gln Arg Leu Ala Ile Thr Lys Gly Lys465 470 475 480gtg gat ccc acc gac tac ttc agg aac gag cag agc atc ccg ccg ctc 1488Val Asp Pro Thr Asp Tyr Phe Arg Asn Glu Gln Ser Ile Pro Pro Leu485 490 495atc aaa aag tac tga 1503Ile Lys Lys Tyr500<210>4<211>500<212>PRT<213>梯牧草<400>4Tyr Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Cys Leu Val1 5 10 15Lys Glu Ile Pro Pro Arg Leu Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro Ala Tyr20 25 30Pro Ser Val Leu Gly Gln Thr Ile Arg Asn Ser Arg Trp Ser Ser Pro35 40 45Asp Asn Val Lys Pro Ile Tyr Ile Val Thr Pro Thr Asn Ala Ser His50 55 60Ile Gln Ser Ala Val Val Cys Gly Arg Arg His Gly Val Arg Ile Arg65 70 75 80Val Arg Ser Gly Gly His Asp Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr Arg Ser Leu85 90 95Gln Pro Glu Glu Phe Ala Val Val Asp Leu Ser Lys Met Arg Ala Val100 105 110Trp Val Asp Gly Lys Ala Arg Thr Ala Trp Val Asp Ser Gly Ala Gln115 120 125Leu Gly Glu Leu Tyr Tyr Ala Ile His Lys Ala Ser Thr Val Leu Ala130 135 140
Phe Pro Ala Gly Val Cys Pro Thr Ile Gly Val Gly Gly Asn Phe Ala145 150 155 160Gly Gly Gly Phe Gly Met Leu Leu Arg Lys Tyr Gly Ile Ala Ala Glu165 170 175Asn Val Ile Asp Val Lys Leu Val Asp Ala Asn Gly Thr Leu His Asp180 185 190Lys Lys Ser Met Gly Asp Asp His Phe Trp A la Val Arg Gly Gly Gly195 200 205Gly Glu Ser Phe Gly Ile Val Val Ala Trp Lys Val Arg Leu Leu Pro210 215 220Val Pro Pro Thr Val Thr Val Phe Lys Ile Pro Lys Lys Ala Ser Glu225 230 235 240Gly Ala Val Asp Ile Ile Asn Arg Trp Gln Val Val Ala Pro Gln Leu245 250 255Pro Asp Asp Leu Met Ile Arg Val Ile Ala Gln Gly Pro Thr Ala Thr260 265 270Phe Glu Ala Met Tyr Leu Gly Thr Cys Gln Thr Leu Thr Pro Met Met275 280 285Ser Ser Lys Phe Pro Glu Leu Gly Met Asn Ala Ser His Cys Asn Glu290 295 300Met Ser Trp Ile Gln Ser Ile Pro Phe Val His Leu Gly His Arg Asp305 310 315 320Asn Ile Glu Asp Asp Leu Leu Asn Arg Asn Asn Thr Phe Lys Pro Phe325 330 335Ala Glu Tyr Lys Ser Asp Tyr Val Tyr Glu Pro Phe Pro Lys Arg Val340 345 350Trp Glu Gln Ile Phe Ser Thr Trp Leu Leu Lys Pro Gly Ala Gly Ile355 360 365Met Ile Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Thr Ile Ser Ala Thr Pro Glu Trp370 375 380
Ala Thr Pro Phe Pro His Arg Lys Gly Val Leu Phe Asn Ile Gln Tyr385 390 395 400Val Asn Tyr Trp Phe Ala Pro Gly Ala Gly Ala Ala Pro Leu Ser Trp405 410 415Ser Lys Glu Ile Tyr Asn Tyr Met Glu Pro Tyr Val Ser Lys Asn Pro420 425 430Arg Gln Ala Tyr Ala Asn Tyr Arg Asp Ile Asp Leu Gly Arg Asn Glu435 440 445Val Val Asn Asp Val Ser Thr Phe Ser Ser Gly Leu Val Trp Gly Gln450 455 460Lys Tyr Phe Lys Gly Asn Phe Gln Arg Leu Ala Ile Thr Lys Gly Lys465 470 475 480Val Asp Pro Thr Asp Tyr Phe Arg Asn Glu Gln Ser Ile Pro Pro Leu485 490 495Ile Lys Lys Tyr500<210>5<211>1503<212>DNA<213>梯牧草<220>
<221>人工DNA序列<222>(1)..(69)<223>來(lái)源于測(cè)序過(guò)的蛋白的DNA序列<220>
<221>天然DNA序列<222>(70)..(1503)<223>
<220>
<221>CDS<222>(1)..(1503)<223>
<400>5tac ttc ccg ccg ccg gct gct aaa gaa gac ttc ctg ggt tgc ctg gtt 48Tyr Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Cys Leu Val1 5 10 15aaa gaa atc ccg ccg cgt ctg ttg tac gcg aaa tcg tcg ccg gcg tat 96Lys Glu Ile Pro Pro Arg Leu Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro Ala Tyr20 25 30ccc tca gtc ctg ggg cag acc atc cgg aac tcg agg tgg tcg tcg ccg144Pro Ser Val Leu Gly Gln Thr Ile Arg Asn Ser Arg Trp Ser Ser Pro35 40 45gac aac gtg aag ccg ctc tac atc atc acc ccc acc aac gtc tcc cac192Asp Asn Val Lys Pro Leu Tyr Ile Ile Thr Pro Thr Asn Val Ser His50 55 60atc cag tcc gcc gtg gtg tgc ggc cgc cgc cac agc gtc cgc atc cgc240Ile Gln Ser Ala Val Val Cys Gly Arg Arg His Ser Val Arg Ile Arg65 70 75 80gtg cgc agc ggc ggg cac gac tac gag ggc ctc tcg tac cgg tct ttg288Val Arg Ser Gly Gly His Asp Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr Arg Ser Leu85 90 95cag ccc gag acg ttc gcc gtc gtc gac ctc aac aag atg cgg gcg gtg336Gln Pro Glu Thr Phe Ala Val Val Asp Leu Asn Lys Met Arg Ala Val100 105 110tgg gtg gac ggc aag gcc cgc acg gcg tgg gtg gac tcc ggc gcg cag384Trp Val Asp Gly Lys Ala Arg Thr Ala Trp Val Asp Ser Gly Ala Gln115 120 125ctc ggc gag ctc tac tac gcc atc tat aag gcg agc ccc acg ctg gcg432Leu Gly Glu Leu Tyr Tyr Ala Ile Tyr Lys Ala Ser Pro Thr Leu Ala130 135 140ttc ccg gcc ggc gtg tgc ccg acg atc gga gtg ggc ggc aac ttc gcg480Phe Pro Ala Gly Val Cys Pro Thr Ile Gly Val Gly Gly Asn Phe Ala145 150 155 160ggc ggc ggc ttc ggc atg ctg ctg cgc aag tac ggc atc gcc gcg gag528Gly Gly Gly Phe Gly Met Leu Leu Arg Lys Tyr Gly Ile Ala Ala Glu165 170 175aac gtc atc gac gtg aag ctc gtc gac gcc aac ggc aag ctg cac gac576Asn Val Ile Asp Val Lys Leu Val Asp Ala Asn Gly Lys Leu His Asp180 185 190aag aag tcc atg ggc gac gac cat ttc tgg gcc gtc agg ggc ggc ggg624Lys Lys Ser Met Gly Asp Asp His Phe Trp Ala Val Arg Gly Gly Gly195 200 205
ggc gag agc ttc ggc atc gtg gtc gcg tgg cag gtg aag ctc ctg ccg 672Gly Glu Ser Phe Gly Ile Val Val Ala Trp Gln Val Lys Leu Leu Pro210 215 220gtg ccg ccc acc gtg aca ata ttc aag atc tcc aag aca gtg agc gag 720Val Pro Pro Thr Val Thr Ile Phe Lys Ile Ser Lys Thr Val Ser Glu225 230 235 240ggc gcc gtg gac atc atc aac aag tgg caa gtg gtc gcg ccg cag ctt 768Gly Ala Val Aep Ile Ile Asn Lys Trp Gln Val Val Ala Pro Gln Leu245 250 255ccc gcc gac ctc atg atc cgc atc atc gcg cag ggg ccc aag gcc acg 816Pro Ala Asp Leu Met Ile Arg Ile Ile Ala Gln Gly Pro Lys Ala Thr260 265270ttc gag gcc atg tac ctc ggc acc tgc aaa acc ctg acg ccg ttg atg 864Phe Glu Ala Met Tyr Leu Gly Thr Cys Lys Thr Leu Thr Pro Leu Met275 280 285agc agc aag ttc ccg gag ctc ggc atg aac ccc tcc cac tgc aac gag 912Ser Ser Lys Phe Pro Glu Leu Gly Met Asn Pro Ser His Cys Asn Glu290 295 300atg tca tgg atc cag tcc ato ccc tto gtc cac ctc ggc cac agg gac 960Met Ser Trp Ile Gln Ser Ile Pro Phe Val His Leu Gly His Arg Asp305 310 315 320gcc ctc gag gac gac ctc ctc aac cgg aac aac tcc ttc aag ccc ttc 1008Ala Leu Glu Asp Asp Leu Leu Asn Arg Asn Asn Ser Phe Lys Pro Phe325 330 335gcc gaa tac aag tcc gac tac gtc tac cag ccc ttc ccc aag acc gtc 1056Ala Glu Tyr Lys Ser Asp Tyr Val Tyr Gln Pro Phe Pro Lys Thr Val340 345 350tgg gag cag atc ctc aac acc tgg ctc gtc aag ccc ggc gcc ggg atc 1104Trp Glu Gln Ile Leu Asn Thr Trp Leu Val Lys Pro Gly Ala Gly Ile355 360 365arg atc ttc gac ccc tac ggc gcc acc atc agc gcc acc ccg gag tcc 1152Met Ile Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Thr Ile Ser Ala Thr Pro Glu Ser370 375 380gcc acg ccc ttc cct cac cgc aag ggc gtc ctc ttc aac atc cag tac 1200Ala Thr Pro Phe Pro His Arg Lys Gly Val Leu Phe Asn Ile Gln Tyr385 390 395 400gtc aac tac tgg ttc gcc ccg gga gcc gcc gcc gcg ccc ctc tcg tgg 1248Val Asn Tyr Trp Phe Ala Pro Gly Ala Ala Ala Ala Pro Leu Ser Trp405 410 415agc aag gac atc tac aac tac atg gag ccc tac gtg agc aag aac ccc 1296Ser Lys Asp Ile Tyr Asn Tyr Met Glu Pro Tyr Val Ser Lys Asn Pro420 425 430agg cag gcg tac gca aac tac agg gac atc gac ctc ggc agg aac gag 1344Arg Gln Ala Tyr Ala Asn Tyr Arg Asp Ile Asp Leu Gly Arg Asn Glu435 440 445gtg gtc aac gac gtc tcc acc tac gcc agc ggc aag gtc tgg ggc cag 1392
Val Val Asn Asp Val Ser Thr Tyr Ala Ser Gly Lys Val Trp Gly Gln450 455 460aaa tac ttc aag ggc aac ttc gag agg ctc gcc att acc aag ggc aag 1440Lys Tyr Phe Lys Gly Asn Phe Glu Arg Leu Ala Ile Thr Lys Gly Lys465 470 475 480gtc gat cct acc gac tac ttc agg aac gag cag agc atc ccg ccg ctc 1488Val Asp Pro Thr Asp Tyr Phe Arg Asn Glu Gln Ser Ile Pro Pro Leu485 490 495atc aaa aag tac tga 1503Ile Lys Lys Tyr500<210>6<211>500<212>PRT<213>梯牧草<400>6Tyr Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Cys Leu Val1 5 10 15Lys Glu Ile Pro Pro Arg Leu Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro Ala Tyr20 25 30Pro Ser Val Leu Gly Gln Thr Ile Arg Asn Ser Arg Trp Ser Ser Pro35 40 45Asp Asn Val Lys Pro Leu Tyr Ile Ile Thr Pro Thr Asn Val Ser His50 55 60Ile Gln Ser Als Val Val Cys Gly Arg Arg His Ser Val Arg Ile Arg65 70 75 80Val Arg Ser Gly Gly His Asp Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr Arg Ser Leu85 90 95Gln Pro Glu Thr Phe Ala Val Val Asp Leu Asn Lys Met Arg Ala Val100 105 110Trp Val Asp Gly Lys Ala Arg Thr Ala Trp Val Asp Ser Gly Ala Gln115 120 125Leu Gly Glu Leu Tyr Tyr Ala Ile Tyr Lys Ala Ser Pro Thr Leu Ala130 135 140
Phe Pro Ala Gly Val Cys Pro Thr Ile Gly Val Gly Gly Asn Phe Ala145 150 155 160Gly Gly Gly Phe Gly Met Leu Leu Arg Lys Tyr Gly Ile Ala Ala Glu165 170 175Asn Val Ile Asp Val Lys Leu Val Asp Ala Asn Gly Lys Leu His Asp180 185 190Lys Lys Ser Met Gly Asp Asp His Phe Trp Ala Val Arg Gly Gly Gly195 200 205Gly Glu Ser Phe Gly Ile Val Val Ala Trp Gln Val Lys Leu Leu Pro210 215 220Val Pro Pro Thr Val Thr Ile Phe Lys Ile Ser Lys Thr Val Ser Glu225 230 235 240Gly Ala Val Asp Ile Ile Asn Lys Trp Gln Val Val Ala Pro Gln Leu245 250 255Pro Ala Asp Leu Met Ile Arg Ile Ile Ala Gln Gly Pro Lys Ala Thr260 265 270Phe Glu Ala Met Tyr Leu Gly Thr Cys Lys Thr Leu Thr Pro Leu Met275 280 285Ser Ser Lys Phe Pro Glu Leu Gly Met Asn Pro Ser His Cys Asn Glu290 295 300Met Ser Trp Ile Gln Ser Ile Pro Phe Val His Leu Gly His Arg Asp305 310 315 320Ala Leu Glu Asp Asp Leu Leu Asn Arg Asn Asn Ser Phe Lys Pro Phe325 330 335Ala Glu Tyr Lys Ser Asp Tyr Val Tyr Gln Pro Phe Pro Lys Thr Val340 345 350Trp Glu Gln Ile Leu Asn Thr Trp Leu Val Lys Pro Gly Ala Gly Ile355 360 365Met Ile Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Thr Ile Ser Ala Thr Pro Glu Ser370 375 380
Ala Thr Pro Phe Pro His Arg Lys Gly Val Leu Phe Asn Ile Gln Tyr385 390 395 400Val Asn Tyr Trp Phe Ala Pro Gly Ala Ala Ala Ala Pro Leu Ser Trp405 410 415Ser Lys Asp Ile Tyr Asn Tyr Met Glu Pro Tyr Val Ser Lys Asn Pro420 425 430Arg Gln Ala Tyr Ala Asn Tyr Arg Asp Ile Asp Leu Gly Arg Asn Glu435 440 445Val Val Asn Asp Val Ser Thr Tyr Ala Ser Gly Lys Val Trp Gly Gln450 455 460Lys Tyr Phe Lys Gly Asn Phe Glu Arg Leu Ala Ile Thr Lys Gly Lys465 470 475 480Val Asp Pro Thr Asp Tyr Phe Arg Asn Glu Gln Ser Ile Pro Pro Leu485 490 495Ile Lys Lys Tyr500<210>7<211>10<212>PRT<213>梯牧草<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(60)..(6)<223>未確定的氨基酸<400>7Ile Val Ala Leu Pro Xaa Gly Met Leu Lys1 5 10<210>8<211>14
<212>PRT<213>黑麥草(Lolium Perenne)<400>8Phe Leu Glu Pro Val Leu Gly Leu Ile Phe Pro Ala Gly Val1 5 10<210>9<211>9<212>PRT<213>黑麥草<400>9Gly Leu Ile Glu Phe Pro Ala Gly Val1 5<210>10<211>12<212>PRT<213>鴨茅(Dactylus glomerata)<400>10Asp Ile Tyr Asn Tyr Met Glu Pro Tyr Val Ser Lys1 5 10<210>11<211>11<212>PRT<213>鴨茅<400>11Val Asp Pro Thr Asp Tyr Phe Gly Asn Glu Gln1 5 10<210>12
<211>17<212>PRT<213>鴨茅<400>12Ala Arg Thr Ala Trp Val Asp Ser Gly Ala Gln Leu Gly Glu Leu Ser1 5 10 15Tyr<210>13<211>15<212>PRT<213>鴨茅<400>13Gly Val Leu Phe Asn Ile Gln Tyr Val Asn Tyr Trp Phe Ala Pro1 5 10 15<210>14<211>11<212>PRT<213>狗牙根(Cynodon dactylon)<400>14Lys Thr Val Lys Pro Leu Tyr Ile Ile Thr Pro1 5 10<210>15<211>22<212>PRT<213>狗牙根<400>15
Lys Gln Val Glu Arg Asp Phe Leu Thr Ser Leu Thr Lys Asp Ile Pro1 5 10 15Gln Leu Tyr Leu Lys Ser20<210>16<211>16<212>PRT<213>狗牙根<400>16Thr Val Lys Pro Leu Tyr Ile Ile Thr Pro Ile Thr Ala Ala Met Ile1 5 10 15<210>17<211>24<212>PRT<213>狗牙根<400>17Leu Arg Lys Tyr Gly Thr Ala Ala Asp Asn Val Ile Asp Ala Lys Val1 5 10 15Val Asp Ala Gln Gly Arg Leu Leu20<210>18<211>14<212>PRT<213>狗牙根<400>18Lys Trp Gln Thr Val Ala Pro A la Leu Pro Asp Pro Asn Met1 510<210>19
<211>15<212>PRT<213>狗牙根<400>19Val Thr Trp Ile Glu Ser Val Pro Tyr Ile Pro Met Gly Asp Lys1 5 10 15<210>20<211>19<212>PRT<213>狗牙根<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>未確定的氨基酸<400>20Gly Thr Val Arg Gln Leu Leu Xaa Arg Thr Ser Asn Ile Lys Ala Phe1 5 10 15Gly Lys Tyr<210>21<211>23<212>PRT<213>狗牙根<400>21Thr Ser Asn Ile Lys Ala Phe Gly Lys Tyr Lys Ser Asp Tyr Val Leu1 5 10 15Glu Pro Ile Pro Lys Lys Ser20
<210>22<211>13<212>PRT<213>狗牙根<400>22Tyr Arg Asp Leu Asp Leu Gly Val Asn Gln Val Val Gly1 5 10<210>23<211>15<212>PRT<213>狗牙根<400>23Ser Ala Thr Pro Pro Thr His Arg Ser Gly Val Leu Phe Asn Ile1 5 10 15<210>24<211>36<212>PRT<213>狗牙根<400>24Ala Ala Ala Ala Leu Pro Thr Gln Val Thr Arg Asp Ile Tyr Ala Phe1 5 10 15Met Thr Pro Tyr Val Ser Lys Asn Pro Arg Gln Ala Tyr Val Asn Tyr20 25 30Arg Asp Leu Asp35<210>25<211>149
<212>DNA<213>梯牧草<400>25caccggaagg gggtgctgtt caacatccag tacgtcaact actggttcgc cccgggagcc 60ggcgcggcgc cattgtcgtg gagcaaggag atctacaact acatggagcc gtacgtgagc 120aaggaccccg tccaggccta cgccaacta 149<210>26<211>299<212>DNA<213>梯牧草<400>26actactggtt cgccccggga gccggcgcgg cgccattgtc gtggagcaag gagatctaca 60actacatgga gccatacgtg agcaagaacc ccaggcaggc ctacgccaac tacagggaca 120tcgacctcgg gaggaacgag gtggtgaacg acgtctccac cttcagcagc ggtttggtgt 180ggggccagaa atacttcaag ggcaacttcc agaggctcgc catcaccaag ggcaaggtgg 240atcccaccga ctacttcagg aacgagcaga gcatcccgcc gctcatcaaa aagtactga 299<210>27<211>33<212>PRT<213>梯牧草<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(14)..(14)<223>未確定的氨基酸<400>27Tyr Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Xaa Leu Val1 5 10 15
Lys Glu Ile Pro Pro Arg Leu Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro Ala Tyr20 25 30Pro<210>28<211>18<212>PRT<213>梯牧草<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>未確定的氨基酸<400>28Ser Ala Thr Pro Phe Xaa His Arg Lys Gly Val Leu Phe Asn Ile Gln1 5 10 15Tyr Val<210>29<211>10<212>PRT<213>梯牧草<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(3)..(8)<223>未確定的氨基酸<400>29Gly Leu Xaa Tyr Arg Xaa Leu Xaa Pro Glu1 5 10
<210>30<211>12<212>PRT<213>梯牧草<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(9)<223>未確定的氨基酸<400>30Lys Xaa Met Gly Asp Asp His Phe Xaa Ala Val Arg1 5 10<210>31<211>9<212>PRT<213>梯牧草<400>31Ala Pro Glu Gly Ala Val Asp Ile Ile1 5<210>32<211>16<212>PRT<213>未確定的氨基酸<400>32Met Glu Pro Tyr Val Ser Ile Asn Pro Val Gln Ala Tyr Ala Asn Tyr1 5 10 15<210>33
<211>15<212>PRT<213>梯牧草<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(14)..(14)<223>未確定的氨基酸<400>33Tyr Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Xaa Leu1 5 10 15<210>34<211>10<212>PRT<213>梯牧草<400>34Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro Ala Tyr Pro1 5 10<210>35<211>33<212>PRT<213>梯牧草<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(14)..(14)<223>未確定的氨基酸<400>35
Tyr Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Xaa Leu Val1 5 10 15Lys Glu Ile Pro Pro Arg Leu Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro Ala Tyr20 25 30Pro<210>36<211>29<212>PRT<213>梯牧草<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(14)..(14)<223>未確定的氨基酸<400>36Tyr Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phs Leu Gly Xaa Leu Val1 5 10 15Lys Glu Pro Pro Arg Leu Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro20 25<210>37<211>15<212>PRT<213>梯牧草<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(4)..(14)<223>未確定的氨基酸
<400>37Tyr Phe Pro Xaa Xaa Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Xaa Leu1 5 10 15<210>38<211>15<212>PRT<213>梯牧草<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(4)..(14)<223>未確定的氨基酸<400>38Tyr Phe Pro Xaa Xaa Ala Lys Lys Glu Asp Phe Leu Gly Xaa Leu1 5 10 15<210>39<211>15<212>PRT<213>梯牧草<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(4)..(14)<223>未確定的氨基酸<400>39Tyr Phe Pro Xaa Xaa Ala Ala Lys Asp Asp Phe Leu Gly Xaa Leu1 5 10 15<210>40<211>11
<212>PRT<213>梯牧草<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(4)..(5)<223>未確定的氨基酸<400>40Tyr Phe Pro Xaa Xaa Leu Ala Asn Glu Asp Phe1 5 10<210>41<211>18<212>PRT<213>梯牧草<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>未確定的氨基酸<400>41Ser Ala Thr Pro Phe Xaa His Arg Lys Gly Val Leu Phe Asn Ile Gln1 5 10 15Tyr Val<210>42<211>10<212>PRT<213>梯牧草
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(3)..(8)<223>未確定的氨基酸<400>42Gly Leu Xaa Tyr Arg Xaa Leu Xaa Pro Glu1 5 10<210>43<211>12<212>PRT<213>梯牧草<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(9).
<223>未確定的氨基酸<400>43Lys Xaa Met Gly Asp Asp His Phe Xaa Ala Val Arg1 5 10<210>44<211>9<212>PRT<213>梯牧草<400>44Ala Pro Glu Gly Ala Val Asp Ile Ile1 5<210>45<211>16
<212>PRT<213>梯牧草<400>45Met Glu Pro Tyr Val Ser Ile Asn Pro Val Gln Ala Tyr Ala Asn Tyr1 5 10 15<210>46<211>29<212>DNA<213>梯牧草<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(29)<223>′n′表示次黃嘌呤核苷<400>46ytntaygcna arwsnwsncc ngcntaycc 29<210>47<211>28<212>DNA<213>梯牧草<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(28)<223>′n′表示次黃嘌呤核苷<400>47caymgnaarg gngtnytntt yaayatmc28<210>48
<211>26<212>DNA<213>梯牧草<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(26)<223>′n′表示次黃嘌呤核苷<400>48tarttngcrt angcytgnac nggrtt26<210>49<211>23<212>DNA<213>梯牧草<400>49actactggtt cgccccggga gcc 23<210>50<211>28<212>DNA<213>梯牧草<400>50tgaagtattt ctggccccac accaaacc 28<210>51<211>24<212>DNA<213>梯牧草<400>51cccttggtga tggcgagcct ctgg 24
<210>52<211>23<212>DNA<213>梯牧草<400>52ctcagtcctg gggcagacca tcc 2權(quán)利要求
1.DNA分子，它相應(yīng)于選自SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 3和SEQID NO 5的核苷酸序列。
2.DNA分子，它含有從70位開(kāi)始的權(quán)利要求1的核苷酸序列，它編碼具有梯牧草的主要過(guò)敏原Phl p4的性質(zhì)的多肽。
3.DNA分子，它相應(yīng)于編碼梯牧草的主要過(guò)敏原Phl p4的核苷酸序列。
4.DNA分子，它在嚴(yán)格條件下與權(quán)利要求1～3中的一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的DNA分子雜交，并且源自禾本科物種的DNA序列。
5.DNA分子，它編碼能與梯牧草的主要過(guò)敏原Phl p4發(fā)生免疫學(xué)上的交叉反應(yīng)的多肽，并且源自禾本科物種的DNA序列。
6.DNA分子，它相應(yīng)于權(quán)利要求1～5中的一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的部分序列或部分序列的組合，它編碼免疫調(diào)控性的T-細(xì)胞反應(yīng)性的第4組禾本科過(guò)敏原的片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的DNA分子，它編碼選自下組的Phl p4片段片段1-200，具有Phl p4的氨基酸1-200；片段185-500，具有Phl p4的氨基酸185-500。
8.DNA分子，它相應(yīng)于權(quán)利要求1～7中的一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的核苷酸序列，它編碼免疫調(diào)控性的T-細(xì)胞反應(yīng)性的片段，其特征在于，所述的核苷酸序列已經(jīng)通過(guò)各個(gè)密碼子的特異性突變、去除或增加進(jìn)行了特異性的修飾。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的DNA分子，其特征在于，所述的突變導(dǎo)致相應(yīng)多肽中一個(gè)、多個(gè)或所有半胱氨酸替換為其它的氨基酸。
10.重組DNA表達(dá)載體或克隆系統(tǒng)，它含有與表達(dá)控制序列功能性連接的權(quán)利要求1～9中的一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的DNA分子。
11.宿主生物體，它被權(quán)利要求1～9中的一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的DNA分子或權(quán)利要求10的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化。
12.通過(guò)培養(yǎng)權(quán)利要求11的宿主生物體、從培養(yǎng)物中分離相應(yīng)的多肽來(lái)制備權(quán)利要求1～9中的一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的DNA序列編碼的多肽的方法。
13.權(quán)利要求1～9中的一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的DNA序列編碼的多肽。
14.用作藥物的權(quán)利要求13的多肽。
15.藥物組合物，它含有至少一種權(quán)利要求14的多肽，任選地含有其它用于過(guò)敏癥的診斷和/或治療的活性成分和/或佐劑，其中禾本科的第4組過(guò)敏原參與該過(guò)敏癥的誘發(fā)。
16.至少一種權(quán)利要求14的多肽在制備用于診斷和/或治療過(guò)敏癥和/或預(yù)防該過(guò)敏癥的藥物中的應(yīng)用，其中禾本科的第4組過(guò)敏原參與該過(guò)敏癥的誘發(fā)。
17.用作藥物的權(quán)利要求1～9中的一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的DNA分子。
18.用作藥物的權(quán)利要求10所述的重組表達(dá)載體。
19.藥物組合物，它含有至少一種權(quán)利要求17的DNA分子或至少一種權(quán)利要求18的表達(dá)載體，任選地含有其它用于過(guò)敏癥患者的免疫治療性DNA接種和/或預(yù)防該過(guò)敏癥的活性成分和/或佐劑，其中禾本科的第4組過(guò)敏原參與該過(guò)敏癥的誘發(fā)。
20.至少一種權(quán)利要求17的DNA分子或至少一種權(quán)利要求18的表達(dá)載體在制備用于過(guò)敏癥患者的免疫治療性DNA接種和/或預(yù)防該過(guò)敏癥的藥物中的應(yīng)用，其中禾本科的第4組過(guò)敏原參與該過(guò)敏癥的誘發(fā)。
全文摘要
本發(fā)明涉及提供主要的草花粉過(guò)敏原Phl p4的基因序列。本發(fā)明還包括具有低過(guò)敏反應(yīng)的片段、部分序列的新組合和點(diǎn)突變體。重組DNA分子和衍生出的多肽、片段、部分序列的新組合以及變體能用于治療花粉過(guò)敏性疾病。由重組方法制備的蛋白能用于花粉過(guò)敏癥的體外和體內(nèi)診斷。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1665835SQ03815178
公開(kāi)日2005年9月7日 申請(qǐng)日期2003年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月25日
發(fā)明者H·菲比希, A·南迪, R·蘇克, O·克羅姆維爾, A·彼得森, W·-M·貝克 申請(qǐng)人:默克專(zhuān)利股份公司