專利名稱：對化學試劑分類并鑒定其細胞靶的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于表征例如諸如可用于治療哺乳動物病原體感染的的化合物的抗生素化合物，以及鑒定其細胞靶的領域。本發(fā)明進一步涉及對抗生素化合物進行分類的方法和用于確定其作用方式的方法。
背景技術：
食品來源和水來源傳染病的流行正在全世界不斷增長且成為嚴重的公共衛(wèi)生威脅。更糟的是，對抗生素有抗性的微生物的百分比也正快速增長，而研究人員正愈加關注與我們吃的食物和我們飲用的水有關的交叉抗性。特別關注的是金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(MRSA)菌株中對二甲氧基苯青霉素的抗性和腸道球菌(VRE)菌株中對″最后-依靠″的抗生素萬古霉素的抗性及其向其他生物體的傳播。
過去，細菌抗藥性的解決主要依賴于臨床上可行的抗-微生物藥劑的開發(fā)。除了發(fā)現(xiàn)來自植物和動物的天然抗菌肽外，最近幾年中幾乎沒有開發(fā)出新的抗生素。因此，目前幾乎不期望基于在活細胞中直接測定特定化合物的抑制能力的傳統(tǒng)抗生素篩選法。
根據(jù)上述，提供鑒定先導化合物，即對人無毒的抗生素化合物的分子靶的方法將是本領域中的重大進步。如果該方法能鑒定抗生素化合物新的分子靶，其將是更大的進步。
發(fā)明概述本發(fā)明是基于這樣的理解，即微生物生化組成的內在變化是刺激物的性質的特征，所述生化組成的內在變化源于該微生物接受的來自其周圍環(huán)境的外界刺激物。因此，通過測定這些內在變化，微生物可用作傳感器以測定其環(huán)境條件以及，更具體地，刺激物的性質。所述刺激物的實例為化學物質，其能抑制微生物的生長或甚至殺死微生物，如抗生素化合物。已經令人驚訝地發(fā)現(xiàn)微生物對物質接觸的反應和該物質影響微生物生長的特定方式可用于對那些物質進行分類，例如通過所述物質的作用方式或通過所述物質的分子靶和/或通過所述物質影響的代謝途徑。
在第一個方面，本發(fā)明現(xiàn)在利用該發(fā)現(xiàn)提供產生用于化合物的分類表的方法，包括根據(jù)如通過將所述生物暴露于多種單個化合物持續(xù)少于一個世代的時期所測定的生物生化反應譜的相似性而進行聚類。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述根據(jù)相似性的聚類包括主要組分的分析。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述化合物為抗生素化合物。在又一個優(yōu)選實施方案中，所述多種單個化合物包括作用方式已知的參照化合物并且其中所述模式為根據(jù)作用方式相似性聚類的參照反應譜。
在另一個方面，本發(fā)明提供了用于通過本發(fā)明的方法可獲得的化合物的分類表。
在另一方面本發(fā)明提供了對化合物進行分類的方法，包括通過實施如上所述產生化合物分類表的本發(fā)明的方法，將生物體暴露于所述化合物，測定所述生物體的生化反應譜，以及確定所述生化反應譜在所述分類表中的聚類位置而提供用于化合物分類表的步驟。
在又一方面本發(fā)明提供了根據(jù)作用方式對抗生素化合物進行分類的方法，包括通過實施產生如上所述化合物分類表的方法提供化合物的分類表的步驟，其中所述化合物為抗生素化合物，其中多種單個的抗生素化合物包含作用方式已知的參照化合物并且其中所述譜為根據(jù)作用方式相似性聚類的參照反應譜，所述方法包括將生物體暴露于所述抗生素化合物，確定所述生物的生化反應譜，確定所述生化反應譜在所述分類表中的聚類位置，以及將所述抗生素化合物指定至參照反應譜的對應聚類的作用方式或如果所述位置在參照反應譜的任何已知的聚類之外，將所述抗生素化合物指定至新的作用方式的額外步驟。
在又一方面，本發(fā)明提供了分析抗生素化合物作用方式的方法，包括以下步驟，實施根據(jù)本發(fā)明的對抗生素化合物進行分類的方法，其中所述生化反應譜是轉錄反應譜，由此確定所述抗生素化合物的轉錄反應譜的聚類位置，由所述轉錄反應譜鑒定所述生物的基因，所述基因的表達受暴露于所述抗生素化合物的顯著影響并且其表征了所述聚類位置，和由所述基因的同一性來確定受所述抗生素化合物所影響的細胞過程。
在又一方面，本發(fā)明提供了鑒定抗生素化合物的新的作用方式的方法，包括以下步驟，實施根據(jù)本發(fā)明對抗生素化合物進行分類的方法，其中所述生化反應譜是轉錄反應譜，選擇其相應轉錄反應譜具有在任何參照反應譜的已知聚類之外的聚類位置的抗生素化合物，由所述選定化合物的轉錄反應譜鑒定所述生物的基因，所述基因的表達受暴露于所述選定抗生素化合物的顯著影響并且其表征了所述聚類位置，和由所述基因的同一性來確定受所述選定抗生素化合物所影響的細胞過程，由此鑒定新的作用方式。
在又一方面，本發(fā)明提供了鑒定抗生素化合物的分子靶的方法，包括以下步驟，實施如上所述分析抗生素化合物作用方式的方法或實施如上所述鑒定抗生素化合物新的作用方式的方法，選擇一組表征被所述抗生素化合物影響的過程的潛在分子靶，并在所述潛在分子靶組中鑒定抗生素化合物的分子靶。
在又一方面，本發(fā)明提供了鑒定新的代謝途徑的方法，包括以下步驟，實施如上所述的對抗生素化合物進行分類的方法，其中所述生化反應譜是轉錄反應譜，其中所述多種單個的化合物包含作用方式已知的參照化合物并且其中所述譜為根據(jù)作用方式相似性聚類的參照反應譜，選擇其相應轉錄反應譜具有在任何參照反應譜的已知聚類之外的聚類位置的化合物，由所述轉錄反應譜鑒定所述生物的基因，所述基因的表達受暴露于所述化合物的顯著影響并且其表征了所述的聚類位置，以及由所述基因的同一性來確定受所述化合物影響的細胞過程，由此鑒定新的代謝途徑。


圖1顯示了基本上如權利要求1所要保護的產生化合物分類表的方法的流程圖。
圖2顯示了基本上如權利要求9所要保護的對化合物進行分類的方法的流程圖。
圖3顯示了基本上如權利要求10所要保護的根據(jù)作用方式對抗生素化合物進行分類的方法的流程圖。
圖4顯示了一記分曲線，其中描繪了來自實施例1中所述實驗的數(shù)據(jù)。
圖5顯示一記分曲線，其中描繪了來自實施例2中所述實驗的數(shù)據(jù)。
發(fā)明詳述本文所用的術語“條目”指可以通過本發(fā)明的方法分類的任何事物并且包括化合物，例如抗生素化合物，和生化反應譜，例如轉錄反應譜或參照譜。
本文所用的術語“世代時間”指在微生物的對數(shù)生長期期間每次細胞分裂的恒定時間間隔(即加倍時間[td])，其可以由td＝ln2/μ計算而來，其中μ是特定的生長速率。對數(shù)期是最大的生長時期，此時在細胞數(shù)目(或細胞質量的對數(shù))和時間之間有線性關系，所述線性關系可以描述為dN/dt＝μN或dx/dt＝μx，其中N＝細胞數(shù)目，x＝細胞質量(g)，t＝時間(h)，而μ＝特定生長速率(h-1)。許多種因素可以影響細胞的世代時間a)物理生長條件。細胞在最佳的條件下比在次優(yōu)化的條件下生長得更快。例如，大腸桿菌(Escherichia coli)中在15℃時的td是180分鐘，而它在37℃時僅為20分鐘(假定所有其它條件都是最佳的)；b)營養(yǎng)生長條件。細胞在富營養(yǎng)的培養(yǎng)基中比在貧瘠的培養(yǎng)基中生長得更快。例如，大腸桿菌在營養(yǎng)肉湯中的td約為20分鐘而在化學配制的培養(yǎng)基中可以高達50分鐘(假定所有其它條件都是最佳的)；c)微生物的類型。一些物種天生比其它物種生長得更快。例如，在其各自最佳條件下，大腸桿菌具有20分鐘的td而干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)具有60分鐘的td。
以本領域公認的意義使用術語“分類(classifying)”并且因而指通過類別或類目來對條目，即化合物或反應譜進行排列或排序，或基于它們共有的和/或將它們區(qū)別開來的特性將它們分入邏輯分級類別，亞類，和亞-亞類。具體地，“分類”指將未分類的化合物或反應譜指定到一種類別或種類?！邦悇e”則是基于一種或多種特征、屬性、特性、品質、作用、參數(shù)等的一組條目，所述特征等是它們共同具有的，以便根據(jù)已經確立的系統(tǒng)或方案對它們進行分類。
以本領域公認的意義使用術語“分類表”并且因而指根據(jù)一套預先確立的原則進行排列的類別列表，以便基于條目的相似性和差異將它們歸類在一個集合中或歸類到各組中。
術語“聚類”指集合、聚集或聯(lián)合到一個具有相同或相似要素的聚群或聚群條目中，“聚群”指緊密聚集或存在在一起的一組或許多相同或相似的條目?！熬垲惖摹敝笚l目已經進行過聚類。
術語“聚類位置”指單個條目在許多聚群中的定位，所述定位是通過將所述條目進行聚類而確定的。
用于本發(fā)明的方法中的聚類方法可以是任何已知的在特征、屬性、特性、品質、作用等方面，通過來自可測量參數(shù)的數(shù)據(jù)比較條目相似性的數(shù)學方法?？梢允褂媒y(tǒng)計學分析，如例如實例多變量分析，或其它分析方法。優(yōu)選地使用諸如自組織圖譜、分級聚類、多維量標度法、主要組分分析、監(jiān)督學習法、k-最近鄰法、支持向量機、判別分析和/或部分最小二乘法。在本發(fā)明方法的最優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)相似性使用主要組分分析對條目進行聚類。
本文所用的“生化反應譜”指一組數(shù)據(jù)，通常以圖或表的形式，其代表源于一種刺激的生物的生化組成的質或量的變化，所述刺激為即該生物暴露于化合物。在本說明書中通篇中所述生化組成意指一起形成細胞的各種(生)化化合物的組成，所述生化組成的變化意指刺激前的組成減去刺激后的組成，矯正作一般試驗影響。
本文所用的“轉錄反應譜”指一組數(shù)據(jù)，通常以圖或表的形式，其代表源于一種刺激的生物的mRNA庫的質或量的變化，所述刺激即為該生物暴露于化合物。“轉錄反應譜”可以通過轉錄譜圖化而適當?shù)孬@得，該方法使用10到數(shù)千種排列在微陣列中的不同DNA探針，每種DNA都代表不同的基因或基因的部分，在某一時間點同時量化存在于細胞中的全部或大部分的不同mRNA分子，由此對該細胞的轉錄組進行表征。術語“反應譜”意指刺激前的mRNA分子組成減去刺激后的mRNA分子組成，矯正作一般試驗影響。
原則上，任何生物都可以用在本發(fā)明的方法中，包括植物、動物(包括人)和優(yōu)選的微生物?？捎糜诒景l(fā)明的方法中的微生物可以包括細菌、archaea、真菌、酵母、原生動物和藻類。更優(yōu)選使用細菌、真菌和/或酵母。
在本說明書的上下文中“敏感”生物是對化合物作出響應的生物，即它在暴露于所述化合物后其化學成分顯示可檢測的變化。因而，“敏感”不僅涉及抗生素產生的生長抑制，還在本文中以更泛化的語境進行使用。
“參照化合物”是一種化合物，它的一種或多種用來對化合物進行分類的特性是已知的并且其被用來確立參照反應譜。當所述化合物是抗生素時，已知的特性可以包括例如作用方式和/或靶。
合適的參照化合物包括抗生素如作為蛋白質合成抑制劑的紅霉素、四環(huán)素和氯霉素，作為干擾膜完整性的化合物的粘菌素和多粘菌素B硫酸鹽，作為干擾核酸合成的化合物的環(huán)丙沙星和利福平，和作為干擾細胞壁合成的化合物復達欣和氨芐青霉素。
術語“相似性”指相似，即具有相同或一些相同特性，如作用方式、靶或生化反應譜的狀態(tài)或質量。
參照反應譜的已知聚群是作用方式、靶或影響的細胞過程是已知的聚群。這類知識可以由文獻數(shù)據(jù)或由經驗性測試或由實施本發(fā)明的方法而獲得。
術語“受影響的”包括諸如被作用、被影響，或被改變、被轉化、被修飾和/或被變化的意思。在基因表達的語境中它可以具體指其中的提高或降低，而在細胞過程的語境中它可以具體指其抑制或刺激。
“分子靶”是細胞成分，它的功能被抗生素化合物的作用所干擾。本領域已知的分子靶包括細胞壁中的肽聚糖橋，核糖體形式的蛋白質合成機制，以及許多蛋白質如RNA酶P，二氫葉酸還原酶和DNA促旋酶?？股氐淖饔媚Ｊ绞抢绺蓴_蛋白質合成，干擾膜完整性或細胞壁合成。
通常，鑒定抗生素靶的現(xiàn)有技術方法是通過首先鑒定其表達受到影響的基因以及從由此獲得的遺傳信息推知可能的靶或作用方式進行表征。
相反，本發(fā)明方法是通過結合已知的作用方式，已知的靶和/或已知的受影響的代謝途徑產生大量的生化參照反應譜，隨后對那些譜進行分析尋找共同特性，即，對所述譜進行聚類，一旦在已知的聚群中發(fā)現(xiàn)某一種化合物的獨特譜就對所述譜進行研究以產生確立例如新代謝途徑或新靶所需的遺傳信息進行表征。這種方法比現(xiàn)有技術的方法有效得多并且成本效率高得多。
本發(fā)明的方法包括通過利用測試由化學或生物學化合物產生的靶生物的生長抑制的經典微生物學技術來選擇潛在抗生素化合物。優(yōu)選地，所述化合物在哺乳類細胞的細胞毒性測試中呈陰性就可以被潛在地用作抗生素。生物的生長抑制顯示所述生物對所述化合物的敏感性。
隨后如下將選定的潛在抗生素化合物應用如下生成生化反應譜將靶生物暴露于高劑量的(優(yōu)選高于最小抑制濃度或MIC)的測試化合物，優(yōu)選所述生物的對數(shù)培養(yǎng)中期。
在暴露持續(xù)1秒到24小時的時間后，優(yōu)選1和20分鐘之間，固定或淬滅所述生物的細胞中的細胞代謝。淬滅可以通過利用4倍體積的60％甲醇于-40℃立即淬滅細胞代謝而適當?shù)匕l(fā)生。隨后，測定所述生物的生化組分。例如，分離RNA分子并進行熒光標記以便通過DNA微陣列雜交進行檢測。所述DNA微陣列代表例如所述生物的基因組。把用暴露細胞獲得的雜交結果，即在這種情況下為轉錄譜與用在相同條件下培養(yǎng)的正常未暴露細胞獲得的雜交結果相比以提供轉錄反應譜。
本發(fā)明的一個特征是暴露于化合物是短暫的，并且優(yōu)選在高于最小抑制濃度的濃度上?！岸虝骸币庵杆霰┞痘旧喜辉试S生物在所述化合物存在的情況下進行完整的生長周期。相反，優(yōu)選對基因表達的影響限于直接從暴露于化合物并且不從多效性影響如細胞死亡或與減弱的生長或生長阻滯間接關聯(lián)的影響所發(fā)出的那些影響。一般，暴露于化合物的合適持續(xù)時間可以表示為少于一個世代時間，更優(yōu)選在大約1到45分鐘范圍內的時間，更優(yōu)選在大約1到15分鐘范圍內的時間，最優(yōu)選大約10分鐘的時間。本領域技術人員會理解，為了測量化合物對微生物的真實影響，暴露時間可以在化合物之間有所不同，因為一些化合物將影響膜完整性，導致細胞反應幾乎立即的級聯(lián)，而其它化合物將對蛋白質合成具有影響，導致在代謝上，例如在表達譜上更加逐漸的反應。同樣地，暴露時間可以在不同生物之間以及在不同培養(yǎng)條件之間有所不同。
淬滅細胞代謝是本發(fā)明的優(yōu)選特征。這意指細胞代謝的阻滯基本上是立即的。許多現(xiàn)有技術受限于不受控制或不明確的暴露方案，因為代謝未被立即終止或阻滯，這是由于沒有實施淬滅，作為結果所觀察到的改變表達的影響是相當多效性的。
在敏感生物暴露于不同化合物之后獲得的轉錄反應譜優(yōu)選地通過主要組分分析進行比較，其隨后根據(jù)例如生物學作用方式或其它相似參數(shù)的相似性提供轉錄譜的聚類。利用由此獲得的類群可能基于化合物的作用方式對它們進行分類。
化合物的這種分類是本發(fā)明方法的中心，因為由這種分類發(fā)生了多種可能性。例如，可以生成各種分類表，例如基于參照化合物現(xiàn)有的知識，如對于受影響的靶或作用方式或細胞過程的知識?；蛘?，分類可以純粹地基于反應譜的聚類。
基于上面分類方法的其中一種，可以選擇化合物作進一步分析。這種分析可以包含首先選擇和鑒定其表達在某種轉錄譜的聚群中被強烈影響的那些基因。基于這些結果確定細胞中的哪種生物學過程被所述化合物所影響。這一信息隨后形成選擇有關化合物的有限組的潛在分子靶的基礎。
在對于新的抗微生物策略研究中，現(xiàn)在根據(jù)本發(fā)明的抗生素化合物的分類促進了生化反應譜的鑒定，所述生化反應譜與在例如數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有的任何已知反應譜不相似。由此，推知所獲得的反應譜是新的，以及所述化合物的靶是新的，或所述化合物的作用方式是新的。因而，通過利用本發(fā)明的方法能夠尋找新的抗生素化合物和/或尋找新的靶。
另外，本發(fā)明允許對于未進行廣泛研究的生物檢測合適的抗微生物化合物。這與現(xiàn)有技術的方法形成對比，在現(xiàn)有技術中所用微生物的基因組的功能的基本部分是已知的(常用的是例如酵母屬(Saccharomyces))。這些現(xiàn)有技術的方法僅僅允許鑒定被已知化合物影響的代謝途徑。所以本發(fā)明的這一特征是允許特異性檢測可以用來影響對基因組無深入了解的新發(fā)現(xiàn)微生物株生長的抗微生物化合物。因而，用本發(fā)明有可能鑒定小譜的抗生素化合物，即僅能夠阻滯特異性微生物，優(yōu)選特異性株系生長的化合物?？梢匀菀椎乜闯鲞@種新的抗生素化合物將在臨床設置中非常有用。首先，它將對于引發(fā)感染性疾病的株系是特異性的，而不會干涉身體中的所有其它微生物，其經常是有用的(腸菌群)。另外，這種抗生素化合物將不能引起交叉耐受性，這降低了生成多重抗性細菌菌株的危險。
在實踐中生物的生化組成是來自生物，優(yōu)選用于本發(fā)明方法中的微生物的生物分子的測量數(shù)據(jù)的集合。所述測量數(shù)據(jù)優(yōu)選獲自定性測量，但也可以利用(半)定量測量。
合適的測量數(shù)據(jù)的集合是通過生物的轉錄表達譜形成的，例如可通過測量細胞中各種信使RNA分子，即轉錄組而獲得。另一種測量數(shù)據(jù)的集合是由生物的蛋白表達譜形成的，其可以通過測量存在于細胞中的各種蛋白質分子，即蛋白質組來獲得。又一種備選是代謝物，即代謝組(metabolome)的集合。
反映細胞的生物學條件或狀態(tài)的生物的生化組成因而可以通過測量轉錄狀態(tài)，由此測定RNA的量，翻譯狀態(tài)，由此測定蛋白質的量，活性狀態(tài)，由此測定酶學活性，或代謝途徑的狀態(tài)，由此測定代謝物的量，或通過測量其組合來進行測量。事實上，許多不同生物分子的測量可以提供生物的生化組成，所述生物可以用于本發(fā)明的方法中。
這種生物分子可以包含多核苷酸，如核酸，“多”肽或蛋白，多糖，脂，脂多糖和/或其它細胞大分子。還可以測量代謝中間物如糖，有機酸，醇，脂肪酸，氨基酸，核苷酸等。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中測量核酸，如RNA，包括信使、轉運和核糖體RNA或其組合。
在本發(fā)明的方法的更優(yōu)選的實施方案中通過測定細胞的轉錄狀態(tài)，即如以信使RNA的形式所測量的，來測定生物的生化組成。
優(yōu)選以并行的生化分析方法進行生物的生物分子的測量，所述測量可以用來生成在一起提供生化組成的測量數(shù)據(jù)的集合。這些測量可以例如通過分離細胞生物分子，共同或個別地標記它們以及定性或定量地檢測它們來進行。
在此上下文中，分離細胞生物分子意指基于它們的特異性生化特征對相同生物分子的組進行物理分離，目的在于檢測，以及如果必要的話，量化由此分離的生物分子。物理分離各組相同生物分子是，不過并不總是必要的。在此上下文中，生物分子的標記意指用特異性標記物特異性或非特異性標記生物分子，目的在于檢測和，如果必要的話，量化由此標記的生物分子。這些技術是本領域公知的。
為了進行這些測量，可以使用一種或多種下列技術，如-原位測量技術，如核酸探針技術和/或免疫學測量技術；利用這些技術，可以單獨或個別地測量多種細胞組分，而不用通過特異性或非特異性檢測技術進行的實際分離，其適宜性依賴于待檢測的物質；-電泳和/或層析測量技術；利用這些技術可以基于例如大小、重量、電荷、對變性的敏感性分離細胞組分，其后可以通過利用特異性或非特異性檢測技術進行檢測，其適宜性依賴于待檢測的物質；-微陣列和/或DNA生物芯片技術；利用這些技術可以基于對表面固定結合部分的親和性分離生化組分，其后可以通過利用特異性或非特異性檢測技術進行檢測，其適宜性依賴于待檢測的物質。
可以與以上技術一起應用的合適的檢測技術包括放射自顯影檢測技術，基于熒光、發(fā)光或磷光的檢測技術或發(fā)色體檢測技術。這些檢測技術在生物分子檢測領域是已知的。
優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中通過利用包括雜交到核酸探針或核酸模擬探針陣列上的技術測量生物的轉錄狀態(tài)。
為了測定生物的轉錄狀態(tài)，可以從所述生物的一個或多個細胞中分離RNA，包括總RNA和mRNA。對于這種分離過程可以使用每一種能夠分離mRNA的RNA分離方法(見例如Ausubel等，1987-1993，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons.Inc.NewYork)。通過利用熟練技術人員已知的方法，如Chomczynski的單步分離法(1989，美國專利號4,843,155)，可以處理大量的樣品。
轉錄物(在編碼遺傳信息中起始步驟的RNA拷貝)代表差異表達基因的RNA，并且可以通過利用熟練技術人員已知的多種方法在各種樣品中進行鑒定。例如，可以利用差異篩選(Tedder等，1988.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85208-212)，消減雜交(Hedrick等，1984，Nature 308149-153；Lee等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 882825)，差異顯示(Liang & Pardee，1992，Science 257967-971；美國專利號5,262,311)，已表達序列標志(EST)(Adams等，1991，Science 521656)，基因表達的連續(xù)分析(SAGE)(Kinzler等，美國專利5,695,937)或cDNA AFLP(Vos等，1995，Nucleic Acids Res.，23，4407-14)技術。
隨后可以用這些差異表達的基因的鑒定設計特異性標記或標簽，其可以用來以快速的方式確定特定(水平的)mRNA分子的存在，所述mRNA分子表明生物接受的刺激類型。
為了測量生物中的各種mRNA分子，優(yōu)選首先將mRNA轉變成互補DNA(cDNA)，其技術是熟練技術人員公知的，如例如反轉錄，假如通過利用反轉錄酶將mRNA轉錄成cDNA的話。任選地，RNA轉變成cDNA可以與通過PCR進行的cDNA的擴增結合(Mullis 1987，美國專利號4,683,195，4,683,202，en 4,800,159)-所述PCR任選地為巢式、多重或對稱形式的-或通過利用連接酶鏈式反應(Barany 1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88189-193；EP申請?zhí)枺?20,308)，自動維持序列復制(3SR)(Guatelli等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871874-1878)，鏈置換擴增(SDA)″(美國專利號5,270,184，和5,455,166)，轉錄擴增系統(tǒng)(Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861173-1177)，Q-Beta復制酶(Lizardi等，1988，Bio/Technology 61197)，滾環(huán)擴增(RCA)或任何其它擴增核酸的方法。在可選的方法中，還可以直接使用RNA或在使用前通過現(xiàn)有的RNA擴增方法如基于核酸序列的擴增(NASBA)(L.Malek等，1994，Meth.Molec.Biol.28，Ch.36，Isaac PG，ed.，HumanaPress，Inc.，Totowa，N.J.)或轉錄介導的擴增(TMA)進行擴增。
通過利用核酸陣列獲得遺傳信息的方法是本領域公知的(見i.a.Chee等，1996，Science 274(5287)610-614)。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中，優(yōu)選應用DNA微陣列。這種寡核苷酸的陣列包含例如對于某些mRNA分子或對于遺傳標記特異的DNA序列。具體地，優(yōu)選所述陣列不僅包含功能性遺傳單元的結合部分，如在功能性基因組分析之后鑒定的試驗性(預測的)開放閱讀框(ORFs)。更確切地，優(yōu)選所述陣列作為隨機陣列而產生，所述隨機陣列由核酸結合部分所組成，其能夠雜交到基因組的基本上所有的部分，優(yōu)選被表達為mRNA的基因組的所有部分。優(yōu)選的陣列包含待分析生物的基本上完整的DNA的離散片段。這種陣列的一個優(yōu)點是化合物的作用隨后也可以在代謝功能上得以檢測，所述功能尚未進行鑒定，即對于它來說沒有已知存在于試驗生物的基因組中的ORFs。利用具有隨機生成的核酸片段的微陣列的另一個優(yōu)點是該方法還可以用其功能性基因組尚沒有或僅僅很少被研究的生物來實施。
為了制成包含微生物物種(例如金黃色葡萄球菌)代表基因組范圍的陣列，可以例如通過混合幾種(2-20，例如，8種所述物種菌株(例如8種金黃色葡萄球菌菌株)的基因組DNA(gDNA)制成一個物種的基因組文庫或該生物的混合基因組文庫。在這種混合物中聚集的菌株可以基于展現(xiàn)不同的抗生素抗性譜(敏感性譜)，優(yōu)選地一起覆蓋大多數(shù)已知類型的抗生素抗性來進行選擇。所述菌株可以進一步例如基于不具有大量質粒(例如可以通過分離的gDNA的瓊脂糖凝膠分析確定的)而進行選擇。
為了制備包含微生物物種代表基因組范圍的陣列，可以例如通過超聲波剪切gDNA或gDNA混合物，并且可以例如通過電泳，例如在瓊脂糖凝膠上的電泳分離單個片段。隨后可以切出合適大小的DNA片段(例如大約1-3kb)并進行分離/純化(例如通過結合到玻璃-奶上)。隨后對分離的DNA片段進行預處理以促進有效克隆(例如飩末端克隆)入合適載體中，例如，細菌質粒中?？寺∫话銓▽⑵芜B接到載體中和宿主細胞的轉化，以及單一克隆的再生和分離。隨后可以將來自每個克隆的基因組插入片段用作微陣列上的基因組探針。用載體特異性的插入片段擴增引物通過PCR擴增可以獲得所述探針，優(yōu)選利用在一端包含可固定基團的引物以便將各種PCR擴增產物有效地點(例如在玻璃上)在微陣列上。
通過熟練技術人員已知的方法可以產生DNA微陣列。DNA微陣列的制造和使用來檢測特異性核酸序列已有大量描述(US 5,571,639；Sapolsky等，1999，Genet.Anal.-Biomolecular Eng.14，187-192；Shena等，1995，Science 270，467-470；Sheldon等，1993，Clinical Chem.39，718-719；Fodor等，1991，Science 251，767-773)。
本領域技術人員能夠根據(jù)他自己的設計以及來自特定供應商的隨附讀取裝備生產或獲得陣列(例如Affymetrix Corp.，Santa Clara，CA，USA for DNA arrays and Ciphergen Biosystems，F(xiàn)remont，CA，USA forProteinChip Arrays)。
通過比較在暴露于化合物之前或之后的生化組成，并且用對照處理矯正一般試驗影響，可以獲得與該特異化合物相關的該生物的生化反應譜?？梢詫⒍喾N這類生化反應譜儲存于數(shù)據(jù)庫中，從而可以輕易地將測量的結果(新的生化反應譜)與已有的數(shù)據(jù)相比較。作為結果，數(shù)據(jù)庫自身的大小和細節(jié)將會增長，為將來的實驗作更好的詮釋。
通過用新獲得的生化反應譜對數(shù)據(jù)庫中的一些或全部生化反應譜進行聚類，或通過計算分析定義數(shù)據(jù)庫中一些或全部生化反應譜的聚類的某些類型的定義的數(shù)學關系，并且隨后定義單個模式在所述聚類類型中的位置的數(shù)學公式，且將該數(shù)學公式應用于新獲得的生化反應譜上，能夠確定所述新獲得的生化反應譜在已知的模式中的聚類位置。如果所述聚類位置在已知的聚群內，即包含參照化合物的聚群，所述受參照化合物影響的作用方式、靶、細胞過程，或任何其它的可分類特性是已知的，隨后可以將相同的特性賦予該化合物，用它獲得所述新獲得的生化反應譜。
為了加強數(shù)據(jù)庫的這種預測特性，或一般而言，這種分類表，可以經驗性地確定特性的存在。
如果新獲得的生化反應譜的聚類位置在已知的聚群之外，那么不能給該化合物賦予特性，而所述化合物在本質上和在其對于生物細胞的作用方面都具有可能未知的特性。因而，這些化合物成為令人感興趣的研究對象并且可以對于它們對細胞的作用作更加詳細地分析。
原則上，可以進行任何類型的分析來獲得受這種化合物影響的靶、作用方式或細胞過程的更多了解。
現(xiàn)在本發(fā)明提供一種這樣的方法，其中可對抗生素化合物的作用方式進行分析。所述分析起始于測定用所述化合物生成的轉錄反應譜在分類表中的聚類位置。為了分析新的作用模式，所述化合物應當生成其聚類位置在任何已知的參照反應譜聚類之外的轉錄反應譜。為了分析本質上已知但尚未進行分析的作用方式，所述化合物應當生成其聚類位置在已知的參照反應譜聚類之內的轉錄反應譜。不考慮所述聚類位置是否對應于已知的參照反應譜的聚類或在任何已知的參照反應譜聚群之外，所述轉錄反應譜顯示作為測試生物暴露于所述化合物的結果，發(fā)生在信使RNAs庫中的變化。因而，作為所述暴露的結果一些基因的表達可以受影響，并且通過測量微陣列上強度顯著提高或降低的點，可以鑒定受影響的基因。并非所有受影響基因的表達都將等同相關于化合物作用方式的分析。而是，那些表征所述聚類位置的基因，其將會是主要決定具體實驗條件與對照條件之間區(qū)別的基因-如能夠通過主要組分分析進行鑒定的-是較重要的。如果涉及特定過程的多基因受到影響，那么通過分析受影響基因的組合，可以推知受所述抗生素化合物影響的細胞過程，在任何已知聚類之外的聚類位置表示受影響的新過程。如果所述分析顯示許多參與一種細胞過程的基因的表達在測試化合物的影響下得以改變，這將指向所述過程為受所述化合物影響。例如參與蛋白質合成的基因將顯示蛋白質合成的細胞過程受到影響，表明該作用方式干擾細胞蛋白質合成。另一種指征將是對于一種化合物顯示特異性反應，但對其它處理或化合物不顯示反應的基因。
在又一方面，本發(fā)明提供了鑒定抗生素化合物分子靶的方法。這種方法的第一步是如上所述實施分析抗生素化合物作用方式(聚類位置在已知的聚類內)的方法或如上所述實施鑒定抗生素化合物新作用方式(聚類位置在已知的聚類之外)的方法。這種方法表明受影響的細胞過程。注意到表征所述受影響過程的某些關鍵酶或其它細胞組分形成一組受所述抗生素化合物影響的潛在分子靶。隨后，可以例如通過利用酶量化方法中的抗體標記仔細研究該組，以鑒定所述抗生素化合物的分子靶。
本發(fā)明還提供了鑒定新代謝途徑的方法?；旧洗朔椒ò瑢嵤┤缟纤龅膶衔镞M行分類的方法以及確定聚類位置在任何已知參照反應譜之外的所述化合物。由此，確證對于該化合物的反應在以前用其它化合物未曾見到。隨后，基本上通過利用如上所述的鑒定所述化合物的新作用方式的方法來確定受所述化合物影響的細胞過程。如果所述細胞過程并非以往已知的受影響的過程，所述過程將包括新的代謝途徑。
實施例實施例1.通過測量Pseudomonas putida的RNA表達測定抗生素處理在本測試設計中，將Pseudomonas putida S12株暴露于高劑量的不同抗生素化合物，每種化合物以遠超過對于這種抗生素化合物已知的MIC-值的濃度(最小抑制濃度)進行施用。固定細胞，其后從細胞中分離RNA。將分離的RNA在用來自Pseudomonas putida S12的基因組DNA片段涂布的陣列上進行雜交。數(shù)據(jù)分析包括標準化和根據(jù)主要組分分析(PCA)的分析。以一式兩份實施所述測試并重復一次。
細菌菌株和生長條件通過鋪板于Trypton Soy Agar(TSA，Oxoid)上，隨后于30℃溫育20小時獲得Pseudomonas putida S12的純培養(yǎng)物。此后，將該菌株在TSB中于30℃生長1天以便獲得預累積物。
抗生素處理通過在錐形瓶里于50m1新鮮TSB培養(yǎng)基中20倍稀釋P.putidaS12的過夜累積物(35℃)獲得作為抗生素處理結果的特定生理狀態(tài)的P.putida S12培養(yǎng)物。以此方式，同時生產4份50ml培養(yǎng)物，讓其在35℃大約生長7小時達到OD660約為0.5。這通過每30分鐘測量一種培養(yǎng)物的OD660而確認。當OD660為0.5時，將兩種其它培養(yǎng)物進行抗生素處理(用于此實驗中的化合物是紅霉素、四環(huán)素、黏菌素和多黏菌素B硫酸鹽)。另一種培養(yǎng)物留作對照處理。10分鐘后，淬滅來自三種溫育培養(yǎng)物的細胞并收集進行RNA分離。
在幾次獨立的實驗中測定紅霉素和黏菌素。
RNA分離通過將10ml培養(yǎng)物噴在保持于-40℃的冷的60％甲醇的水溶液的攪拌溶液中來實現(xiàn)培養(yǎng)物代謝活性的淬滅(基本上如W.de Koning &K.van Dam 1992.Anal.Biochem.204118-123所述)。隨后通過在-20℃于4500g離心10分鐘將細胞沉淀。將沉淀物在-45℃作進一步處理或保存于-80℃。基本上如Chin-Yi & Wilkins(1994.Anal.Biochem.2237-12)所述分離RNA。在0℃將2-ml帶螺帽的Eppendorf管充滿0.4克的鋯珠和500μl Trizol(Invitrogen，GibcoBRL)。在37℃將細胞沉淀物(-45℃)重懸于450μl硼酸鹽緩沖液(Chin-Yi & Wilkins，1994)中并且隨后與珠和Trizol一起加入到Eppendorf管中，手動混合并放于冰上。通過將細胞在Beadbeater(Biospec Products)中攪拌(beat)60秒而將它們破裂。將懸浮液放在冰上，其后加入100μl氯仿，渦旋振蕩并且隨后于室溫以12,000g離心。利用500μl酚/氯仿(1/1)并且隨后用氯仿伴隨著短暫離心來萃取水相以便獲得純水相。向水相中加入0.4倍體積的異丙醇和0.4倍體積的0.8M檸檬酸鈉，1.2M NaCl，混合并在冰上冷卻10分鐘。其后，通過在4℃于20,000g離心來沉淀RNA。用-20℃的70％乙醇洗滌沉淀物并且在離心(20,000g于4℃)后在真空下進行干燥。將沉淀物溶于100μl水中。
微陣列的構建為了使Pseudomonas putida S12中基因表達的基因組范圍的分析成為可能，制成了這種生物的基因組庫。為此目的，將50微克的基因組DNA與20％甘油一起并入TE緩沖液中并在噴霧器中以1巴(bar)剪切30秒。通過凝膠電泳的方法評估2-3kb的平均片段大小。沉淀后，在T4DNA聚合酶、Klenow聚合酶和dNTPs存在下將末端鈍化。在酶的熱滅活后，利用T4多核苷酸激酶將末端磷酸化。在熱滅活性，再次在瓊脂糖凝膠上分離混合物并將2和3kb之間的片段從凝膠中切出并利用Qiagen凝膠抽提試劑盒進行純化。根據(jù)″Clone Smart Blunt cloningkit″說明書(Lucigen Corp.)將以此方式獲得的片段連接在載體pSMART中。將一部分這種連接混合物轉化在大腸桿菌(E.coli)ElectroMax DH10B細胞(Invitrogen)中并鋪板于氨芐青霉素平板上。利用菌落挑取器，挑取這些菌落并轉移入96孔微量滴定板中。在37℃過夜生長后，將甘油加至15％的最終濃度并將甘油貯液保存于-80℃。
利用在96孔PCR板中的PCR擴增復制來自這種庫中的基因組插入片段。為此目的，將下列組分放在一起5微升10x SuperTaq緩沖液；5微升2mM dNTP(Roche Diagnostics)；1微升引物L1；1微升引物R1；37微升MQ水；1微升甘油貯液；1.5U SuperTaq聚合酶。引物L1具有下列堿基序列5′-CAG TCC AGT TAC GCT GGA GTC-3′。引物R1具有下列堿基序列5′-CTT TCT GCT ATG GAG GTC AGGTAT G-3′。兩種引物都在5’端C6接頭后含有游離的NH2基團。利用下列PCR程序進行擴增于94℃4min；30x(于94℃30sec，于50℃30sec，于72℃3min)；于72℃10min；4℃。
在反應后，將產物轉移到圓底96孔板中并用異丙醇進行沉淀。將以此方式純化的PCR產物轉移入384-孔板中，其中所述DNA在蒸干后并入10微升3xSSC中。用這些點平板將總共5500個PCR產物轉移到微陣列載玻片上，在所述微陣列載玻片上它們以規(guī)則有序的模式進行點樣。點樣后，將這些微陣列進行封閉，其后它們就可以進一步用于雜交實驗中。
標記RNA為了總RNA的熒光標記，使用12.5微克的RNA。向此RNA中加入0.5微升RNAsin，1.25微克的隨機引物(p(dN)6；RocheDiagnostics)和水至總體積5微升。將此混合物于70℃溫育10分鐘，隨后于20℃溫育10分鐘并放于冰上。隨后添加下列組分0.5微升RNAsin，3微升5X第一鏈緩沖液(SuperScriptII；Life Technologies)，1.5微升0.1M DTT，3微升核苷酸混合物(2.5mM的dATP，dCTP，dGTP，1mM dTTP)，1微升Cy5-dUTP或Cy3-dUTP(AmershamBiosciences)和1微升SuperScriptII酶(Life Technologies)?；旌虾?，將反應組分在42℃溫育2小時。隨后通過在95℃加熱樣品2分鐘，短暫離心，加入1.5微升新鮮的2.5M NaOH并將此在56℃溫育10分鐘而降解RNA。通過加入1.46微升的2.5M HAc，中和該反應混合物。根據(jù)隨附的說明書通過在Autoseq G50柱(Amersham Biosciences)上的純化而對此反應混合物進行純化。在此純化后，留出1/10部分的標記材料進行分光光度分析。
預雜交/雜交/洗滌在雜交的準備中，將載玻片放置于Petri培養(yǎng)皿的20ml預雜交溶液(1％BSA，5x SSC，0.1％SDS，濾過0.45-微米-濾器)中并于42℃旋轉45分鐘。隨后將所述載玻片浸在5x過濾除菌的milliQ水中。隨后再次在純milliQ水中洗滌所述載玻片，其后將載玻片浸在5x異丙醇中。隨后利用N2槍干燥載玻片，然后就可以用于雜交了。
將在一個雜交中進行比較的用Cy5-dUTP和用Cy3-dUTP標記的樣品合并在一杯中。向此加入4微升的酵母tRNA(25微克/微升)，其后將混合物蒸干。干燥后，將沉淀物并入30微升EasyHyb(RocheDiagnostics)中并在短暫離心后進行變性(95℃，1.5min)。隨后將混合物吸取到預雜交載玻片上，覆以蓋玻片并導入Corning Hybridization室中并于42℃溫育過夜。
雜交后，將載玻片從雜交室中取出并直接導入20ml 37℃的1xSSC/0.2％SDS溶液中。隨后將載玻片轉移到37℃的新鮮1xSSC/0.2％SDS溶液中，蓋玻片保留到第一次洗滌溶液之后。劇烈攪動之后，將載玻片轉移到37℃的0.5xSSC洗滌溶液中并再次進行充分攪動。隨后將載玻片轉移到0.2xSSC洗滌緩沖液中并于20℃在旋轉平臺上以300rpm混合10分鐘。在更換洗滌緩沖液后，重復此步驟。隨后通過利用N2槍吹去殘留液體對載玻片進行干燥。
掃描和圖像分析洗滌后，將載玻片避光保存或直接用來進行掃描。30微米分辨率的快速掃描進行選擇光學掃描裝置(ScanArray 4000，Perkin Elmer)。Cy5和Cy3信號的光學掃描發(fā)生于10微米的分辨率并且將得到的圖像進行電子保存。在軟件包ImaGene(version 4.2，BioDiscovery Inc.)中打開對應于載玻片的圖像。放置代表DNA樣品在載玻片上點樣模式和點樣識別的柵格后，計算每個點上的信號和背景。將獲得的數(shù)據(jù)保存在電子文件中并用于進一步的數(shù)據(jù)處理。
數(shù)據(jù)預處理在計算M和A值后(Roberts等，2000，Science，287，873-880；Dudoit等，2000，Statistics，UC Berkeley，Technical reports #578)，利用Loess標準化(Cleveland et al.，1991，Statistics and Computing，volume 1(1)pp.47-62)使原始數(shù)據(jù)標準化，不計入下列點1)過量加樣的點(在一個或兩個通道中的信號強度大于64000)；2)背景大于信號的點；3)參照點；4)被圖像分析包賦予不同于0的標記的點。
在此實驗中，只考慮對于所有實驗都具有良好信號的點。在Loess標準化后，將單個的陣列結果標準化以達到統(tǒng)一(平方和等于1)。
數(shù)據(jù)分析隨后利用主要組分分析(PCA)分析數(shù)據(jù)組，平均值作為所選的標度方法的中心。利用其它標度方法或利用其它多變量方法可以獲得可比較的結果，不論是否利用存在不同樣品聚類的信息。
結果發(fā)現(xiàn)P.putida菌株S12根據(jù)所用抗生素的量和性質而在TSB中生長良好或不好。為了在抗生素處理之后測量細胞反應，在抗生素處理或對照處理之后分析微陣列上的基因表達模式。為此目的，在抗生素處理10分鐘后，將細胞淬滅，收集并進一步處理以進行微陣列分析。
圖4顯示了一種記分曲線，其中描繪了來自實驗組的數(shù)據(jù)。該圖顯示了在各種實驗中抗生素處理之間的明顯差異。兩個軸代表主要組分，其一同描述了數(shù)據(jù)組中總共72％的總差異。
實施例2.通過測量金黃色葡萄球菌的RNA表達測定抗生素處理在本測試設計中，將金黃色葡萄球菌ATCC6538株暴露于高劑量的不同已知和未知的抗生素化合物，每種化合物以遠超過對于這種抗生素化合物已知的MIC-值(最小抑制濃度)的濃度進行施用。固定細胞，其后從細胞中分離RNA。將分離的RNA在用來自金黃色葡萄球菌ATCC6538的基因組DNA片段涂布的陣列上進行雜交。數(shù)據(jù)分析包括標準化和根據(jù)主要組分分析(PCA)的分析。以一式兩份實施所述測試并重復一次。
細菌菌株和生長條件通過鋪板于Trypton Soy Agar(TSA，Oxoid)上，隨后于37℃溫育20小時獲得金黃色葡萄球菌ATCC6538的純培養(yǎng)物。此后，將該菌株在TSB中于37℃生長1天以便獲得預累積物。
抗生素處理通過在錐形瓶(Erlenmeyer瓶)里于40ml的新鮮TSB培養(yǎng)基中100倍稀釋金黃色葡萄球菌ATCC6538的過夜累積物(37℃)獲得作為抗生素處理結果的特定生理狀態(tài)的金黃色葡萄球菌ATCC6538的培養(yǎng)物。以此方式，同時生產幾份40ml培養(yǎng)物，讓其在37℃大約生長3小時達到OD660約為0.5。這通過每30分鐘測量一種培養(yǎng)物的OD660而確認。當OD660為0.5時，將其它培養(yǎng)物進行抗生素處理。用于此實驗中的化合物是紅霉素、四環(huán)素、氯霉素、甲氧芐啶、慶大霉素、復達欣(Ceftazidin)、放線菌素、利福平、環(huán)丙沙星、氧氟沙星和硝基呋喃妥英。還對兩種未知的生長抑制化合物，′box9-e4′和′box7-x3′進行測試。所有的化合物都在使用前新溶于DMSO中。對于所有化合物來說用于暴露的濃度是2x MIC值。通過加入純DMSO將兩種培養(yǎng)物用作對照。10分鐘后，淬滅來自溫育培養(yǎng)物的細胞并收集進行RNA分離。
在幾次獨立的實驗中測定氧氟沙星、氯霉素、復達欣和硝基呋喃妥。
RNA分離通過將40ml培養(yǎng)物于-45℃噴在200ml 60％甲醇/66.7mM HEPES的攪拌溶液pH6.5中來實現(xiàn)培養(yǎng)物中代謝活性的淬滅(基本上如W.deKoning & K.van Dam 1992.Anal.Biochem.204118-123所述)。隨后通過在-20℃于6000xg離心20分鐘將細胞沉淀。將沉淀物于-45℃懸浮于8ml甲醇/HEPES溶液中并分入4個Eppendorf管。將沉淀物在-45℃作進一步處理或保存于-80℃。將四只Eppendorf管其中一只中的細胞在4℃通過6000g離心5分鐘進行沉淀并在0℃懸浮于800μl Trizol(Invitrogen，GibcoBRL)中。將此懸浮液加至1.5-ml帶螺帽的Eppendorf管中，所述管充滿0.4克的0.1mm鋯珠，手動混合并放于冰上。通過將細胞在Beadbeater(Biospec Products)中以最大速度攪拌(beat)60秒而將它們破裂。將懸浮液放在冰上，其后加入160μl氯仿，渦旋振蕩并且隨后于室溫以7000g離心持續(xù)10分鐘。將水相轉移到2-ml帶螺帽Eppendorf管中并加入等體積的70％乙醇。混合后，根據(jù)Qiagen手冊將RNA溶液應用在RNeasy柱(Qiagen)上進一步純化。將柱以8000g于20℃離心20秒并將流過液重新加樣在柱上。離心后，棄去流過液并將350μl RW1緩沖液(Qiagen)應用到柱上。離心后通過加入10μlDNAse I貯液和70μl RDD緩沖液(Qiagen)的混合物到柱上并于37℃溫育15分鐘而將結合的RNA進行DNAse I處理。再次將350μl RW1應用到柱上并在離心后用RPE緩沖液(Qiagen)將柱洗滌兩次。為了消除所有痕量的緩沖液，將柱于10.000xg離心干燥1分鐘并通過加入30μl水到柱中來洗脫RNA。在10.000xg離心1分鐘后重復此步驟，純化的RNA溶液就可以進行標記了。為了確定RNA的質與量，在BioAnalyzer(Agilent)上或通過凝膠電泳分析樣品。
金黃色葡萄球菌微陣列的構建為了制成包含物種金黃色葡萄球菌代表基因組范圍的陣列，通過混合8個金黃色葡萄球菌菌株的gDNA制成該生物的混合基因組文庫。選擇(a)顯示對多組抗生素的每一不同抗性譜(一起覆蓋大多數(shù)類型的抗生素抗性)，和(b)在它們分離的gDNA的瓊脂糖凝膠分析中不包含明顯的質粒帶。通過超聲波(Branson sonifier 450)剪切gDNA混合物并在幾條0.8％瓊脂糖凝膠上跑膠。切下DNA片段(大約1-3kb)并通過結合到玻璃乳(Bio101-試劑盒)上進行分離。用DNA-terminatorEnd-repair試劑盒(Lucigen Corp.)對分離的片段進行預處理以促進有效(鈍端)克隆入細胞質粒中(pSmartHCkan vector，CloneSmart BluntCloning Kit，Lucigen)。通過電穿孔(0,1cm-gap cuvettes Eurogentec，BioRad Pulsor，25uF，2ohms，1,6kV)將部分的連接混合物(1μl)轉化入25μl大腸桿菌細胞中(E.cloni 10G極端電感受態(tài)細胞，Lucigen)，在TB-培養(yǎng)基中恢復，鋪板于具有30μg/ml卡那霉素的TY-平板上并于37℃過夜生長。利用牙簽，將菌落轉移入96孔微量滴定板中(32塊板，150μl/孔，具有30μg/ml卡那霉素的TY培養(yǎng)基)。于37℃過夜生長之后，加入甘油(終濃度15％)并將甘油貯液保存于-80℃。
用在96孔PCR板(22塊板)中的PCR擴增復制來自孔板中每個克隆的基因組插入片段。PCR反應包含50μl反應混合物/孔，具有l(wèi)xSuperTaq緩沖液，0.2mM的每種dNTP(Roche Diagnostics)，0.4μM的每種正向和反向引物(載體特異性插入片段擴增引物)，1.5USuperTaq-DNA-聚合酶和1μl來自gDNA庫的相應孔的甘油貯液。兩種引物都包含游離的NH2-基團用于片段的固定，所述片段通過C6接頭偶聯(lián)到引物的5’末端。使用下列PCR程序94℃4min，30x(94℃30sec，50℃30sec，72℃3min)，72℃10min并于4℃保溫。擴增后，將50μl PCR產物轉移到96孔圓底平板中并通過加入150μl NaAc/異丙醇混合物(0.2M NaAc，每種的異丙醇最終濃度為67％)進行沉淀，于-80℃溫育1hr，離心(1hr，2.5krpm，4℃)，去除上清液并用1μl 70％乙醇進行洗滌。將DNA沉淀物重懸于50μl水/孔中，轉移至384孔板中，進行干燥(speed vac)并重懸于15μl 3xSSC-緩沖液/孔。利用大約2100種不同的PCR產物(來自2100個不同的克隆)來對微陣列點樣。利用ESI微陣列打印機結合24 TeleChem Stealth micro spotting quill-pins(大約100μm直徑)將PCR產物點樣in duplo于系列的最大75″乙醛″涂布的載玻片上(Cell Associates))。
點樣后，通過用硼-酸酐于室溫下的處理將載玻片表面進行封閉2x 5分鐘于0.2％SDS中，2x 5min于水中，1x 2min 100℃的水，10min于硼-酸酐緩沖液中(1.7g NaBH4于510ml PBS緩沖液和170ml 1％乙醇中)，3x 5min于0.2％SDS中，3x 5min于水中，2sec于100℃的水中，用N2流進行干燥。PBS(磷酸緩沖鹽溶液)是6.75mM Na2HPO4，1.5mM K2HPO4，140mM NaCl，2.7mM KCl pH 7.0.(1.2g Na2HPO4，0.2g K2HPO4，8.0g NaCl，0.2g KCl每升，pH 7.0).
標記RNA為了總RNA的熒光標記，使用12.5μg的干燥RNA。向此RNA中加入0.5μl的RNAsin(40U/μl Promega)，5微克的隨機引物(p(dN)6；Roche Diagnostics)和水至總體積5μl。將此混合物于70℃溫育5分鐘，隨后于20℃溫育10分鐘并放于冰上。添加下列組分0.5μl RNAsin，2.5μl 5x第一鏈緩沖液(SuperScriptII；Life Technologies)，1μl 0.1MDTT，2μl核苷酸混合物(2.5mM的dATP，dCTP，dGTP，1mM dTTP)，1μl Cy5-dUTP或Cy3-dUTP(Amersham Biosciences)和1μlSuperScriptII酶(Life Technologies)。混合后，將反應組分在42℃溫育2小時。通過加入2.5μl的新鮮的2.5M NaOH并將此在56℃溫育15分鐘而降解RNA。通過加入2.5μl的2.5M HAc，中和反應混合物。根據(jù)生產商的說明書通過利用Autoseq G50柱(Amersham Biosciences)而對此反應混合物進行純化。在此純化后，取出1/10部分的標記材料進行分光光度分析。
預雜交/雜交/洗滌在雜交的準備中，將載玻片放置于Petri培養(yǎng)皿的20ml預雜交溶液(1％BSA，5x SSC，0.1％SDS，濾過0.45-微米-濾器)中并于42℃旋轉45分鐘。在大體積的milliQ水中浸入一次之后，將載玻片在50mlmilliQ水中洗滌兩次，并利用N2槍進行干燥。
將在一個雜交中進行比較的用Cy5-dUTP和用Cy3-dUTP標記的樣品合并在一杯中。向此加入4微升的酵母tRNA(25μlg/μl)，其后將混合物蒸干。干燥后，將沉淀物溶于30μl EasyHyb(Roche Diagnostics)中，進行變性(95℃，1.5min)并短暫離心。隨后將混合物吸取到預雜交載玻片上，覆以蓋玻片，導入Corning Hybridization室中并于42℃溫育過夜。
雜交后，將載玻片從雜交室中取出并直接導入50ml 37℃的1xSSC/0.2％SDS溶液中。隨后將載玻片轉移到37℃的新鮮1xSSC/0.2％SDS溶液中，將蓋玻片保留到第一次洗滌溶液之后。劇烈攪動之后，將載玻片轉移到37℃的0.5xSSC洗滌溶液中并再次進行充分攪動。隨后將載玻片轉移到0.2x SSC洗滌緩沖液中并于20℃在旋轉平臺上以300rpm混合10分鐘。在更換洗滌緩沖液后，重復此步驟。隨后通過利用N2槍吹去殘留液體對載玻片進行干燥。
掃描和圖像分析，數(shù)據(jù)預處理和數(shù)據(jù)分析基本上如實施例1中所述。
結果發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌菌株ATCC6538根據(jù)所用抗生素的量和性質在TSB中生長良好或不好。為了在抗生素處理之后測量細胞反應，在抗生素處理或對照處理之后分析微陣列上的基因表達模式。為此目的，在抗生素處理10分鐘后，將細胞淬滅，收集并進一步處理以進行微陣列分析。
圖5顯示一種記分曲線，其中描繪了來自實驗組的數(shù)據(jù)。該圖顯示了在各種實驗中抗生素處理之間的明顯差異。兩個軸代表主要組分，其一同描述了數(shù)據(jù)組中總共72％的總差異。
權利要求
1.產生化合物分類表的方法，包括根據(jù)通過將所述生物暴露于多種單個化合物持續(xù)少于一個世代的時間所測定的生物體的生化反應譜的相似性而進行聚類。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其中在所述暴露時間后直接淬滅生物體的代謝。
3.根據(jù)權利要求1或2的方法，其中所述根據(jù)相似性的聚類包含主要組分分析。
4.根據(jù)在前權利要求任一項的方法，其中所述化合物對哺乳動物細胞無毒性。
5.根據(jù)在前權利要求任一項的方法，其中所述生物體對于所述單個化合物敏感。
6.根據(jù)在前權利要求任一項的方法，其中所述化合物為抗生素化合物。
7.根據(jù)在前權利要求任一項的方法，其中所述多種單個化合物包括作用方式已知的參照化合物并且其中所述譜為根據(jù)作用方式相似性聚類的參照反應譜。
8.可通過權利要求1-7任一項的方法獲得的化合物的分類表。
9.對化合物進行分類的方法，包括下列步驟a)通過實施權利要求1-6任一項的方法提供化合物的分類表；b)將生物體暴露于所述化合物；c)測定所述生物體的生化反應譜，和d)確定所述生化反應譜在所述分類表中的聚類位置。
10.根據(jù)作用方式對抗生素化合物進行分類的方法，包括下列步驟a)通過實施權利要求1-6任一項的方法提供化合物的分類表，其中所述化合物為抗生素化合物，其中所述多種單個抗生素化合物包含作用方式已知的參照化合物并且其中所述譜為根據(jù)作用方式相似性聚類的參照反應譜；b)將生物體暴露于所述抗生素化合物；c)確定所述生物體的生化反應譜；d)確定所述生化反應譜在所述分類表中的聚類位置，和e)將所述抗生素化合物指定至參照反應譜對應聚類的作用方式或如果所述位置在參照反應譜的任何已知的聚類之外，將所述抗生素化合物指定至新的作用方式。
11.分析抗生素化合物作用方式的方法，包括以下步驟a)實施根據(jù)權利要求10的對抗生素化合物進行分類的方法，其中所述生化反應譜是轉錄反應譜，由此確定所述抗生素化合物的轉錄反應譜的聚類位置；b)由所述轉錄反應譜鑒定所述生物體的基因，所述基因的表達受暴露于所述抗生素化合物的顯著影響并且表征了所述聚類位置，和c)由所述基因的同一性來確定受所述抗生素化合物影響的細胞過程。
12.鑒定抗生素化合物新的作用方式的方法，包括以下步驟a)實施根據(jù)權利要求10的對抗生素化合物進行分類的方法，其中所述生化反應譜是轉錄反應譜；b)選擇其相應轉錄反應譜具有在任何已知的參照反應譜的聚類之外的聚類位置的抗生素化合物；c)由所述選定化合物的轉錄反應譜鑒定所述生物體的基因，所述基因的表達受暴露于所述選定抗生素化合物的顯著影響并且表征所述聚類位置，和d)由所述基因的同一性來確定受所述選定抗生素化合物影響的細胞過程，由此鑒定新的作用方式。
13.鑒定抗生素化合物的分子靶的方法，包括以下步驟a)實施根據(jù)權利要求11或12的方法；b)選擇一組表征受所述抗生素化合物影響的所述細胞過程的潛在分子靶，和c)在所述組中鑒定所述抗生素化合物的分子靶。
14.鑒定新的代謝途徑的方法，包括以下步驟a)實施根據(jù)權利要求9的方法，其中所述生化反應譜是轉錄反應譜，其中所述多種單個化合物包含作用方式已知的參照化合物并且其中所述譜為根據(jù)作用方式相似性聚類的參照反應譜；b)選擇其相應轉錄反應譜具有在任何已知的參照反應譜的聚類之外的聚類位置的化合物；c)由所述轉錄反應譜鑒定所述生物體的基因，所述基因的表達受暴露于所述化合物的顯著影響并且表征所述聚類位置，和d)由所述基因的同一性來確定受所述化合物影響的細胞過程，由此鑒定新的代謝途徑。
全文摘要
本發(fā)明屬于表征例如諸如可用于治療哺乳動物病原體感染的的化合物的抗生素化合物，以及鑒定其細胞靶的領域。本發(fā)明進一步涉及基于分類表對抗生素化合物進行分類的方法，用于確定其作用方式和用于鑒定新的抗生素靶的方法，所述分類表包括根據(jù)暴露于所述化合物少于一個世代時期的生物體的生化反應譜(例如基因表達模式)的相似性而進行聚類。
文檔編號G01N33/50GK1878873SQ200480033226
公開日2006年12月13日 申請日期2004年10月13日 優(yōu)先權日2003年10月13日
發(fā)明者羅伊·克里斯蒂安·蒙泰因, 弗蘭克·亨里·約翰·許倫 申請人:荷蘭應用科學研究組織