專利名稱：靜電紡絲制備的固定酶電極及其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種靜電紡絲制備的固定酶電極及其方法，屬于固定化酶電極技術(shù)。
背景技術(shù)：
固定化酶電極是將具有生物催化作用的酶固定在電極材料表面，從酶催化電極反應(yīng)產(chǎn)生的電極電位和響應(yīng)電流得到組分的詳細(xì)信息。固定化酶電極是生物傳感器、生物燃料電池等的關(guān)鍵組成部件。其中生物傳感器作為近幾十年來出現(xiàn)的一種新型傳感技術(shù)，在臨床診斷、食品和藥物分析、環(huán)境分析、生物藥物開發(fā)、工業(yè)控制、軍事、生物芯片和生物技術(shù)等方面均有應(yīng)用。生物燃料電池可以利用生物體內(nèi)的有機物作為燃料產(chǎn)生電能，是一種清潔、綠色、純天然的可再生能源。
常見的固定酶電極制備方法主要有包埋、共價鍵、吸附、交聯(lián)、靜電組裝等。包埋法是將酶用凝膠或微膠囊包埋于格狀結(jié)構(gòu)或膠囊結(jié)構(gòu)中，方法簡便，采用具有良好生物親和性的凝膠材料使固定酶量多，活性高，電極靈敏度高，但是酶易流失，從而使使用壽命降低；吸附法是利用酶與載體間的范德華力、離子鍵、氫鍵等作用力固定酶的方法，可以保留酶的活性，酶結(jié)合力強，但是酶的負(fù)載量較低，靈敏度低，長期使用會由于解吸附造成靈敏度下降；交聯(lián)法是使酶與帶兩個以上的多功能團(tuán)試劑進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，生成不溶于水的二維交聯(lián)聚集體，這種方法是用化學(xué)結(jié)合的固定酶，結(jié)合力強，酶不易流失，但缺點是交聯(lián)劑降低了酶的活性；靜電組裝是通過帶相反電荷的聚電解質(zhì)靜電相互作用固定酶，方法簡單，穩(wěn)定性好不受基體材料的尺寸限制，可以在分子水平控制膜的組成結(jié)構(gòu)和厚度，適用性廣；此外，還有碳糊固定酶電極、導(dǎo)電聚合物固定酶電極等方法。
目前市售的生物傳感器酶電極均用上述方法制備。如US6，280，587，CN1，186，115主要采用包埋酶的方法制備酶電極；Decher G等用靜電自組裝形成的高分子聚合物膜固定酶電極(Decher G et.al，Chem.Macromol.Symp.1991，46)。CN1563969A綜合了包埋技術(shù)、納米技術(shù)，用PEM膜層制備了酶電極。
靜電紡絲是聚合物溶液或熔體借助于高壓靜電作用進(jìn)行噴射拉伸而形成超細(xì)纖維的紡絲方法。通過靜電紡絲可最終在接收屏上形成納米級長絲(Z.M.Huang，Y.Z.Zhang，M.Kotaki，et al.，[J].Comp.Sci.Technol.，2003，632223-2253.)。靜電紡絲法可用于超級電容器、聚合物電解質(zhì)、場效應(yīng)晶體管等的研制中，也可以用來固定酶。Lili Wu等利用PVA靜電紡絲的方法固定化纖維素酶催化纖維素的水解(Lili Wu，Xiaoyan Yuan.，Jing Sheng，[J].Journal of Membrane Science 2005，250167～173)，Jia等用靜電紡絲制備的納米纖維固定α-糜蛋白酶(Jia HF，Zhu GY et.al，Biotechnol Prog，2002)。Bin Ding等提出用PVA和PAA共紡的方法構(gòu)筑NH3親和型傳感器(Bin Ding，JinhoKim，Yasuo Miyazaki，[J].Sensors and Actuators B，2004，101373-380)，但通過靜電紡絲的方法固定化酶構(gòu)筑安培型生物傳感器和生物燃料電池尚未見文獻(xiàn)報道。通過靜電紡絲的方法制備超細(xì)纖維同時固定酶，制備的活性酶膜面積大，制備方法簡單，適用于批量化生產(chǎn)，在生物傳感器及生物燃料電池電極的制備方面將有很現(xiàn)實的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種靜電紡絲制備的固定酶電極及其方法，該固定酶電極具有活性酶膜面積大，制備過程簡單，使用壽命長的特點。
本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案加以實現(xiàn)的，一種靜電紡絲制備的固定酶電極，它由電極基底、反應(yīng)層構(gòu)成。其特征在于，反應(yīng)層由聚合物的納米纖維薄膜及膜內(nèi)氧化還原酶構(gòu)成，或者反應(yīng)層由聚合物的納米纖維薄膜及膜內(nèi)氧化還原酶和粒徑為5～100納米電活性金屬粒子或碳納米管構(gòu)成，或者反應(yīng)層由聚合物的納米纖維薄膜及膜內(nèi)氧化還原酶和電子介體構(gòu)成。
上述的聚合物的納米纖維薄膜為聚乙烯醇、明膠、殼聚糖、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、聚苯胺中的一種或兩種以上的納米纖維薄膜。
上述聚合物薄膜的層數(shù)為1-3層，每層膜厚度在5～50nm。
上述氧化還原酶為葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、尿酸氧化酶、膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶、膽紅素氧化酶、乙酰膽堿酯酶、漆酶、辣根過氧化物酶、細(xì)胞色素C氧化酶、微過氧化物酶中的一種或兩種以上。
上述電活性納米金屬粒子為金顆粒、銀顆粒、銅顆粒、二氧化硅顆粒中的一種或兩種以上，粒徑范圍在30～80nm。
上述電子介體為二茂鐵系聚合物、含配位鍵的鋨或釕電活性過渡金屬螯合物。
上述的生物酶電極的制備方法，其特征在于包括以下過程1)用粒徑10-50μm的Al2O3粉在鹿皮上打磨工作電極的下端部分，使之光亮潔凈，經(jīng)二次去離子水反復(fù)沖洗后，置于pH＝6.8的磷酸緩沖溶液(PBS)中經(jīng)循環(huán)伏安掃描至穩(wěn)定。
2)用聚乙烯醇、明膠、殼聚糖、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、聚苯胺中的一種或兩種以上，加入去離子水，經(jīng)水浴加熱并攪拌使之完全溶解，攪拌下冷卻至室溫，制得質(zhì)量體積比濃度為1％-10％的水溶液。
3)向按步驟2)已配制好的溶液中，加入葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、尿酸氧化酶、膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶、膽紅素氧化酶、乙酰膽堿酯酶、漆酶、辣根過氧化物酶、細(xì)胞色素C氧化酶、微過氧化物酶中的一種或兩種以上酶溶液或混合溶液，每毫升溶液加入10～500u。
(1)或者向步驟3)配制的含酶溶液中加入含有金顆粒、銀顆粒、銅顆粒、二氧化硅顆粒中的一種或兩種以上，加入比例為每毫升凝膠溶液中加入10-40μl。
(2)或者向步驟3)含酶和金屬顆粒的溶液種加入二茂鐵系聚合物、含配位鍵的鋨或釕電活性過渡金屬螯合物。
4)將步驟3)中含有氧化還原酶的溶液或按步驟3)中(1)或步驟3)中(2)配制好的溶液分別注入帶有針頭(12號，內(nèi)徑0.8mm，長度約為30mm，尖端磨平)的注射器，將注射器固定在注射泵上。以流量為0.1ml/h，電壓為10kV，在接收屏上和電極上收集紡絲纖維，紡絲時間為1.5-3h。紡絲結(jié)束后置于低溫箱中(4℃)備用。
5)將紡絲置于濃度為10％-30％的戊二醛溶液的上方，在37℃常壓環(huán)境下以戊二醛的蒸汽對紡絲纖維進(jìn)行交聯(lián)。交聯(lián)后用去離子水清洗，得到靜電紡絲制備的固定酶電極。
本發(fā)明的有益效果在于，1)通過靜電紡絲的方法制備的固定酶電極可以將酶和電子介體有效的固定在基片表面，掃描電鏡照片表明通過靜電紡絲方法得到了固定有酶和電子介體的納米紡絲纖維膜。
2)靜電紡絲所得到的酶電極具有更好的響應(yīng)性能，其響應(yīng)電流高。通過在紡絲膜中加入電子介體，提高了酶膜的電子傳輸能力，有利于提高酶電極的抗干擾能力。
3)通過靜電紡絲的方法制備超細(xì)纖維同時固定酶，制備的活性酶膜面積大，制備方法簡單，適用于批量化生產(chǎn)，該方法在生物傳感器及生物燃料電池電極的制備方面將有很現(xiàn)實的意義。


圖1為未加酶的靜電紡絲掃描電鏡照片，圖2為按照實施例1制備的靜電紡絲電極電鏡照片。從圖中可以看到在紡絲纖維上出現(xiàn)了一些呈梭狀的突起，這是因為酶的加入，削弱了溶液形成紡絲噴射細(xì)流的能力，從而產(chǎn)生了梭形珠。
圖3中(A)為用聚乙烯醇(PVA)靜電紡絲的IR譜圖，(B)為用實施例2制備電極的IR譜圖。
圖4中(a)為實施例3與澆鑄膜法所得酶電極C-V曲線的比較；(b)實施例3與實施例7所得酶電極的C-V曲線；(c)實施例5酶電極的C-V曲線；(d)實施例6酶電極的C-V曲線。
具體實施例方式
實施例1將金基片用粒徑均勻的Al2O3粉在鹿皮上打磨拋光，經(jīng)二次蒸餾水反復(fù)沖洗后，置于pH＝6.8的磷酸緩沖溶液(PBS)中經(jīng)循環(huán)伏安掃描至穩(wěn)定。稱取PVA加入去離子水，經(jīng)水浴加熱并攪拌使PVA完全溶解，攪拌下冷卻至室溫，制得濃度質(zhì)量體積比為8％的PVA水溶液。取5ml已制好的PVA水溶液，加入198μL的葡萄糖氧化酶，以保證溶液中GOD濃度為200U/ml。向PVA水溶液中加入120μL納米金溶液。加入納米金溶液的PVA/葡萄糖氧化酶混合溶液注入帶有針頭的注射器，將注射器固定在注射泵上。在距離針頭10cm處放置接地接收屏(鋁箔)，在鋁箔中央開孔，孔的直徑與基片直徑相當(dāng)。將預(yù)處理過的基片穿過該孔并固定好，使基片端面與鋁箔平齊?；c接地相連，而將針頭與高壓電源相連，打開注射泵開關(guān)，設(shè)定流量為0.1ml/h。隨著注射泵的步進(jìn)擠壓，紡絲液在針頭形成半球狀液滴，此時打開高壓電源并調(diào)整電壓為10kV，在接收屏上和基片上收集紡絲纖維。通過鹵鎢燈觀察紡絲過程，紡絲時間為1.5-3h。實驗結(jié)束后，關(guān)閉高壓電源，把針頭、接收屏以及基片放電，并將鋁箔與基片取下，置于冰箱中(4℃)備用。將紡好的基片和接收鋁箔置于冰箱中備用。將紡好的基片置于25％的戊二醛溶液的容器上方，在37℃常壓環(huán)境下放置一段時間(2h)，以戊二醛的蒸汽對紡絲纖維進(jìn)行交聯(lián)。
實施例2用銅電極作為工作電極的基底電極，其他與實施例1相同。
圖3為在銅電極基底上未加酶與加酶電極的對比。(A)上3364cm-1左右的寬峰是PVA中O-H的伸縮振動峰，也是PVA的特征吸收峰；2943cm-1左右為-CH2的伸縮振動峰；1420cm-1左右是O-H和C-H彎曲振動以及-CH2的彎曲振動引起的吸收峰；1096cm-1左右是C-O(多締和體)單鍵伸縮和O-H彎曲振動吸收峰，854cm-1左右是與全同立構(gòu)序列有關(guān)的特征峰。在PVA/GOD譜圖[圖(B)]上出現(xiàn)了PVA的特征吸收峰，同時由于葡萄糖氧化酶分子中N-H的伸縮振動峰與O-H的伸縮振動峰相交疊，因此在3348cm-1左右處的吸收峰比PVA的寬。PVA/GOD紅外譜圖上1654cm-1處的特征吸收峰為酰胺鍵吸收峰。由此可以說明PVA/GOD酶膜上確有酶的存在。
實施例3用鉑電極作為工作電極的基底電極，其他與實施例1相同。
實施例4用碳電極作為工作電極的基底電極，其他與實施例1相同。
實施例5將加入納米金顆粒的濃度調(diào)整為2.3％(V/V)，紡絲時間1.5h(V/V)，紡絲時間2.5h，其余與實施例1相同。
實施例6將加入納米金顆粒的濃度調(diào)整為2.3％(V/V)，紡絲時間5.5％(V/V)，紡絲時間2.5h，其余與實施例1相同。
實施例7用實施例1的方法但不加納米金顆粒制備。
圖4顯示出實施例3、實施例7、實施例5、實施例6酶電極的C-V曲線對比。掃描速率為50mV/s時，靜電紡絲固定酶電極的峰值電流相對澆鑄膜固定酶電極有較大提高。未加入納米金溶液的酶電極的C-V曲線其峰值響應(yīng)電流較小，且沒有出現(xiàn)氧化還原峰。由于葡萄糖、尿酸、抗壞血酸等物質(zhì)均會在0.6V電位附近出現(xiàn)峰值電流，通過加入納米金使葡萄糖出現(xiàn)峰值電流的工作電位降低，從而排除了在對葡萄糖進(jìn)行測試時尿酸、抗壞血酸等物質(zhì)的干擾。加入的納米金的量較小，紡絲時間較短，所得紡絲纖維膜較薄(目應(yīng)固載的酶量也較少)，峰值響應(yīng)電流相對較小。隨著納米金含量的增加和紡絲時間的延長，酶電極峰值響應(yīng)電流有了較大提高。
實施例8用納米銀顆粒代替納米金顆粒，其余與實施例1相同。
實施例9用納米銅顆粒代替納米金顆粒，其余與實施例1相同。
實施例10用納米二氧化硅顆粒代替納米金顆粒，其余與實施例1相同。
實施例11用混合的納米金和納米二氧化硅顆粒代替納米金顆粒，其余與實施例1相同。
實施例12用混合的納米金和納米銀和納米二氧化硅代替納米金顆粒，其余與實施例1相同。
實施例13用單壁納米管代替納米金顆粒，其余與實施例1相同。
實施例14用多壁納米管代替納米金顆粒，其余與實施例1相同。
實施例15用二茂鐵代替納米金顆粒，其余與實施例1相同。
實施例16用普魯士藍(lán)代替納米金顆粒，其余與實施例1相同。
實施例17用含配位鍵的鋨螯合物代替納米金顆粒，其余與實施例1相同。
實施例18用乳酸氧化酶代替葡萄糖氧化酶，其余與實施例1相同。
實施例19用尿酸氧化酶代替葡萄糖氧化酶，其余與實施例1相同。
實施例20用膽固醇酯酶代替葡萄糖氧化酶，其余與實施例1相同。
實施例21用膽紅素氧化酶代替葡萄糖氧化酶，其余與實施例1相同。
實施例22用乙酰膽堿酯酶代替葡萄糖氧化酶，其余與實施例1相同。
實施例23用漆酶代替葡萄糖氧化酶，其余與實施例1相同。
實施例24用辣根過氧化物酶代替葡萄糖氧化酶，其余與實施例1相同。
實施例25用細(xì)胞色素C氧化酶代替葡萄糖氧化酶，其余與實施例1相同。
實施例26用微過氧化物酶代替葡萄糖氧化酶，其余與實施例1相同。
實施例27用混合的葡萄糖氧化酶和微過氧化物酶代替葡萄糖氧化酶，其余與實施例1相同。
實施例28用混合的葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶代替葡萄糖氧化酶，其余與實施例1相同。
實施例29用膽固醇氧化酶代替葡萄糖氧化酶，其余與實施例1相同。
實施例30用明膠代替聚乙烯醇，其余與實施例1相同。
實施例31用殼聚糖代替聚乙烯醇，其余與實施例1相同。
實施例32用海藻酸鈉代替聚乙烯醇，其余與實施例1相同。
實施例33稱取海藻酸鈉加入去離子水，經(jīng)水浴加熱并攪拌使海藻酸鈉完全溶解，攪拌下冷卻至室溫，制得濃度質(zhì)量體積比為3％的海藻酸鈉水溶液。取5ml已制好的海藻酸鈉水溶液，加入260μl的葡萄糖氧化酶和1g聚乙烯吡咯烷酮。再向海藻酸鈉水溶液中加入200μl去離子水，加入200μl納米銀溶液。加入納米銀溶液的海藻酸鈉/葡萄糖氧化酶混合溶液注入帶有針頭的注射器，將注射器固定在注射泵上。按實施例1的方法制備電極。設(shè)定注射泵流量為0.15ml/h，調(diào)整高壓電源電壓為8kV，紡絲時間為2h。以戊二醛的蒸汽對紡絲纖維進(jìn)行交聯(lián)。其余與實施例1相同。
實施例34將基片打磨拋光，沖洗后，置于pH＝6.8的磷酸緩沖溶液(PBS)中經(jīng)循環(huán)伏安掃描至穩(wěn)定。配制1％的二茂鐵的乙醇溶液，并在基片上滴加20μl，室溫下晾干。稱取明膠加入去離子水，制成5％的明膠水溶液。取5ml加入200μl的葡萄糖氧化酶。再加入200ul去離子水和納米銀溶液。將混合液注入帶有針頭的注射器，將注射器固定在注射泵上。在距離針頭10cm處放置接地接收屏(鋁箔)，在鋁箔中央開孔，孔的直徑與基片直徑相當(dāng)。將預(yù)處理過的基片穿過該孔并固定好?；c接地相連，而將針頭與高壓電源相連，打開注射泵開關(guān)，設(shè)定流量為0.15ml/h。隨著注射泵的步進(jìn)擠壓，在基片上收集紡絲纖維。通過鹵鎢燈觀察紡絲過程，紡絲時間為2h。實驗結(jié)束后，關(guān)閉高壓電源，把針頭、接收屏以及基片放電，并將鋁箔與基片取下，置于冰箱中(4℃)備用。將紡好的基片和接收鋁箔置于冰箱中備用。將紡好的基片用25％的戊二醛溶液交聯(lián)。
權(quán)利要求
1一種靜電紡絲制備的固定酶電極，該酶電極由電極基底、反應(yīng)層構(gòu)成，其特征在于，反應(yīng)層由聚合物的納米纖維薄膜及膜內(nèi)氧化還原酶構(gòu)成，或者反應(yīng)層由聚合物的納米纖維薄膜及膜內(nèi)氧化還原酶和粒徑為5～100納米電活性金屬粒子或碳納米管構(gòu)成，或者反應(yīng)層由聚合物的納米纖維薄膜及膜內(nèi)氧化還原酶和電子介體構(gòu)成。
2按權(quán)利要求1所述的酶電極，其特征在于，聚合物的納米纖維薄膜為聚乙烯醇、明膠、殼聚糖、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、聚苯胺中的一種或兩種以上的納米纖維薄膜。
3按權(quán)利要求1所述的酶電極，其特征在于，聚合物薄膜的層數(shù)為1-3層，每層膜厚度在5～50nm。
4按權(quán)利要求1所述的酶電極，其特征在于，氧化還原酶為葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、尿酸氧化酶、膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶、膽紅素氧化酶、乙酰膽堿酯酶、漆酶、辣根過氧化物酶、細(xì)胞色素C氧化酶、微過氧化物酶中的一種或兩種以上。
5按權(quán)利要求1所述的酶電極，其特征在于，電活性納米金屬粒子為金顆粒、銀顆粒、銅顆粒、二氧化硅顆粒中的一種或兩種以上，粒徑范圍在30～80nm。
6按權(quán)利要求1所述的酶電極，其特征在于，電子介體為二茂鐵系聚合物、含配位鍵的鋨或釕電活性過渡金屬螯合物。
7一種制備權(quán)利要求1所述的生物酶電極的方法，其特征在于包括以下過程1)用粒徑10-50μm的Al2O3粉在鹿皮上打磨工作電極的下端部分，使之光亮潔凈，經(jīng)二次去離子水反復(fù)沖洗后，置于pH＝6.8的磷酸緩沖溶液中經(jīng)循環(huán)伏安掃描至穩(wěn)定；2)用聚乙烯醇、明膠、殼聚糖、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、聚苯胺中的一種或兩種以上，加入去離子水，經(jīng)水浴加熱并攪拌使之完全溶解，攪拌下冷卻至室溫，制得質(zhì)量體積比濃度為1％-10％的水溶液；3)向按步驟2)已配制好的溶液中，加入葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、尿酸氧化酶、膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶、膽紅素氧化酶、乙酰膽堿酯酶、漆酶、辣根過氧化物酶、細(xì)胞色素C氧化酶、微過氧化物酶中的一種或兩種以上酶溶液或混合溶液，每毫升溶液加入10～500u；(1)或者向步驟3)配制的含酶溶液中加入含有金顆粒、銀顆粒、銅顆粒、二氧化硅顆粒中的一種或兩種以上，加入比例為每毫升凝膠溶液中加入10-40μl；(2)或者向步驟3)配制的含酶溶液中加入二茂鐵系聚合物或含配位鍵的鋨或釕電活性過渡金屬螯合物；4)將步驟3)中含有氧化還原酶的溶液或按步驟3)中(1)或步驟3)中(2)配制好的溶液分別注入帶有針頭的注射器，將注射器固定在注射泵上，以流量為0.1ml/h，電壓為10kV，在接收屏上和電極上收集紡絲纖維，紡絲時間為1.5-3h，紡絲結(jié)束后置于4℃低溫箱中備用；5)將紡絲置于濃度為10％-30％的戊二醛溶液的上方，在37℃常壓環(huán)境下以戊二醛的蒸汽對紡絲纖維進(jìn)行交聯(lián)，交聯(lián)后用去離子水清洗，得到靜電紡絲制備的固定酶電極。
全文摘要
本發(fā)明公開一種靜電紡絲制備的固定酶電極及其方法，屬于固定化酶電極技術(shù)。所述的酶電極由電極基底、反應(yīng)層構(gòu)成，反應(yīng)層由聚合物的納米纖維薄膜及膜內(nèi)氧化還原酶構(gòu)成，或者反應(yīng)層由聚合物的納米纖維薄膜及膜內(nèi)氧化還原酶和粒徑為5～100納米電活性金屬粒子或碳納米管構(gòu)成，或者反應(yīng)層由聚合物的納米纖維薄膜及膜內(nèi)氧化還原酶和電子介體構(gòu)成。其制備方法包括以下過程電極打磨，聚合物溶液的配制，配制含有氧化還原酶的聚合物溶液，或向含有氧化還原酶的聚合物溶液中加入鈉米金屬顆?；螂娮咏轶w，將上述溶液用靜電紡絲制得酶電極。本發(fā)明的優(yōu)點在于制備的酶電極活性酶膜面積大，抗干擾能力強，制備方法簡單，適用于批量化生產(chǎn)。
文檔編號G01N27/327GK1737560SQ20051001496
公開日2006年2月22日 申請日期2005年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月2日
發(fā)明者許鑫華, 陳強, 劉強, 袁曉燕, 任光雷 申請人:天津大學(xué)