專利名稱：多激光器觸發(fā)系統(tǒng)和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及流式細(xì)胞術(shù)，更具體地，本發(fā)明涉及在流式細(xì)胞術(shù)中使用多個激光器的系統(tǒng)和方法。
背景技術(shù)：
在典型的流式細(xì)胞儀10中，如圖1所示，將顆粒12的樣品溶液與鞘液(sheath fluid)14混合。所述顆?？梢允菬晒鈽?biāo)記的，且可以是細(xì)胞或由聚苯乙烯或其他材料制成的微球。鞘液14以這樣的方式流動，使其以液力的方式聚焦用于分析的含顆粒的樣品溶液12。含顆粒的樣品溶液12和鞘液14沿液流通道16流動。激發(fā)光源18通常是激光器，在顆粒12沿液流通道16流動時聚焦在顆粒上，從而從存在于顆粒中或顆粒上的任何指示染料誘發(fā)熒光。來自顆粒的熒光由光學(xué)收集器(collection optics)20捕獲，該光學(xué)收集器與激光束的路徑相正交而設(shè)置，并使用光電倍增管22檢測所述的熒光。
前向角散射光(FALS)檢測器24通常是光電二極管或其他光電探測器，該檢測器24放置在恰好離開激光軸的位置，并捕獲被顆粒散射的光。來自FALS檢測器的信號指示顆粒的存在，并且該檢測器通常是用于數(shù)據(jù)收集的觸發(fā)器。當(dāng)FALS檢測器信號的振幅大于預(yù)定臨界值時，表明存在顆粒，觸發(fā)數(shù)據(jù)收集電子儀器并且獲得由光電倍增管產(chǎn)生的信號作為積分值和/或峰值。
對于單激光器系統(tǒng)，激光束相對于液流通道的對準(zhǔn)以及用于收集散射光的對準(zhǔn)是簡單明了的。通常，對準(zhǔn)包括調(diào)節(jié)激光束的位置以使FALS響應(yīng)最大化，然后調(diào)整光學(xué)收集器以使熒光信號最大化。該方法在4,038,556中已進行過闡述，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。
為了有利于多路調(diào)制，顆?？梢院幸环N或多種編碼染料，所述染料需要被一個或多個激發(fā)光源所激發(fā)。使用多個激發(fā)光源通常會增加復(fù)雜程度，因為所有激發(fā)光源需要與光學(xué)收集器對準(zhǔn)。
一個解決方案是調(diào)整激發(fā)光源使得它們聚焦在流動室中的同一點。激發(fā)光源可以在同一直線上，也可以不在同一直線上，但是應(yīng)當(dāng)在檢測區(qū)重合。應(yīng)當(dāng)通過使用示波器在顆粒通過流動室時觀察來自每個激發(fā)光源的前向散射光信號，進行激發(fā)光源的相互調(diào)整。調(diào)節(jié)激發(fā)光源的位置直至來自激發(fā)光源的前向散射光同時發(fā)生。這導(dǎo)致激發(fā)光源在流動室內(nèi)的相同位置撞擊顆粒。這種調(diào)節(jié)經(jīng)常是非常麻煩和耗時的，激發(fā)光源的任何相對的不一致都會導(dǎo)致一個或多個熒光通道的信號減弱。
人們經(jīng)常希望分離激發(fā)光源，使得每個顆粒都順序通過每個激發(fā)光源。分離激發(fā)光源導(dǎo)致來自顆粒的信號發(fā)生空間分離，這有利于捕獲顆粒的特定響應(yīng)，以分離激發(fā)光源。然而，因為信號被暫時分開，激發(fā)光源的分離使復(fù)雜性增加。使用分開的激光器的系統(tǒng)的實例公開于美國專利No.4,243,318中，該專利的全部內(nèi)容通過引用并入本文。
針對暫時分離的替代性解決方案，例如使用門控放大器(gated amp)或延遲線，需要事先了解激發(fā)光源的相對分離，且在實驗過程中不能校準(zhǔn)激發(fā)光源或中心(core)速率的偏差。美國專利Nos.5,528,045、5,682,038、5,880,474和Beckman Coulter EPIC 750以及Beckman Coulter ELITEManuals中說明了替代性解決方案的實例，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。
因此，就需要在流動室中使兩個或多個激發(fā)光源與顆粒對準(zhǔn)的改進方法。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明涉及用于測量熒光標(biāo)記顆粒的發(fā)光的系統(tǒng)。所述系統(tǒng)包括血細(xì)胞計數(shù)器的流動室，所述流動室具有用于使熒光標(biāo)記顆粒通過的液流通道；所述系統(tǒng)還具有多個激發(fā)光源，每個激發(fā)光源均發(fā)射光束入射到所述血細(xì)胞計數(shù)器的流動室；多個散射光檢測器與血細(xì)胞計數(shù)器的流動室的液流通道之間具有光通訊，每個散射光檢測器都被設(shè)置為檢測來自所述的多個激發(fā)光源中的僅僅一個光源的光，所述檢測器以如此方式排列在熒光標(biāo)記顆粒通過血細(xì)胞計數(shù)器的流動室的液流通道時，所述的每個散射光檢測器檢測來自所述顆粒的散射光。
所述的多個散射光檢測器與觸發(fā)器相連接。當(dāng)入射在其中一個散射光檢測器上的散射光超過預(yù)定臨界值時，所述觸發(fā)器發(fā)出信號。光學(xué)收集器與血細(xì)胞計數(shù)器的流動室的液流通道之間為光通訊，以收集來自熒光標(biāo)記顆粒的發(fā)射光。
至少一個熒光檢測器接收由光學(xué)收集器收集的發(fā)射光并產(chǎn)生輸出。所述的至少一個熒光檢測器設(shè)置成僅響應(yīng)離散的波段。電子積分器與所述觸發(fā)器和所述至少一個熒光檢測器連接，從而響應(yīng)來自觸發(fā)器的信號而記錄所述至少一個熒光檢測器的輸出。
此外，本發(fā)明涉及用于測量具有多種染料的顆粒的熒光的方法。所述方法包括以下步驟使用第一激發(fā)光源探詢顆粒；使用被設(shè)置成僅檢測來自第一激發(fā)光源的光的散射光檢測器，檢測借助第一激發(fā)光源對顆粒的探詢；以及當(dāng)檢測發(fā)現(xiàn)顆粒正在被第一激發(fā)光源探詢時，使用熒光檢測器檢測所述顆粒發(fā)出的任何熒光。
此外，所述方法包括以下步驟使用第二激發(fā)光源探詢顆粒；使用被設(shè)置成僅檢測來自第二激發(fā)光源的光的散射光檢測器，檢測借助第二激發(fā)光源對顆粒的探詢；以及當(dāng)檢測發(fā)現(xiàn)顆粒正在被第二激發(fā)光源探詢時，使用熒光檢測器檢測所述顆粒發(fā)出的任何熒光。
此外，根據(jù)本發(fā)明用于測量熒光標(biāo)記顆粒的發(fā)光的系統(tǒng)可以具有多個觸發(fā)器，所述多個觸發(fā)器中的每一個觸發(fā)器都與單獨的散射光檢測器耦合。所述系統(tǒng)還可以具有多個熒光檢測器?？捎卸鄠€積分器與所述的多個觸發(fā)器耦合，每個積分器被設(shè)置成響應(yīng)來自觸發(fā)器的信號而記錄所述多個熒光檢測器中的至少一個熒光檢測器的輸出。任選地，所述系統(tǒng)具有與所述的多個積分器和多個觸發(fā)器耦合的控制器，所述控制器被編程以控制多個積分器和多個觸發(fā)器，從而防止獲得異常數(shù)據(jù)。


參考以下附圖能夠更好地理解本發(fā)明，其中圖1是現(xiàn)有技術(shù)的流式血細(xì)胞計系統(tǒng)的示意圖；圖2是根據(jù)本發(fā)明的流式細(xì)胞計系統(tǒng)的一個實施方式的示意圖，其中采用三個激發(fā)光源，顆粒正在通過來自三個激發(fā)光源中的第一個光源的光束；圖3示出從圖2所示的散射光檢測器接收到的信號；圖4是圖2的流式細(xì)胞計系統(tǒng)的示意圖，其中顆粒正在通過來自三個激發(fā)光源中的第二個光源的光束；圖5示出從圖4所示的散射光檢測器接收到的信號；圖6是圖2的流式細(xì)胞計系統(tǒng)的示意圖，其中顆粒正在通過來自三個激發(fā)光源中的第三個光源的光束；圖7示出從圖6所示的散射光檢測器接收到的信號；圖8是根據(jù)本發(fā)明的流式細(xì)胞計系統(tǒng)的第一附加實施方式的示意圖，使用三個激發(fā)光源，其中第二和第三激發(fā)光源沿液流通道具有略微不同的交叉點；圖9示出從圖8所示的散射光檢測器接收到的信號；圖10是根據(jù)本發(fā)明的第二附加實施方式的散射光檢測器的設(shè)置的示意圖；圖11是圖10的散射光檢測器的側(cè)視圖；圖12是根據(jù)本發(fā)明的第三附加實施方式的散射光檢測器的設(shè)置的示意圖；圖13示出根據(jù)本發(fā)明的第四附加實施方式，使用多個激發(fā)光源的流式細(xì)胞計系統(tǒng)；以及圖14示出根據(jù)本發(fā)明的第五實施方式，使用作為側(cè)向散射光檢測器設(shè)置的多個激發(fā)光檢測器的流式細(xì)胞計系統(tǒng)。
具體實施例方式
通常，本發(fā)明與流式細(xì)胞計聯(lián)合使用。在流式細(xì)胞計中，在顆粒單行通過流動室的檢測區(qū)時，使用一個或多個激發(fā)光源探詢所述顆粒。樣品顆?？梢允呛泻?或涂布有受到激發(fā)光源激發(fā)的熒光指示染料的微球。通常，所述微球是直徑為0.5至10μm的聚苯乙烯顆粒。
激發(fā)光源可以是二極管激光器、固態(tài)激光器、氣體激光器、染料激光器、弧光燈或者是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他光源。例如，可以使用532nm激光器誘導(dǎo)染料例如藻紅素(PE)、CY3和DBCY3染料，這些染料在大約550nm至620nm發(fā)出熒光，同時可以使用635nm激光器誘導(dǎo)染料例如squarine染料和菁藍(lán)染料在約650nm至750nm發(fā)出熒光。本發(fā)明可以包括在488nm發(fā)光的第三激光器，在此公開的本發(fā)明可以很容易延伸至三個激光器以上。可以使用的其他染料包括熒光素、Alexa532和Alexa633?？梢允褂玫募ぐl(fā)光源的其他波長包括650nm和750nm。
誘發(fā)的熒光采用熒光檢測器進行檢測。通常，熒光檢測器是光電倍增管或者本領(lǐng)域已知的其他檢測器。所述的熒光檢測器通常與積分器耦合，所述積分器收集時間窗內(nèi)的熒光檢測器產(chǎn)生的信號。使用積分器不僅能夠?qū)晒鈾z測器接收的整個信號求積分，而且可以用于記錄熒光檢測器接收的峰值強度或最大強度。
在本發(fā)明中，通過使用兩個或更多個散射光檢測器捕獲散射光從而使直線排列兩個或多個激發(fā)光源以及保持兩個或多個激發(fā)光源的直線排列的需要最小化。通常，每個散射光檢測器都具有光電二極管或其他已知的檢測器。帶通濾光器放置在每個光電二極管前面，所述帶通濾光器使來自僅僅一個激發(fā)光源的光到達(dá)所述光電二極管。因此，當(dāng)散射光檢測器檢測散射光時，已知所研究的顆粒位于來自特定激發(fā)光源的光束的路徑中。所述散射光檢測器的信號可以觸發(fā)與特定激發(fā)光源相關(guān)的、從熒光檢測器的數(shù)據(jù)獲得?；蛘撸⑸涔鈾z測器信號可以觸發(fā)從所有熒光檢測器收集數(shù)據(jù)。通常，在信號已經(jīng)通過延遲線后進行數(shù)據(jù)處理。美國專利No.5,367,474中討論了延遲線的用途，該專利的全部內(nèi)容通過引用并入本文。
圖2至9示出了根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式的流式細(xì)胞儀30。對三個激發(fā)光源32、34和36進行調(diào)焦，使得每個激發(fā)光源在沿液流通道40的不同點處探詢顆粒38。充當(dāng)散射光傳感器的三個光電二極管42、44和46順序排列。每個光電二極管都與單獨的帶通濾光器48、50和52光耦合，單獨的帶通濾光器使來自僅僅一個激發(fā)光源的光通過它并射向光電二極管。另外，每個光電二極管42、44和46前面都放置單獨的收集透鏡54、56、58，以收集采用光電二極管檢測的散射光。任選地，束流收集器(未示出)阻擋每個未被散射的激發(fā)光源的光束且防止它們進入收集透鏡。所述光電二極管與觸發(fā)器60電耦合。觸發(fā)器60與積分器62電耦合。積分器62與多個熒光檢測器(未示出)電耦合。熒光檢測器位于激發(fā)光源的光束的直接通路之外。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解，每個光電二極管都可以與單獨的觸發(fā)器耦合，每個單獨的觸發(fā)器都可以與單獨的積分器耦合，且每個單獨的積分器都可以與單獨的熒光檢測器耦合。
在圖2和圖3中，流過液流通道40的顆粒38通過來自第一激發(fā)光源32的光束64。設(shè)有第一帶通濾光器48的、用于僅僅檢測第一激發(fā)光源32的波長的光的第一光電二極管42檢測散射光。如果被檢測的散射光的量大于預(yù)選的臨界值，則觸發(fā)器60觸發(fā)積分器62，對與受到第一激發(fā)光源32激發(fā)的染料相關(guān)的、來自熒光檢測器的信號求積分。設(shè)置成檢測來自第二和第三激發(fā)光源34、36的散射光的第二和第三光電二極管44、46不檢測任何光。
在圖4和圖5中，顆粒38通過來自第二激發(fā)光源34的光束66。設(shè)有第二帶通濾光器50的、用于僅僅檢測第二激發(fā)光源34的波長的光的第二光電二極管44檢測散射光。如果被檢測的散射光的量大于預(yù)選的臨界值，則觸發(fā)器60觸發(fā)積分器62，以對與受到第二激發(fā)光源34激發(fā)的染料相關(guān)的、來自熒光檢測器的信號求積分。設(shè)置成檢測來自第一和第三激發(fā)光源32、36的散射光的第一和第三光電二極管42、46不檢測任何光。
在圖6和圖7中，顆粒38通過來自第三激發(fā)光源36的光束68。設(shè)有第三帶通濾光器52的、用于僅僅檢測第三激發(fā)光源36的波長的光的第三光電二極管46檢測散射光。如果被檢測的散射光的量大于預(yù)選的臨界值，則觸發(fā)器60觸發(fā)積分器62，以對與受到第三激發(fā)光源36激發(fā)的染料相關(guān)的、來自熒光檢測器的信號求積分。設(shè)置成用于檢測來自第一和第二激發(fā)光源32、34的散射光的第一和第二光電二極管42、44不檢測任何光。
激發(fā)光源不需要聚焦于所述液流通道的不同部分。因為帶通濾光器使每個光電二極管僅僅檢測來自一個激發(fā)光源的光，所以可以適當(dāng)?shù)赜|發(fā)積分器。當(dāng)發(fā)生重疊時，兩個或多個光電二極管檢測散射光，在合適的熒光檢測器中開始求積分。
在本發(fā)明的第一附加實施方式中，如圖8和9所示，顆粒38通過來自第二激發(fā)光源34和第三激發(fā)光源36的交叉光束66、68。設(shè)置成用于僅僅檢測第二激發(fā)光源34的波長的光的第二光電二極管44檢測散射光，并通過與第二激發(fā)光源34觸發(fā)的熒光染料相關(guān)的熒光檢測器觸發(fā)積分。
同時，被設(shè)置成僅僅檢測第三激發(fā)光源36的波長的光的第三光電二極管46檢測散射光，并且通過與第三激發(fā)光源36觸發(fā)的熒光染料相關(guān)的熒光檢測器觸發(fā)求積分。設(shè)置成用于檢測來自第一激發(fā)光源32的散射光的第一光電二極管42不檢測任何光且不通過其相應(yīng)的熒光檢測器觸發(fā)求積分。
優(yōu)選地，所述的激光束在與液流通道的交叉點處呈橢圓形。橢圓光束的寬軸與窄軸的長寬比約為10∶1，橢圓的窄軸的取向穿過液流軸。所述窄軸約為8微米且寬軸約為80微米。優(yōu)選地，光束沿所述液流通道方向相互間隔盡可能地近而不發(fā)生重疊。所述光束之間的間隔優(yōu)選為約30至50微米。
圖10和圖11示出根據(jù)本發(fā)明的第二附加實施方式的散射光檢測器的排列。充當(dāng)傅立葉透鏡的單個大孔徑會聚透鏡69收集從所有三個激發(fā)光源散射的光。激光束被位于所述透鏡前面的單個束流收集器(未示出)阻擋。三個光電二極管70、72、74距離透鏡光軸大約等距離排列。光電二極管70、72、74位于以下平面內(nèi)，所述平面位于距離透鏡一個焦距且垂直于透鏡的光軸。在光電二極管的平面處，顆粒散射的光產(chǎn)生光學(xué)傅立葉轉(zhuǎn)換。該轉(zhuǎn)換將相對于散射角的散射光強度轉(zhuǎn)化成相對于與透鏡光軸的距離的光強度。該轉(zhuǎn)換不依賴于光源的位置。每個光電二極管在大的角度范圍內(nèi)收集光線，即從約+/-1°至約+/-19°，產(chǎn)生隨顆粒大小單調(diào)增大的電信號。
任選地，其中一個光電二極管70的面積約為其他光電二極管72、74中的任意一個的面積的兩倍。面積差有助于補償光電二極管隨激發(fā)波長變化的靈敏度。光電二極管對藍(lán)光波長內(nèi)的激發(fā)光不太靈敏，且隨著激發(fā)光移至紅光和紅外光波長，其靈敏度增大。而且，可以調(diào)節(jié)兩個較小的光電二極管的前置放大器的增益，以進一步補償靈敏度的差異。調(diào)節(jié)的目標(biāo)是對于給定尺寸顆粒的每個二極管而言可獲得具有大致相同的振幅的信號。
在每個光電二極管前面是濾光器76、78、80，所述濾光器使三個激發(fā)光波長中的僅僅一個到達(dá)光電二極管?？梢詫碜悦總€光電二極管檢測器70、72、74的輸出輸送到充當(dāng)觸發(fā)器(未示出)的單獨的信號處理板，使得每個信號可以充當(dāng)獨立的觸發(fā)。另外，來自所有三個光電二極管70、72、74的輸出信號可以相加在一起，且將得到的復(fù)合信號輸送到用于顯示的單個示波器通道中。
每個信號處理板測試來自光電二極管的輸出，以確定所述輸出是否已經(jīng)達(dá)到預(yù)定觸發(fā)水平。如果來自光電二極管的輸出高于預(yù)定觸發(fā)水平，則信號處理板指示積分器(未示出)對從合適的熒光檢測器接收的信號求積分。
所述積分器一旦被觸發(fā)，可以對預(yù)選的最短時間段所檢測的任何信號求積分。信號處理板繼續(xù)測試來自觸發(fā)光電二極管的輸出，直至該輸出降至預(yù)定觸發(fā)水平以下。一旦來自觸發(fā)光電二極管的輸出降至預(yù)定的觸發(fā)水平以下，信號處理板則指示積分器停止求積分。
在本發(fā)明的第三附加實施方式中，如圖12所示，使用纖維光學(xué)束82形成散射光檢測器。三個激光器84、86、88用作激發(fā)光源。纖維光學(xué)束82含有三套不同的纖維90、92、94。三套纖維90、92、94中的每一套對應(yīng)于三個激光器84、86、88之一。三套纖維束90、92、94中的每一套都指向單獨的光電二極管96、98、100。三套光電二極管96、98、100中的每一套負(fù)責(zé)檢測來自三個激光器之一的光。所述光電二極管可以與傅立葉透鏡一起使用或者不與其一起使用。
每個光電二極管96、98、100的前面都具有帶通濾光器102、104、106，使僅僅一個波長的光被輸送至光電二極管96、98、100。如圖12所示，可以排列纖維光學(xué)束82使得每隔三個的纖維都屬于同一組且指向同一光電二極管。由于激發(fā)光源的相對位置是已知的，因此每次試驗的激發(fā)光源的相對位置有小的偏差是可以容許的。
本發(fā)明還可減少熒光檢測器的數(shù)目。通常，對于每種不同的待檢測染料，使用單獨的熒光檢測器。每個熒光檢測器前面都具有濾光器，僅允許具有特定染料波長的光通過。
通常，在具有兩個不同激發(fā)光源的系統(tǒng)中，每個激發(fā)光源激發(fā)顆粒上的兩種不同染料，需要四個不同的熒光檢測器。當(dāng)顆粒通過第一激發(fā)光源前面時，與受到第一激發(fā)光源激發(fā)的染料相關(guān)的兩個熒光檢測器開始求積分。同樣，當(dāng)所述顆粒通過第二激發(fā)光源前面時，與受到第二激發(fā)光源激發(fā)的染料相關(guān)的兩個熒光檢測器開始求積分。
本發(fā)明使用對每個激發(fā)光源專用的散射光檢測器，以得知哪個激發(fā)光源在給定時間正在探詢顆粒。另外，本發(fā)明將多帶通濾光器與每個熒光檢測器結(jié)合使用，以減少必需的熒光檢測器的數(shù)目。
圖13示出本發(fā)明的第四附加實施方式。如圖13所示，結(jié)合使用多帶通濾光器和熒光檢測器的示例系統(tǒng)具有聚焦于液流通道110中的顆粒108上的兩個激發(fā)光源106。在該示例性實施方式中，所述兩個激發(fā)光源是激光器。一個激光器的波長為532nm，另一個激光器的波長為635nm。分別與單獨的帶通濾光器114耦合的兩個光電二極管112對應(yīng)于所述的兩個激光器的波長之一，設(shè)置這兩個光電二極管以接收被散射的激發(fā)光。每個光電二極管都與觸發(fā)器116電耦合，所述觸發(fā)器與積分器118電耦合。任選地，控制器119與觸發(fā)器116和積分器118耦合。注意，在圖13中，液流通道110的方向垂直于頁面。因此，只有兩個激發(fā)光源106中的一個激發(fā)光源、光電二極管112，帶通濾光器114，觸發(fā)器116和積分器118是可以看到的。
熒光光學(xué)收集器120收集由與顆粒相關(guān)的染料發(fā)射的熒光。第一光電倍增管122和第二光電倍增管124用作熒光檢測器。所述第一和第二光電倍增管122、124與積分器118電耦合，且圍繞50/50鏡126相互呈90度設(shè)置。將50/50鏡126設(shè)計成反射50％的入射在其上的光且透射50％的入射在其上的光。
第一光電倍增管122與第一雙帶通濾光器128耦合。第二光電倍增管124與第二雙帶通濾光器130耦合。每個雙帶通濾光器128、130都被設(shè)計成使由受到所述兩個激光器中的每一個激光器激發(fā)的一種染料所發(fā)射的光通過。
在該示例性實施方式中，每個顆粒具有三種染料藻紅素(PE)，響應(yīng)532nm光的激發(fā)在575nm和605nm發(fā)光；BCD646，響應(yīng)635nm光的激發(fā)在660nm發(fā)光的squaraine染料；以及BCD676，響應(yīng)635nm光的激發(fā)在780nm發(fā)光的菁藍(lán)染料。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以使用其他染料代替上面所列舉的那些染料。
第一雙帶通濾光器128使由于532nm激發(fā)而發(fā)出的575nm的光和由于635nm激發(fā)而發(fā)出的660nm的光通過。第二雙帶通濾光器130使由于532nm激發(fā)而發(fā)出的605nm的光和由于635nm激發(fā)而發(fā)出的780nm的光通過。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，其他激發(fā)光源/發(fā)射的組合也是可行的。
通過手工或自動使激光器復(fù)位并監(jiān)控兩個前向散射光傳感光電二極管，使激光器在空間上相互偏移。當(dāng)來自兩個光電二極管112的信號不是同時發(fā)生時，激光器在空間上偏移。
因為光電二極管指示哪個激光器當(dāng)前正照射顆粒，所以來自每個光電倍增管的響應(yīng)可以歸屬于特定的染料。為了示例的目的，顆粒首先對準(zhǔn)532nm激光器，然后是635nm激光器。但是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，使用前不需要知道順序。
當(dāng)具有532nm帶通濾光器的光電二極管檢測響應(yīng)時，顆粒108位于532nm激光器前面。被提到的染料是PE，該染料在575nm和605nm發(fā)光。來自這兩個通道的熒光將占所述發(fā)射線的大多數(shù)。對來自第一和第二光電倍增管的輸出求積分并歸屬于PE。
當(dāng)顆粒108繼續(xù)沿液流通道110向下流動時，所述顆粒到達(dá)635nm激光器，具有635nm帶通濾光器的光電二極管觸發(fā)對來自光電倍增管的信號求積分。這里所提到的兩種染料是BCD646和BCD676。來自第一光電倍增管的輸出歸屬于BCD646，來自第二光電倍增管的輸出歸屬于BCD676。有效的做法是，與熒光檢測器組合的散射光傳感光電二極管使來自每個光電倍增管的求積分信息基于哪個激光器正在探詢顆粒而進行動態(tài)歸屬。
當(dāng)顆粒通過激發(fā)光的光路時，在來自顆粒的多個方向上發(fā)生散射。盡管前向角光散射占主導(dǎo)地位，但是在激發(fā)光方向的正交方向上也發(fā)生大量散射。
在第五附加實施方式中，如圖14所示，排列散射光檢測器以收集側(cè)向散射光。在該實施方式中，有兩個激發(fā)光源，例如激光器。激發(fā)光106聚焦于液流通道110中的顆粒108上。熒光光學(xué)收集器120收集側(cè)向散射光和由與顆粒相關(guān)的染料發(fā)射的熒光。注意，在圖14中，液流通道110的方向垂直于頁面。因此，兩個激發(fā)光源106中只有一個是可見的。
第一玻璃片132與離開光學(xué)收集器的光路呈約45度角排列，該玻璃反射少量的光，例如約4％。反射光通過第一濾光器136，所述濾光器被設(shè)計成透射來自兩個激光器中僅僅一個激光器的光。然后由第一光電探測器140，例如光電倍增管或光電二極管，檢測通過第一濾光器136的被反射光。
透過第一玻璃片132的光照射第二玻璃片134，該玻璃片與離開光學(xué)收集器的光路呈約45度角排列。第二玻璃片134反射少量的光，例如約4％。從第二玻璃片134反射的光通過第二濾光器138，所述濾光器被設(shè)計用于透射來自另一個激光器的光。然后由第二光電探測器142，例如光電倍增管或光電二極管，檢測通過第二濾光器138的反射光。
來自第一和第二光電探測器140、142的輸出被發(fā)送至信號處理板，該信號處理板用作與熒光檢測器144耦合的積分器(未示出)的觸發(fā)器，所述熒光檢測器與每個激光器相關(guān)。任選地，控制器(未示出)可與所述的信號處理板和所述的積分器耦合。
本發(fā)明構(gòu)思可以延伸至更多種被監(jiān)控的染料。如果X是被所述系統(tǒng)中任一個激光器激發(fā)的染料的最大數(shù)目，則需要X個檢測器，且位于每個檢測器前面的濾光器包括最多Y個帶通區(qū)，其中Y是激光器的數(shù)目。舉例來說，如果總計有15種染料和三個激光器，每個激光器激發(fā)五種染料，則可以使用五個檢測器，每個檢測器與具有三個帶通的多帶通濾光器耦合。
雖然本發(fā)明增加了直線排列激光器以獲得好的熒光信息的范圍，但是該范圍是有限的。這種限制主要是由于熒光光學(xué)收集器的觀察區(qū)導(dǎo)致的。通常，熒光光學(xué)收集器收集來自顆粒的熒光射線，通過幾百微米寬的小孔聚焦熒光射線，然后使熒光射線與熒光檢測器對準(zhǔn)。所述小孔的存在可在空間上濾出散射光。如果移動激發(fā)光源，使得熒光超出光學(xué)器件能夠收集和透過小孔的范圍，則收集效率降低，導(dǎo)致熒光強度下降。通過使用垂直狹縫代替所述小孔，可以略微減小該限制。光學(xué)器件能夠收集和透過的范圍沿顆粒的流動而擴展。
如果在使用來自空間上分離的激發(fā)光源的獨立觸發(fā)時不控制某些條件，則可能會獲得異常數(shù)據(jù)?？梢杂煽刂破骺刂频倪@些異常數(shù)據(jù)有幾個來源，所述控制器可處理來自所述觸發(fā)器的信號，從而保證得到正確數(shù)據(jù)。
當(dāng)所述激發(fā)光源之一產(chǎn)生觸發(fā)信號而不是任意數(shù)目的其他激發(fā)光源產(chǎn)生觸發(fā)信號時，產(chǎn)生第一異常數(shù)據(jù)源。當(dāng)一個觸發(fā)器從其相應(yīng)的散射光檢測器接收的信號具有足以越過預(yù)定臨界值的振幅時，就會發(fā)生這種情況，但是來自所有散射光檢測器的信號都不足以越過它們各自的預(yù)定臨界值。防止所述的第一異常數(shù)據(jù)源的第一種方法是保持觸發(fā)器臨界值相對于散射光檢測器信號振幅而言盡可能低。但是，該方法是有限的，因為預(yù)定臨界值還應(yīng)當(dāng)高于背景噪音水平，從而防止來自碎屑、光噪以及電子噪聲的亂真觸發(fā)信號。
防止所述的第一異常數(shù)據(jù)源的第二種方法要求散射光檢測器信號具有足以越過第一觸發(fā)器臨界值的振幅，從而引發(fā)“事件”且隨后使用所述“事件”信號激發(fā)后面的觸發(fā)器。使用這一方法，還應(yīng)當(dāng)存在超時裝置(time-out means)，如果沒有越過一個或多個后面的觸發(fā)器的臨界值則該裝置限制“事件”的持續(xù)時間。在簡單的實施方案中，由“事件”的開始引發(fā)單個的超時裝置，且如果所有需要的觸發(fā)都沒有發(fā)生，則所述超時裝置在所述“事件”的預(yù)期終點之稍后到達(dá)最終計數(shù)。
在更為復(fù)雜的實施方案中，該超時裝置應(yīng)當(dāng)被設(shè)定為比兩個順序觸發(fā)之間的預(yù)期時間略長的時間段，且在一個觸發(fā)都沒有發(fā)生的情況下應(yīng)當(dāng)強行觸發(fā)。在具有多個獨立觸發(fā)器的系統(tǒng)中，應(yīng)當(dāng)重新設(shè)定且在每一對可能的獨立觸發(fā)器之間重新配置該超時裝置。該實施方案能夠識別哪個觸發(fā)器失蹤。在另一個實施方案中，觸發(fā)功能的強制性保持捕獲和獲得周期的完整性。含有強行觸發(fā)的任何數(shù)據(jù)幀都應(yīng)當(dāng)被標(biāo)記，標(biāo)明該數(shù)據(jù)幀可能含有可疑數(shù)據(jù)且不應(yīng)當(dāng)被包括在最終的數(shù)據(jù)集中。
潛在異常數(shù)據(jù)的第二個來源是在從其獲得數(shù)據(jù)的顆粒附近存在游動的第二顆粒。當(dāng)樣品顆粒的頻率增大時該問題的嚴(yán)重性增加。由于捕獲過程的周期時間，導(dǎo)致兩個順序事件之間存在有限距離，在該距離內(nèi)兩個事件都不能被捕獲，這就是“被占”時間。該“被占”時間導(dǎo)致所有“事件”被分成兩類被捕獲的“事件”和遺漏的“事件”。不僅沒有記錄關(guān)于“事件”的數(shù)據(jù)，而且如果來自“遺漏事件”的一部分信號落在“被捕獲事件”的捕獲窗內(nèi)，則還會污染來自“被捕獲事件”的數(shù)據(jù)。
污染性“遺漏事件”分成兩類“被捕獲事件”前面的事件和“被捕獲事件”后面的事件。前面的“遺漏事件”是在更早發(fā)生的“被捕獲事件”的“被占”時間發(fā)生的事件。如果包括一個或多個觸發(fā)器和一個或多個積分器的捕獲系統(tǒng)已經(jīng)完成事件捕獲并且將要被重新配置，則應(yīng)當(dāng)確定沒有另一事件正在進行。如果在事件期間捕獲系統(tǒng)被重新配置，則無法精確確定樣品顆粒的位置且無法精確捕獲有關(guān)該顆粒的數(shù)據(jù)。因此，所述的重新配置過程應(yīng)當(dāng)測試一個或多個觸發(fā)器信號，以證實事件不在進行中。
如果在“遺漏事件”結(jié)束之后立即重新配置該捕獲系統(tǒng)且隨后通過緊隨其后的下一事件觸發(fā)該系統(tǒng)，則兩個事件都可以存在于該捕獲窗中。防止該問題的一種方法是將捕獲過程的重新配置向后延一時間，該時間比在前事件的終點超過一預(yù)選的延遲時間。所述的預(yù)選延遲時間例如可以等于捕獲窗寬度的約一半。每個事件都重新設(shè)定且重新啟動該延遲時間。
為了檢測和補償后面的“遺漏事件”引起的污染，捕獲系統(tǒng)在“被占”時間期間檢查用于其他事件的觸發(fā)處理器。如果發(fā)生其他事件，則“被捕獲事件”被標(biāo)記為可能被污染，且不應(yīng)當(dāng)包括在最終的數(shù)據(jù)集中。
潛在異常數(shù)據(jù)的第三個來源是存在距離被捕獲顆粒足夠遠(yuǎn)游動的“遺漏事件”顆粒，所述“遺漏事件”顆粒不出現(xiàn)在同一捕獲窗中，但是足夠近地位于被捕獲顆粒前面，以較早觸發(fā)下一觸發(fā)器。為了減小該可能性，改進上述超時裝置以提供涵蓋預(yù)期觸發(fā)時間的激活窗。這將排斥較早的觸發(fā)，同時允許所述觸發(fā)依賴于來自被捕獲顆粒的信號。如果激活窗結(jié)束且仍不發(fā)生觸發(fā)，則如上所述強行觸發(fā)第一觸發(fā)器，以保持相關(guān)性。應(yīng)當(dāng)標(biāo)記包含強行觸發(fā)的任何數(shù)據(jù)幀，注明該數(shù)據(jù)幀可能含有可疑數(shù)據(jù)，且不應(yīng)當(dāng)被包括在最終的數(shù)據(jù)集中。
造成“被捕獲事件”的潛在污染的最后一個來源是兩個事件的捕獲窗發(fā)生重疊，所述兩個事件發(fā)生在捕獲過程中，但是位于不同的激光器位置。隨著激光器探詢點的數(shù)目增加、探詢點之間的距離增大以及樣品顆粒的速率增大，出現(xiàn)該潛在問題的可能性增大。該問題的嚴(yán)重性依賴于不同光學(xué)測量通道之間的光學(xué)隔離程度。在兩個或多個捕獲窗之間發(fā)生重疊的事實是可檢測的，且可以用于標(biāo)記很可能異常的結(jié)果。
應(yīng)當(dāng)通過處理觸發(fā)信號的電子設(shè)備檢測并控制錯誤捕獲的所有這些可能原因，從而防止獲得異常數(shù)據(jù)。
本發(fā)明排除了必須要求來自兩個或多個激發(fā)光源的光束在流動室中的單個點交叉。而且，本發(fā)明減少了來自受到其他激發(fā)光源激發(fā)的染料的干擾熒光(“串?dāng)_”)。而且，激發(fā)光源的整體直線排列受到的限制較少，因為每個激發(fā)光源都有其自己的位置傳感器。將多帶通濾光器與較少的光電倍增管和相關(guān)的電子設(shè)備結(jié)合使用顯著降低了成本并節(jié)省了空間。
雖然已經(jīng)結(jié)合特定的優(yōu)選實施方式相當(dāng)詳細(xì)地描述了本發(fā)明，但是其他實施方式也是可行的。因此，權(quán)利要求書的旨意和范圍并不限于本文中對優(yōu)選實施方式的描述。
說明書，包括權(quán)利要求書、摘要和附圖中公開的所有特征，以及公開的任何方法或工藝中的所有步驟都可以任意組合，至少一些上述特征和/或步驟相互排斥的組合除外。說明書，包括權(quán)利要求書、摘要和附圖中公開的每個特征都可以被用于相同、等同或相似目的的替代性特征所代替，除非另外明確指出。這樣，除非另外明確指出，公開的每個特征都是僅僅屬于等同或相似特征的上位系列的一個實例。
權(quán)利要求
1.用于測量熒光標(biāo)記顆粒的發(fā)光的系統(tǒng)，其包括血細(xì)胞計數(shù)器的流動室，該流動室具有供熒光標(biāo)記顆粒通過的液流通道；多個激發(fā)光源，每個激發(fā)光源都發(fā)射入射在血細(xì)胞計數(shù)器的流動室上的光束；多個散射光檢測器，其與血細(xì)胞計數(shù)器的流動室的液流通道具有光通訊，每個散射光檢測器都被設(shè)置用于檢測來自所述多個激發(fā)光源中的僅僅一個光源的光，且以如此方式排列在熒光標(biāo)記顆粒通過血細(xì)胞計數(shù)器的流動室的液流通道時，所述的每個散射光檢測器檢測來自所述顆粒的散射光；與所述的多個散射光檢測器連接的觸發(fā)器，當(dāng)入射在其中一個散射光檢測器上的散射光超過預(yù)定臨界值時，所述觸發(fā)器發(fā)出信號；與血細(xì)胞計數(shù)器的流動室的液流通道具有光通訊的光學(xué)收集器，用于收集來自熒光標(biāo)記顆粒的射線；至少一個熒光檢測器，用于接收由光學(xué)收集器收集的射線并且產(chǎn)生輸出，所述至少一個熒光檢測器被設(shè)置成僅僅響應(yīng)多個離散的波段；以及至少一個積分器，與所述觸發(fā)器和所述至少一個熒光檢測器相連接，用于響應(yīng)來自所述觸發(fā)器的信號而記錄所述的至少一個熒光檢測器的輸出。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其進一步包括三個激發(fā)光源和三個散射光檢測器，每個散射光檢測器都被設(shè)置成檢測來自三個激發(fā)光源中僅僅一個光源的光。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的系統(tǒng)，其中所述三個激發(fā)光源沿液流通道而設(shè)置；且其中所述三個散射光檢測器的排布使每個散射光檢測器對應(yīng)于所述三個激發(fā)光源中的一個不同光源。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的系統(tǒng)，其中帶通濾光器設(shè)置在所述的每個散射光檢測器前面，使所述三個激發(fā)光波長中的僅僅一個波長到達(dá)檢測器。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的系統(tǒng)，其中所述的三個激發(fā)光源圍繞激發(fā)光軸設(shè)置；圍繞所述的激發(fā)光軸設(shè)置纖維光學(xué)束，所述纖維光學(xué)束含有三套光學(xué)纖維；且每套光學(xué)纖維與所述三個散射光檢測器中的一個不同的檢測器光耦合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中，所述多個散射光檢測器中的每一個還包括帶通濾光器，每個帶通濾光器使來自僅僅一個激發(fā)光源的光通過。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中使至少兩個激發(fā)光源聚焦，從而在流動室的液流通道中重疊。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中，所述的多個散射光檢測器中的每一個都進一步包括光電二極管。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的系統(tǒng)，其中所述的至少一個熒光檢測器包括光電倍增管。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的系統(tǒng)，其中所述的至少一個熒光檢測器包括具有至少一個帶通的濾光器。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的系統(tǒng)，其中，所述的多個激發(fā)光源中的至少一個光源包括激光器。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的系統(tǒng)，其中，所述的多個激發(fā)光源包括兩個激光器。
13.用于測量具有多種染料的顆粒的熒光性的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括a)預(yù)定數(shù)目的激光器，至少一個激光器激發(fā)最大數(shù)目的染料；b)至少一個熒光檢測器，每個熒光檢測器進一步包括(i)光電倍增管；以及(ii)與光電倍增管具有光通訊的多帶通濾光器，所述的多帶通濾光器使多個離散的波段通過并到達(dá)光電倍增管，所述波段的數(shù)目小于或等于激光器的預(yù)定數(shù)目；且其中熒光檢測器的數(shù)目等于染料的最大數(shù)目。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的系統(tǒng)，其進一步包括a)多個散射光檢測器，其數(shù)目等于激光器的數(shù)目；b)與所述的散射光檢測器耦合的觸發(fā)器，當(dāng)入射在其中一個散射光檢測器上的散射光超過預(yù)定臨界值時所述觸發(fā)器發(fā)射信號；以及c)與所述觸發(fā)器和所述至少一個熒光檢測器耦合的至少一個積分器，所述積分器響應(yīng)來自觸發(fā)器的信號記錄至少一個熒光檢測器的輸出。
15.用于測量具有多種染料的顆粒的熒光性的方法，該方法包括a)使用第一激發(fā)光源探詢顆粒；b)使用散射光檢測器檢測第一激發(fā)光源對顆粒的探詢，所述散射光檢測器被設(shè)置成僅僅檢測來自第一激發(fā)光源的光；c)當(dāng)檢測到第一激發(fā)光源正在探詢顆粒時，使用熒光檢測器檢測顆粒發(fā)射的任何熒光；d)使用第二激發(fā)光源探詢顆粒；e)使用散射光檢測器檢測第二激發(fā)光源對顆粒的探詢，所述散射光檢測器被設(shè)置成僅僅檢測來自第二激發(fā)光源的光；以及f)當(dāng)檢測到第二激發(fā)光源正在探詢顆粒時，使用熒光檢測器檢測顆粒發(fā)射的任何熒光。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其進一步包括a)當(dāng)確定第一激發(fā)光源正在探詢顆粒時，將任何檢測到的熒光歸屬于已知將被第一激發(fā)光源激發(fā)的染料；以及b)當(dāng)確定第二激發(fā)光源正在探詢顆粒時，將任何檢測到的熒光歸屬于已知將被第二激發(fā)光源激發(fā)的染料。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的多個熒光檢測器的至少一個包括濾光器，該濾光器僅使受到第一激發(fā)光源的激發(fā)而由第一染料發(fā)射的光和受到第二激發(fā)光源的激發(fā)而由第二染料發(fā)射的光通過。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其進一步包括多個觸發(fā)器，所述多個觸發(fā)器中的每一個都與多個散射光檢測器中單獨的一個相應(yīng)的散射檢測器耦合，且當(dāng)入射在相應(yīng)散射光檢測器上的散射光超過預(yù)定的臨界值時每個觸發(fā)器都發(fā)射信號；多個熒光檢測器；以及多個積分器，每個積分器都與多個觸發(fā)器中單獨的一個相應(yīng)的觸發(fā)器耦合，且每個積分器都被設(shè)置成響應(yīng)來自所述的相應(yīng)的觸發(fā)器的信號而記錄多個熒光檢測器中的至少一個的輸出。
19.根據(jù)權(quán)利要求19所述的系統(tǒng)，其進一步包括與多個積分器和多個觸發(fā)器耦合的控制器，所述控制器別被編程以控制多個積分器和多個觸發(fā)器，從而防止獲得異常數(shù)據(jù)。
全文摘要
用于測量熒光標(biāo)記顆粒(38)的發(fā)光的系統(tǒng)，其包括血細(xì)胞計數(shù)器流動室；多個激發(fā)光源(32)；多個散射光檢測器，每個散射光檢測器都被設(shè)置成檢測來自多個激發(fā)光源(32)中僅僅一個光源的光且被排列用于檢測來自所述顆粒(38)的散射光；與多個散射光檢測器連接的觸發(fā)器(60)，當(dāng)入射在其中一個散射光檢測器上的散射光超過預(yù)定臨界值時所述觸發(fā)器(60)發(fā)出信號；光學(xué)收集器(120)；至少一個熒光檢測器，用于接收由光學(xué)收集器(120)收集的射線且產(chǎn)生輸出，所述至少一個熒光檢測器被設(shè)置成僅僅響應(yīng)多個離散的波段；以及積分器(118)，用于響應(yīng)來自觸發(fā)器(60)的信號而記錄至少一個熒光檢測器的輸出。
文檔編號G01N15/14GK1910439SQ200580002052
公開日2007年2月7日 申請日期2005年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月23日
發(fā)明者羅伯特·愛德華·奧爾, 克拉倫斯·盧, 斯特芬·L·小彭托尼, 楊大偉 申請人:貝克曼考爾特公司