專利名稱：B細(xì)胞疾病的靶的制作方法
專利說明B細(xì)胞疾病的靶 發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及B細(xì)胞疾病如多發(fā)性骨髓瘤(MM)的診斷和治療。特別地，本發(fā)明涉及使用與在淋巴樣細(xì)胞表面上表達(dá)的游離λ輕鏈結(jié)合的配體治療淋巴增生疾病。

背景技術(shù)：
多發(fā)性骨髓瘤是一種血液癌癥，其中惡性細(xì)胞是最終分化的單克隆B細(xì)胞。對這種疾病的常規(guī)治療是給予高劑量的化療方案與或無自體干細(xì)胞移植。然而，越來越多的臨床跡象表明這種治療方案不可避免地要失敗，因為腫瘤最終難以控制(Davies et a1.(2000)Eur.J.Haematol.64359-367；Ryoo et al.(2002)Blood Rev.16167-174；Kyle RA，(2001a)Oncologist 6119-124)。
目前對多發(fā)性骨髓瘤的治療 目前對MM的治療方法在文獻(xiàn)中已經(jīng)報道，包括多種高劑量的化療方法(Kyle RA(2001a)Oncologist 6119-124；Kyle RA(2001b)Seminars in Hematology 38；2；3；11-14，Anderson et a1.(1999)Seminars in Hematology 36；1；3-8)。大多數(shù)MM患者在診斷時已經(jīng)具有癥狀性疾病并需要治療，然而一些患者無癥狀，一般未得到治療直至出現(xiàn)癥狀。
小于65歲的MM患者選擇的治療方法是自體外周血干細(xì)胞移植(autologous peripheral blood stem cell transplantation，APB ST)組合化療方法(Harousseau and Attal(2002)Blood Reviews 16；245-253)。對于65歲以上的患者或者不可進(jìn)行移植的較年輕的患者優(yōu)選最初只進(jìn)行化療。APBST可適用于一半以上的MM患者。盡管嘗試降低移植物的腫瘤細(xì)胞污染，還是示出自體外周血干細(xì)胞通常污染了骨髓瘤細(xì)胞或其前體。這導(dǎo)致了惡性細(xì)胞在骨髓的重新建群(re-population)并最后導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)。
最初對有癥狀的MM患者的治療是高劑量的化療(Kyle RA，(2001a)The Oncologist 6；2；119-124；Kyle RA，(2001b)Seminarsin Hematology 38；2；3；11-14，Anderson et al.(1999)Seminars inHematology 36；1；3-8)。大多數(shù)醫(yī)師治療患者是使用長春新堿、阿霉素(Adriamycin)和地塞米松(VAD)治療3-4個月。這導(dǎo)致骨髓和外周血中腫瘤細(xì)胞減少。然后給予高劑量的環(huán)磷酰胺和粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)。G-CSF刺激外周血干細(xì)胞(CD34+B-細(xì)胞)產(chǎn)生以進(jìn)行自體外周血干細(xì)胞移植。在這個階段取外周血，使用熒光活化的細(xì)胞分選儀(FACS)收集干細(xì)胞。
目前在用干細(xì)胞進(jìn)行骨髓移植之前有至少兩個治療方案可以選擇。在第一個情況中，給予患者高劑量的化療和/或全身照射，隨后進(jìn)行APBST?；蛘?，在干細(xì)胞收集之后可以給予患者烷化劑直至達(dá)到平臺期。然后給予α2-干擾素抑制細(xì)胞生長和分裂，或者可以不予治療直至疾病復(fù)發(fā)。在這個階段給予患者高劑量的苯丙氨酸氮芥和/或全身照射及輸注先前收集的血液干細(xì)胞。通常，給予苯丙氨酸氮芥(200mg/m2)，因為其毒性較低，而且看起來使用全身照射無益處。
在MM患者中常規(guī)化療和高劑量化療組合APBST的比較研究表明后者顯著改善無疾病存活和總存活(Harousseau and Attal(2002)Blood Reviews 16；245-253)。目前VAD治療隨后進(jìn)行APBST治療在移植組與僅VAD處理組相對比具有更好的5年存活期(52％對12％)。可以持續(xù)化療直至患者處于平臺狀態(tài)或者持續(xù)一年的化療。如果6個月后在平臺期疾病復(fù)發(fā)，則應(yīng)重新制定化療方案。盡管近來對治療方案有所改進(jìn)，但是對這些臨床研究的長期追蹤調(diào)查示出即使大劑量的化療和APBST也不能消除患者中的骨髓瘤。
因此，目前的治療是延長患者的生命而不是治愈?，F(xiàn)在很明顯這種疾病的進(jìn)展與遺傳不穩(wěn)定性相關(guān)，更特別與參與粘附、凋亡、細(xì)胞周期、藥物抗性、生長停滯、腫瘤形成、信號化和轉(zhuǎn)錄的基因失調(diào)相關(guān)(Zhan et al.(2002)Blood 99；5；1745-1757)。
疾病的進(jìn)展是一個多步轉(zhuǎn)化過程 一些研究提示多發(fā)性骨髓瘤中疾病的進(jìn)展與惡性漿細(xì)胞的進(jìn)展性遺傳事件相關(guān)(Hallek et al.(1998)Blood 91，13-21；Avet-Loiseau et al.(2002)Blood 99；6；2185-2191；Zhan et al.(2002)Blood 99；5；1745-1757)。疾病的進(jìn)展階段看起來是由于先發(fā)生的稱作未確定意義的單克隆丙種球蛋白病(monoclonal gammopathy ofundetermined significance，MGUS)的單克隆漿細(xì)胞紊亂引發(fā)的，其中所述細(xì)胞被永生化而不是轉(zhuǎn)化。進(jìn)展接下來的階段是髓內(nèi)骨髓瘤，發(fā)現(xiàn)所述細(xì)胞僅在骨髓中并且依賴骨髓間質(zhì)細(xì)胞(BMSC)存活。特別地，在MM細(xì)胞和BMSC之間產(chǎn)生白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-6受體(IL-6R)的旁分泌環(huán)。IL-6看起來是在骨髓中建立骨髓瘤細(xì)胞最重要的細(xì)胞因子。最明顯的作用是IL-6具有抑制地塞米松在骨髓瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的能力。
伴隨的是骨髓瘤細(xì)胞刺激與負(fù)責(zé)骨吸收的破骨細(xì)胞，導(dǎo)致在MM中發(fā)現(xiàn)特征性的骨損害。在這個階段之后是髓外階段，其中細(xì)胞增殖更迅速并且在血液中生長(漿細(xì)胞性白血病，PCL)或者在其它髓外部位生長。疾病發(fā)展最后階段是細(xì)胞完全失調(diào)，并且可以在體外增殖。
遺傳異常 在細(xì)胞水平，疾病進(jìn)展與和基因失調(diào)的特異例子相關(guān)的遺傳異常密切相關(guān)(Hallek et al.(1998)Blood 91，1；3-21)。一些核型分析研究示出非整倍性是骨髓瘤細(xì)胞的一個共有特征，其不依賴于疾病階段。這些研究的綜述提示多發(fā)性骨髓瘤中有兩類主要的遺傳異常(Fonseca et al.(2004)Cancer Research 64；1546-1558)。一類是由涉及免疫球蛋白重鏈基因座(IgH)的易位的患者組成，這組成了骨髓瘤患者中將近一半的遺傳異常。還清楚的是亞二倍體核型和染色體13單體性通常與IgH易位相關(guān)。最近已經(jīng)確定了特異性IgH易位的普遍性和臨床重要性，并且在Fonseca et al.(2004)Cancer Research 64；1546-1558中報道。
剩余的50％的患者似乎具有超二倍體核型，不具有IgH易位。
涉及輕鏈(IgL)基因的易位還未充分鑒定。一項研究表明將近10％的MGUS樣品和將近20％的骨髓內(nèi)MM腫瘤中存在IgL-λ易位(Fonseca et al.(2002)Blood，100；1417-1424)。IgL-κ的易位僅在少數(shù)髓內(nèi)MM腫瘤中鑒別(Fonseca et al.(2004)Cancer Research 64；1546-1558)。目前，IgL易位的臨床重要性還未知。
骨髓瘤細(xì)胞的單克隆蛋白質(zhì) 盡管在多發(fā)性骨髓瘤中發(fā)現(xiàn)的核型異常很復(fù)雜，但這種疾病的實驗室特點是單克隆蛋白質(zhì)(M-蛋白質(zhì))的產(chǎn)生及分泌進(jìn)血液和/或尿液中。通常，M-蛋白質(zhì)是一種免疫球蛋白或者免疫球蛋白組分，其未保留正常的抗體功能。骨髓瘤細(xì)胞通常產(chǎn)生過量的λ或者κ輕鏈(本斯-瓊斯氏蛋白(Bence Jones protein)，BJP)。BJP存在于細(xì)胞質(zhì)中并且也分泌進(jìn)血液中。它們通常以單體(22-25kD)和二聚體(50kD)形式分泌，并且足夠小可以自由通過進(jìn)入尿液中(Durie(2003)International Myeloma Foundation，Multiple Myeloma，ConciseReview of the Disease and Treatment Options)。
與重鏈不相關(guān)的膜結(jié)合λ輕鏈的存在提供了對骨髓瘤細(xì)胞的新治療靶。
發(fā)明概述 本發(fā)明人鑒別了骨髓瘤細(xì)胞的新靶，其用于設(shè)計用于多發(fā)性骨髓瘤及其它B細(xì)胞疾病的診斷和治療的方法中。這個靶是在骨髓瘤細(xì)胞表面上表達(dá)的游離λ輕鏈?！坝坞xλ輕鏈”是指與完整的免疫球蛋白不相關(guān)的λ輕鏈。在骨髓瘤細(xì)胞表面上表達(dá)的游離λ輕鏈在本文稱作λ骨髓瘤抗原(lambda myeloma antigen，LMA)。
本發(fā)明人提議的治療方法基于將特異性結(jié)合LMA的結(jié)合部分(binding moiety)或配體給予患有B細(xì)胞疾病的對象以耗竭惡性細(xì)胞。優(yōu)選地，所述配體是抗LMA抗體。本文所述的治療方案呈現(xiàn)了與先前和目前治療B細(xì)胞疾病不同的一種基本原理。
因此，本發(fā)明提供了一種治療對象中B細(xì)胞疾病的方法，所述方法包括給予所述對象有效量的抗LMA抗體以抑制所述對象中淋巴樣細(xì)胞的生長或者殺死淋巴樣細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了抗LMA抗體在制備用于治療B細(xì)胞疾病的藥物中的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，B細(xì)胞疾病是一種淋巴增生疾病。優(yōu)選地，所述淋巴增生疾病選自多發(fā)性骨髓瘤、B細(xì)胞淋巴瘤和巨球蛋白血癥。優(yōu)選地，所述淋巴增生疾病是多發(fā)性骨髓瘤，更優(yōu)選是λ-類型多發(fā)性骨髓瘤。
在一個特殊的實施方案中，本發(fā)明涉及一種抑制對象中淋巴樣細(xì)胞生長或者殺死淋巴樣細(xì)胞的方法，所述方法包括在足以使得抗LMA抗體與淋巴樣細(xì)胞結(jié)合的條件下給予對象抗LMA抗體以抑制所述細(xì)胞生長或者殺死所述細(xì)胞。例如，淋巴樣細(xì)胞的抑制或殺死可以通過凋亡或者通過對象的免疫細(xì)胞而實現(xiàn)(例如通過抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC))。
本發(fā)明還提供了一種抑制或殺死對象中淋巴樣細(xì)胞的方法，通過在足以使得LMA配體綴合物與癌細(xì)胞結(jié)合的條件下給予與細(xì)胞毒性部分或者生物學(xué)調(diào)節(jié)物(modifier)綴合的LMA配體以抑制該細(xì)胞的生長或者殺死該細(xì)胞。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述淋巴樣細(xì)胞是骨髓瘤細(xì)胞。
本文所用術(shù)語“LMA配體綴合物”是指與細(xì)胞毒性部分或者生物學(xué)調(diào)節(jié)物綴合的LMA配體。
所述LMA配體可以是經(jīng)鑒別具有LMA結(jié)合親和性的任何多肽或者化合物。配體與LMA之間的結(jié)合可以通過共價或者非共價相互作用或者共價和非共價相互作用的組合而介導(dǎo)。當(dāng)配體與LMA的相互作用產(chǎn)生非共價結(jié)合的復(fù)合物時，發(fā)生的結(jié)合典型是靜電相互作用、氫鍵或者是親水性/親脂性相互作用的結(jié)果。特別優(yōu)選的LMA配體是抗LMA抗體。
在一個實施方案中，所述細(xì)胞毒性部分是一種毒素(可以是光激活的毒素)、化療劑或者放射性制劑。
所述細(xì)胞毒性部分的非限制性例子可以是細(xì)胞毒性藥物或者細(xì)菌或者植物來源的酶促活性毒素(如gelonin)，或者這種毒素的酶促活性片段(A鏈)。優(yōu)選酶促活性毒素及其片段，例如gelonin、白喉A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、莫迪素(modeccin)A鏈、α-八疊球菌、油桐(Aleuritesfordii)蛋白、康乃馨蛋白(dianthin)、Phytoiacca americana蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻風(fēng)樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、石堿草(saponaria officinalis)抑制劑、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素和伊諾霉素。
用于本發(fā)明的細(xì)胞毒性藥物包括但不限于阿霉素(及其衍生物)、順鉑(cis-platinum)復(fù)合物(及其衍生物)、博來霉素和氨甲蝶呤(及其衍生物)。這些細(xì)胞毒性藥物有時用于臨床處理再發(fā)腫瘤及特別用于乳腺癌，但其應(yīng)用伴隨嚴(yán)重的副作用和導(dǎo)致非靶細(xì)胞的損害?？筁MA抗體可作為這種藥物的有用載體，是可以將藥物輸送至癌細(xì)胞并增強(qiáng)進(jìn)入癌細(xì)胞中的有效手段。
細(xì)胞毒性部分也可以是放射性制劑。特別地，所述細(xì)胞毒性部分可以是放射性核素如釔-90(90Y)、銦-111(111In)、碘-131(131I)或者銅-67(67Cu)。
可以與LMA配體偶聯(lián)并用于本發(fā)明中的生物學(xué)應(yīng)答調(diào)節(jié)物包括但不限于淋巴因子和細(xì)胞因子如IL-2和干擾素(α、β或者γ)。這些生物學(xué)應(yīng)答調(diào)節(jié)物對腫瘤細(xì)胞具有多種作用。這些作用包括通過直接作用增加腫瘤殺傷以及通過增加宿主防御作用介導(dǎo)的過程增加腫瘤細(xì)胞殺傷。LMA配體與這些生物學(xué)應(yīng)答調(diào)節(jié)物的綴合可以選擇性定位于淋巴樣細(xì)胞內(nèi)，并因此改善抗增殖作用同時抑制導(dǎo)致非靶細(xì)細(xì)胞毒性的非特異性作用。
包含LMA配體的綴合物可以使用多種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑制備。這種試劑的例子是SPDP、IT、亞氨酸酯的雙功能衍生物如二甲基己二酰亞胺鹽酸(dimethyl adipimidate HCl)，活性酯如二琥珀酰亞氨基辛二酸酯，醛如戊二醛，二-疊氮基化合物如二(p-疊氮苯甲?；?己二胺、雙-重氮基衍生物如雙-(p-重氮苯甲?；?-乙二胺，二異氰酸酯如甲代亞苯基2，6-二異氰酸酯及雙活性氟化合物如1，5-二氟-2，4-二硝基苯。
在另一個實施方案中，所述細(xì)胞毒性部分是編碼細(xì)胞毒性制劑的核酸分子。在這個實施方案中，LMA配體作為載體將編碼胞毒劑的治療基因?qū)隠MA+細(xì)胞如骨髓瘤細(xì)胞中，所述基因例如毒素基因如白喉毒素-A、凝集素、假單胞菌外毒素A、石堿草SO-6(SoriaM，(1989)Pharmacol.Res.，21 Suppl 235-46)或者蓖麻毒蛋白；細(xì)胞自殺基因如胸苷激酶或者硝基還原酶；激活化療基因的蛋白質(zhì)如gangcyclovir或者絲裂霉素C；核酶，RNase，或者反義序列(例如BCL2序列)。優(yōu)選地，由治療性基因編碼的胞毒劑的極少量分子的表達(dá)即足以殺死表達(dá)該基因的細(xì)胞。優(yōu)選所述治療性基因與細(xì)胞或者組織特異性轉(zhuǎn)錄單位可操縱地連接，例如與細(xì)胞或者組織特異性啟動子和/或增強(qiáng)子可操縱地連接。優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄單位是指導(dǎo)在如下細(xì)胞中表達(dá)的那些轉(zhuǎn)錄單位B細(xì)胞(例如如下基因的轉(zhuǎn)錄單位Ig重鏈基因、Igκ基因、Igλ基因、BCL-6基因(Dalla Favera et al.，C.S.H.Smp.Quant.Biol.，59，117(1994))、CD19基因、CD20基因或者CD22基因(Kerhl et al.，Immunol.Today，15，432(1994))、T細(xì)胞(例如如下基因的轉(zhuǎn)錄單位IL-4基因、IL-2基因、IL-2R基因、T細(xì)胞受體基因、IL-5基因、IL-13基因、GM-CSF基因和Fas配體基因(Nagata et al.，Prog.Mol.Subcell.Biol.，16，87(1996))或者髓樣細(xì)胞。髓樣特異性轉(zhuǎn)錄單位包括但不限于在美國專利No.5,502,176揭示的那些轉(zhuǎn)錄單位，以及如下基因的轉(zhuǎn)錄單位PU.1基因(Fisher etal.，Stem Cells，16，25(1998))、CD11c或者CD18基因(Corbi etal.，Leuk.& Lymph.，25，415(1997))、IgH增強(qiáng)子、CSF受體G、GM和/或G基因(Zhang et al.，Cur.Top.Micro.& Immunol.，211，137(1996))、或者C/EBP、Runt/PEBP2/CBF或者Ets基因(Clarke etal.，J.Leuko，Biol.，63，153(1998))。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括在給予抗LMA抗體或者LMA配體綴合物之前處理對象以降低對象體液中存在的游離λ輕鏈水平的步驟。優(yōu)選地，對象血清中存在的游離輕鏈水平被降低。血清中游離輕鏈水平的降低可以通過例如化療或者血漿置換術(shù)實現(xiàn)，或者通過其中LMA配體(如抗LMA抗體)與固體支持物(例如無菌濾膜)結(jié)合并用于從體液中捕獲游離λ輕鏈的方法而實現(xiàn)。優(yōu)選降低對象體液中游離輕鏈水平的處理就在給予抗LMA抗體或者LMA配體綴合物之前進(jìn)行。
本發(fā)明還提供了一種從分離的細(xì)胞樣品例如但不限于骨髓細(xì)胞中除去淋巴樣細(xì)胞的方法，通過在所述淋巴樣細(xì)胞與所述抗體或者綴合物結(jié)合的條件下將細(xì)胞樣品暴露于抗LMA抗體或者LMA配體綴合物，并分離與所述抗體或綴合物不結(jié)合的所述細(xì)胞樣品的細(xì)胞級分。這種方法可用于例如從骨髓樣品中除去骨髓瘤細(xì)胞以進(jìn)行自體骨髓移植。
本發(fā)明還提供了一種用于在對象中自體造血細(xì)胞移植的方法，所述方法包括 (i)從對象中移出造血祖細(xì)胞群(hematopoietic progenitor cellpopulation)， (ii)用抗LMA抗體或者LMA配體綴合物處理該細(xì)胞群，及 (iii)將步驟(ii)處理的細(xì)胞群移植進(jìn)對象體內(nèi)。
用抗LMA抗體或者LMA配體綴合物處理祖細(xì)胞群的步驟優(yōu)選包括將所述細(xì)胞群與抗LMA抗體或者LMA配體綴合物在足以使得抗LMA抗體或者LMA綴合物與細(xì)胞群中存在的淋巴樣細(xì)胞結(jié)合的條件下接觸以抑制所述淋巴樣細(xì)胞的生長或殺死所述淋巴樣細(xì)胞。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述方法還包括將抗LMA抗體或者LMA配體綴合物靜脈內(nèi)輸注進(jìn)對象。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，自體移植的方法是在細(xì)胞減數(shù)治療(cytoreductive therapy)期間或之后進(jìn)行的。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，抗LMA抗體或者LMA配體綴合物與一種固體支持物結(jié)合。
在本發(fā)明的另一方面，上述綴合物或者抗LMA抗體可用于在體外抑制細(xì)胞樣品如骨髓樣品中淋巴樣細(xì)胞的生長或者殺死該細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及抗獨特型抗體(anti-idiotypic antibody)，其反映抗LMA抗體的結(jié)合位點，并特異于抗體識別的構(gòu)象表位。本發(fā)明進(jìn)一步涉及這些抗獨特型抗體通過主動免疫在治療B細(xì)胞疾病中的應(yīng)用。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種在對象中定位淋巴樣細(xì)胞的方法，通過給予抗LMA抗體或者LMA配體，使得所述抗體或配體與對象體內(nèi)的細(xì)胞結(jié)合，并確定所述抗體或配體在對象內(nèi)的位置。在這方面的一個優(yōu)選實施方案中，所述抗體或配體是用例如放射性核素、熒光團(tuán)、生色團(tuán)或酶可檢測地標(biāo)記的。
可用于產(chǎn)生標(biāo)記的配體的標(biāo)記物包括可以直接檢測的部分，如熒光染料和放射性標(biāo)記，以及必須經(jīng)過反應(yīng)或者衍生化才可以檢測的部分，如酶。這種標(biāo)記的例子是32P、125I、3H、14C、熒光素及其衍生物、羅丹明及其衍生物、丹酰、傘形酮、螢光素(luciferia)、2，3-dihydrophthalzainediones、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、溶菌酶、及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。所述配體可以用這種標(biāo)記通過已知方法進(jìn)行標(biāo)記。例如，偶聯(lián)劑如醛、碳二亞胺、二馬來酰亞胺、亞氨酸酯、琥珀酰亞胺、bis-diazotized benzadine等等可以用于將配體與上述熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記和酶標(biāo)記偶聯(lián)。
本發(fā)明另一方面提供了一種與細(xì)胞毒性部分或者生物學(xué)調(diào)節(jié)物綴合的抗LMA抗體。在這方面的一個實施方案中，所述細(xì)胞毒性部分是一種毒素、光激活的毒素、化療劑或者放射性制劑。
在這方面的另一個實施方案中，所述細(xì)胞毒性部分是一種核酸分子。因此，本發(fā)明提供了導(dǎo)入宿主哺乳動物中的一種治療組合物，其選擇性靶定LMA細(xì)胞表面分子，但是作為治療基因其免疫原性降低或者無免疫原性，優(yōu)選是環(huán)形DNA如質(zhì)粒DNA形式，而不是免疫原性蛋白質(zhì)形式。結(jié)果，可以將該治療組合物重復(fù)給予哺乳動物，例如骨髓瘤對象，而不產(chǎn)生明顯的抗體應(yīng)答，特別是對該治療基因編碼的細(xì)胞毒性制劑的應(yīng)答。另外，本發(fā)明的治療組合物用于殺死具有其它LMA+血漿增殖性疾病如B細(xì)胞淋巴瘤和巨球蛋白血癥的對象中的細(xì)胞。優(yōu)選地，用于人體的所述組合物中融合多肽的抗體部分是人源化形式。
另一方面，本發(fā)明涉及一種用可檢測的部分標(biāo)記的抗LMA抗體，所述可檢測的部分的非限制性例子是熒光團(tuán)、生色團(tuán)、放射性核素或酶。
再一方面，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的抗LMA抗體及一種藥物可接受的載體、稀釋劑或者賦形劑。
本發(fā)明還涉及一種與固體支持物結(jié)合的抗LMA抗體或者LMA配體/細(xì)胞毒素。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述抗LMA抗體是一種嵌合抗體或者人源化抗體。
在本說明書中，單詞“包含”是指一個指定的元件、整數(shù)或步驟，或者一組元件、整數(shù)或步驟，但不排除任何其它元件、整數(shù)或步驟或一組元件、整數(shù)或步驟。
上述各個部分中提到的本發(fā)明的不同特征和實施方案在進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎椇罂梢杂糜谄渌牟糠?。因此，一個部分中描述的特征可以與其它部分中的特征組合。
附圖簡述

圖1通過ELISA對mAb與游離λ輕鏈結(jié)合的分析。將mAbL7(A)、mab1306(B)和ME 154(C)與固定在ELISA平板上的抗原-起保溫，所述抗原由人λ輕鏈(λLC F、λLC H、λLC K和λLC Q，單體(mon)和二聚體(dim)兩種形式)、混雜的(pooled)正常人IgGλ(Hu IgGλ)和游離的人κ輕鏈(κLC)組成。結(jié)合的mAb使用抗小鼠IgG-AP綴合物檢測?？贵w-抗原復(fù)合物通過pNPP酶反應(yīng)進(jìn)行觀測，在405nm測定吸光度。
圖2通過表面等離子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)對mAb與游離λ輕鏈結(jié)合的分析。將mAb L7(A)和mab1306(B)固定在Biacore CM5-葡聚糖芯片上。使抗原通過固定的mAb，所述抗原由人λ輕鏈(Lam F、Lam H、Lam K、Lam L、Lam Q，單體(mon)和二聚體(dim)兩種形式)、混雜的正常人IgGλ(Lambda IgG)和游離的人κ輕鏈(κLC)組成?？贵w-抗原結(jié)合使用Biacore 2000 Biosensor通過SPR測定。
圖3抗λmAb與LP-1骨髓瘤細(xì)胞的結(jié)合。將LP-1λ骨髓瘤細(xì)胞(5×105)與50μL的100μg/mL mAb L7(A)、mab1306(B)或者M(jìn)E154(C)在冰上保溫30分鐘。然后將細(xì)胞洗滌兩次，與PE-標(biāo)記的山羊抗小鼠F(ab’)2保溫，洗滌，通過流式細(xì)胞計量術(shù)進(jìn)行分析。實心灰色柱狀圖代表與不相關(guān)的mAb及隨后與PE標(biāo)記的山羊抗小鼠F(ab’)2保溫的細(xì)胞。
圖4與游離λLC的預(yù)保溫抑制mAb L7與LP-1細(xì)胞的結(jié)合。將mAb L7(100μg/mL)與200-800μg/mL濃度的游離λ(λF LC、A或者λH LC、B)或者κ輕鏈(κLC)在37℃預(yù)保溫30分鐘。然后將細(xì)胞與被抑制的L7在冰上保溫30分鐘，洗滌兩次并與PE-標(biāo)記的山羊抗小鼠F(ab’)2保溫。洗滌兩次后，通過流式細(xì)胞計量術(shù)分析細(xì)胞。實心的灰色柱狀圖代表與抗κLC mAb(陰性對照)、隨后與PE標(biāo)記的山羊抗小鼠F(ab’)2保溫的細(xì)胞。
圖5通過Western印跡對LP-1λ骨髓瘤細(xì)胞表面上游離λLC抗原的鑒別。將LP-1細(xì)胞在40mM Tris中裂解，在非還原條件下分離細(xì)胞質(zhì)和膜結(jié)合蛋白質(zhì)級分。級分通過12％SDS-PAGE分離，移至硝化纖維素膜上。在用BSA封閉膜后，使用抗λmAbs L7(A)、mab1306(B)或者M(jìn)E 154(C)檢測λ輕鏈。圖中左側(cè)的數(shù)字表示大約的分子量(kDa)。
圖6與λ輕鏈結(jié)合的mAb誘導(dǎo)對LP-1骨髓瘤細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)。將PKH-26標(biāo)記的LP-1骨髓瘤細(xì)胞與7nM(1μg/mL)或者0.7nM mab 1306(黑色條柱)或者M(jìn)E 154(陰影條柱)在存在IL-2刺激的鼠NK細(xì)胞的條件下保溫。16小時后，使用流式細(xì)胞計量儀通過TO-PRO-Iodide 3熒光檢測死亡的LP-1細(xì)胞，計算死亡的LP-1細(xì)胞的百分比。為了對照抗體非依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(AICC)，將LP-1細(xì)胞在存在NK效應(yīng)細(xì)胞的條件下在沒有抗體的PBS(空心條柱)中保溫(誤差條柱示出一式三份SEM)。
發(fā)明詳述 通用技術(shù) 除非特別說明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義一致(例如細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、免疫學(xué)、免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域)。
除非特別指出，本發(fā)明利用的重組蛋白質(zhì)、細(xì)胞培養(yǎng)和免疫學(xué)技術(shù)均為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)程序。這種技術(shù)在例如如下文獻(xiàn)中描述和闡述J.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning，John Wiley and Sons(1984)，J.Sambrook et a1.，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)，T.A.Brown(editor)，Essential Molecular BiologyA PracticalApproach，Volumes 1 and 2，IRL Press(1991)，D.M.Glover and B.D.Hames(editors)，DNA CloningA Practical Approach，Volumes 1-4，IRL Press(1995 and 1996)，和F.M.Ausubel et a1.(editors)，CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括最新的補(bǔ)充資料)，Ed Harlow and DavidLane(editors)AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring HarbourLaboratory，(1988)，及J.E.Coligan et al.(editors)Current Protocols inImmunology，John Wiley & Sons(包括最新的補(bǔ)充資料)，在此所述文獻(xiàn)并入?yún)⒖肌?br> LMA配體和抗LMA抗體 本發(fā)明人首次揭示了游離λ輕鏈(LMA)在骨髓瘤細(xì)胞表面上表達(dá)。針對LMA的抗體通過如ADCC、補(bǔ)體依賴性裂解及凋亡等機(jī)制能殺死λ-型骨髓瘤細(xì)胞，并因此是對抗λ-型骨髓瘤細(xì)胞的有效治療劑。另外，針對LMA的配體可用于將細(xì)胞毒素直接輸送至惡性細(xì)胞。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知λ-型免疫球蛋白由4條多肽鏈組成，其中兩條是重鏈(每條大約50-70kD)，兩條是λ輕鏈(每條大約26kD)。每條鏈的N末端是主要負(fù)責(zé)抗原識別的大約100-110或更多個氨基酸的可變區(qū)。術(shù)語可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VM)分別指這些輕鏈和重鏈。編碼λ輕鏈的基因的裝配包括在λ輕鏈基因座的V、J和C基因節(jié)段的重排(見Chapter 5，″Organization and Expression ofImmunoglobulin Genes″in Kuby Immunology，4th ed，Goldsby et a1.(Freeman，2000))。
因此，本文使用的術(shù)語“LMA”涵蓋了與衍生自λ-型免疫球蛋白的輕鏈相等的任何游離λ輕鏈。該術(shù)語因此涵蓋了其可變區(qū)序列不同的一系列λ輕鏈多肽。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述LMA單體形式為大約26kD，二聚體形式為大約52kD。
本發(fā)明使用的LMA配體可以是經(jīng)鑒別與LMA具有結(jié)合親和性的任何多肽或化合物。當(dāng)LMA是膜結(jié)合或者分離狀態(tài)(例如沒有膜)時，LMA配體優(yōu)選能結(jié)合LMA。特別優(yōu)選的LMA配體是抗LMA抗體。
盡管不是必需的，但LMA配體可以特異性結(jié)合LMA。術(shù)語“特異性結(jié)合”是指在特定條件下，LMA配體結(jié)合LMA而不以顯著量結(jié)合其它蛋白質(zhì)或者碳水化合物。在這種條件下的特異性結(jié)合LMA可需要根據(jù)其特異性選擇的抗體?？梢允褂枚喾N免疫分析選擇與LMA特異性免疫反應(yīng)的抗體。例如，固相ELISA免疫分析通常用于選擇與蛋白質(zhì)或碳水化合物特異性免疫反應(yīng)的抗體。見Harlowand Lane(1988)Antibodies，a Laboratory Manual，Cold Spring HarborPublications，New York，其描述了可用于確定特異性免疫反應(yīng)性的免疫分析形式和條件。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知抗LMA抗體。例如，針對LMA的抗體已經(jīng)用于檢測血清或尿液中的游離λ輕鏈以診斷多發(fā)性骨髓瘤(Bradwell et al.，(2001)Clin.Chem.47673-680)。然而，LMA目前還未用于作為治療多發(fā)性骨髓瘤或者定位患者骨髓瘤細(xì)胞的靶。
合適的抗LMA抗體的例子包括RDI-TRK1L7-3D1(RDI；Flanders，NJ，USA)、CBL317(Cymbus Biotechnology Ltd，UK)、2G7(Nakano and Nagata(2003)J Immunol Methods 275；9-17)、L7或者M(jìn)E-154(AbCam Ltd(Cambridge，UK)或者mAb1306(ChemiconInternational，Australia)。
抗體可以完整的免疫球蛋白形式存在，或者以多種修飾形式存在，包括例如，結(jié)構(gòu)域抗體包括VH或VL結(jié)構(gòu)域、重鏈可變區(qū)的二聚體(VHH，如針對camelid所述)、輕鏈可變區(qū)的二聚體(VLL)、僅含有輕鏈和重鏈可變區(qū)的Fv片段或者含有重鏈可變區(qū)和CH1結(jié)構(gòu)域的Fd片段。scFv由重鏈和輕鏈的可變區(qū)組成，連接在一起形成單鏈抗體(Bird et al.，Science，242424-426(1988)；Huston et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，855879-5883(1988)，這兩篇文獻(xiàn)并入本文作參考)，術(shù)語“抗體”也涵蓋了scFv的寡聚體如二元體(diabodies)和三元體(triabodies)。該術(shù)語也涵蓋了抗體片段，如含有可變區(qū)和部分恒定區(qū)的Fab、(Fab′)2和FabFc2片段。該術(shù)語還涵蓋了CDR-移植(CDR-grafted)抗體片段和抗體片段的寡聚體。Fv的重鏈和輕鏈成分可以衍生自相同或不同的抗體，從而產(chǎn)生嵌合的Fv區(qū)域。抗體可以是動物(尤其是小鼠或大鼠)或者人源的，或者可以是嵌合的(Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，6851-6855(1984)，并入本文作參考)或者是人源化的(Jones et al.，Nature，321，522-525(1986)，及公布的UK專利申請#8707252，均并入本文作參考)。本文所用術(shù)語“抗體”包括這些變化形式。使用本文提供的指導(dǎo)及上文引用的參考文獻(xiàn)及如Harlow & Lane，Antibodiesa LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，(1988)這種出版物中描述的本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的那些方法，可以容易地產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。
LMA-結(jié)合抗體可以是包含可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)的Fv區(qū)域。所述輕鏈和重鏈可以直接結(jié)合或者通過接頭結(jié)合。如本文所用，“接頭”是指與輕鏈和重鏈共價連接的分子，在這兩條鏈之間提供足夠的間距和靈活性，由此能達(dá)到可以特異性結(jié)合其針對的表位的構(gòu)象。特別優(yōu)選蛋白質(zhì)接頭，因為它們作為融合多肽的Ig部分的固有成分而表達(dá)。
本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案是重組產(chǎn)生的單鏈scFv抗體，優(yōu)選人源化的scFv。
編碼抗體或其片段的基因的制備 編碼抗體的基因、輕鏈和重鏈基因或其部分，例如單鏈Fv區(qū)域，可以克隆自雜交瘤細(xì)胞系。它們均可以使用相同的一般策略而克隆。典型地，例如，使用隨機(jī)六聚體作為引物將從雜交瘤細(xì)胞中提取的poly(A)+mRNA逆轉(zhuǎn)錄。對于Fv區(qū)域，VH和VL結(jié)構(gòu)域分別通過兩個聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增。重鏈序列可以使用5’末端引物和3’末端引物擴(kuò)增，所述5’末端引物是根據(jù)抗LMA重鏈的氨基末端蛋白質(zhì)序列設(shè)計的，3’末端引物是根據(jù)共有的免疫球蛋白恒定區(qū)序列設(shè)計的(Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest.5th edition.U.S.Department of Health and Human Services，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)，并入作參考)。輕鏈Fv區(qū)域使用5’末端引物組合引物C-kappa擴(kuò)增，所述5’末端引物是根據(jù)抗LMA輕鏈的氨基末端蛋白質(zhì)序列設(shè)計的。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到可以應(yīng)用許多合適的引物獲得Fv區(qū)域。
將PCR產(chǎn)物亞克隆進(jìn)合適的克隆載體中。通過DNA限制鑒別含有正確大小插入體的克隆。然后使用與克隆位點相鄰的測序引物，可以從雙鏈質(zhì)粒DNA中確定重鏈或輕鏈編碼區(qū)的核苷酸序列?？梢允褂蒙藤彽脑噭┖?例如the Sequenase.TM.kit，United StatesBiochemical Corp.，Cleveland，Ohio，USA)對DNA進(jìn)行測序。
因此，編碼Fv區(qū)域的DNA可以通過任何合適方法制備，包括例如擴(kuò)增技術(shù)，如連接酶鏈反應(yīng)(LCR)(見Wu and Wallace，Genomics，4560(1989)，Landegren，et al.，Science，2411077(1988)和Barringer，et al.，Gene，89117(1990))、轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(見Kwoh，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，861173(1989))及自身持續(xù)序列復(fù)制(見Guatelli，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，871874(1990))，合適序列的克隆和限制或者通過如下方法直接化學(xué)合成如Narang et al.，Meth.Enzymol.6890-99(1979)的磷酸三酯方法；Brown et al.，Meth Enzymol.68109-151(1979)的磷酸二酯方法；Beaucage et al.，Tetra.Lett.，221859-1862(1981)的二乙基亞磷酰胺方法；及美國專利No.4,458,066的固體支持物方法，本段中的所有這些參考文獻(xiàn)均并入本文參考。
化學(xué)合成方法產(chǎn)生單鏈寡核苷酸。其可以通過與互補(bǔ)序列雜交而轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA，或者通過使用該單鏈作為模板與DNA聚合酶聚合而轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA。雖然可以化學(xué)合成一整條的單鏈Fv區(qū)域，但優(yōu)選合成許多較短的序列(大約100-150個堿基)，隨后連接在一起。
或者，可以克隆亞序列并使用合適的限制酶切割合適的亞序列。然后連接片段以產(chǎn)生所需的DNA序列。
一旦獲得Fv可變輕鏈和重鏈DNA，可以直接或者通過編碼肽接頭的DNA序列將該序列連接在一起，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)進(jìn)行。在一個實施方案中，重鏈和輕鏈區(qū)域通過一個靈活性肽接頭(例如(Gly4Ser)3)連接，所述接頭起自重鏈Fv結(jié)構(gòu)域的羧基末端，終于輕鏈Fv結(jié)構(gòu)域的氨基末端。完整的序列編碼單鏈抗原結(jié)合蛋白質(zhì)形式的Fv結(jié)構(gòu)域。
細(xì)胞毒性部分 用于本發(fā)明的合適的細(xì)胞毒性部分包括但不限于制劑，如細(xì)菌或者植物毒素，藥物例如環(huán)磷酰胺(CTX；cytoxan)、苯丁酸氮芥(CHL；leukeran)、順鉑(CisP；CDDP；platinol)、白消安(myleran)、苯丙氨酸氮芥、亞硝脲氮芥(BCNU)、鏈脲菌素、曲他胺(TEM)、絲裂霉素C及其它烷化劑；氨甲蝶呤(MTX)、表鬼臼毒素吡喃葡糖苷(VP-16；vepesid)、6-巰基嘌呤(6MP)、6-硫代鳥嘌呤(6TG)、阿糖胞苷(Ara-C)、5-氟尿嘧啶(5FU)、達(dá)卡巴嗪(dacarbazine，DTIC)、2-氯脫氧腺苷(2-CdA)及其它抗代謝物；抗生素，包括放線菌素D、阿霉素(DXR；adriamycin)、道諾霉素、博來霉素、光神霉素以及其它抗生素；生物堿，如長春新堿(VCR)、長春花堿等等；以及其它抗癌制劑，包括抑制細(xì)胞生長制劑糖皮質(zhì)激素類，如地塞米松(DEX；decadron)及皮質(zhì)類固醇類，如強(qiáng)的松，核苷酸酶抑制劑，如羥基脲等等。
本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到有許多其它放射性同位素和化學(xué)細(xì)胞毒性制劑可以通過熟知技術(shù)與LMA配體偶聯(lián)并輸送以特異性破壞腫瘤組織。見例如Blattler等的美國專利No.4,542,225所述。光激活的毒素的例子包括二氫吡啶-和Ω-芋螺毒素(Schmidt et al.，J Biol.Chem.，1991，266(27)18025-33)。可以使用的成像和細(xì)胞毒性試劑的例子包括125I、131I、111In、123I、99mTc、32P、3H和14C；熒光標(biāo)記如熒光素和羅丹明，及化學(xué)發(fā)光物如螢光素。抗體可以使用這種試劑利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)進(jìn)行標(biāo)記。例如，見Wenzel and Meares，Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy，Elsevier，N.Y.(1983)關(guān)于放射性標(biāo)記抗體的技術(shù)(也見于Colcer et al.，″Use of MonoclonalAntibodies As Radiopharmaceuticals For The Localization Of HumanCarcinoma Xenografts In Nude Mice″，Methods Enzymol.，121802-16，1986″Order，Analysis，Results and Future Prospective of theTherapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy″，inMonoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy，Baldwin etal.(eds)，pp.303-16(Academic Press 1985))。
在一個實例中，通過穩(wěn)定的硫脲共價鍵將接頭-螯合劑tiuexutan與LMA配體綴合，提供銦-111或者釔-90的高親和性螯合位點。
當(dāng)本發(fā)明的治療組合物中存在編碼胞毒劑的DNA分子時，所述DNA優(yōu)選編碼是細(xì)菌或者植物毒素的多肽。這些多肽包括但不限于天然或修飾的假單胞菌外毒素(PE)、白喉毒素(DT)、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、gelonin、木鱉子皂苷II、細(xì)菌RIP如志賀(shiga)和志賀樣毒素a-鏈、絲瓜籽毒蛋白(luffin)[見Islam et al.，Agricultural Biological Chem.，54(5)1343-1345(1990)]、atrichosanthin[見Chow et al.，J.Biol.Chem.，2658670-8674(1990)]]、木鱉子皂苷I[見Ho et al.，BBA，1088311-314(1991)]、紫茉莉抗病毒蛋白(Mirabilis anti-viral protein)[見Habuka et al.，J.Biol.Chem.，264(12)6629-6637(1989)]、美洲商陸抗病毒蛋白[見Kung et al.，Agric.Biol.Chem.，54(12)3301-3318(1990)]、byodin 2(美國專利No.5,597,569)、gaporin[見Benatti et al.，Eur.J.Biochem.，183465-470(1989)]以及其遺傳工程化變體。天然PE和DT是高毒性化合物，其典型通過肝毒性而致死。優(yōu)選地，將PE和DT修飾為除去毒素天然靶定成分(例如PE的Ia結(jié)構(gòu)域及DT的B鏈)的形式。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到本發(fā)明不限于特定的胞毒劑。
本文所用術(shù)語“假單胞菌外毒素”(PE)是指全長天然(天然存在的)PE或者經(jīng)修飾的PE。這種修飾可包括但不限于消除結(jié)構(gòu)域Ia、結(jié)構(gòu)域II和III中的多種氨基酸缺失、單一氨基酸取代(例如在第590和606位用Gln置換Lys)及在羧基末端加入一或多個序列。見Siegall et al.，J.Biol.Chem.，26414256-14261(1989)所述。因此，例如PE38是指由253-364和381-613氨基酸組成的截短的假單胞菌外毒素。PE的天然C末端，REDLK(殘基609-613)，可以用序列KDEL、REDL置換，Lys-590和Lys-606均突變?yōu)镚ln。
本文所用術(shù)語“白喉毒素”(DT)是指全長天然DT或者經(jīng)修飾的DT。修飾典型包括除去B鏈中的靶定結(jié)構(gòu)域，更特別包括B鏈羧基區(qū)域的截短。
抗體融合多肽的制備 一旦已經(jīng)鑒別了編碼LMA結(jié)合部分(例如抗LMA抗體片段)的DNA序列，則可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備包含該區(qū)域的融合多肽。例如，將編碼Fv區(qū)域的基因與編碼細(xì)胞毒性部分的基因融合，優(yōu)選所述部分是一種多肽。任選地，F(xiàn)v基因與編碼肽連接物(connector)的一個節(jié)段連接。所述肽連接物可以只是間隔LMA結(jié)合部分與細(xì)胞毒性部分，或者促進(jìn)這些區(qū)域之間的活動性以使得它們達(dá)到其最佳構(gòu)象。包含連接物的DNA序列也可以提供序列(如引物位點或者限制位點)以便于克隆或者可以保持編碼結(jié)合部分的序列與編碼細(xì)胞毒性部分的序列之間的讀框。這種連接物肽的設(shè)計為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
通常，產(chǎn)生融合多肽包括單獨制備Fv輕鏈和重鏈及編碼與之融合的任何其它蛋白質(zhì)的DNA，將DNA序列在質(zhì)?；蚱渌d體中重組以形成編碼特定所需的融合多肽的構(gòu)建體。然而，一種較簡便的方法包括將編碼特定Fv區(qū)域的DNA插入已經(jīng)編碼所需另一多肽的構(gòu)建體中。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)將編碼Fv區(qū)域的DNA序列插入構(gòu)建體中。
本發(fā)明的一個實施方案是一種融合多肽，其包含與DNA結(jié)合多肽結(jié)合的重組產(chǎn)生的、包含VH和CH或其部分的抗體。所述融合多肽和包含VL和CL或其一部分的抗體一起形成一種重組抗體，用于將預(yù)先選擇的線性或環(huán)形DNA分子靶向攜帶預(yù)先選擇的靶分子的細(xì)胞或組織。
本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案是重組產(chǎn)生的單鏈scFv抗體，優(yōu)選人源化的scFv。特別地，本發(fā)明提供了與DNA結(jié)合多肽結(jié)合的重組單鏈抗體，因為這些抗體具有特異性結(jié)合DNA的能力，因此用作靶定部分以將與DNA結(jié)合多肽結(jié)合的DNA靶向攜帶LMA的細(xì)胞或組織。
通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的及可利用的任何方法，可以將本發(fā)明的重組單鏈抗體與細(xì)胞毒素或者具有特定活性的其它分子融合或者結(jié)合。這兩種成分可以通過多種熟知的化學(xué)程序化學(xué)鍵合在一起。例如，通過異源雙功能交聯(lián)劑連接，例如SPDP、碳二亞胺、戊二醛等等。多種免疫毒素的產(chǎn)生以及化學(xué)綴合方法為本領(lǐng)域所熟知，可見于例如Monoclonal Antibody-Toxin ConjugatesAiming theMagic Bullet，Thorpe et al.，Monoclonal Antibodies in ClinicalMedicine，Academic Press，pp.168-190(1982)；Waldmann，Science，2521657(1991)；Vitetta et al.，1987，Science，2381098；Pastan et al.，1986；Cell，47641；及Thorpe et al.，1987，Cancer Res.，475924所述，所述文獻(xiàn)在此并入作參考。這些方法一般通過交聯(lián)劑在兩個多肽之間導(dǎo)入二硫鍵而將細(xì)胞毒素與抗體綴合。已經(jīng)用不可還原鍵制備的免疫毒素與通過二硫鍵交聯(lián)的相似毒素相比，示出細(xì)胞毒性較低。
其它優(yōu)選的試劑是2-鹽酸巰醇亞胺(2-iminothiolanehydrochloride，2IT)、S-4-琥珀酰亞氨基氧基羰基-α-甲基芐基硫代硫酸鈉(S-4-succinimidyloxycarbonyl-alpha-methyl benzyl thiosulfate，SMBT)和2IT或者succinimidyloxy carbonyl-α-methyl-α(2-pyrid-yldithio)-toluene及2IT。每組試劑在細(xì)胞毒素與抗體之間導(dǎo)入一個可還原的二硫鍵，但該鍵對分解有抗性，提供了綴合物在體外和體內(nèi)的穩(wěn)定性。在靶細(xì)胞中作為溶酶體或內(nèi)涵體而內(nèi)在化的基礎(chǔ)上，所述鍵被還原。例如使用具有抗體的重組PE分子，在第287氨基酸位具有半胱氨酸形式的PE分子優(yōu)選通過半胱氨酸的硫醇部分將毒素與抗體或者其它配體偶聯(lián)。
在一個實施方案中，LMA結(jié)合部分也可以通過重組方式與細(xì)胞毒素融合，例如通過使用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生編碼抗體和細(xì)胞毒素并且在宿主細(xì)胞中表達(dá)重組DNA序列的核酸，所述宿主細(xì)胞例如是真核宿主如哺乳動物宿主如CHO或者COS細(xì)胞，或者原核宿主例如大腸桿菌宿主。編碼融合多肽的DNA可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何克隆方法克隆進(jìn)cDNA中或者是基因組形式。見例如Sambrook et al.，Molecular Cloninga Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，(1989)所述，在此并入本文作參考。
本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到在化學(xué)合成、生物表達(dá)或者純化后，融合多肽可以具有與天然抗體基本上不同的構(gòu)象。在這種情況中，必需使得所述多肽變性和還原，然后使得該多肽重折疊為優(yōu)選的構(gòu)象。使得多肽還原和變性及誘導(dǎo)其重折疊的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(見Debinski et al.，J.Biol.Chem，26814065-14070(1993)；Kreitman and Pastan，Bioconjug.Chem.，4581-585(1993)；andBuchner，et al.，Anal.Biochem.，205263-270(1992)，所述文獻(xiàn)在此并入本文作參考)。例如，Debinski等描述了在胍-DTE中內(nèi)涵體蛋白質(zhì)的變性和還原方法。然后將所述多肽在含有氧化的谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化還原緩沖液中重折疊。
技術(shù)人員認(rèn)識到可以對融合多肽進(jìn)行修飾而不削弱其生物學(xué)活性。可以進(jìn)行一些修飾以促進(jìn)克隆、表達(dá)，或者將融合多肽的抗體部分摻入融合多肽中。這種修飾為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，包括例如在氨基末端加入甲硫氨酸以提供起始位點，在多肽的任一末端加入His-標(biāo)記以便于純化或者在任一末端加入額外的氨基酸以產(chǎn)生便于定位的限制位點或者終止密碼子。
技術(shù)人員認(rèn)識到可以進(jìn)行其它修飾。因此，例如可以產(chǎn)生氨基酸取代以增加融合多肽的特異性或結(jié)合親和性?；蛘?，分子的非必需區(qū)域可以被縮短或者全部消除。因此，在分子存在自身不參與分子活性的區(qū)域的情況中，該區(qū)域可以被消除或者用較短節(jié)段置換，以在分子的活性成分之間保持正確的空間關(guān)系?；蛘撸梢詫⒏`活性的節(jié)段置于內(nèi)結(jié)構(gòu)域(interdomian)區(qū)域中，然后可便于分子的折疊或者產(chǎn)生(Brinkmann，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，893075-3079(1992)。
單克隆抗體 針對LMA表位的單克隆抗體可易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員產(chǎn)生。本領(lǐng)域熟知通過雜交瘤產(chǎn)生單克隆抗體的一般方法。產(chǎn)生抗體的無限增殖細(xì)胞系可以通過細(xì)胞融合產(chǎn)生，也可以通過其它技術(shù)如用致癌DNA直接轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞或者用Epstein-Barr病毒轉(zhuǎn)染而產(chǎn)生。針對LMA表位產(chǎn)生的單克隆抗體可以針對不同性質(zhì)篩選，即針對同種型和表位親和性進(jìn)行篩選。
小鼠衍生的單克隆抗體可用于在體內(nèi)直接免疫治療及在體外進(jìn)行免疫治療。然而，已經(jīng)觀測到當(dāng)小鼠衍生的單克隆抗體用于人體作為治療劑時，患者產(chǎn)生人抗小鼠抗體。因此，小鼠衍生的單克隆抗體非優(yōu)選用于治療，特別不適合長期應(yīng)用。然而，使用建立的遺傳工程技術(shù)可以產(chǎn)生具有動物衍生部分和人衍生部分的嵌合或人源化抗體。所述動物可以是小鼠或者其它嚙齒類動物如大鼠。
如果嵌合抗體的可變區(qū)是小鼠衍生的，而恒定區(qū)是人衍生的，則該嵌合抗體與“純”小鼠衍生的單克隆抗體相比通常免疫原性較低。這些嵌合抗體很可能更適于治療應(yīng)用，“純”小鼠衍生的抗體是不適合的。
嵌合抗體 本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得產(chǎn)生嵌合抗體的方法。例如，可以使用免疫球蛋白輕鏈和免疫球蛋白重鏈在單獨的質(zhì)粒中單獨表達(dá)輕鏈和重鏈。然后純化這些輕鏈和重鏈并在體外裝配成完整抗體；完成這種裝配的方法已經(jīng)描述。見例如Scharff，M.，Harvey Lectures 69125(1974)所述。也見Oi et al.，Bio Techniques 4(4)214-221(1986)；和Sun et al.Hybridoma 5(1986)Suppl 1517-20所述。這種DNA構(gòu)建體可包含與編碼人恒定區(qū)的DNA連接的編碼抗LMA抗體的輕鏈或重鏈可變區(qū)的功能重排基因的DNA。用輕鏈和重鏈的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的淋巴樣細(xì)胞如骨髓瘤或雜交瘤可表達(dá)并裝配所述抗體鏈。
IgG抗體從還原分離的輕鏈和重鏈中形成的體外反應(yīng)參數(shù)也已經(jīng)描述。見例如Beychok，S.，Cells of Immunoglobulin Synthesis，Academic Press，New York，p.69，1979所述。輕鏈和重鏈在相同細(xì)胞中共表達(dá)以實現(xiàn)重鏈和輕鏈的細(xì)胞內(nèi)締合和連接為完整的H2L2IgG抗體也是可能的。這種共表達(dá)可以使用相同或不同的質(zhì)粒在相同的宿主細(xì)胞中實現(xiàn)。
人源化抗體 在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，抗LMA抗體是人源化的，即通過分子建模技術(shù)(molecular modelling technique)產(chǎn)生的抗體，其中抗體的人成分最大化，而導(dǎo)致很少或不喪失與鼠抗體的可變區(qū)的結(jié)合親和性。
下文描述的方法可用于人源化抗LMA抗體。
有許多因素要考慮以決定在人源化期間使用何種人抗體序列。輕鏈和重鏈的人源化彼此獨立，但推理基本相似。
這種選擇方法基于如下基本原理給定的抗體的抗原特異性和親和性主要由可變區(qū)CDR的氨基酸序列決定?？勺兘Y(jié)構(gòu)域構(gòu)架殘基很少或者無直接作用。構(gòu)架區(qū)的主要功能是保持CDR的正確空間方向以識別抗原。因此，如果人可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)架與嚙齒類動物可變結(jié)構(gòu)域的構(gòu)架高度同源，則在人可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)架中源自該嚙齒類動物可變結(jié)構(gòu)域的CDR的取代很可能使其正確的空間方向得以保持。因此人可變結(jié)構(gòu)域優(yōu)選與嚙齒類動物可變結(jié)構(gòu)域高度同源。合適的人抗體可變結(jié)構(gòu)域序列可如下選擇。
步驟1使用計算機(jī)程序搜索所有可獲得的蛋白質(zhì)(和DNA)數(shù)據(jù)庫中與嚙齒類動物抗體可變結(jié)構(gòu)域最同源的那些人抗體可變結(jié)構(gòu)域序列。合適程序輸出與嚙齒類動物抗體最同源的序列列表、每個序列的同源百分比、及每個序列與嚙齒類動物序列的排列對比。對于重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列單獨進(jìn)行搜索。如果只包括人免疫球蛋白序列，則上述分析更易于完成。
步驟2列出人抗體可變結(jié)構(gòu)域序列并進(jìn)行同源對比。首先對比CDR的長度，除外非常可變的重鏈CDR3。將人重鏈及κ和λ輕鏈分成亞組，重鏈分成3個亞組，κ鏈分成4個亞組，λ鏈分成6個亞組。每個亞組內(nèi)CDR大小相似，但亞組之間不同。通常可以將嚙齒類動物抗體CDR與所述人亞組之一匹配，作為同源的第一個近似值。然后對比攜帶相似長度CDR的抗體的氨基酸序列同源性，尤其是CDR內(nèi)，但也在周圍構(gòu)架區(qū)內(nèi)對比。選擇最同源的人可變結(jié)構(gòu)域作為構(gòu)架進(jìn)行人源化。
現(xiàn)行人源化方法/技術(shù) 可以根據(jù)EP-A-0239400所述將所需的CDR移植于人構(gòu)架上而將抗體人源化。因此從其CDR希望被重構(gòu)(reshape)的人DNA開始，可以產(chǎn)生編碼所需被重構(gòu)抗體的DNA序列。將含有所需CDR的嚙齒類動物可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列與選擇的人抗體可變結(jié)構(gòu)域序列進(jìn)行對比。標(biāo)明人可變結(jié)構(gòu)域中需要改變?yōu)閲X類動物中相應(yīng)殘基的殘基，以產(chǎn)生摻入嚙齒類動物CDR的人可變區(qū)。這些殘基也可以是人序列中需要取代、添加或者缺失的殘基。
合成可用于誘變?nèi)丝勺兘Y(jié)構(gòu)域構(gòu)架以含有所需殘基的寡核苷酸。那些寡核苷酸可以是任何常規(guī)大小的。通常長度僅受所利用的特定合成儀的能力的限制。寡核苷酸體外定向誘變的方法為本領(lǐng)域所熟知。
或者，人源化可以使用WO 92/07075的重組聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法實現(xiàn)。使用這種方法，可以在人抗體構(gòu)架區(qū)之間剪接CDR。
通常，WO 92/07075的技術(shù)可以使用包含兩個人構(gòu)架區(qū)AB和CD的模板進(jìn)行，在這兩個構(gòu)架區(qū)之間所述CDR被供體CDR置換。引物A和B用于擴(kuò)增構(gòu)架區(qū)AB，引物C和D用于擴(kuò)增構(gòu)架區(qū)CD。然而，引物B和C在其5’末端還均含有相應(yīng)于全部或者至少部分供體CDR序列的一個額外序列。引物B和C重疊足夠的長度，以使得其5’末端在可以進(jìn)行PCR的條件下彼此退火。因此，擴(kuò)增的AB和CD區(qū)域通過重疊延伸而經(jīng)歷基因剪接，在一個反應(yīng)中產(chǎn)生人源化產(chǎn)物。
重構(gòu)抗體的轉(zhuǎn)染和表達(dá) 在進(jìn)行誘變反應(yīng)以重構(gòu)抗體之后，誘變的DNA可以與編碼輕鏈或者重鏈恒定區(qū)的合適DNA連接，克隆進(jìn)表達(dá)載體中，并轉(zhuǎn)染進(jìn)宿主細(xì)胞優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞中。這些步驟可以常規(guī)方式進(jìn)行。重構(gòu)抗體因此可通過包括如下步驟的方法制備 (a)制備第一種可復(fù)制的表達(dá)載體，其包括與編碼至少Ig重鏈或輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域的DNA序列可操縱地連接的合適啟動子，所述可變結(jié)構(gòu)域包含來自人抗體的構(gòu)架區(qū)和本發(fā)明人源化抗體所需的CDR； (b)制備第二種可復(fù)制的表達(dá)載體，其包括與分別編碼至少互補(bǔ)Ig輕鏈或重鏈可變結(jié)構(gòu)域的DNA序列可操縱地連接的合適啟動子； (c)用第一種或者這兩種制備的載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞系；及 (d)培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系以產(chǎn)生所述改變的抗體。
優(yōu)選地，步驟(a)中的DNA序列編碼人抗體鏈的可變結(jié)構(gòu)域和每個恒定結(jié)構(gòu)域。人源化抗體可以使用任何合適的重組表達(dá)系統(tǒng)制備。被轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生改變的抗體的細(xì)胞系可以是中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系或者無限增殖化的哺乳動物細(xì)胞系，優(yōu)選是淋巴源的，如骨髓瘤、雜交瘤、三雜交瘤(trioma)或者四雜交瘤(quadroma)細(xì)胞系。所述細(xì)胞系還可以包含正常的淋巴樣細(xì)胞，如已經(jīng)用病毒如Epstein-Barr病毒轉(zhuǎn)化而無限增殖化的B細(xì)胞。最優(yōu)選地，所述無限增殖化的細(xì)胞系是骨髓瘤細(xì)胞系或其衍生物。
用于表達(dá)本發(fā)明抗體的CHO細(xì)胞可以是二氫葉酸還原酶(dhfr)缺陷的，并因此依賴胸苷和次黃嘌呤以生長(Urlaub et al.，Proc.Natl.Acac.Sci.U.S.A.，77 4216-4220(1980))。將親代dhfr-CHO細(xì)胞系用編碼所述抗體和dhfr基因的DNA轉(zhuǎn)染，可以選擇dhfr陽性表型的CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)化體。將所述集落在沒有胸苷和次黃嘌呤的培養(yǎng)基上培養(yǎng)以進(jìn)行選擇，胸苷和次黃嘌呤的缺乏可以防止未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)化的細(xì)胞恢復(fù)葉酸途徑并因此繞過(bypassing)選擇系統(tǒng)。這些轉(zhuǎn)化體依靠轉(zhuǎn)染的感興趣的DNA和編碼dhfr的DNA的共整合而通常表達(dá)低水平感興趣的DNA。編碼所述抗體的DNA的表達(dá)水平可以使用氨甲蝶呤(MTX)通過擴(kuò)增而增加。這種藥物是dhfr酶的直接抑制劑，并且可以分離擴(kuò)增其dhfr基因拷貝數(shù)足以在這些條件下存活的抗性集落。由于編碼dhfr和所述抗體的DNA序列在原始的轉(zhuǎn)化體中緊密連接，因此通常伴隨擴(kuò)增，并因此增加所需抗體的表達(dá)。
與CHO或骨髓瘤細(xì)胞使用的另一種優(yōu)選的表達(dá)系統(tǒng)是WO87/04462所述的谷氨酰胺合成酶(GS)擴(kuò)增系統(tǒng)。這個系統(tǒng)包括用編碼酶GS的DNA及編碼所需抗體的DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。然后選擇在無谷氨酰胺的培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞，因此推測所述細(xì)胞具有整合的編碼GS的DNA。然后用甲硫氨酸磺酰亞砜亞銨(methioninesulphoximine，Msx)將這些選擇的克隆進(jìn)行GS酶抑制。為了存活，細(xì)胞將擴(kuò)增編碼GS的DNA，編碼所述抗體的DNA伴隨擴(kuò)增。
盡管用于產(chǎn)生人源化抗體的細(xì)胞系優(yōu)選是哺乳動物細(xì)胞系，但可另外使用任何其它合適的細(xì)胞系，如細(xì)菌細(xì)胞系或者酵母細(xì)胞系。特別地，可以使用大腸桿菌衍生的細(xì)菌菌株。檢測獲得的抗體的功能性。如果功能性喪失，則需要返回步驟(2)及改變所述抗體的構(gòu)架。
一旦表達(dá)，則可以回收本發(fā)明的完整抗體、其二聚體、各個輕鏈和重鏈、或者其它免疫球蛋白形式，根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法對其進(jìn)行純化，包括硫酸銨沉淀、親和柱、柱層析、凝膠電泳等等(見Scopes，R.，Protein Purification，Springer-Verlag，N.Y.(1982))。藥物應(yīng)用優(yōu)選至少大約90-95％同質(zhì)性的、并最優(yōu)選98-99％或更高同質(zhì)性的基本上純的免疫球蛋白。一旦純化，如所需部分地或同質(zhì)性，則人源化抗體可以治療性應(yīng)用或者產(chǎn)生和進(jìn)行分析程序、免疫熒光染色等等(見Immunological Methods，Vols.I and II，Lefkovitsand Pernis，eds.，Academic Press，New York，N.Y.(1979 and1981))。
Greenwood和Clark((1993)Eur.J.Immunol.231098-1104)進(jìn)行的研究表明人效應(yīng)細(xì)胞對抗體Fc區(qū)域的識別可以通過對免疫球蛋白分子的恒定區(qū)進(jìn)行工程化而優(yōu)化。這可以通過將具有所需特異性的抗體可變區(qū)基因與編碼免疫球蛋白同種型的人恒定區(qū)基因融合而實現(xiàn)，所述免疫球蛋白同種型在人對象中具有經(jīng)論證有效的ADCC，例如IgG1和IgG3同種型(Greenwood and Clark(1993)ProteinEngineering of Antibody Molecules for Prophylactic and TherapeuticApplications in Man.Edited by Mike Clark，published by AcademicTities.Section II 85-113)。所得LMA的嵌合或人源化抗體在誘導(dǎo)ADCC中應(yīng)特別有效。
針對LMA的具有完全人可變區(qū)的抗體也可以通過給予已經(jīng)修飾的轉(zhuǎn)基因動物所述抗原以應(yīng)答抗原攻擊而產(chǎn)生抗體而制備，但是轉(zhuǎn)基因動物內(nèi)源基因座已經(jīng)失效?？梢赃M(jìn)行多種隨后的操縱以獲得抗體或其相似物(見例如美國專利No.6,075,181)。
治療方法 一方面，本發(fā)明的方法利用未經(jīng)修飾的抗體或結(jié)合片段，依賴于所述抗體或片段與骨髓瘤細(xì)胞表面的LMA原位結(jié)合而刺激免疫攻擊。例如，其中抗原結(jié)合位點與人Fc區(qū)域連接的嵌合抗體，例如IgGl，可以用于促進(jìn)抗體依賴性介導(dǎo)的細(xì)胞毒性或者補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。
另一方面，本發(fā)明的治療方法可以使用胞毒劑或者生物學(xué)調(diào)節(jié)物與之結(jié)合的LMA結(jié)合部分進(jìn)行。所得綴合物與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合抑制所述細(xì)胞生長或殺死所述細(xì)胞。
本發(fā)明抗體的抗獨特型單克隆抗體也可以治療性應(yīng)用于主動腫瘤免疫和腫瘤治療中(見例如Hellstrom et al.，″Anti Idiotypes″inCovalently Modified Antigens and Antibodies in Diagnosis andTherapy，supra at pp.35-41)。
在多發(fā)性骨髓瘤中，本發(fā)明的抗體或抗體片段可進(jìn)一步用于制備其中除去了骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞樣品。這種應(yīng)用在自身骨髓移植中特別重要，其中骨髓樣品從在進(jìn)行高劑量化療之前的癌癥患者中獲取。高劑量化療的目標(biāo)是殺死癌細(xì)胞，這樣也導(dǎo)致了骨髓細(xì)胞的耗竭。經(jīng)過這種處理后，將獲取的骨髓細(xì)胞再導(dǎo)入患者體內(nèi)。
在骨髓瘤和相關(guān)疾病中，獲取的骨髓污染了骨髓瘤細(xì)胞；因此再導(dǎo)入未經(jīng)處理的骨髓易于再次引起疾病發(fā)生。先前防止癌細(xì)胞再次導(dǎo)入的方法包括用化療劑及其它抗腫瘤制劑在體外處理骨髓樣品。其它方法包括凈化癌細(xì)胞樣品。
在本發(fā)明的進(jìn)一步實踐中，本文描述的單克隆抗體和片段可用于從患者骨髓樣品中除去骨髓瘤細(xì)胞之后再導(dǎo)入患者體內(nèi)。在一個非限制性實例中，所述單克隆抗體或結(jié)合片段與一種基質(zhì)如珠附著。這可以通過制備包含抗體或其結(jié)合片段的親和基質(zhì)的幾種熟知方法實現(xiàn)。然后將骨髓樣品暴露于該基質(zhì)，在促進(jìn)樣品中骨髓瘤細(xì)胞通過抗原/抗體相互作用與附著于基質(zhì)的抗體或結(jié)合片段結(jié)合的條件下，將細(xì)胞穿經(jīng)含有所述基質(zhì)的柱。樣品中的骨髓瘤細(xì)胞附著于所述基質(zhì)，而柱流出物，即未附著的細(xì)胞群，沒有骨髓瘤細(xì)胞。這種方法的效力可以通過檢驗剩余的骨髓瘤細(xì)胞而監(jiān)測，例如下文描述的使用可檢測標(biāo)記的抗體進(jìn)行。所述方法可以重復(fù)進(jìn)行或加以改變以增加效力。
這種凈化方法(見例如Ramsay et al.，J.Clin.Immunol.，8(2)81-88，1988)可以與除去或殺死癌細(xì)胞的其它方法一起進(jìn)行，包括但不限于將純化的骨髓細(xì)胞暴露于化療劑。這種化療劑包括使用與胞毒劑綴合的本發(fā)明的抗體或抗體結(jié)合片段，如上述在體內(nèi)進(jìn)行治療。因此，本發(fā)明的抗體或抗體片段與胞毒劑的綴合物可用于離體(exvivo)殺死細(xì)胞樣品中的腫瘤細(xì)胞。所述方法可另外包括將細(xì)胞暴露于細(xì)胞因子(例如GM-CSF、IL-6)、細(xì)胞因子受體(例如IL-6受體)、促細(xì)胞分裂原(例如美洲商陸促細(xì)胞分裂原(PWM))或者粘附分子(例如CD40配體)以刺激骨髓瘤細(xì)胞快速分化并從而上調(diào)癌癥特異性抗原在其細(xì)胞表面上的表達(dá)。這些處理形式是通過將骨髓瘤細(xì)胞與本發(fā)明的單克隆抗體或其片段一起保溫而使其易受體外介導(dǎo)的細(xì)胞毒性攻擊。
在本發(fā)明治療方法的另一方面，與胞毒劑如化療劑、光可激活的毒素或者放射性核素綴合的所述抗體或其結(jié)合片段可用于不用上述凈化技術(shù)而在體外或者離體抑制或殺死骨髓樣品中的骨髓瘤細(xì)胞。用細(xì)胞毒性抗體或抗體片段處理樣品可與其它殺死癌細(xì)胞的方法組合，通過從被移植的組織中除去細(xì)胞而增加骨髓移植、特別是自身骨髓移植的效力。這些方法可包括另外將所述細(xì)胞暴露于細(xì)胞因子等。因此，本文描述了一種從分離的細(xì)胞樣品中除去骨髓瘤細(xì)胞的方法，包括如下步驟將所述細(xì)胞樣品暴露于在其中骨髓瘤細(xì)胞與單克隆抗體或其結(jié)合片段粘附的條件下所述單克隆抗體或抗體結(jié)合片段與之結(jié)合的固體支持物，分離與所述基質(zhì)不結(jié)合的細(xì)胞樣品級分。非限制性例子是使用骨髓細(xì)胞，特別是進(jìn)行移植、優(yōu)選自身骨髓移植的骨髓細(xì)胞。
本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到，一些骨髓瘤患者在其循環(huán)中具有顯著水平的游離λ輕鏈。因為抗LMA抗體與這些游離輕鏈反應(yīng)，因此其存在于對象體液中可降低治療效力。因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述治療方法進(jìn)一步包括處理對象以降低其體液(例如血液)中循環(huán)的游離λ輕鏈水平，之后給予抗LMA抗體。這個額外的處理步驟可包括例如血漿置換術(shù)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，血漿置換術(shù)是其中通過細(xì)胞分離儀從血細(xì)胞中除去血漿的方法。所述分離儀通過高速旋轉(zhuǎn)血液或者通過將血液流經(jīng)具有只可以使血漿通過的孔的膜而從體液中分離細(xì)胞。將細(xì)胞回輸給對象，而棄去含有游離κ輕鏈的血漿并代以其它液體。在所述方法進(jìn)行期間可通過靜脈給予防止血液凝集的藥物(例如抗凝劑)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到包括使用抗LMA抗體的治療B細(xì)胞疾病如多發(fā)性骨髓瘤的方法可以單獨進(jìn)行，或者作為已知的化療或放療方案的輔助療法。例如，抗LMA抗體治療可以與藥物如苯丙氨酸氮芥或者環(huán)磷酰胺治療聯(lián)合進(jìn)行，或者在所述藥物治療之后進(jìn)行。
藥物組合物、劑量和給藥途徑 本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含抗LMA抗體與藥物可接受的載體或稀釋劑。
本發(fā)明的抗體和藥物組合物用于胃腸外給藥、局部給藥、口服例如通過氣霧劑或者經(jīng)皮局部給藥，以預(yù)防和/或治療性處理。優(yōu)選的抗LMA抗體的給藥途徑是胃腸外給藥，如本文所用術(shù)語“胃腸外”包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、直腸、陰道或者腹膜內(nèi)給藥。這些給藥途徑中，最優(yōu)選靜脈內(nèi)給藥。
給予的組合物通常包含所述抗體溶解于藥物可接受的載體、優(yōu)選水溶液載體的溶液?？梢允褂枚喾N水溶液載體，例如緩沖的鹽水等。這些溶液是無菌的，并通常沒有非所需的物質(zhì)。這些組合物可以通過熟知的常規(guī)滅菌技術(shù)滅菌。所述組合物可含有近似生理條件需要的藥物可接受的輔助物，如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑、毒性調(diào)節(jié)劑等，例如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等等。這些制劑中抗體的濃度可以變化很大，根據(jù)選擇的特定給藥模式和患者的需要而主要基于液體體積、粘度、體重等加以選擇。
腫瘤細(xì)胞的生長可以通過給予需要治療的對象有效量的抗LMA抗體而抑制或降低。典型地，所述抗體可以每劑量大約0.001-2000mg/kg體重的量、優(yōu)選大約0.01-500mg/kg體重的量給予。根據(jù)主治醫(yī)生的處方可以重復(fù)給予。然而，其它量也是適合的。通常，抗體的給予是通過輸注進(jìn)行的，由此可產(chǎn)生不利作用的抗體量可以通過改變給予速度而控制。典型地，輸注一個劑量可持續(xù)幾個小時。然而，本發(fā)明還涵蓋了持續(xù)輸注治療劑，使得血清中抗體水平保持恒定?？筁MA抗體的輸注可如下述進(jìn)行。對靜脈內(nèi)(I.V.)輸液管用例如0.9％NaCl和5％人血清白蛋白進(jìn)行預(yù)處理，進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥。I.V.輸注液可包括總體積為250ml的0.9％NaCl和5％人血清白蛋白，根據(jù)觀測到的任何與速度相關(guān)的副作用在大約2小時的時間輸注。在輸注期間每15分鐘及輸注后每1小時檢查生命跡象直至穩(wěn)定。可以在輸注之前和結(jié)束后進(jìn)行徹底的心肺檢查。準(zhǔn)備包括對乙酰氯薩羅、苯海拉明、腎上腺素和皮質(zhì)類固醇在內(nèi)的藥物以處理發(fā)生的變態(tài)反應(yīng)。根據(jù)主治醫(yī)生的觀測可重復(fù)給予所述抗體。
在本發(fā)明的一個實例中，放射性標(biāo)記形式的抗λ抗體作為治療劑通過靜脈內(nèi)注射給予表達(dá)LMA的靶細(xì)胞。放射性標(biāo)記抗體的前例及治療性給予患者的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。所述標(biāo)記例子包括I131標(biāo)記的Lym-l，針對HLA-DR的β亞基(DeNardo SJ et al.Antibody Immunoconj Radiophar(1988)117-33；DeNardo SJ et al.IntJ Biol Markers(1987)249-53)及抗CD20銦111和釔90標(biāo)記的Ibritumomab Tiuxetan(IDEC-Y2B8，ZEVALIN)和碘I131Tositumomab(BEXXAR)。
在任何治療方案中，所述治療組合物可以單獨給予患者，或者在含有其它治療劑、組合物等的混合物中給予患者，所述其它治療劑、組合物包括但不限于免疫抑制劑、耐受誘導(dǎo)劑、增效劑和副作用減輕劑。特別優(yōu)選免疫抑制劑用于抑制宿主的變態(tài)反應(yīng)。優(yōu)選的免疫抑制劑包括強(qiáng)的松、苯丙氨酸氮芥、強(qiáng)的松龍、DECADRON(Merck，Sharp & Dohme，West Point，Pa.)、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢霉素、6-巰基嘌呤、氨甲蝶呤、咪唑硫嘌呤和i.v.的γ球蛋白或者其組合。優(yōu)選的增效劑包括莫能菌素、氯化銨、哌克昔林、異搏定、金剛烷胺和氯奎。所有這些制劑通常以在接受的有效劑量范圍內(nèi)給予，如Physician′s Desk Reference，41st Ed.，Publisher Edward R.Barnhart，N.J.(1987).Patent Cooperation Treaty(PCT)，1989年8月10日公布的專利申請WO 89/069767所述，所述文獻(xiàn)并入本文作參考。
診斷分析和試劑盒 本發(fā)明的抗體也用于在體外和體內(nèi)的診斷性應(yīng)用，以檢測人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞。體外診斷方法包括免疫組織化學(xué)檢測腫瘤細(xì)胞。免疫組織化學(xué)技術(shù)包括用本發(fā)明的抗體染色生物學(xué)標(biāo)本如組織標(biāo)本，然后檢測與其抗原作為抗原-抗體復(fù)合物復(fù)合的抗體。標(biāo)本中這種抗體-抗原復(fù)合物的形成表明所述組織中存在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞。對標(biāo)本進(jìn)行抗體檢測可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)進(jìn)行，如免疫酶學(xué)技術(shù)，例如免疫過氧化物酶染色技術(shù)或者抗生物素蛋白-生物素技術(shù)，或免疫熒光技術(shù)(見例如Ciocca et al.，″ImmunohistochemicalTechniques Using Monoclonal Antibodies″，Methods Enzymol，121562-79，1986及Kimball，(ed)，Introduction to Immunology(2.sub.ndEd)，pp.113-117(Macmillan Pub.Co.，1986)。
在一個優(yōu)選的實施方案中，檢測與融合多肽結(jié)合的標(biāo)記。標(biāo)記多肽的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。標(biāo)記可以通過共價鍵直接連接或者通過典型地具有能與標(biāo)記和抗體分別形成共價鍵的反應(yīng)位點的連接分子共價連接。一種常用的方法是使用抗生物素蛋白或者鏈霉抗生物素蛋白或者生物素標(biāo)記所述多肽，所述標(biāo)記彼此不可逆地結(jié)合。
合適的標(biāo)記為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。本文所用術(shù)語“標(biāo)記”是指通過分光、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)或者化學(xué)方式可檢測的組合物。例如，有用的標(biāo)記包括放射性分子如32P、14C、125I、3H、和35S，熒光染料如熒光素或羅丹明，電子致密試劑，異硫氰酸酯/鹽；生色團(tuán)，酶(通常用于ELISA中)，發(fā)光酶如螢光素酶等等。
這種標(biāo)記的抗體或結(jié)合片段可用于抗原的組織學(xué)定位、ELISA、細(xì)胞淘選及其它免疫學(xué)技術(shù)例如檢測和/或量化抗原和攜帶抗原的細(xì)胞。如上所述，這種標(biāo)記的抗體或其片段的特殊應(yīng)用是在移植、特別是自身骨髓移植之前，確定骨髓組織中骨髓瘤細(xì)胞耗竭的效力。
本發(fā)明還涉及使用上述抗LMA抗體對多發(fā)性骨髓瘤成像的方法。攜帶LMA的其它癌癥也適合這些診斷方法。所述方法包括給予或輸注本發(fā)明所述單克隆抗體或結(jié)合片段，與或不與一種可檢測部分例如放射性核素綴合。在給予或輸注后，所述抗體或抗體片段與腫瘤細(xì)胞結(jié)合，之后檢測所述抗體或抗體片段的位置。對于可檢測標(biāo)記的抗體或其結(jié)合片段，如用放射性核素標(biāo)記的那些抗體或其結(jié)合片段，可以使用成像檢測設(shè)備鑒別體內(nèi)所述試劑的位置。對于使用未標(biāo)記的抗體或片段，可以給予第二種可檢測的試劑定位所述抗體或抗體片段，因此可適當(dāng)?shù)貦z測。這些方法已經(jīng)用于其它抗體，技術(shù)人員熟知這些不同的成像體內(nèi)抗體或片段的位置的方法。
攜帶LMA的癌細(xì)胞的解剖位置的檢測可用于隨后對每個特殊患者設(shè)計抗腫瘤治療方案。特別地，使用本發(fā)明的融合多肽可以對組織切片(例如活檢組織)、體液樣品(例如血液)或者細(xì)胞制品進(jìn)行免疫組織化學(xué)病理學(xué)診斷。
本發(fā)明還包含進(jìn)行研究或診斷目的的試劑盒。試劑盒典型包括含有抗LMA抗體的一或多個容器。所述抗LMA抗體可以用標(biāo)記衍生化，或者其可與另一種標(biāo)記結(jié)合以進(jìn)行隨后的檢測。如上所述，這種標(biāo)記可包括放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記，即辣根過氧化物酶(HRP)等等。所述試劑盒還可含有合適的另外的標(biāo)記(例如綿羊抗小鼠-HRP等等)。所述試劑盒還可含有促進(jìn)融合多肽結(jié)合、除去非特異性結(jié)合抗體及檢測結(jié)合的標(biāo)記的多種試劑。這種試劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
另一方面，本發(fā)明提供了包含與固體支持物結(jié)合的本發(fā)明的單克隆抗體或抗體結(jié)合片段的組合物。用于本發(fā)明中的固體支持物在進(jìn)行結(jié)合的反應(yīng)條件下是惰性的。用于本發(fā)明中的固相支持物必須具有反應(yīng)基團(tuán)或者活性基團(tuán)以附著所述單克隆抗體或其結(jié)合配偶體(partner)。在另一個實施方案中，所述固相支持物可以是層析支持物，如碳水化合物聚合物SEPHAROSE.RTM.、SEPHADEX.RTM或者瓊脂糖。如本文所用，固相支持物不限于特定類型的支持物。大量支持物是可以利用的，這些為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。固相支持物包括例如硅膠、樹脂、衍生化塑料膜、玻璃珠、棉制物、塑料珠、氧化鋁凝膠、磁珠、膜(包括但不限于硝化纖維素膜、纖維素膜、尼龍和玻璃棉)、塑料和玻璃皿或孔等等。
上述研究和診斷試劑盒的使用方法為本領(lǐng)域所熟知，通常在試劑盒的使用說明書中提供。
為了更清楚地理解本發(fā)明，參考如下非限制性實例進(jìn)行描述。
實施例 材料和方法 抗體 這些研究中使用的鼠單克隆抗體(mAb)是針對人游離λ輕鏈(λLC)產(chǎn)生的，是同種型IgG2a。在本文稱作L7(克隆3D12)和ME154(克隆ME-154)的mAb得自AbCam Ltd.(Cambridge，UK)。在本文稱作mab1306(克隆HP6054)的mAb得自Chemicon InternationalInc.(Melbourne，Victoria，Australia)。
細(xì)胞系 人λ-型多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系(LP-1)得自德國微生物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，Germany)。將細(xì)胞根據(jù)DSMZ的建議在Iscoves MDM和20％FBS中、在37℃和5％CO2條件下維持。
ELISA mAbs L7、mab1306和ME 154對于多種人游離λ輕鏈(λLC)的特異性通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)確定。特異性抗原由分離自λ型多發(fā)性骨髓瘤患者尿液的人游離λ輕鏈(本斯-瓊斯氏蛋白質(zhì)，BJP)組成。純化四種λLCLam F、Lam H、Lam K和Lam Q，并在Australian Proteomic Analysis Facility(APAF)使用HPLC分離為單體和二聚體級分。與重鏈相關(guān)的λ輕鏈由純化自正常人血清的完整多克隆λ-型人γ球蛋白(IgGλ)呈遞，得自Bethyl Laboratories，Inc.(Montgomery，Tx，USA)。不相關(guān)的對照抗原由單體和二聚體形式的人游離κ輕鏈(κLC)組成。
將ELISA平板的孔用每種抗原包被，所述抗原于具有0.02％疊氮化鈉的pH 7.4磷酸鹽緩沖鹽水中(PBS-az)。在37℃保溫1小時后，將孔用PBS-az洗滌3次并用于PBS-az中的3％BSA在4℃封閉過夜。將mAb與抗原在37℃保溫3小時，然后將孔用PBS-az洗滌3次。向每個孔中加入山羊抗小鼠IgG-AP綴合物(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)，在37℃保溫1小時。最后，將孔如上述洗滌并向每個孔中加入底物(pNpp；Sigma)。顏色的產(chǎn)生與和抗原結(jié)合的mAb的量成比例，在ELISA平板讀器上在405nm吸光度測定。
表面等離子共振(SPR) mAbs L7和mab1306對于人游離λ輕鏈的特異性在Biacore 2000生物傳感器上使用SPR證實。將mAbs L7和mab1306通過胺偶聯(lián)固定在葡聚糖包被的Biacore CM5芯片上，將與在ELISA中使用的相同的本斯-瓊斯氏抗原以10μg/mL注射固定的mAb 12分鐘。mAb-抗原結(jié)合在共振單位(resonance unit)中通過SPR測定，其與芯片表面由于抗原的mAb捕獲導(dǎo)致的質(zhì)量(mass)增加成比例。
流式細(xì)胞術(shù) mAbs L7、mab1306和ME 154與LP-1骨髓瘤細(xì)胞表面的結(jié)合通過流式細(xì)胞計量術(shù)評估。收獲LP-1細(xì)胞，通過離心洗滌并以1×106細(xì)胞/mL濃度重懸于具有1％BSA的PBS-az中。使等份5×105細(xì)胞沉淀，然后與mAb(100μg/mL)在冰上保溫30分鐘。對照樣品由相同濃度的同種型(IgG2a)匹配的對照mAb組成，或者只由具有1％BSA的PBS-az組成。在與抗體保溫后，將細(xì)胞在具有1％BSA的750μL的PBS-az中洗滌兩次，在50μL的1∶20稀釋的PE-綴合的山羊抗小鼠F(ab’)2(Dako)中在冰上保溫30分鐘。將細(xì)胞洗滌兩次，之后在FACSCalibur流式細(xì)胞計量儀(BD Biosciences)的FL-2通道中分析。
游離λLC對L7與LP-1細(xì)胞結(jié)合的抑制 將L7(100μg/mL)與不同濃度的游離λ輕鏈二聚體(Lam F和Lam H)或者與κLC(800μg/mL)在37℃預(yù)保溫1小時。在預(yù)保溫之后，將抗體混合物加入5×105細(xì)胞中，如上述通過流式細(xì)胞計量術(shù)確定結(jié)合。
通過熒光顯微鏡鑒別LP-1細(xì)胞表面上的游離λLC抗原 通過雙色熒光顯微鏡觀測免疫球蛋白重鏈(γ)和輕鏈(λ)的定位。使用與異硫氰酸熒光素(FITC)綴合的、得自O(shè)pen Biosystems(Huntsville，AL，USA)的山羊抗人γ-特異性抗體檢測γ鏈。使用與德克薩斯紅(Texas Red)綴合的、得自EY Laboratories Inc.(SanMateo，CA，USA)的山羊抗人λ抗體檢測λ鏈?？功丝贵w與游離的和重鏈相關(guān)的輕鏈均結(jié)合。抗體與LP-1細(xì)胞的結(jié)合通過將106的細(xì)胞與200μg/mL抗γ-FITC和抗λ-德克薩斯紅在冰上于具有1％BSA的PBS-az中保溫30分鐘而證明。將細(xì)胞洗滌兩次，之后用BX51熒光顯微鏡(Olympus，Tokyo，Japan)分析。表面免疫球蛋白的定位在UV光下使用470-490nm帶通激發(fā)濾波器(bandpass excitationfilter)檢測，示出FITC染色(綠色)。表面λ輕鏈的定位在UV光下使用520-550nm帶通激發(fā)濾波器檢測，示出德克薩斯紅染色(紅色)。然后將FITC和德克薩斯紅圖像重疊產(chǎn)生雙色圖像。FITC和德克薩斯紅位于同一位，紅色和綠色融合產(chǎn)生黃色。這樣可以確定λ輕鏈?zhǔn)欠裨讦面溦紦?jù)的那些區(qū)域之外的區(qū)域中出現(xiàn)。
通過Western印跡鑒別LP-1細(xì)胞的細(xì)胞膜級分中游離λLC抗原 LP-1細(xì)胞的細(xì)胞膜級分中游離λLC抗原的存在通過Western印跡證明。將LP-1細(xì)胞(4.5×107)通過離心用PBS洗滌兩次，然后以107細(xì)胞/mL的濃度重懸于40mM Tris pH 7.2和完全蛋白酶抑制劑(Roche)中。將細(xì)胞渦旋30秒，超聲15分鐘，然后再次渦旋30秒。在室溫保溫20分鐘后，將細(xì)胞渦旋，然后在4000g離心10分鐘。細(xì)胞質(zhì)級分得自上清，細(xì)胞膜級分由沉淀組成。將沉淀通過離心用PBS洗滌兩次，然后重懸于含有1％NP 40的Tris緩沖鹽水(TBS)中。將溶解的細(xì)胞膜在冰上保溫30分鐘，然后在4000g離心10分鐘。收集上清作為溶解的細(xì)胞膜級分。將等份的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜級分使用非變性條件進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后印跡在硝化纖維素膜上。游離λLC抗原通過與mAbs L7、mab1306和ME 154在室溫保溫90分鐘、隨后在含有0.05％Tween和0.3％BSA的TBS中洗滌3次進(jìn)行檢測。然后將膜與抗小鼠GAM-AP綴合物(Sigma)保溫90分鐘，如上述洗滌3次。通過將該膜與BCIP和NBT(SigmaFASTTM)一起保溫進(jìn)行蛋白質(zhì)條帶顯色。
抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC) mab1306和ME 154誘導(dǎo)ADCC的能力在體外使用Wilkinson等所述的流式細(xì)胞計量方法(Journal of Immunological Methods 2001 258pp183-91)評定。天然殺傷(NK)細(xì)胞用作效應(yīng)細(xì)胞，LP-1骨髓瘤細(xì)胞用作靶。
小鼠NK細(xì)胞分離自從健康Balb/c小鼠收獲的脾淋巴細(xì)胞懸浮液，使用MACS磁性細(xì)胞分選儀(Miltenyi Biotech，Germany)進(jìn)行。使用Miltenyi Biotech NK細(xì)胞分離試劑盒，除去除了NK細(xì)胞之外的所有淋巴細(xì)胞，剩下純化的未標(biāo)記的NK細(xì)胞。將NK細(xì)胞在補(bǔ)加了125ng/mL重組鼠IL-2(Sigma-Aldrich，USA)的RPMI 10％FCS中培養(yǎng)6天。
在U形底的96孔組織培養(yǎng)平板(Nunc，Denmark)中進(jìn)行分析。就在分析之前，將靶細(xì)胞(LP-1骨髓瘤細(xì)胞)用熒光膜染料PKH-26(Sigma-Aldrich，USA)根據(jù)廠商指導(dǎo)進(jìn)行標(biāo)記。將LP-1細(xì)胞(3×104細(xì)胞/mL)與于無菌PBS中的ME 154或者mab1306(7nM和0.7nM終濃度)在37℃和5％CO2條件下預(yù)保溫15分鐘。然后加入在RPMI中洗滌并重懸于其中的效應(yīng)細(xì)胞，鼠NK細(xì)胞，使得NK與LP-1的比率為25∶1、12.5∶1和6.25∶1?；旌霞?xì)胞，然后將該平板在400g離心10分鐘，以保證細(xì)胞與細(xì)胞緊密接觸。將平板在37C保溫16小時。
16小時后，將50μL的DNA結(jié)合染料TO-PRO-Iodide 3(1μM于PBS中；Molecular Probes Inc.，USA)加入每個測試樣品中。TO-PRO-Iodide 3只可進(jìn)入細(xì)胞膜不健全的細(xì)胞中，與雙鏈DNA結(jié)合。只有在這種DNA結(jié)合的基礎(chǔ)上，TO-PRO-Iodide 3才發(fā)熒光。2-5分鐘之后，將細(xì)胞在FACSCalibur流式細(xì)胞計量儀(BD Inc.，USA)上運轉(zhuǎn)。死亡的細(xì)胞通過由于TO-PRO-Iodide 3/DNA復(fù)合物所致的在FL4通道中的陽性熒光而鑒別。靶細(xì)胞(LP-1)通過由于PKH-26標(biāo)記所致的在FL2通道中的陽性熒光而鑒別。死亡的靶細(xì)胞因此經(jīng)鑒別是在FL2和FL4通道中均陽性熒光的那些細(xì)胞。細(xì)胞毒性百分比如下式計算 (FL4-FL2雙陽性細(xì)胞數(shù))/(FL2陽性細(xì)胞數(shù))×100 實施例1抗體L7、mab1306和ME 154對于λ輕鏈的特異性 L7與人游離λ輕鏈結(jié)合的特異性示于圖1A和2A。這些結(jié)果表明L7與單體和二聚體形式的三種不同λ輕鏈(Lam F、Lam H和LamK)均結(jié)合，并且與單體形式的第四種λ輕鏈(Lam Q)結(jié)合。所述抗體與正常人免疫球蛋白中重鏈相關(guān)的λ輕鏈不結(jié)合，與游離κ輕鏈也不結(jié)合。
mab1306與一系列人λ輕鏈的抗原結(jié)合性質(zhì)示于圖1B和2B。這些結(jié)果表明mab1306結(jié)合一系列游離的和免疫球蛋白相關(guān)的λLC，但是不結(jié)合游離κLC。相似地，mAb ME 154結(jié)合游離的和重鏈相關(guān)的λLC(圖1C)。所有這三種mAb均示出與單體形式的LamQ結(jié)合，但與二聚體形式的這種抗原不結(jié)合。
實施例2LP-1骨髓瘤細(xì)胞上λ輕鏈的鑒別 流式細(xì)胞計量術(shù)結(jié)果表明L7、mab1306和ME 154均特異性結(jié)合LP-1骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞表面抗原(圖3)。對于mAb L7，抗體與LP-1細(xì)胞的結(jié)合通過與兩種不同的單體游離λ輕鏈(Lam F和Lam H)預(yù)保溫而抑制(圖4)。這種抑制以濃度依賴性方式發(fā)生(圖4B)，然而L7結(jié)合不被相同濃度的游離κ輕鏈抑制。
使用熒光顯微鏡證明與Ig重鏈不相關(guān)的游離λ輕鏈抗原存在于LP-1細(xì)胞表面上(數(shù)據(jù)未示出)。細(xì)胞與熒光標(biāo)記的特異于IgGγ鏈的多克隆抗體(抗γ-FITC)一起保溫，示出LP-1細(xì)胞的綠色染色的不均勻強(qiáng)度，而λ輕鏈的多克隆抗體，抗λ-德克薩斯紅，示出細(xì)胞表面上一些片狀強(qiáng)紅色染色(數(shù)據(jù)未示出)。最強(qiáng)的紅色片狀染色(λ輕鏈)似乎與綠色染色(Ig相關(guān)γ鏈)在不同的位置。這個觀測結(jié)果通過重疊相同細(xì)胞的兩種顏色圖片而證實(數(shù)據(jù)未示出)。組合紅色和綠色產(chǎn)生黃色，而僅用一種抗體染色的區(qū)域保持原來的顏色。細(xì)胞表面上的黃色代表與免疫球蛋白相關(guān)的λ輕鏈。然而，明顯的片狀紅色表示與Ig不相關(guān)的λ輕鏈，因此游離λ輕鏈區(qū)域在細(xì)胞表面上。
通過非還原SDS-PAGE的Western印跡，使用mAbs L7、mab1306和ME 154檢測LP-1骨髓瘤細(xì)胞的膜相關(guān)λ輕鏈(圖5)。陽性對照組由純化的人游離λ輕鏈組成，其可以通過所有三種抗體檢測到。mab 1306(圖5B)和ME 154(圖5C)均檢測到在細(xì)胞的膜和胞質(zhì)級分中單體(25kD)和二聚體(50kD)形式的游離λ輕鏈。mAb L7示出與膜結(jié)合的單體和二聚體形式的游離λ輕鏈結(jié)合，但是在胞質(zhì)中看起來只檢測到單體形式的抗原。
討論 鼠單克隆抗體L7特異性結(jié)合四種不同的人游離λ輕鏈，但是不結(jié)合與重鏈相關(guān)的λ輕鏈。對抗體結(jié)合λ型骨髓瘤細(xì)胞系LP-1的分析表明，該抗體結(jié)合細(xì)胞表面抗原。與細(xì)胞表面抗原的結(jié)合可以通過將該抗體與兩種不同的λ輕鏈預(yù)保溫而阻斷。另外，可溶形式的游離λ輕鏈可以完全消除L7與LP-1細(xì)胞上細(xì)胞表面抗原的結(jié)合。這些數(shù)據(jù)提示所述抗體識別含有與在游離λ輕鏈上發(fā)現(xiàn)的相似表位的細(xì)胞表面抗原。
熒光顯微鏡檢表明細(xì)胞表面游離λ輕鏈可以與λ型骨髓瘤細(xì)胞表面上Ig相關(guān)的λ輕鏈相區(qū)別。另外，25kD單體和50kD二聚體形式的細(xì)胞膜游離λ輕鏈可以通過所有三種mAb在λ骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜級分中檢測到。
λ骨髓瘤細(xì)胞的特異性抗原依賴性細(xì)細(xì)胞毒性可以使用抗體mab1306和ME 154證明。這些結(jié)果提示結(jié)合細(xì)胞表面上單體和二聚體形式的游離λ輕鏈的抗體在存在效應(yīng)細(xì)胞的條件下可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
本文詳述的實驗表明針對游離λ輕鏈的一些鼠單克隆抗體可以檢測細(xì)胞膜上λ抗原的單體(25kD)和二聚體(50kD)形式。我們提出這種LMA由與細(xì)胞膜相關(guān)的游離λ輕鏈組成，并且可用于使用單克隆抗體特異性靶定λ型多發(fā)性骨髓瘤患者的骨髓瘤細(xì)胞。
另外，注意到LMA在多種B細(xì)胞疾病的B細(xì)胞上呈遞。這種細(xì)胞的例子是DOHH-2(人B細(xì)胞淋巴瘤)、WSU-NHL(人B細(xì)胞淋巴瘤)、DB(人B細(xì)胞淋巴瘤)、KARPAS-1106P(人B細(xì)胞淋巴瘤)、WSU-DLCL2(人B細(xì)胞淋巴瘤)、SU-DHL-5(人B細(xì)胞淋巴瘤)、MHH-PREB-1(人B細(xì)胞淋巴瘤)GRANTA-519(人B細(xì)胞淋巴瘤)和MC-116(人B細(xì)胞淋巴瘤)。
由于LMA對于惡性B細(xì)胞的細(xì)胞膜是獨特的，因此提議能選擇性結(jié)合這些抗原的任何mAb均可用于治療如多發(fā)性骨髓瘤的疾病。其次的作用是，能結(jié)合LMA的合適同種型的任何mAb均能通過使用宿主效應(yīng)細(xì)胞引起ADCC而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。這個其次作用有助于耗竭B細(xì)胞疾病患者中的B細(xì)胞。
以上說明書中提及的所有出版物在本文均并入作參考。在不偏離本發(fā)明的范圍和精神的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明描述的方法和系統(tǒng)作各種修改和改變。盡管結(jié)合特別優(yōu)選的實施方案對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但應(yīng)理解請求保護(hù)的本發(fā)明不限于這些特殊的實施方案。事實上，分子生物學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的對本發(fā)明所述模式進(jìn)行的各種修改，其也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種治療或者預(yù)防對象中B細(xì)胞疾病的方法，所述方法包括給予所述對象有效量的抗LMA抗體以抑制所述對象中淋巴樣細(xì)胞生長或者殺死所述對象中的淋巴樣細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述B細(xì)胞疾病是選自多發(fā)性骨髓瘤、B細(xì)胞淋巴瘤和巨球蛋白血癥的一種淋巴增生疾病。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述B細(xì)胞疾病是多發(fā)性骨髓瘤。
4.權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中所述抗LMA抗體與一種細(xì)胞毒性部分或者生物學(xué)調(diào)節(jié)物綴合。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述細(xì)胞毒性部分是毒素、化療劑或者放射性制劑。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述細(xì)胞毒性部分是編碼細(xì)胞毒性多肽的核酸分子。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述生物學(xué)應(yīng)答調(diào)節(jié)物是淋巴因子、細(xì)胞因子或者干擾素。
8.一種抑制對象中淋巴樣細(xì)胞生長或者殺死淋巴樣細(xì)胞的方法，所述方法包括在LMA配體綴合物足以與淋巴樣細(xì)胞結(jié)合的條件下給予對象與細(xì)胞毒性部分或者生物學(xué)調(diào)節(jié)物綴合的LMA配體，以抑制所述細(xì)胞的生長或者殺死該細(xì)胞。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述LMA配體是抗LMA抗體。
10.權(quán)利要求8或9的方法，其中所述細(xì)胞毒性部分是毒素、化療劑或者放射性制劑。
11.權(quán)利要求8或9的方法，其中所述細(xì)胞毒性部分是編碼細(xì)胞毒性多肽的核酸分子。
12.權(quán)利要求8-11任一項的方法，其中所述生物學(xué)應(yīng)答調(diào)節(jié)物是淋巴因子、細(xì)胞因子或者干擾素。
13.權(quán)利要求1-12任一項的方法，其進(jìn)一步包括在給予抗LMA抗體或者LMA配體綴合物之前處理對象以降低對象體液中存在的游離λ輕鏈水平的步驟。
14.權(quán)利要求13的方法，其中對象血清中存在的游離輕鏈的水平通過化療或者血漿置換術(shù)而降低。
15.一種用于對象的自體造血細(xì)胞移植的方法，所述方法包括
(i)從對象取出造血祖細(xì)胞群，
(ii)用抗LMA抗體或者LMA配體綴合物處理該細(xì)胞群，及
(iii)將步驟(ii)的處理的細(xì)胞群移植進(jìn)所述對象。
16.權(quán)利要求15的方法，其進(jìn)一步包括給對象靜脈內(nèi)輸注抗LMA抗體或者LMA配體綴合物。
17.權(quán)利要求15或16的方法，其中將所述抗LMA抗體或者LMA配體綴合物與一種固體支持物結(jié)合。
18.一種在對象體內(nèi)定位淋巴樣細(xì)胞的方法，所述方法包括給予對象抗LMA抗體或者LMA配體，使得所述抗體或配體與對象的細(xì)胞結(jié)合，及確定對象中所述抗體或者配體的位置。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述抗體或配體是可檢測地標(biāo)記的。
20、權(quán)利要求1-19任一項的方法，其中所述抗LMA抗體是嵌合抗體或者人源化抗體。
21.一種與細(xì)胞毒性部分或者生物學(xué)調(diào)節(jié)物綴合的抗LMA抗體。
22.權(quán)利要求20的抗LMA抗體，其中所述細(xì)胞毒性部分是毒素、化療劑或者放射性制劑。
23.權(quán)利要求20的抗LMA抗體，其中所述細(xì)胞毒性部分是編碼細(xì)胞毒性多肽的核酸分子。
24.權(quán)利要求20的抗LMA抗體，其中所述生物學(xué)應(yīng)答調(diào)節(jié)物是淋巴因子、細(xì)胞因子或干擾素。
25.一種用可檢測部分標(biāo)記的抗LMA抗體。
26.一種藥物組合物，其包含抗LMA抗體或者LMA抗原綴合物及一種藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑或者賦形劑。
27.一種結(jié)合于固體支持物的抗LMA抗體或者LMA配體綴合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及B細(xì)胞疾病如多發(fā)性骨髓瘤(MM)的診斷和治療。特別地，本發(fā)明涉及使用結(jié)合淋巴癌細(xì)胞表面上表達(dá)的游離λ輕鏈的配體治療B細(xì)胞疾病。
文檔編號G01N33/532GK1946425SQ20058001315
公開日2007年4月11日 申請日期2005年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月27日
發(fā)明者羅薩尼·多羅西·鄧恩, 達(dá)倫·羅斯·瓊斯, 帕里薩·阿斯瓦蒂, 羅伯特·雷森, 安德魯·塔斯曼·哈欽森 申請人:派克邁伯有限公司