專利名稱：磷酸膽堿偶聯(lián)物和相應(yīng)抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動脈粥樣硬化和缺血性心血管疾病的治療和風(fēng)險評估領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
動脈粥樣硬化是一種慢性疾病，引起大動脈和中等大小動脈的最內(nèi)層(內(nèi)膜)增厚。它使血流緩慢，并可以在由受感染血管供血的器官中引起缺血和組織破壞。動脈粥樣硬化是導(dǎo)致心肌梗塞等心血管疾病、中風(fēng)和外周動脈疾病的主要原因。它是西方國家的主要死因，預(yù)計不出二十年，將成為全球最主要的死亡原因。
這種疾病始于血管的細(xì)胞外基質(zhì)中積累脂蛋白，主要是低密度脂蛋白(LDL)。這些LDL顆粒聚集并發(fā)生氧化。氧化后的LDL具有促炎特性和毒性，引起血管損傷。動脈粥樣硬化在很多方面代表了對這種損傷的一種反應(yīng)，包括炎癥和纖維變性。
1989年，Palinski及其同事鑒定出人體內(nèi)抗氧化型LDL的循環(huán)自身抗體。這一發(fā)現(xiàn)提示，動脈粥樣硬化可能是由抗氧化型脂蛋白的免疫反應(yīng)引起的自身免疫病。同一時期，多個實(shí)驗(yàn)室開始尋找抗氧化型LDL抗體滴度與心血管疾病之間的關(guān)系。但這些研究沒有得出明確的結(jié)論。目前已經(jīng)有針對氧化型LDL表面眾多不同表位的多種抗體，但這些表位的結(jié)構(gòu)尚不清楚。因此，術(shù)語″氧化型LDL抗體″是指多種不同抗體的未知混合物，而不是指一種特殊的抗體。
眾所周知，動脈硬化病灶存在持續(xù)炎癥，其特征是免疫活性細(xì)胞被活化，產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子。已經(jīng)確認(rèn)的風(fēng)險因素，例如高血壓、血脂、糖尿病和吸煙都很可能促進(jìn)這種炎癥反應(yīng)，但這種現(xiàn)象的發(fā)生機(jī)制尚不明確，存在多種互不相干的排他性可能性。已經(jīng)有人提出多種可以引起該免疫反應(yīng)的自身抗原，包括氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)和熱休克蛋白(HSP)2，3。有關(guān)免疫反應(yīng)在動脈粥樣硬化中的作用的現(xiàn)有信息提示一種復(fù)雜的關(guān)系。其中一種情況是，在動物模型中進(jìn)行免疫接種，以便影響動脈粥樣化的形成。當(dāng)使用HSP時，動脈粥樣硬化增加，當(dāng)以oxLDL作為抗原時，動脈粥樣硬化減少4，5。
aOxLDL在人類疾病中的作用似乎比較復(fù)雜。此前有人證實(shí)，aOxLDL在健康對照人群中的水平高于臨界高血壓(borderline hypertension，一種早期心血管疾病6)人群。近期研究與該發(fā)現(xiàn)是一致的7，8。另一方面，有多位研究者報道，aOxLDL在人類心血管疾病(CVD)中升高，尤其是在晚期疾病中2.3.9.10。實(shí)例之一是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)以及與CVD極高風(fēng)險有關(guān)的自身免疫病。有CVD病史的SLE-患者aOxLDL水平明顯升高11。這些在某種程度上相互矛盾的結(jié)果可能主要是由于LDL-氧化的不同方法和狀態(tài)在抗原性方面產(chǎn)生差異。疾病階段和風(fēng)險系數(shù)變化譜都傾向于與抗體水平相關(guān)。
氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)本身具有多種促炎特性，包括活化T細(xì)胞12.13，單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞14-16。OxLDL還在來自動脈粥樣硬化病灶的免疫活性細(xì)胞中促進(jìn)炎癥17。但要注意，oxLDL也可以緩解急性炎癥反應(yīng)，并替代促進(jìn)更低級的慢性炎癥，這在動脈粥樣硬化中可見18。有趣的是，oxLDL的多種生物學(xué)活性是由oxLDL中的血小板活化因子(PAF)-樣脂質(zhì)引起的19-21。
磷酸膽堿(phosphorylcholine，PC)不僅是血小板活化因子PAF(它在與PAF-受體相互作用時是必需的)等炎癥性磷脂和oxLDL中的主要成分，還可以作為肺炎鏈球菌(S.Pneumoniae)等多種細(xì)菌的免疫原成分22。而且，PC由凋亡細(xì)胞表達(dá)2，23。
在US5455032中，在用于提供抗感染(例如肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae))的免疫保護(hù)的疫苗中使用磷酸膽堿偶聯(lián)物。Binder等人最近對小鼠中肺炎球菌疫苗的研究24顯示，免疫接種減少了動脈粥樣硬化灶的形成。有研究發(fā)現(xiàn)，由動脈粥樣硬化小鼠產(chǎn)生的多種抗oxLDL自身抗體與提供抗常見感染性病原體(包括肺炎鏈球菌)的保護(hù)作用的抗體有相同的結(jié)構(gòu)。在小鼠、而非人類中的研究并未提供任何關(guān)于特異性的信息，也未能提示，IgM抗-磷酸膽堿抗體在動脈粥樣硬化中是比相應(yīng)IgG抗體明顯更為重要的保護(hù)因子。此外，磷酸膽堿偶聯(lián)物未被用于肺炎球菌疫苗中。
另一項(xiàng)研究25顯示，抗磷酸膽堿抗體水平在牙周病(periodontal diseases)患者體內(nèi)升高。其結(jié)論是，磷酸膽堿是與牙周菌群中生物相關(guān)的重要的口腔抗原，而抗-PC抗體水平的升高是牙周患病的結(jié)果。至今尚無動脈粥樣硬化的抗體和可能的保護(hù)作用或進(jìn)展的任何信息。
目前已有多篇關(guān)于動脈粥樣硬化的免疫接種治療的文獻(xiàn)被公開(如WO2002080954和WO0168119)，但這些是基于使用脫脂載脂蛋白B的肽片段或抗T細(xì)胞受體alpha/beta鏈的抗體。有一篇文獻(xiàn)(WO9908109)描述了用抗脂蛋白表面氧化作用特異性表位的單克隆抗體檢測動脈粥樣硬化斑的方法。與該方法不同的是，本發(fā)明的方法使用磷酸膽堿偶聯(lián)物檢測受試者樣品中的IgM或IgG等抗體。
發(fā)明簡述本發(fā)明涉及藥物組合物及其在治療、預(yù)防動脈粥樣硬化，例如治療、預(yù)防或緩解動脈粥樣硬化的進(jìn)一步進(jìn)展方面的用途，所述藥物組合物包含磷酸膽堿偶聯(lián)物、或特異性針對磷酸膽堿偶聯(lián)物的抗體制劑，例如單克隆抗體。本發(fā)明還涉及磷酸膽堿偶聯(lián)物或所述抗體制劑，例如單克隆抗體在制備藥物組合物中的用途，所述偶聯(lián)物或抗體制劑可以與佐劑組合或者不與佐劑組合。本發(fā)明還涉及診斷有無抗體，例如IgM或IgG抗體的方法，所述抗體與患缺血性心血管病風(fēng)險的增加或降低相關(guān)。
本發(fā)明第一方面提供了藥物組合物在制備免疫接種和治療哺乳動物動脈粥樣硬化或動脈粥樣硬化相關(guān)疾病的藥物中的用途，所述藥物組合物包含至少一種磷酸膽堿偶聯(lián)物，或特異性針對磷酸膽堿偶聯(lián)物的抗體制劑，例如單克隆抗體，所述哺乳動物包括人。所述藥物是用于對動脈粥樣硬化有致免疫特性或治療特性的免疫接種。
本發(fā)明第二方面提供了免疫接種和治療哺乳動物動脈粥樣硬化或動脈粥樣硬化相關(guān)疾病的方法，所述方法包括對所述哺乳動物施用藥物組合物，所述藥物組合物包含至少一種磷酸膽堿偶聯(lián)物，或特異性針對磷酸膽堿偶聯(lián)物的抗體制劑，例如單克隆抗體，所述哺乳動物包括人。所述藥物組合物是用于對動脈粥樣硬化有致免疫特性或治療特性的免疫接種。
磷酸膽堿偶聯(lián)物是指磷酸膽堿組分與載體相連，優(yōu)選通過間隔臂(spacer)相連。作為結(jié)構(gòu)性組件的磷酸膽堿可包括磷酸膽堿衍生物。合適的磷酸膽堿偶聯(lián)物實(shí)例可參見US 5,455,032，見上文。例如，US 5,455,032提供了這樣的磷酸膽堿偶聯(lián)物，其中磷酸膽堿組分借助直鏈烷基和酰胺鍵與各種不同的免疫學(xué)載體相連。所述磷酸膽堿偶聯(lián)物可以是，例如人血清白蛋白(HSA)-或匙孔血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)-磷酸膽堿偶聯(lián)物或牛血清白蛋白(BSA)-磷酸膽堿偶聯(lián)物(例如見實(shí)施例)。PC-BSA(磷酸膽堿-牛血清白蛋白)可以從Biosearch Technologies，INC(Ca，USA)購買。HSA-BSA可以通過化學(xué)方法偶聯(lián)，所述方法舉例如下可以按照Chesebro，B.在Biochemistry 11，(1972)766中所述方法，以含10％鈀的活性碳(charcoal)作為催化劑，使O-(4-硝基苯基-磷酰基)-膽堿(Sigma N 5879)與氫氣在1atm進(jìn)行還原反應(yīng)，大量產(chǎn)生O-(4-氨基苯基磷?；?-膽堿(I)。
用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)-碳二亞胺)的MES液(pH 4)使(I)與HAS偶聯(lián)，方法基本如Padilla，N.D.等在J.Immun..Methods 293(2004)1-11中所述。偶聯(lián)的HAS可以通過對經(jīng)過緩沖的鹽水(pH 7.4)透析而被分離。
載體可以是，例如，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或聚合物。載體可以是乳膠珠，例如實(shí)施例中所述。
所述藥物可以用于注射給藥。
本發(fā)明另一方面提供了在先任一方面定義的一或多種磷酸膽堿偶聯(lián)物在制備免疫治療或治療缺血性心血管疾病的藥物組合物中的用途，可以與佐劑組合或不與佐劑組合。
本發(fā)明又一方面提供了預(yù)防性治療或治愈性治療哺乳動物的方法，所述哺乳動物是指患有動脈粥樣硬化或者有患缺血性心血管病的風(fēng)險的哺乳動物，例如人，所述方法包括施用治療有效量的至少一種磷酸膽堿偶聯(lián)物、或特異性針對磷酸膽堿偶聯(lián)物的抗體制劑，例如單克隆抗體。
本發(fā)明還涉及確定有無抗磷酸膽堿的抗體，例如抗磷酸膽堿的IgM或IgG抗體的方法，所述抗體與患缺血性心血管病風(fēng)險的增加或降低相關(guān)。
本發(fā)明又一方面提供了用磷酸膽堿偶聯(lián)物診斷有無抗體，例如IgM或IgG抗體的方法，所述抗體與患缺血性心血管病風(fēng)險的增加或降低相關(guān)。
故而本發(fā)明還有一方面提供了磷酸膽堿偶聯(lián)物在評估患者發(fā)生或進(jìn)展缺血性心血管疾病的風(fēng)險的方法中的用途，在所述方法中，評估所述患者的與磷酸膽堿偶聯(lián)物反應(yīng)的抗體，例如IgM或IgG抗體的水平。
磷酸膽堿偶聯(lián)物已經(jīng)在上文中描述。磷酸膽堿可以與載體通過間隔臂相連。所述載體可以是蛋白質(zhì)，這可以是KLH(匙孔血藍(lán)蛋白)或人血清白蛋白(HSA)。所述載體可以是乳膠珠。
所述患者的與磷酸膽堿偶聯(lián)物反應(yīng)的抗體，例如IgM或IgG抗體的水平可以用免疫分析方法評估。合適的免疫分析方法的實(shí)例在下丈中描述，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員在任何情況下都明顯可以得知的。
可能需要測定與oxLDL或MD-LDL反應(yīng)的抗體以及測定與磷酸膽堿偶聯(lián)物反應(yīng)的抗體，例如IgM或IgG抗體。或者，或進(jìn)一步地，可能需要測定HSP70，HDL，TNF和/或HSP60的水平(見實(shí)施例)以及測定與磷酸膽堿偶聯(lián)物反應(yīng)的抗體，例如IgM或IgG抗體的水平。
發(fā)明詳述以下實(shí)施例旨在舉例說明本發(fā)明，不應(yīng)認(rèn)為是對權(quán)利要求所概括的保護(hù)范圍作任何限制。本文提到的文獻(xiàn)都引入作為參考。
這里描述了一例測定與缺血性心血管疾病患病風(fēng)險升高或降低相關(guān)的抗磷酸膽堿IgM抗體存在與否(或水平)的方法。也可以用本領(lǐng)域已知的其它方法。類似的方法可以用于測定抗磷酸膽堿IgG抗體的存在與否(或水平)。
測定抗磷酸膽堿的IgM抗體存在與否的方法用酶聯(lián)免疫吸附法測定抗PC-BSA的IgM抗體。
微量滴定板用PC-BSA(10μg/ml；例如可以購自Biosearch Technologies，INC(Ca，USA)的磷酸鹽緩沖液(PBS)包被。用PBS洗板，然后將板用2％BSA溶液封閉。血清樣品用0.2％BSA-PBS稀釋(1∶30)。將微量滴定板40℃保溫過夜，洗板。添加堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗-人IgM(用樣品緩沖液稀釋成l∶7000)，100ul/孔，40℃保溫過夜。洗板后，添加堿性磷酸酶底物，將板于室溫避光保溫60min，進(jìn)行顯色。在分光光度計中讀取405nm處的吸光度。
測試了磷酸膽堿的不同載體(carrier)和間隔臂(spacer)。載體不限于舉例的這些。也可以用本領(lǐng)域已知的其它載體，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或聚合物，例如乳膠珠。載體可以參見上文中提到的US 5,455,032。
由本發(fā)明方法檢測到的IgM或IgG抗體還可以結(jié)合含有暴露在表面的磷酸膽堿(PC)的化合物中的PC，例如溶血磷脂酰膽堿(lysoPC；see，forexample，Kim et al，J Exp Med.2002 Sep 2；196(5)655-65)中的PC。因此，本發(fā)明的方法可以檢測與溶血磷脂酰膽堿結(jié)合的IgM或IgG抗體。
合成磷酸膽堿偶聯(lián)物和制備藥物組合物將乳膠珠(0.20μm或0.81μm)懸浮在PBS中，與10μg/ml磷酸膽堿-BSA溶液混合過夜。然后將這些珠離心，用緩沖液洗數(shù)次，用10μg/ml BSA溶液封閉。再洗一次，然后將這些珠重懸于適當(dāng)?shù)木彌_液中達(dá)到適當(dāng)?shù)臐舛?，冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 帶有連接臂的磷酸膽堿也可以借助重氮苯基(diazophenyl)與KLH(匙孔血藍(lán)蛋白)偶聯(lián)。更優(yōu)選按照Chesebro，B.和Metzger，H.(1972)Biochem.11776的方法合成PC的p-硝基苯基-6-(O-磷酸膽堿)羥基己酸酯衍生物。先將p-硝基苯基-6-(O-磷酸膽堿)羥基己酸酯溶于干乙腈(100mg/ml)，再迅速將其加入KLH中。使衍生物和KLH在4℃混合過夜，然后透析除去未結(jié)合的間隔臂和作為離去基團(tuán)(leaving group)的p-硝基苯(nitrophenylate)。
將所得磷酸膽堿偶聯(lián)物懸浮在合適的緩沖液中，制得注射液，其可以直接用于免疫接種。
用磷酸膽堿偶聯(lián)物進(jìn)行免疫接種BALB/c小鼠腹腔注射(i.p.)200μg[p-硝基苯基-6-(O-磷酸膽堿)羥基己酸酯-KLH]進(jìn)行免疫接種，按照建議的免疫分析方法，在所述小鼠血漿中檢測到高滴度的識別磷酸膽堿的IgM抗體。
抗磷酸膽堿偶聯(lián)物的單克隆抗體單克隆抗體可以用本領(lǐng)域已知的任何標(biāo)準(zhǔn)方法制備。例如，可參見“Briles DE，F(xiàn)orman C，Hudak S，Claflin JL.Anti-phosphorylcholine antibodiesof the T15 idiotype are optimally protective against Streptococcus pneumoniae.JExp Med.1982；1561177-85”或“T15 PC binding monoclonal antibodies retainspecificity when they switch from IgM to IgG.，Spira，Gad；Aguila，Hector L.；Scharff.Matthew D.Fac.Med.，Techniton-Israel Inst.Technol.，Haifa，Israel.Journal of Immunology(1988)，140(8)，2675-80。
其它抗磷酸膽堿偶聯(lián)物抗體可以用本領(lǐng)域已知的方法制備。例如，可以按照以下的描述，用磷酸膽堿偶聯(lián)物進(jìn)行親和純化，制得人免疫球蛋白制劑的具有aPC活性的部分(subfraction)。靜脈免疫球蛋白制劑(如IGIV；Baxter等)是市面上可以買到的高純度IgG制劑，可以用于治療不具有抗體生成能力或者抗體生成能力極低的患者。免疫球蛋白制劑包括可以從以下廠家購買到的那些Baxter(US)eg Gammagard，Isiven(Antimo Naples，ltaly)，Omrix(Tel-Hashomer，Israel)，Miles(Biological Products Division，WestHeaven，CT)，Sclavo(Lucca，Italy)，Sandoz(Novartis，Basel，Swizerland)egSandoglobulin，Biotest Diagnostic Corporation(Deville，NJ)。免疫球蛋白制劑的實(shí)例有Gammagard S/D，Gammar IV，Gammar-P IV，GammimuneN，Iveegam，Panglobulin，Polygam S/D，Sandoglobulin，Venoglobulin。免疫球蛋白制劑通常包含一些IgM，還含有IgG。Gammagard中有很少量IgM。Pentaglobin(Biotest)是富含IgM的制劑，可用于治療SARS。具有aPC活性的部分可包含IgG和IgM二者，或者可以選擇主要包含IgG(例如，用Gammagard等富含IgG的制劑開始，和/或選擇IgG)；或主要包含IgM(例如，用Pentaglobin等富含IgM的制劑開始，和/或選擇IgM)。
具有磷酸膽堿偶聯(lián)物特異性的抗體制劑結(jié)合未被偶聯(lián)的磷酸膽堿，也可以結(jié)合含有暴露的磷酸膽堿(PC)的化合物中的PC、例如溶血磷脂酰膽堿(lysoPC；參見，例如，Kim et al，J Exp Med.2002 Sep 2；196(5)655-65)中的PC。因此，具有磷酸膽堿偶聯(lián)物特異性的抗體制劑也可以結(jié)合溶血磷脂酰膽堿。
動脈粥樣硬化受試者中的IgM免疫球蛋白水平在動脈粥樣硬化風(fēng)險因子相關(guān)研究中，測定高血壓患者(舒張壓(diastolic pressure)＞95mmHg)中抗磷酸膽堿的IgM自身抗體的基礎(chǔ)水平和4年后水平。結(jié)果概述如下在剛加入試驗(yàn)時的77例受試者(35％)和4年隨訪后的84例受試者(38％)中檢測到頸動脈斑(Carotid plaque)。該研究共包括218例受試人。中膜-內(nèi)膜厚度(IMT)的增加在隨訪組中比在那些剛加入試驗(yàn)時具有高血清水平的抗PC IgM(75th或90th百分點(diǎn))的患者中少見。IMT增加者與減少者之間抗-磷酸膽堿IgM抗體水平均值有顯著性差異(638.8±219.6比(vs.)734.8±266.9，p＝.004)。
抗PC的IgM自身抗體與IMT變化之間的關(guān)系與年齡、吸煙習(xí)慣、阿替洛爾(atenolol)或拉西地平(lacidipine)治療以及血脂都無關(guān)。IgM自身抗體也與IgG水平無關(guān)。
因而本發(fā)明的一個實(shí)施方案是，用磷酸膽堿偶聯(lián)物制備藥物組合物，以便在動脈粥樣硬化的治療或預(yù)防中應(yīng)用。所述偶聯(lián)物可以是磷酸膽堿與蛋白質(zhì)或聚合物相連。所述藥物組合物優(yōu)選經(jīng)注射給藥。
本發(fā)明建議的主動免疫方法將可以調(diào)節(jié)自身抗體的滴度，從而在對抗動脈粥樣硬化發(fā)生方面起到積極有利的作用。
本發(fā)明另一實(shí)施方案是，用識別磷酸膽堿偶聯(lián)物的抗體制劑(例如單克隆抗體)制備藥物組合物，以便在動脈粥樣硬化的治療或預(yù)防中應(yīng)用。所述單克隆抗體可以用本領(lǐng)域已知的方法制備。
本發(fā)明另一實(shí)施方案是，提供一種用磷酸膽堿偶聯(lián)物檢測抗磷酸膽堿抗體(例如IgM或IgG抗體)存在與否的方法，所述抗體與患缺血性心血管病風(fēng)險的增加或降低相關(guān)。優(yōu)選的方法是免疫分析方法。所述方法可以用于評估患者發(fā)生或進(jìn)展缺血性心血管疾病的風(fēng)險。


圖1a用β2GPI，PS和CL抑制抗體(IgM)與經(jīng)過PC白蛋白包被的ELISA-板的結(jié)合。通過不同抗原與PC白蛋白包被板的結(jié)合來抑制。為研究aPC的特異性，按照試驗(yàn)部分所述進(jìn)行競爭試驗(yàn)。結(jié)果用均值±SD表示。
圖1b用β2GPI，PS和CL抑制抗體(IgG)與經(jīng)過PC白蛋白包被的ELISA-板的結(jié)合。通過不同抗原與PC白蛋白包被板的結(jié)合來抑制。為研究aPC的特異性，按照試驗(yàn)部分所述進(jìn)行競爭試驗(yàn)。結(jié)果用均值±SD表示。
圖2a用oxLDL和MDA-LDL抑制抗體(IgM)與經(jīng)過PC白蛋白包被的ELISA-板的結(jié)合。通過不同抗原與PC白蛋白包被板的結(jié)合來抑制。為研究aPC的特異性，按照試驗(yàn)部分所述進(jìn)行競爭試驗(yàn)。結(jié)果用均值±SD表示。
圖2b用oxLDL和MDA-LDL抑制抗體(IgG)與經(jīng)過PC白蛋白包被的ELISA-板的結(jié)合。通過不同抗原與PC白蛋白包被板的結(jié)合來抑制。為研究aPC的特異性，按照試驗(yàn)部分所述進(jìn)行競爭試驗(yàn)。結(jié)果用均值±SD表示。
圖3從IGIV提取的aPC對巨噬細(xì)胞中oxLDL攝取的影響測試了兩組巨噬細(xì)胞加oxLDL，巨噬細(xì)胞加已經(jīng)與從IVIG提取的aPC預(yù)保溫的oxLDL。
巨噬細(xì)胞+-oxLDL(共107個細(xì)胞)弱染色37/107＝34.58％ 強(qiáng)染色10/107＝9.35％ 總?cè)旧栃?7/107＝43.93％巨噬細(xì)胞+Dil-oxLDL+aPC-組(檢查了156個細(xì)胞)弱染色37/156＝23.72％ 強(qiáng)染色2/156＝1.28％總?cè)旧栃?9/156＝25％圖3A示Dil-標(biāo)記的oxLDL染色。圖3B顯示無標(biāo)記的oxLDL的染色。
圖4將高血清滴度抗磷脂抗體(aPL)與人免疫球蛋白集合物Gammagard預(yù)保溫對膜聯(lián)蛋白V與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的結(jié)合的影響培養(yǎng)24小時后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析

圖5aPC對內(nèi)皮細(xì)胞中ICAM-誘導(dǎo)的影響1ug/ml PAF與aPC IgM預(yù)保溫或不經(jīng)預(yù)保溫而添加到內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物中。ICAM-1的表達(dá)用FACScan測定。綠線代表PAF的作用，紅線是PAF+aPC IgM以及空白對照。數(shù)據(jù)清楚表明，添加aPC IgM后，柱狀圖左移。
試驗(yàn)受試者226例確認(rèn)為高血壓(舒張壓＞95mm Hg)的受試者在加入歐洲拉西地平對動脈粥樣硬化影響的研究的瑞典分組(the Swedish component of theEuropean Lacidipine Study on Atherosclerosis(ELSA)25，26)之前取血樣。在為期4周的清除期(washout period)內(nèi)不使用任何藥物，以便將治療對測量值的影響減至最小，4周后采血。按照文獻(xiàn)25，26所述測定血壓、膽固醇和甘油三酯水平。115例受試者隨后用β-阻斷劑阿替洛爾治療，111例受試者用鈣拮抗劑拉西地平治療。該研究經(jīng)Ethics Committee of the Karolinska Hospital核準(zhǔn)，符合the Helsinki Declaration的規(guī)定。所有受試者都是在知情的情況下表示同意加入研究。
頸動脈超聲(Carotid ultrasound)按照文獻(xiàn)25，26所述進(jìn)行頸動脈超聲并分析。共有218例患者獲得了有效的基礎(chǔ)超聲值和4年隨訪超聲值。簡言之，左右頸動脈用Biosound 2000IIA 型多普勒儀(duplex scanner)以8.0MHz環(huán)形振子轉(zhuǎn)換器(annular arraytransducer)進(jìn)行測定。測出內(nèi)腔-內(nèi)膜回聲(lumen-intima echo)的最邊緣(theleading edge)與中膜-外層回聲(media-adventitious echo)的最邊緣之間的距離，將其作為遠(yuǎn)壁(the far wall)的內(nèi)膜-中膜(I-M)厚度。將測量結(jié)果作為動脈粥樣硬化的替代指示物，它是，四年隨訪期間，頸總動脈遠(yuǎn)端(the distalcommon carotids)和雙側(cè)頸動脈分支(carotid bifurcations bilaterally，CBMmax)中4處遠(yuǎn)壁的平均最大內(nèi)膜-中膜厚度(IMT)的改變。對加入本研究之時的抗PC抗體水平與4年隨訪期間IMT的增加或減少之間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行評估。
試劑Polysorp F96微量免疫滴定板購自Nunc(Roskilde Denmark)，PC-BSA(磷酸膽堿-牛血清白蛋白)購自Biosearch Technologies，INC(USA)。
牛血清白蛋白(BSA)，堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗人IgG(r-鏈特異性)，堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗人IgM(u-鏈特異性)，PNPP(堿性磷酸酶底物)都購自Sigma(St.Louis，MO，USA)。心磷脂(CL)購自AVANTT(US，β2糖蛋白(β2GP1)得自Calbiochem(US)。
IgG和IgM總水平用文獻(xiàn)6所述常規(guī)技術(shù)測定。
血清CRP用高敏感度顆粒增強(qiáng)型免疫濁度測定法(particle-enhancedimmunonephelometry，Behring Nephelometer Analyzer，BN II(Dade BehringGmBH，Marburg，Germany))進(jìn)行分析，將試驗(yàn)誤差(antir-assay variation)設(shè)定為＜4％。
測定抗PC，oxLDL和MDA-LDL的自身抗體用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定抗PC-BSA的lgG和IgM抗體。從17例抗磷脂綜合征患者收集血清作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，并在每個平板上都進(jìn)行檢測。用10μg/ml抗原濃度達(dá)到抗體結(jié)合的平臺期。F96微量滴定polysorp板用每孔50μg PC-BSA(10μg/ml)的PBS液包被。將包被板在4℃保溫過夜。用PBS洗5次，然后將板用2％BSA-PBS室溫封閉2h，再如上述洗板。血清樣品用0.2％BSA-PBS稀釋(1∶30)，按照50μl/孔進(jìn)行加樣。
按照文獻(xiàn)所述6，用連續(xù)制備型超速離心法(sequential preparativeultra-centrifugation)從健康供血者血漿分離LDL，用銅離子氧化(OxLDL)，或用MDA衍化(MDA-LDL)。
基本按照文獻(xiàn)6所述，用ELISA測定OxLDL和MDA-LDL。將OxLDL或MDA-LDL用包被緩沖液(碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液50mM pH9.7)稀釋至2μg/ml，按照100μl/孔添加到包被的ELISA板(Costar 2581)中。將板在4℃靜置過夜，用PBS洗4次，然后用20％成年牛血清的PBS溶液(20％ABS-PBS)室溫封閉2小時。再與已用20％ABS-PBS稀釋至1∶30的100μl血清一起4℃保溫過夜。
將板在4℃保溫過夜，如上述洗板。按照100μl/孔添加堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗人IgG(用樣品緩沖液稀釋至1∶9000)和堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗人IgM(用樣品緩沖液稀釋至1∶7000)，4℃保溫過夜。洗5次，然后按照100μl/孔添加堿性磷酸酶底物(PNPP)，將板在室溫避光保溫60min以便顯色。在ELISA Multiskan Plus spectrophotometer上用405nm讀板。在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中測定所有樣品，偏差系數(shù)(coefficient of variation)低于10-15％。
抗-磷酸膽堿-BSA抗體的特異性為了檢查抗-磷酸膽堿-BSA的特異性，用收集匯總的高滴度血清進(jìn)行吸附試驗(yàn)。將高滴度血清集合物在與PC-BSA有50％最大結(jié)合的稀釋度與不同濃度的PC-BSA一起預(yù)保溫。將試管渦旋后，40℃保溫過夜，13000r.p.m.離心30min(40℃)。按照文獻(xiàn)所述測定上清中抗體與PC-BSA的結(jié)合。抑制百分比如下計算抑制百分比＝(不含競爭物時的OD-有競爭物時的OD)×100/不含競爭物時的OD統(tǒng)計學(xué)分析分析(dichotomize)第75和第90百分點(diǎn)的抗-磷酸膽堿水平?？?磷酸膽堿抗體(或其它抗體)與動脈粥樣硬化進(jìn)展之間的4年期間的關(guān)聯(lián)性如下確定用邏輯回歸分析來估計IMT增長(有增長或無增長)并計算差異率(oddsratios，ORs)和95％置信區(qū)間(CI)，或用Spearman correlation如所述進(jìn)行比較。針對有可能造成混淆的因素，如年齡、吸煙習(xí)慣、血清膽固醇、血清甘油三酯以及抗-高血壓治療(拉西地平，阿替洛爾)模式等，作出適當(dāng)調(diào)整。雙側(cè)p-值＜0.05時認(rèn)為具有顯著性。
結(jié)果受試者剛加入研究時的基本情況另有詳述(Pockley et al(2003)Hypertension 42，235-238)，可參見本文表I。
競爭性研究表明，IgM和IgG類的aPC與PC-BSA預(yù)保溫時有競爭力(competed out)，心磷脂競爭能力弱，磷脂酰絲氨酸沒有競爭能力(圖1a，1b)。β2-糖蛋白I可在一定程度上與IgG競爭對PC-BSA的結(jié)合，但不如與IgM競爭的程度(圖1a，1b)。PC-BSA對結(jié)合其它受試抗原的競爭力弱(數(shù)據(jù)未顯示)。OxLDL和MDA-LDL可以競爭IgM aPC對PC-BSA的結(jié)合，也可以競爭IgG aPC的結(jié)合，但后一種情況的程度弱(圖2a，2b)。
隨訪組的IMT增長在那些剛加入研究時具有抗PC(第75或第90百分點(diǎn))，oxLDL和MDA-LDL(第90百分點(diǎn))的IgM高血清水平的患者中少見，CRP與IMT變化無關(guān)(表2)。
邏輯回歸分析表明，抗PC，oxLDL和MDA-LDL的IgM自身抗體與IMT變化之間的關(guān)聯(lián)性與年齡、吸煙習(xí)慣、阿替洛爾或拉西地平治療以及血脂無關(guān)。aPC IgM在第75百分點(diǎn)和第90百分點(diǎn)都與IMT變化顯著相關(guān)，IgM類aOxLDL和aMDA-LDL僅在第90百分點(diǎn)顯著相關(guān)(表3a-d)。IgM自身抗體也與IgG值無關(guān)(數(shù)據(jù)未顯示)。IgG總水平和IgM總水平與IMT測量值或變化無關(guān)(數(shù)據(jù)未顯示)。
抗PC的IgG自身抗體在有IMT增長的受試者中傾向于更低水平，但這種差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(表2)。
男性和女性之間存在顯著差異。IgM類的aPC，aMDA-LDL和aOxLDL在女性中明顯高于男性(p’s＜0.05)。但這些自身抗體的IgG水平在男女之間無差別。此外，女性在剛加入研究時以及隨訪中，動脈斑發(fā)生率明顯更低(p＜0.05)。
aPC IgM水平與IMT增長呈負(fù)相關(guān)(Rho 0.18，p＝0.006)，這與另兩種保護(hù)因子，HDL和HSP70的表現(xiàn)相反，后二者在連續(xù)測量中與IMT變化無關(guān)(數(shù)據(jù)未顯示)。與aPC IgM不同，aOXLDL和aMDA-LDL在這些測定中未達(dá)到顯著性(數(shù)據(jù)未顯示)。
aPC IgM水平與aOCLDL IgM(Rho 0.74，p＜0.001)和aMDA-LDL IgM(rho 0.51，p＜0.001)之間有顯著相關(guān)性。類似地，aPC與HSP60(Rho 0.28，p＜0.001)，HSP70(Rho 0.35，p＜0.001)和HDL(Rho 0.23，p＜0.01)都相關(guān)，其中HSP70在最近的文獻(xiàn)中被描述為該群體(cohort)中新的人動脈粥樣硬化保護(hù)因子(Pockley et al(2003)，出處同上)。aPC IgM，aOxLDL IgM或aOxLDL，MDA-LDL和LDL，CRP或甘油三酯之間無關(guān)聯(lián)(數(shù)據(jù)未顯示)。
在控制年齡、總膽固醇、甘油三酯、吸煙和治療等因素的情況下，分別對男性和女性進(jìn)行邏輯回歸分析，結(jié)果表明，IgM aPC在女性中僅在第90百分點(diǎn)時顯示明顯的保護(hù)效應(yīng)(EXP(B)＝.17，95％CI＝0.05-.68；p＝0.01)，在男性中僅在第70百分點(diǎn)時顯示明顯的保護(hù)效應(yīng)(EXP(B)＝.18，95％CI＝0.04-.74；p＝0.01)。
抗MDA-LDL和oxLDL的IgM在這方面有不同，僅有女性的檢測值具有統(tǒng)計學(xué)顯著性。因此，在對男性和女性分別進(jìn)行邏輯回歸分析時，在控制年齡、總膽固醇、甘油三酯、吸煙和治療這些因素的情況下，抗MDA-LDL的IgM以及抗OxLDL的IgM在女性中有明顯保護(hù)作用(分別為EXP(B)＝.17，95％CI＝.05-.68，p＝0.01和EXP(B)＝.18，95％CI＝.04-.74，p＝0.01)，男性中這種效應(yīng)不具有顯著性(分別為EXP(B)＝.60，95％CI＝.15-2.2，p＝0.44和EXP(B)＝.39，95％CI＝.10-1.5，p＝0.17)，這表明，高滴度的抗OxLDL IgM和抗MDA-LDL IgM在女性中有特異性保護(hù)作用。
表1.剛加入研究時的基本情況。結(jié)果表示為平均值(SD)或百分比(％)，脂質(zhì)結(jié)果表示為mg/dL。

表2.抗磷酸膽堿(PC)的IgG和IgM自身抗體為基礎(chǔ)水平時對IMT變化的直接預(yù)測。


表3a用高血壓受試者aPC IgM自身抗體基礎(chǔ)水平的第75百分點(diǎn)預(yù)測4年期間的IMT變化。

表3b用高血壓受試者aPC IgM自身抗體的第90百分點(diǎn)預(yù)測4年期間的IMT變化。

表3c用高血壓受試者抗OxLDL IgM自身抗體和其它風(fēng)險因子的第90百分點(diǎn)預(yù)測4年期間的IMT變化。


表3d用高血壓受試者抗MDA-LDL IgM自身抗體和其它風(fēng)險因子的第90百分點(diǎn)預(yù)測4年期間的IMT變化。

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顯示aPC的保護(hù)作用的研究在Malm的觀察研究(the Malm Diet and Cancer Study)中，30000例受試者有約6000例接受了進(jìn)一步的心血管調(diào)查，包括用頸動脈超聲測量來對亞臨床動脈粥樣硬化進(jìn)行非侵入性評估。還測定了其它心血管風(fēng)險因子的基礎(chǔ)水平。對這些受試者隨訪10年，考查他們的心血管疾病新事件(心肌梗塞、慢性冠狀動脈心臟疾病、動脈粥樣血栓性中風(fēng)(atherothrombotic stroke))發(fā)生率。為了評估95％置信區(qū)間內(nèi)的相對風(fēng)險(計算為相對危險(relativehazard))，對低水平的抗磷酸膽堿抗體(aPC-IgM)進(jìn)行嵌套式-病例-控制分析(nested-case-control analyse)(每種情況3個對照)。共有145例心血管疾病(CVD)病例(主要是心肌梗塞(MI)和缺血性中風(fēng))和400例在年齡和性別上相匹配的對照。aPC水平第10百分點(diǎn)的臨界值是307。共有20例CVD病例的aPC水平低于第10百分點(diǎn)(14％)，對照有34例低于該百分點(diǎn)(9％)，相對危險為1,9(95％CI 1,1-4,3)。在男性病例中，共有16例CVD病例的aPC水平低于第10百分點(diǎn)(19％)，25例對照低于該水平(11％)，相對危險為1,9(95％CI 1,1-3,5)。女性病例數(shù)太少，無法獲得有效的相對風(fēng)險信息(見表1和2)。
這些結(jié)果提示，aPC低水平預(yù)示健康受試者心血管疾病的發(fā)生，其可以作為心血管疾病的標(biāo)記物。
表1.aPC統(tǒng)計結(jié)果(＜第10百分點(diǎn))

表2.對所有患者、男性患者、以及女性患者分別進(jìn)行傳統(tǒng)的邏輯回歸單變量分析(Univariate analysis)，考查aPC(＜第10百分點(diǎn))對CVD的影響。

aPC的作用簡介利用預(yù)先吸附了PC-BSA，PC-KLH或肺炎球菌疫苗(Statens SerumInstitute，Denmark)的柱，提取可與這些化合物反應(yīng)的抗體。至少前兩種化合物的aPC IgG水平升高。從IVIG提取出少量IgM，將其加載至已經(jīng)預(yù)先吸附了上述抗原的柱上。我們通過這種方法獲得了IgG和IgM類的多克隆人aPC。蛋白測定表明，可提取出0.5mg/ml aPC IgM。用體外模型測試這些抗體的功能1.在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系THP1中，濃度遞增的aPC IgM與氧化型LDL預(yù)先保溫是否可以減少結(jié)合和攝?。靠梢允褂门浜瞎步癸@微術(shù)和/或FACS的測試系統(tǒng)。
2.以正常IgM為對照，濃度遞增的aPC IgM與PAF、溶血磷脂酰膽堿(LPC)一起預(yù)先保溫，是否可以抑制這些脂質(zhì)對內(nèi)皮細(xì)胞表面粘附分子ICAM的誘導(dǎo)？還可以用購買的試劑盒(多種不同細(xì)胞因子；BioSource)測試其它細(xì)胞因子。測試可以用FACScan進(jìn)行。
細(xì)胞培養(yǎng)從Cascade Biologics，Inc.(Portland，OR，USA)購買凍存的第2代HUVEC集合物。將這些培養(yǎng)物在不含酚紅、但含有2％胎牛血清和添加劑的EGMTM培養(yǎng)基(Clonetics，San Diego，CA，USA)中維持。細(xì)胞在75cm2燒瓶(TPP，AG，Trasadingen，瑞士)中，于37℃、5％CO2濕境中孵育。
所有實(shí)驗(yàn)在第3-4代進(jìn)行。將細(xì)胞以2×104細(xì)胞/ml的密度接種在12孔板(NUNC，Inc，Naperville，IL，USA)中，準(zhǔn)備用于流式細(xì)胞分析。經(jīng)過12-24小時，使細(xì)胞貼壁，然后使細(xì)胞在SFM中靜置至少12小時，再進(jìn)行處理。
單核細(xì)胞系THP-1來自AT&T(USA)。細(xì)胞在含10％FCS的RPMI中維持。
制備aPC用HiTrap IgM或IgG分離柱(Amersham Biosciences)從購買的人免疫球蛋白集合物(Gammagard)中分離出總IgM或IgG級分，其濃度為50mg/ml。洗脫出抗磷酸膽堿(PC)抗體，方法是，將PC與匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)(1或5mg/ml)或牛血清白蛋白(BSA)(1mg/ml)偶聯(lián)，使該偶聯(lián)的PC結(jié)合NHS-Sepharose柱，將IgM或IgG級分加載到該柱中，隨后加載到僅結(jié)合BSA的柱中。PC-BSA(磷酸膽堿-牛血清白蛋白)和PC-KLH從BiosearchTechnologies，INC(Ca，USA)購買。洗脫的級分在PD-10柱上更換緩沖液，用Millipore Centricone裝置濃縮。方法見說明書。所得IgM aPC濃度主要為50μg/ml，IgG aPC濃度主要為30μg/ml。
THP-1衍生的巨噬細(xì)胞對oxLDLS的清除結(jié)合(cavenger binding)和攝取按文獻(xiàn)所述，通過與銅離子保溫來制備氧化型LDL(oxLDL)。首先，將oxLDL用Dil(Dil-(1，1′-雙十八烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚碳菁高氯酸酯(Dil-(1，1′-dioctadecy1-3，3，3′，3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)；Molecular Probes，Inc))標(biāo)記，在鹽水-EDTA緩沖液中稀釋至1mg/ml。每1mgoxLDL添加2ml不含脂蛋白的血清，然后過濾(0.45um)。每1mg oxLDL添加50ul Dil(3mg/ml)的DMSO溶液，將該混合物37℃保溫15h，然后對鹽水-EDTA透析6h，期間換幾次透析液。之后，將該混合物再用0.45um濾膜過濾。
oxLDL的攝取用熒光/共焦顯微鏡檢來研究。THP-1細(xì)胞作為單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的模型，在載玻片小室(slide chamber)中過夜培養(yǎng)(培養(yǎng)基是DMEM/10％FBS/Glu/PEST)用不含胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基洗3次與oxLDL-DiO 5ug/ml(SFM培養(yǎng)基)一起保溫6小時細(xì)胞用0.2％BSA-PBS洗5次，用PBS洗1次巨噬細(xì)胞細(xì)胞核染色將細(xì)胞與1ug/ml二苯甲亞胺(bisbenzimide)一起保溫10’，用PBS洗3次。
固定和封片(mount)細(xì)胞用4％低聚甲醛(paraformaldehyde)的PBS溶液固定30’，用PBS洗3次，加1滴封片膠，最后將載玻片用蓋玻片覆蓋。
膜聯(lián)蛋白V與內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合將已添加肝素進(jìn)行保護(hù)、并且具有高度的抑制膜聯(lián)蛋白V結(jié)合的能力的血漿置于SFM中，使其濃度為10％，將該血漿液添加到HUVEC單層培養(yǎng)物中。24小時后用細(xì)胞分離液(Cell Dissociation Solution，CDS；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)收獲細(xì)胞，小心地收集上清，避免丟失已脫壁的懸浮細(xì)胞，然后在1200rpm離心7分鐘。將沉淀在100μl膜聯(lián)蛋白V-結(jié)合緩沖液(Molecular Probes Inc，Eugene，OR，USA)中重新懸浮，用2μl 5mg/ml膜聯(lián)蛋白V-FITC(Molecular Probes)染色，在冰上保持15分鐘。添加1mg/ml碘化丙錠(propidium iodide)(PI；活體染料；R&DSystems Europe Ltd，Abingdon，UK)，然后迅速采樣(acquisition)。如上文所述進(jìn)行分析。
統(tǒng)計學(xué)分析用Stat View software，SAS Institute AB，Gteborg，Sweden進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。將偏離的連續(xù)變量(Skewed continuous variables)轉(zhuǎn)換為對數(shù)形式。用方差分析(ANOVA)比較各個研究小組的連續(xù)變量(continuous variable)，用卡方(Chi square)比較各個研究小組的絕對變量(categorical variable)。用Fischer′sPLSD作為post hoc檢驗(yàn)(test)。相關(guān)系數(shù)用簡單回歸計算，或者對于非正態(tài)分布的變量，用Spearman的秩相關(guān)(rank correlation)計算。將顯著性水平設(shè)定在p＜0.05。
結(jié)果測量膜聯(lián)蛋白V對內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合測定膜聯(lián)蛋白V染色陽性的HUVEC的頻率，表示為雙變量點(diǎn)圖(bivariate dot plot)上的膜聯(lián)蛋白V+/PI-細(xì)胞百分比或柱狀圖(histogram)上的膜聯(lián)蛋白V+細(xì)胞百分比。在有已知可減少結(jié)合的血清存在、并且已與IVIG預(yù)保溫的情況下，測定膜聯(lián)蛋白V與HUVEC的結(jié)合。與IVIG預(yù)保溫可以恢復(fù)(restore)膜聯(lián)蛋白的結(jié)合，這表明，IVIG中的抗體可以中和結(jié)合作用(圖4)。
在有CVD病史的SLE患者中，APC-BSA和aPC-KHL都與膜聯(lián)蛋白V對EC的結(jié)合顯著相關(guān)(分別為r＝0.45；p＝0.02和r＝0.42和p＝0.03)。aPC按照上丈的描述進(jìn)行測定。
aPC對巨噬細(xì)胞中oxLDL攝取的影響將如上所述從IVIG提取的IgM和IgG類aPC與oxLDL按照上丈所述進(jìn)行預(yù)保溫(圖3)。用總IgM作為aPC IgM(巨噬細(xì)胞+Dil-oxLDL+IgM)的對照，和對巨噬細(xì)胞攝取的影響。陽性染色的細(xì)胞的總百分?jǐn)?shù)為46.62％，表明，IgM本身不具有aPC那樣的抑制效應(yīng)。IgM從SIGMA購買，是用正常人血清作為起始材料，通過沉淀和凝膠過濾技術(shù)產(chǎn)生的純化的人IgM。這種免疫球蛋白經(jīng)測定純度至少為95％。
aPC對內(nèi)皮細(xì)胞中ICAM誘導(dǎo)作用的影響將指定濃度的PAF與EC一起保溫。如圖5所示，這種脂質(zhì)可以誘導(dǎo)ICAM表達(dá)的顯著增加。將按照上文所述從IVIG提取的IgM類aPC與這些脂質(zhì)按照上文所述一起保溫(圖5)。
ELSA研究中aPC與其它風(fēng)險標(biāo)記物的相關(guān)性(226例高血壓個體，如前述aPC IgM與另兩種保護(hù)因子HSP 70和HDL相關(guān)，見表4所示。與TNF也有弱但顯著的相關(guān)性，TNF是炎癥標(biāo)記物，也是促動脈粥樣硬化的細(xì)胞因子(proatherogenic cytokine)。
TNF是重要的促炎細(xì)胞因子，TNF水平與aPC IgM水平負(fù)相關(guān)。這種相關(guān)性較弱，但卻是顯著的。
HSP 70是最近由發(fā)明人及其他人描述的一種新的保護(hù)因子。存在明顯的正相關(guān)性。HSP60是一種較弱的保護(hù)因子，也有相關(guān)性。
HDL是眾所周知的“良好(good)”膽固醇，具有抗炎特性。它與aPC IgM顯著相關(guān)。

**在.01水平具有顯著相關(guān)性(雙側(cè))。
*在.05水平具有顯著相關(guān)性(雙側(cè))。
權(quán)利要求
1.藥物組合物在制備免疫接種和治療哺乳動物動脈粥樣硬化或動脈粥樣硬化相關(guān)疾病的藥物中的用途，所述藥物組合物包含至少一種磷酸膽堿偶聯(lián)物，或特異性針對磷酸膽堿偶聯(lián)物的抗體制劑，例如單克隆抗體，所述哺乳動物包括人。
2.免疫接種和治療哺乳動物動脈粥樣硬化或動脈粥樣硬化相關(guān)疾病的方法，所述方法包括對所述哺乳動物施用藥物組合物，所述藥物組合物包含至少一種磷酸膽堿偶聯(lián)物，或特異性針對磷酸膽堿偶聯(lián)物的抗體制劑，例如單克隆抗體，所述哺乳動物包括人。
3.權(quán)利要求1的用途或權(quán)利要求2的方法，其中所述藥物是用于通過注射來施用的藥物或者所述組合物通過注射來施用。
4.在先任一權(quán)利要求的用途或方法，其中磷酸膽堿與載體經(jīng)由間隔臂連接。
5.權(quán)利要求4的用途或方法，其中所述載體是蛋白質(zhì)。
6.權(quán)利要求5的用途或方法，其中所述蛋白質(zhì)是KLH(匙孔血藍(lán)蛋白)或人血清白蛋白(HSA)。
7.權(quán)利要求4的用途或方法，其中所述載體是乳膠珠。
8.在先任一權(quán)利要求定義的一或多種磷酸膽堿偶聯(lián)物在制備免疫治療或治療缺血性心血管疾病的藥物組合物中的用途，所述偶聯(lián)物可以與佐劑組合或不與佐劑組合。
9.預(yù)防性治療或治愈性治療哺乳動物的方法，所述哺乳動物是指患有動脈粥樣硬化或者有患缺血性心血管病的風(fēng)險的哺乳動物，例如人，所述方法包括施用治療有效量的至少一種磷酸膽堿偶聯(lián)物、或特異性針對磷酸膽堿偶聯(lián)物的抗體制劑，例如單克隆抗體。
10.用磷酸膽堿偶聯(lián)物診斷有無IgM或IgG抗體的方法，所述抗體與患缺血性心血管病風(fēng)險的增加或降低相關(guān)。
11.權(quán)利要求10的方法，其中磷酸膽堿與載體經(jīng)由間隔臂連接。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述載體是蛋白質(zhì)。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述蛋白質(zhì)是KLH(匙孔血藍(lán)蛋白)或人血清白蛋白(HSA)。
14.權(quán)利要求11的方法，其中所述載體是乳膠珠。
15.權(quán)利要求10-14之一的方法，其中所述試驗(yàn)是免疫分析。
16.磷酸膽堿偶聯(lián)物在評估患者發(fā)生或進(jìn)展缺血性心血管疾病的風(fēng)險的方法中的用途，在所述方法中，評估所述患者的與磷酸膽堿偶聯(lián)物反應(yīng)的IgM或IgG抗體的水平。
全文摘要
本發(fā)明測定了高血壓患者體內(nèi)抗磷酸膽堿的IgG和IgM自身抗體的基礎(chǔ)水平，目的是確定抗體在動脈粥樣硬化進(jìn)展中的重要性。自基礎(chǔ)水平開始隨訪四年的結(jié)果表明，內(nèi)膜－中膜厚度的增加在具有高水平的抗磷酸膽堿自身抗體、尤其是具有高水平的抗磷酸膽堿的IgM自身抗體的患者體內(nèi)明顯少見。因此，本發(fā)明認(rèn)為，抗磷酸膽堿自身抗體、尤其是抗磷酸膽堿的IgM自身抗體的有無，與缺血性心血管疾病的風(fēng)險的增加或減少有關(guān)。本發(fā)明提供了一種測定抗磷酸膽堿自身抗體、尤其是抗磷酸膽堿的IgM自身抗體，從而鑒定有患缺血性心血管疾病風(fēng)險的患者的方法。動物實(shí)驗(yàn)顯示，用匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)－磷酸膽堿偶聯(lián)物進(jìn)行主動免疫之后，可以檢測到血漿中的中－高水平抗磷酸膽堿自身抗體、尤其是抗磷酸膽堿的IgM自身抗體。本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含磷酸膽堿偶聯(lián)物(主動免疫)或特異性針對磷酸膽堿偶聯(lián)物的抗體制劑，例如單克隆抗體(被動免疫)，本發(fā)明還提供了用這些組合物作為主動免疫或被動免疫的免疫原治療或預(yù)防動脈粥樣硬化的用途。
文檔編號G01N33/68GK1968965SQ200580019701
公開日2007年5月23日 申請日期2005年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月15日
發(fā)明者烏爾夫·德費(fèi)爾, 約翰·弗羅斯特加德 申請人:阿瑟拉生物技術(shù)公司