專利名稱：由二乙炔材料構(gòu)成的比色傳感器的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考本申請(qǐng)要求2004年12月17日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)60/636,993的優(yōu)先權(quán)，該申請(qǐng)被全文引入本文以供參考。
背景技術(shù)：
目前用于檢測微生物、尤其是耐抗生素細(xì)菌的技術(shù)通常是耗時(shí)的，典型地涉及培育純形式的細(xì)菌。主要關(guān)注的一種所述微生物是金黃色葡萄球菌(“S.aureus”)，它是引起廣譜感染的病原，這些感染包括淺表損傷如皮膚小膿腫和創(chuàng)傷感染；全身和致命的病癥，如心內(nèi)膜炎、肺炎和敗血癥；以及毒素病，如食物中毒和中毒性休克綜合征。金黃色葡萄球菌耐受除少數(shù)選擇性抗生素以外的所有抗生素。
已經(jīng)嘗試使用各種各樣的常規(guī)技術(shù)分析微生物。例如，方法包括使用熒光免疫色譜法(例如，美國專利第5,753,517號(hào)中所述的快速分析測量程序)、ELISA(例如比色ELISA)、和其它比色技術(shù)。美國專利5,622,872和公開WO 02/00920；美國專利6,395,561 B1；6,306,598 B1；6,277,652；6,183,722；和6,080,423中描述了包括聚二乙炔(PDA)材料的比色傳感器。
二乙炔作為溶液中的單體通常是無色的，經(jīng)加熱或光化學(xué)輻射可發(fā)生加成聚合。當(dāng)聚合時(shí)，這些化合物發(fā)生對(duì)比色變化，變成藍(lán)或紫色。當(dāng)經(jīng)受外部刺激時(shí)，如加熱、物理壓力、或者溶劑或相反電荷離子變化時(shí)，聚二乙炔因平面骨架構(gòu)象的變形表現(xiàn)出進(jìn)一步的顏色變化。例如，已知隨著溫度升高或pH變化，由于共扼骨架中的構(gòu)象變化，聚二乙炔組裝體顏色從藍(lán)變到紅色，如Mino等人，Langmuir，Vol.8，p.594，1992；Chance等人，化學(xué)物理雜志(Journal of Chemistry and Physics)，Vol.71，206，1979；Shibutag，固體薄膜(Thin Solid Films)，Vol.179，p.433，1989；Kaneko等人，固體薄膜(Thin Solid Films)，Vol.210，548，1992；和美國專利5,672,465中所述。
盡管本領(lǐng)域已經(jīng)描述了檢測金黃色葡萄球菌以及其它微生物的方法，但改進(jìn)檢測方法將是有益的。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種比色傳感器，其通過光譜變化(顏色變化可用裸眼或比色計(jì)觀察)來檢測分析物的存在，所述光譜變化是由分析物通過引起聚二乙炔組裝體構(gòu)象變化的方式發(fā)生相互作用而引起的。聚二乙炔組裝體以簡單但高度靈敏的方式指示分析物的存在。
本發(fā)明提供了用于檢測分析物的比色體系，該體系包括包括受體的比色傳感器；包括至少一種二乙炔化合物的聚合組合物(這意味著由所述二乙炔化合物的聚合而形成所述聚合組合物)；其中所述受體被摻入到所述聚合組合物中以形成轉(zhuǎn)導(dǎo)物；和介導(dǎo)所述分析物與所述轉(zhuǎn)導(dǎo)物之間相互作用的緩沖組合物，其中所述緩沖組合物優(yōu)選包括兩種或多種不同的緩沖劑；其中所述轉(zhuǎn)導(dǎo)物在與分析物接觸時(shí)表現(xiàn)出顏色變化。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述緩沖組合物是具有較高離子強(qiáng)度的緩沖劑與具有較低離子強(qiáng)度的緩沖劑的組合。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述緩沖組合物選自HEPES緩沖劑、咪唑緩沖劑、PBS緩沖劑、及其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述緩沖劑通過與所述轉(zhuǎn)導(dǎo)物的離子相互作用來介導(dǎo)分析物的相互作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述緩沖組合物通過增強(qiáng)與所述轉(zhuǎn)導(dǎo)物的疏水相互作用來介導(dǎo)分析物的相互作用。轉(zhuǎn)導(dǎo)物可以被分散在水溶液中或涂覆在基底上。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述比色體系還包括探針。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述探針選自纖維蛋白原、鏈霉親和素、IgG、及其組合。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述比色體系還包括表面活性劑。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述表面活性劑包括非離子型表面活性劑。
在示例性實(shí)施方案中，比色體系的轉(zhuǎn)導(dǎo)物是脂質(zhì)體和/或在與緩沖組合物接觸時(shí)表現(xiàn)出顏色變化。
在示例性實(shí)施方案中，所述二乙炔化合物(即用于聚二乙炔材料的原材料)具有下式 其中R1包括C1-C20烷基、 R2包括
其中R3、R8、R13、R21、R24、R31和R33獨(dú)立地為C1-C20烷基；R4、R5、R7、R14、R16、R19、R20、R22、R25和R32獨(dú)立地為C1-C14亞烷基；R6、R15、R18和R26獨(dú)立地為C1-C14亞烷基、C2-C8亞烯基、或C6-C13亞芳基；R9為C1-C14亞烷基或-NR34-；R10、R12、R27和R29獨(dú)立地為C1-C14亞烷基或(C1-C14亞烷基)-(C2-C8亞芳基)；R11和R28獨(dú)立地為C2-C30炔基；R17為酯活化基團(tuán)；R23為C6-C13亞芳基；R30為C1-C14亞烷基或-NR36-；R34和R36為C1-C4烷基；p為1-5(本文中，“二乙炔”用于包括具有二至十個(gè)C-C三鍵的化合物)；n為1-20；其中R1和R2不相同。
在一個(gè)實(shí)施方案中，比色體系的受體包括磷脂，所述磷脂選自磷酸膽堿、磷酸乙醇胺、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、及其組合。
本發(fā)明還提供了用于檢測分析物的方法。所述方法包括形成包括受體和含二乙炔的聚合組合物(即所述聚合組合物源自二乙炔的聚合)的比色傳感器，其中所述受體被摻入到聚合組合物中以形成能夠表現(xiàn)顏色變化的轉(zhuǎn)導(dǎo)物；使傳感器與探針接觸；在緩沖組合物(優(yōu)選包括兩種或多種不同的緩沖劑)存在的情況下，使傳感器與懷疑包含靶分析物的樣品接觸；如果分析物存在，則觀察顏色變化。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于檢測分析物的方法，該方法包括形成包括受體和含二乙炔的聚合組合物的比色傳感器，其中所述受體被摻入到聚合組合物中以形成轉(zhuǎn)導(dǎo)物，該轉(zhuǎn)導(dǎo)物在探針存在時(shí)能夠表現(xiàn)顏色變化；在緩沖組合物(優(yōu)選包括兩種或多種不同的緩沖劑)存在的情況下，使轉(zhuǎn)導(dǎo)物與懷疑包含靶分析物的樣品、和對(duì)靶分析物和受體兩者都具有親和力的探針接觸；如果分析物存在，則基本上觀察不到顏色變化。優(yōu)選地，可以在接觸轉(zhuǎn)導(dǎo)物前，將所述探針和懷疑包括靶分析物的樣品組合以形成混合物。
在示例性實(shí)施方案中，所述分析物選自金黃色葡萄球菌、蛋白A、PBP2′、大腸桿菌(E.coli)、和銅綠假單孢菌(Pseudomonasaeruginosa)。在大多數(shù)實(shí)施方案中，在轉(zhuǎn)導(dǎo)物與分析物接觸60分鐘以內(nèi)，比色體系表現(xiàn)出可觀察到的顏色變化。
定義對(duì)于下面所定義的術(shù)語，除了在權(quán)利要求書和本說明書其它地方有不同的定義，應(yīng)使用這些定義本文中，術(shù)語“烷基”指具有特定碳原子數(shù)的直鏈或支鏈或環(huán)狀的單價(jià)烴基。烷基包括具有一至二十個(gè)碳原子的烷基。本文中“烷基”的例子包括但不限于甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、異丁基和異丙基等。應(yīng)該理解，當(dāng)想要表示環(huán)狀部分時(shí)，在所述烷基中必須存在至少三個(gè)碳原子。這種環(huán)狀部分包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基和環(huán)庚基。
本文中，術(shù)語“亞烷基”指具有特定碳原子數(shù)的直鏈或支鏈或環(huán)狀的二價(jià)烴基。亞烷基包括具有一至十四個(gè)碳原子的亞烷基。本文中“亞烷基”的例子包括但不限于亞甲基、亞乙基、1，3-亞丙基、1，4-亞丁基等。應(yīng)該理解，當(dāng)想要表示環(huán)狀部分時(shí)，在所述亞烷基中必須存在至少三個(gè)碳原子。這種環(huán)狀部分包括環(huán)亞丙基、環(huán)亞丁基、環(huán)亞戊基、環(huán)亞己基和環(huán)亞庚基。
本文中，術(shù)語“亞烯基”指具有特定碳原子數(shù)和一個(gè)或多個(gè)碳-碳雙鍵的直鏈或支鏈或環(huán)狀的二價(jià)烴基。亞烯基包括具有二至八個(gè)碳原子的亞烯基。本文中“亞烯基”的例子包括但不限于1，2-亞乙烯基、1，3-亞丙烯基等。
本文中，術(shù)語“亞芳基”指二價(jià)不飽和芳族羧基，具有單環(huán)的亞芳基為例如亞苯基，或具有多個(gè)稠環(huán)的亞芳基為例如萘或蒽。亞芳基包括具有六至十三個(gè)碳原子的亞芳基。本文中“亞芳基”的例子包括但不限于1，2-亞苯基、1，3-亞苯基、1，4-亞苯基、1，8-亞萘基等。
本文中，術(shù)語“亞烷基-亞芳基”指上述亞芳基部分與上述亞烷基部分鍵合。本文中“亞烷基-亞芳基”的例子包括但不限于-CH2-亞苯基、-CH2CH2-亞苯基、和-CH2CH2CH2-亞苯基。
本文中，術(shù)語“炔基”指具有二至三十個(gè)碳原子和至少一個(gè)碳-碳三鍵的直鏈或支鏈或環(huán)狀的單價(jià)烴基。本文中“炔基”的例子包括但不限于乙炔基、丙炔基和丁炔基。
本文中，術(shù)語“分析物”指能夠通過本發(fā)明的傳感器檢測的任何材料。這種材料包括但不限于小分子、致病和非致病有機(jī)體、毒素、膜受體和片段、揮發(fā)性有機(jī)化合物、酶和酶底物、抗體、抗原、蛋白質(zhì)、肽、核酸、和肽核酸?！鞍蟹治鑫铩敝競鞲衅黧w系檢測的材料目標(biāo)。
本文中，術(shù)語“細(xì)菌”指被認(rèn)為是細(xì)菌的所有微生物形式，包括球菌、桿菌、螺旋菌、原生質(zhì)球狀體(sheroplasts)、原生質(zhì)體等。
本文中，術(shù)語“受體”指對(duì)于靶分析物和/或探針具有親和力的任何分子或分子組裝體。受體包括但不限于天然或合成受體，如脂質(zhì)體、表面膜蛋白、酶、血凝素、抗體、重組蛋白、合成蛋白、核酸、c-糖苷、碳水化合物、神經(jīng)節(jié)苷脂、及鰲合劑。
本文中，術(shù)語“組裝”或“自組裝”指在聚合前二乙炔分子和磷脂的任何自排序。參見J.Israelachvili，分子間的力和表面力(Intermolecular and Surface Forces)(2ndEd.)，Academic Press，New York(1992)，pp.321-427。
本文中，術(shù)語“自組裝單層”(SAM)指通過自發(fā)自排序，在給定基底上形成的任何有序的超薄有機(jī)薄膜。A.Ulman，超薄有機(jī)薄膜入門(An Introduction to Ultrathin Organic Films)，Academic Press，NewYork(1991)，pp.237-301。
本文中，術(shù)語“轉(zhuǎn)導(dǎo)物”指能夠?qū)⒎肿铀降淖R(shí)別事件如共價(jià)鍵合或非共價(jià)相互作用(例如靜電相互作用、極性相互作用、范德華力)轉(zhuǎn)化成可觀察信號(hào)的材料。
“探針”指能夠與靶分析物和/或受體發(fā)生相互作用的成分。因此，探針是一類“可檢測的結(jié)合試劑”，即該試劑能特異性地識(shí)別并與分析物(即靶分析物)和/或受體發(fā)生相互作用或結(jié)合，其中探針的性質(zhì)允許在結(jié)合時(shí)檢測?！疤禺愋韵嗷プ饔谩币馕吨蓹z測的結(jié)合試劑與靶分析物或受體發(fā)生物理相互作用，基本上排除樣品中還存在的其它分析物?？捎糜诒景l(fā)明的可檢測結(jié)合試劑的結(jié)合具有允許測量所述結(jié)合的穩(wěn)定性。
當(dāng)術(shù)語“包括”及其變化在說明書和權(quán)利要求書中出現(xiàn)時(shí)，這些術(shù)語沒有限制意義。
措辭“優(yōu)選的”和“優(yōu)選地”指在某些環(huán)境下，本發(fā)明的實(shí)施方案可能具有某些益處。但是，在相同環(huán)境或其它環(huán)境下，其它實(shí)施方案也可以是優(yōu)選的。此外，列舉一種或多種優(yōu)選實(shí)施方案并非暗示其它實(shí)施方案不可用，并非意欲將其它實(shí)施方案排除在本發(fā)明的范圍以外。
本文中，“一個(gè)”、“所述”、“至少一個(gè)”和“一種或多種”是互換使用的。
本文中所有的數(shù)值被認(rèn)為可由術(shù)語“約”修飾。通過端點(diǎn)表示的數(shù)值范圍包括此范圍內(nèi)的所有數(shù)值(例如1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4和5)。
上面的發(fā)明概述并非意欲描述本發(fā)明公開的每個(gè)實(shí)施方案或的每個(gè)實(shí)施。下面的描述更具體地示范了說明性實(shí)施方案。在本申請(qǐng)的幾個(gè)地方，通過列舉實(shí)施例提供了指導(dǎo)，這些例子能夠用于各種組合。在每種情況中，所引用的列舉僅僅作為代表組，不應(yīng)認(rèn)為是排它性列舉。
附圖簡述

圖1顯示了本發(fā)明的比色傳感器的示意圖。
圖2顯示了本發(fā)明的比色傳感器陣列的示意圖。
具體實(shí)施方案本發(fā)明提供了用于檢測分析物的比色傳感器體系。所述比色體系包括包括受體和聚合二乙炔材料(聚二乙炔組裝體，它指可以(但不必須)包括其它成分的有組織聚二乙炔結(jié)構(gòu))的比色傳感器，其中所述受體被摻入到聚二乙炔中以形成轉(zhuǎn)導(dǎo)物，該轉(zhuǎn)導(dǎo)物在與探針和/或分析物結(jié)合時(shí)能提供顏色變化。所述比色傳感器能夠在溶液中起作用或涂覆在基底上。
聚二乙炔組裝體本發(fā)明的二乙炔化合物能夠在溶液中自組裝以形成有序的組裝體，所述組裝體能夠使用任何光化學(xué)輻射，如在UV或可見光范圍內(nèi)的電磁譜中的電磁輻射，以聚合該組裝體。所述二乙炔化合物的聚合產(chǎn)生聚合反應(yīng)產(chǎn)物，該產(chǎn)物在小于570納米(nm)、570nm至600nm(包括端點(diǎn))、或大于600nm的可見光譜中具有顏色，這取決于它們的構(gòu)象和所面臨的外部因素。通常，本文公開的二乙炔化合物的聚合導(dǎo)致包括聚二乙炔骨架的亞穩(wěn)定藍(lán)相聚合物網(wǎng)絡(luò)。舉例而言，在經(jīng)受外部因素如加熱、溶劑或相反電荷的變化、或者如果有物理壓力時(shí)，這些亞穩(wěn)定的藍(lán)相聚合物網(wǎng)絡(luò)發(fā)生從藍(lán)到紅-橙色的顏色變化。
本文公開的二乙炔化合物及其聚合產(chǎn)物能夠在暴露于物理壓力時(shí)經(jīng)歷可見的顏色變化的能力，使得它們成為制造傳感裝置來檢測分析物的候選物。由所公開的二乙炔化合物形成的聚二乙炔組裝體能夠在生物傳感應(yīng)用中作為轉(zhuǎn)導(dǎo)物起作用。
對(duì)于給定的傳感應(yīng)用，二乙炔分子的結(jié)構(gòu)要求典型地是應(yīng)用特異性的。特征如總鏈長、溶解性、極性、結(jié)晶性、和用于進(jìn)一步修飾分子而存在的官能團(tuán)一起，共同確定二乙炔分子作為有用的傳感材料的能力。例如，在生物檢測水性介質(zhì)中的分析物的情況下，二乙炔化合物的結(jié)構(gòu)應(yīng)該能夠在水中形成穩(wěn)定的分散體，有效地聚合成有色的材料，能夠摻入恰當(dāng)?shù)氖荏w化學(xué)物質(zhì)以結(jié)合分析物，并能夠通過顏色變化轉(zhuǎn)導(dǎo)所述的結(jié)合相互作用。這些能力取決于二乙炔化合物的結(jié)構(gòu)特征。
本發(fā)明的二乙炔化合物具有上述能力，易于有效地聚合成聚二乙炔組裝體，從而發(fā)生所需的顏色變化。而且，所述二乙炔化合物允許摻入大大過量的不可聚合的材料，如下述受體，同時(shí)仍然形成穩(wěn)定可聚合的溶液。
能夠以快速高收率的方式，包括高產(chǎn)量的合成方法，合成所公開的二乙炔化合物(原材料)。二乙炔化合物(原材料)骨架中存在官能度如雜原子，這樣能夠?yàn)闈M足給定傳感應(yīng)用的要求而進(jìn)行容易的結(jié)構(gòu)加工。通過將二乙炔添加到合適的溶劑如水中，將混合物超聲，然后用波長通常為254nm的紫外光照射所述溶液，能夠?qū)⒍胰不衔锞酆铣砂杈鄱胰补羌艿木W(wǎng)絡(luò)。在聚合后，所述溶液的顏色變成藍(lán)紫色。
可用于本發(fā)明的二乙炔(原材料)典型包含至少為8的平均碳鏈長度，具有至少一個(gè)官能團(tuán)如羧基、伯胺基或叔胺基、羧基的甲酯等。合適的二乙炔包括美國專利5,491,097(Ribi等人)、PCT公開WO02/00920、美國專利6,306,598、和PCT公開WO 01/71317中所述的那些。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚二乙炔組裝體包括由下式二乙炔獲得的聚合化合物 其中R1為烷基、 R2為
R3、R8、R13、R21、R24、R31和R33獨(dú)立地為烷基；R4、R5、R7、R14、R16、R19、R20、R22、R25和R32獨(dú)立地為亞烷基；R6、R15、R18和R26獨(dú)立地為亞烷基、亞烯基、或亞芳基；R9為亞烷基或-NR34-；R10、R12、R27和R29獨(dú)立地為亞烷基或亞烷基-亞芳基；R11和R28獨(dú)立地為炔基；R17為酯活化基團(tuán)；R23為亞芳基；R30為亞烷基或-NR36-；R34和R36獨(dú)立地為H或C1-C4烷基；p為1-5；n為1-20；其中R1和R2不相同。
示例性化合物還描述于美國公開2005/0101794-A1以及美國公開2004/0126897-A1和2004/0132217-A1中。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，R1為 其中R7為亞乙基、1，3-亞丙基、1，4-亞丁基、1，5-亞戊基、1，6-亞己基、1，7-亞庚基、1，8-亞辛基、或1，9-亞壬基，R6為亞乙基、1，3-亞丙基、亞乙烯基、或亞苯基；和其中R2為 其中R20為亞乙基、1，3-亞丙基、1，4-亞丁基、1，5-亞戊基、1，6-亞己基、1，7-亞庚基、1，8-亞辛基、或1，9-亞壬基，其中R21為十一烷基、十三烷基、十五烷基、十七烷基；和其中p為1。
本發(fā)明包括本文所述的化合物，包括異構(gòu)體如結(jié)構(gòu)異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體、鹽、溶劑化物、多晶型物等。
式XXIII的二乙炔能夠按照流程1所示制備，其中n典型地為1至4，m典型為10至14。
流程1在合適的溶劑如DMF中，通過與合適的氧化劑反應(yīng)，可經(jīng)過氧化由式XXII的化合物制備式XXIII的化合物。合適的氧化劑包括例如瓊斯試劑和重鉻酸吡啶鹽。前述反應(yīng)典型在0℃至40℃、通常為0℃至25℃進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為1小時(shí)至48小時(shí)，通常為8小時(shí)。
通過與合適的?；确磻?yīng)，可由式XXI的化合物制備式XXII的化合物。合適的酰基氯包括可提供所需產(chǎn)物的任何?；?，如月桂酰氯、1-十二烷酰氯、1-十四烷酰氯、1-十六烷酰氯和1-十八烷酰氯。合適的溶劑例如包括醚、四氫呋喃、二氯甲烷、和氯仿。前述反應(yīng)典型地在堿如三烷基胺或吡啶堿的存在下，在0℃至40℃、通常為0℃至25℃的溫度下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為1小時(shí)至24小時(shí)，通常為3小時(shí)。
式XXI的化合物可以是購買的(例如當(dāng)n為1-4)，或者按照例如流程1所示和Abrams，Suzanne R.；Shaw，Angela C.“三鍵異構(gòu)化2-至9-癸炔-1-醇”(Triple-bond isomerizations2-to 9-decyn-l-ol)，Org.Synth.(1988)，66，127-31和Brandsma，L.制備性炔化學(xué)”(PreparativeAcetylenic Chemistry)(Elsevier Pub.Co.，New York，1971)所公開的，通過化合物XIX和XX，從式XVIII的化合物制備。
也可以在合適的溶劑如甲苯存在的情況下，通過式XXII的化合物與酸酐如琥珀酸酐、戊二酸酐或鄰苯二甲酸酐反應(yīng)來制備本文公開的二乙炔化合物。前述反應(yīng)典型地在50℃至125℃、通常為100℃至125℃的溫度下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為1小時(shí)至24小時(shí)，通常為15小時(shí)。
包括聚合二乙炔的比色傳感器能夠作為比色檢測分子識(shí)別事件的基礎(chǔ)。通過在聚合前或聚合后，將受體添加到二乙炔單體中，能夠制備所述傳感器。受體能夠通過各種方式，包括物理混合、共價(jià)鍵合、和非共價(jià)相互作用(例如靜電相互作用、極性相互作用等)，將聚二乙炔組裝體功能化。
在聚合時(shí)或聚合后，受體被有效地?fù)饺刖酆衔锞W(wǎng)絡(luò)，從而由于共軛烯-炔聚合物骨架的動(dòng)搖，使受體與分析物相互作用，導(dǎo)致可見的顏色變化。
受體與聚二乙炔組裝體的摻合所提供的結(jié)構(gòu)形狀能夠變形以響應(yīng)與探針和/或分析物的相互作用或結(jié)合。特別有用的受體是具有典型桿狀分子構(gòu)造的兩性分子組裝體，可通過定義為v/(a0lc)的包裝參數(shù)來描述其特征(Israelachvili，J.N.等人，Q.Rev.Biophys.；13，121，1980)其中v是分子的烴成分(例如磷脂或脂肪酸的烴鏈)所占的體積，a0為極性首基(例如磷脂的磷酸鹽首基或脂肪酸的羧酸首基)所占的有效面積，lc是所謂臨界長度，它通常描述分子在其環(huán)境溫度下的長度。對(duì)于受體，優(yōu)選兩性分子的包裝參數(shù)v/(a0lc)值為1/3至1。
有用的受體例子包括但不限于脂質(zhì)、表面膜蛋白、酶、血凝素、抗體、重組蛋白、合成蛋白、核酸、c-糖苷、碳水化合物、神經(jīng)節(jié)苷脂、及鰲合劑。在大多數(shù)實(shí)施方案中，受體是磷脂。合適的磷脂包括磷酸膽堿(例如1，2-二肉豆蔻?；?sn-甘油酰-3-磷酸膽堿)、磷酸乙醇胺、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、和磷脂酰甘油，如Silver，Brian L.，膜物理化學(xué)(The Physical Chemistry of Membranes)，第1章，pp 1-24(1985)中所述的那些。
在一個(gè)實(shí)施方案中，受體物理混合并分散在聚二乙炔中，以形成結(jié)構(gòu)，其中所述結(jié)構(gòu)本身對(duì)所關(guān)注的探針和/或分析物具有結(jié)合親和力。所述結(jié)構(gòu)包括但不限于脂質(zhì)體、膠束、和薄片。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述結(jié)構(gòu)為脂質(zhì)體。盡管不受理論的約束，但相信當(dāng)聚二乙炔組裝體將脂質(zhì)體發(fā)生的物理化學(xué)變化翻譯為可見顏色變化時(shí)，磷脂可模擬細(xì)胞膜。所制備的脂質(zhì)體具有充分限定的形態(tài)學(xué)、大小分布、和其它物理性質(zhì)如充分限定的表面電位。
脂質(zhì)體中受體與二乙炔化合物(原材料)的比率能夠基于材料的選擇和所需的比色響應(yīng)而變化。在大多數(shù)實(shí)施方案中，磷脂與二乙炔化合物(原材料)的比率將為至少25∶75，更優(yōu)選至少40∶60。在優(yōu)選實(shí)施方案中，脂質(zhì)體由二乙炔化合物HO(O)C(CH2)2C(O)O(CH2)4C≡C-C≡C(CH2)4O(O)C(CH2)12CH3[琥珀酸單-(12-四癸酰氧基-十二-5，7-二炔基)酯]、和兩性離子的磷脂1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油酰-3-磷酸膽堿[DMPC]以6∶4的比率混合組成。
在本文中，對(duì)PDA體系的討論涉及脂質(zhì)體在受體組裝體中的用途；然而，該討論也應(yīng)用于其它受體組裝體，包括例如其它平面構(gòu)造。
通過將懸浮在緩沖溶液中的材料混合物進(jìn)行探針超聲來制備脂質(zhì)體，該緩沖溶液被稱為制備緩沖劑。例如，制備緩沖劑可能是低離子強(qiáng)度(5mM)的N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸[HEPES]緩沖劑(pH＝7.2)。另一個(gè)有用的制備緩沖劑是低離子強(qiáng)度(2mM)的三羥甲基氨基乙烷[TRIS]緩沖劑(pH＝8.5)。
設(shè)計(jì)本發(fā)明的比色體系以開發(fā)出如下途徑，即探針能夠與包含受體如磷脂、和聚合二乙炔兩者的脂質(zhì)體相互作用。脂質(zhì)體能夠用作與探針如蛋白質(zhì)相互作用的生物膜模型，如Oellerich，S.等人；J.Phys.Chem B；2004，108，3871-3878；和Zuckermann，M.J.；Heimburg T.；Biophysi.J.；2001，81，2458-2472中所述。通常，在脂質(zhì)體與蛋白質(zhì)的高濃度比率下，蛋白質(zhì)將主要通過靜電相互作用吸附至脂質(zhì)體表面。
隨著蛋白質(zhì)濃度增加，脂質(zhì)體與蛋白質(zhì)濃度比率降低，蛋白質(zhì)繼續(xù)靜電吸附至脂質(zhì)體表面，直至蛋白質(zhì)完全飽和或包裹住脂質(zhì)體。在這個(gè)過程進(jìn)行時(shí)，脂質(zhì)體和蛋白質(zhì)兩者都能夠發(fā)生形態(tài)學(xué)和構(gòu)象變化，直至覆蓋脂質(zhì)體表面的蛋白質(zhì)疏水片段能夠開始與脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的疏水內(nèi)部發(fā)生相互作用。此時(shí)，蛋白質(zhì)能夠變得疏水結(jié)合并滲透脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的基本形態(tài)學(xué)變化，同時(shí)脂質(zhì)體的尺寸和滲透性發(fā)生急劇改變。最終，蛋白質(zhì)層能夠?qū)е聯(lián)p失懸浮穩(wěn)定性、絮凝、和最終沉淀。
這些靜電相互作用的存在不僅高度依賴于存在的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)體類型，而且還高度依賴于它們的環(huán)境。盡管不希望受理論的約束，但相信給定緩沖體系的離子強(qiáng)度將有助于建立脂質(zhì)體和帶電蛋白質(zhì)兩者的表面電位，從而使它們能夠發(fā)生顯著的靜電相互作用。
例如，在具有低離子強(qiáng)度(2-5mM)的中性pH緩沖體系中(例如HEPES、TRIS)，帶電探針能夠靜電吸附至聚二乙炔脂質(zhì)體。盡管起始吸附可能不是本身引發(fā)脂質(zhì)體尺寸和形態(tài)學(xué)的基本變化，并因此引發(fā)最初很小或可忽略的比色響應(yīng)，但如果探針相對(duì)于脂質(zhì)體過量存在，則可能探針最終將與脂質(zhì)體疏水結(jié)合并滲透到其膜結(jié)構(gòu)的內(nèi)部。此時(shí)，期望通過將探針摻入脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)所提供的巨大機(jī)械壓力會(huì)顯著改變聚二乙炔構(gòu)象，從而導(dǎo)致易于觀察的伴隨比色響應(yīng)。
或者，如果探針在中性pH中帶負(fù)電荷，則它與聚二乙炔脂質(zhì)體靜電相互作用的能力會(huì)嚴(yán)重受阻，由于探針和包含受體的聚二乙炔脂質(zhì)體的疏水相互作用而引起比色響應(yīng)的能力可能受到損害。在這種情況下，在中性pH(例如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、咪唑緩沖劑)下使用高離子強(qiáng)度的緩沖劑(＞100mM)，將提供減少脂質(zhì)體的表面電位(通過屏蔽脂質(zhì)體的表面電荷)、促進(jìn)未帶電探針與脂質(zhì)體的直接疏水相互作用、并導(dǎo)致將該蛋白質(zhì)摻入脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)中的手段。因此，在這種情況下，緩沖體系協(xié)助發(fā)生充分的比色響應(yīng)，否則將不能發(fā)生這種響應(yīng)。盡管緩沖劑具有較高的離子強(qiáng)度，但由于其對(duì)脂質(zhì)體表面電位的影響，在不存在探針的情況下，它也能夠引導(dǎo)明顯的比色響應(yīng)，已經(jīng)確定當(dāng)探針存在時(shí)，由于蛋白質(zhì)-脂質(zhì)體的疏水相互作用，比色響應(yīng)明顯增加。這個(gè)結(jié)果具有非常有用的實(shí)踐效果能夠明顯縮短給定檢測限內(nèi)的檢測時(shí)間，或者相反，對(duì)于給定的檢測時(shí)間，能夠明顯降低檢測限。
基于這種現(xiàn)象，能夠基于其與給定分析物靶和聚二乙炔脂質(zhì)體兩者發(fā)生特異性相互作用以引發(fā)比色響應(yīng)的能力來選擇探針。在直接分析的那些情況下，包含聚二乙炔的脂質(zhì)體的比色響應(yīng)與探針的濃度或探針-分析物絡(luò)合物的濃度直接成比例。
對(duì)于給定的應(yīng)用，探針的選擇將部分取決于探針的尺寸、形狀、電荷、疏水性、和與分子的親和力。探針可以是帶正電的、帶負(fù)電的、或根據(jù)環(huán)境的pH是兩性的。在低于探針等電點(diǎn)的pH時(shí)，探針帶正電，高于該點(diǎn)時(shí)它帶負(fù)電。用于本文時(shí)，術(shù)語“等電點(diǎn)”指探針凈電荷為零時(shí)的pH。
為了用聚二乙炔/磷脂體系設(shè)計(jì)生化測定，已知受體(或探針)的等電點(diǎn)將影響緩沖劑組合的選擇。具有較低等電點(diǎn)的探針可能需要較高離子強(qiáng)度的緩沖劑來獲得脂質(zhì)體形態(tài)學(xué)的變化。較高等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)能夠用于低離子強(qiáng)度的緩沖劑如HEPES緩沖劑以產(chǎn)生顏色變化。
在這種常規(guī)機(jī)理下，重要的是限定檢測分析不僅要考慮聚二乙炔脂質(zhì)體組成(例如選擇所使用的磷脂和磷脂與二乙炔的比率)、及所使用的探針(例如多粘菌素、纖維蛋白原、抗體)，還要考慮緩沖體系的選擇所確定的水性環(huán)境。
本發(fā)明的緩沖組合物所提供的體系能夠抵抗其它成分存在時(shí)的pH變化，該組合物由共軛的酸-堿對(duì)組成，其中質(zhì)子接受體與質(zhì)子供體的比率接近一致。而且，本發(fā)明的緩沖體系能介導(dǎo)分析物與比色傳感器成分之間的物理或化學(xué)相互作用。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖組合物抑制分析物與受體的相互作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖組合物促進(jìn)分析物與受體的相互作用。特別有用的緩沖組合物包括HEPES緩沖劑、咪唑緩沖劑、和PBS緩沖劑。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)于給定的應(yīng)用，基于對(duì)探針和/或要檢測的靶分析物的選擇，使用緩沖劑的組合(即不同緩沖劑)來調(diào)整適當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度。
將兩種或多種不同緩沖劑組合是調(diào)適緩沖體系的物理性質(zhì)的方便手段，從而獲得脂質(zhì)體-蛋白質(zhì)探針相互作用中靜電組分和疏水組分的適當(dāng)平衡。
例如，在僅包含HEPES緩沖劑的體系中，其pH為7.2，多粘菌素(其等電點(diǎn)為7.7)具有正電荷，易于粘著至磷脂的負(fù)電荷極性首基，能夠誘導(dǎo)比色傳感器顏色從藍(lán)變?yōu)榧t。纖維蛋白原的等電點(diǎn)是5.3，在相同的HEPES緩沖組合物中帶負(fù)電，這阻止了與磷脂極性首基的吸附或任何靜電相互作用。
或者，在具有較高離子強(qiáng)度的緩沖劑如咪唑或PBS存在的情況下，離子強(qiáng)度可改變脂質(zhì)體(或其它轉(zhuǎn)導(dǎo)物結(jié)構(gòu))的形態(tài)學(xué)，以暴露疏水部分。在包含較高離子強(qiáng)度緩沖組合物的比色體系中，纖維蛋白原結(jié)構(gòu)中包含疏水部分，該部分可與磷脂發(fā)生相互作用以引起顏色變化。
在脂質(zhì)體-蛋白質(zhì)相互作用中，一種獲得靜電組分和疏水組分的最佳平衡的方便方法是使用兩種或多種不同緩沖劑的混合物。例如，將低離子強(qiáng)度的有機(jī)緩沖劑(HEPES、Tris)與具有不同離子強(qiáng)度的無機(jī)緩沖劑(PBS)混合，這樣可超越由單一緩沖劑提供的緩沖劑性質(zhì)范圍。因此，能夠?qū)⒒旌暇彌_體系設(shè)計(jì)成提供最優(yōu)化的脂質(zhì)體-蛋白質(zhì)相互作用。
混合緩沖體系還將提供調(diào)適方式，來調(diào)節(jié)緩沖體系相對(duì)于無相互作用緩沖劑，作為相互作用緩沖劑的程度。例如，能夠用無相互作用的緩沖劑(HEPES)“稀釋”相互作用的緩沖劑(PBS、咪唑)，以調(diào)適其對(duì)脂質(zhì)體形態(tài)學(xué)的影響。當(dāng)然，通過使用混合緩沖體系也能獲得相反的效果(無相互作用緩沖劑變得更具相互作用性)。
最后，通過類似的手段，能夠?qū)⒈砻婊钚詣┙M分引入緩沖組合物中，來幫助探針與比色傳感器的疏水相互作用。在本發(fā)明中特別有用的表面活性劑包括非離子型表面活性劑。聚烷氧基化、尤其是聚乙氧基化的非離子型表面活性劑能夠在溶液中良好穩(wěn)定本發(fā)明的組分。
可能有用的非離子型表面活性劑包括1.聚氧化乙烯延伸的山梨聚糖單烷基酯(即聚山梨醇酯類)。尤其是，作為NIKKOL TL-10出售的聚山梨醇酯20(來自Barret Products)是非常有效的。
2.聚烷氧基化的烷醇。已經(jīng)證明表面活性劑如來自ICI SpecialtyChemicals，Wilmington，DE、以商品名BRIJ出售、HLB為至少約14的那些表面活性劑是有用的。尤其是，已經(jīng)證明BRIJ 78和BRIJ 700是非常有用的，它們分別是分別具有20和100摩爾聚氧化乙烯的硬脂醇乙氧化物。還有用的是ceteareth 55，它來自BASF Corp.，PerformanceChemicals Div.，Mt.Olive，NJ，以商品名PLURAFAC A-39出售。
3.聚烷氧基化的烷基酚。這類有用的表面活性劑包括聚乙氧基化的辛基或壬基酚，其HLB值為至少約14，分別來自BASF Corp.，Performance Chemicals Div.，Mt.Olive，NJ和Union Carbide Corp.，Danbury，CT，以商品名ICONOL和TRITON出售。例子包括TRITONX100(包含15摩爾氧化乙烯的辛基酚，來自Union Carbide Corp.，Danbury，CT)以及ICONOL NP70和NP40(分別包含40和70摩爾氧化乙烯單位的壬基酚，來自BASF Corp.，Performance Chemicals Div.，Mt.Olive，NJ)。這些表面活性劑的硫酸化和磷酸化衍生物也是有用的。這些衍生物的例子包括壬苯醇醚-4-硫酸銨，它來自Rhodia，Dayton，NJ，以商品名RHODAPEX CO-436出售。
4.泊洛沙姆。已經(jīng)顯示基于氧化乙烯(EO)和氧化丙烯(PO)嵌段共聚物的表面活性劑可有效地穩(wěn)定本發(fā)明的成膜聚合物并提供良好的潤濕。預(yù)期EO-PO-EO嵌段和PO-EO-PO嵌段兩者都運(yùn)用良好，只要HLB為至少約14，優(yōu)選至少約16。這些表面活性劑以商品名PLURONIC和TETRONIC出售，來自BASF Corp.，Performance Chemicals Div.，Mt.Olive，NJ。要注意，來自BASF的PLURONIC表面活性劑的報(bào)告HLB值是按照與上述不同的方式計(jì)算的。在這種情況下，應(yīng)使用由BASF報(bào)告的HLB值。例如，優(yōu)選的PLURONIC表面活性劑為L-64和F-127，其HLB分別為15和22。盡管PLURONIC表面活性劑在穩(wěn)定本發(fā)明組合物方面特別有效，并且在碘作為活性劑時(shí)特別有效，但它們可能減少使用聚維酮-碘作為活性劑的組合物的抗菌活性。
5.聚烷氧基化的酯。聚烷氧基化的二醇如乙二醇、丙二醇、甘油等可以被部分或完全酯化，即可以用(C8-C22)烷基羧酸將一個(gè)或多個(gè)醇酯化。這些聚乙氧基化的酯的HLB為至少約14，優(yōu)選至少約16，它們適用于本發(fā)明的組合物。
烷基聚糖苷。烷基聚糖苷如美國專利5,951,993(Scholz等人)從第9欄第44行開始描述的那些與本發(fā)明的成膜聚合物相容，有助于聚合物穩(wěn)定性。例子包括glucopon 425，其(C8-C16)烷基鏈長，平均鏈長為10.3個(gè)碳和1-4個(gè)葡萄糖單位。
最終，基于本發(fā)明比色材料的檢測體系取決于下列因素中的一種或多種二乙炔化合物的分子構(gòu)造；使用的受體部分的類型；脂質(zhì)體的形態(tài)學(xué)(尺寸和結(jié)構(gòu))或二乙炔和受體分子的其它潛在聚集結(jié)構(gòu)；所用的蛋白質(zhì)探針；和用于運(yùn)行測定的緩沖體系。
檢測方法本發(fā)明提供了用于分析分析物的方法，該方法包括將上述比色傳感器與溶液樣品或包含分析物的表面接觸，利用吸光度測量或用裸眼視覺觀察來檢測比色傳感器的顏色變化。
在替代實(shí)施方案中，本發(fā)明通過選擇對(duì)摻入聚乙二炔組裝體的受體和分析物兩者具有親和力的探針，提供用于間接檢測分析物的方法。所選擇的探針將顯示與分析物的競爭親和力。當(dāng)相關(guān)的分析物存在時(shí)，探針將與分析物而不是與聚乙二炔骨架上的受體結(jié)合，從而導(dǎo)致與分析物濃度成反比的顏色變化。如果分析物不存在，則探針將與摻入聚乙二炔骨架的受體結(jié)合，從而導(dǎo)致顏色從藍(lán)變?yōu)榧t。探針能夠在分析物接觸傳感器后接觸傳感器，或者能夠在混合物接觸傳感器之前與分析物混合。
在相反的檢測測定中，使探針和靶分析物在緩沖劑中發(fā)生相互作用，隨后使該緩沖溶液與傳感器接觸。緩沖劑中游離探針的濃度取決于所存在的靶分析物數(shù)量分析物濃度越高，剩余探針的濃度越低。由于傳感器的比色響應(yīng)與可利用的游離探針量成比例，所以比色響應(yīng)與分析物濃度成反比。
在一些情況下，探針能夠與分析物形成絡(luò)合物，該絡(luò)合物與傳感器直接發(fā)生相互作用，從而獲得直接測定，其中比色響應(yīng)與分析物濃度直接成比例。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括在緩沖組合物中提供包括分析物的測試樣品；在緩沖組合物中提供探針；將測試樣品與探針組合，其中探針對(duì)分析物的親和力高于對(duì)受體的親和力；以及用生物傳感器檢測變化。
還重要的是認(rèn)識(shí)到在一些分析中，通過將靶分析物分段或以其它方式裂解，可原位產(chǎn)生探針，如下面的進(jìn)一步討論。探針還可能被認(rèn)為是存在于有機(jī)體細(xì)胞壁外的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段，它們可用于與傳感器發(fā)生直接相互作用。探針和分析物之間的相互作用能夠用于排除與脂質(zhì)體的相互作用?；蛘咛结樋梢耘c分析物發(fā)生相互作用，以形成絡(luò)合物，使所得絡(luò)合物與脂質(zhì)體發(fā)生相互作用。
探針能夠與傳感器在溶液中接觸，或者被涂覆在基底上。探針將是與靶分析物和受體兩者都具有親和力的任何分子。用于本發(fā)明的可能探針包括膜中斷肽如丙甲菌素、蛙皮素、短桿菌肽、硫酸多粘菌素B、和蜂毒素；纖維蛋白原；鏈霉親和素；抗體；血凝素；及其組合。
在一些實(shí)施方案中，使用抗體作探針。“抗體”指免疫球蛋白，其能夠特異性結(jié)合至包括其抗原結(jié)合片段的給定抗原。術(shù)語“抗體”用于包括任何同種型(IgG、IgA、IgM、IgE等)的完整抗體，及其也可以與脊椎動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的片段?？梢允褂贸Ｒ?guī)技術(shù)將抗體分段，將片段篩選以按照與完整抗體相同的方式利用。因此，該術(shù)語包括抗體分子的蛋白水解裂解或重組制備部分的片段，它們能夠選擇性地與某些蛋白質(zhì)反應(yīng)。這些蛋白水解和/或重組片段的非限制性例子包括F(ab′)、F(ab)2、Fv、和包含被肽接頭結(jié)合的VL和/或VH區(qū)域的單鏈抗體(scFv)。scFv能夠共價(jià)或非共價(jià)連接以形成具有兩個(gè)或多個(gè)結(jié)合位置的抗體。能夠用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何可檢測部分標(biāo)記抗體。
各種抗體在本領(lǐng)域中是已知的。例如金黃色葡萄球菌抗體可從Sigma和Accurate Chemical購得。所用的抗體濃度優(yōu)選為至少2納克/毫升(ng/ml)?？贵w濃度通常為至少100ng/ml。例如，可能使用100微克/ml的濃度。通常使用不超過約500微克/ml的濃度。
在其它實(shí)施方案中，使用纖維蛋白原作為探針。不受理論的約束，相信分析物上面/內(nèi)部表達(dá)或存在的纖維蛋白原結(jié)合蛋白會(huì)與纖維蛋白原反應(yīng)。例如，金黃色葡萄球菌可表達(dá)通常被稱為聚集因子的纖維蛋白原結(jié)合蛋白質(zhì)，該聚集因子在與纖維蛋白原接觸時(shí)會(huì)發(fā)生反應(yīng)。
產(chǎn)生該反應(yīng)的纖維蛋白原濃度典型地為至少0.0001wt-％，通常不超過5wt-％。人血漿和動(dòng)物(例如兔)血漿是合適的含纖維蛋白原介質(zhì)。市售的血漿產(chǎn)品通常包括抗凝結(jié)劑如EDTA、檸檬酸鹽、肝素等。源自人的纖維蛋白原可從Sigma Aldrich，St.Louis，MO購得。
使用間接檢測方法，基于所用的探針濃度，提供低檢測水平的高靈敏度是可能的。為進(jìn)行檢測，可選擇探針濃度以對(duì)應(yīng)檢測所需的濃度水平。對(duì)于特定應(yīng)用中所需的靈敏度，使用探針的間接檢測方法將圍繞探針類型和濃度設(shè)計(jì)體系。這使得轉(zhuǎn)導(dǎo)物可通用于多種相關(guān)分析物。例如，根據(jù)探針對(duì)分析物的親和力改變探針與轉(zhuǎn)導(dǎo)物的接觸，單一轉(zhuǎn)導(dǎo)物(聚二乙炔/受體組合)可用于檢測多個(gè)分析物。
特別關(guān)注的檢測分析物是微生物(即微小生物)如革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、原生動(dòng)物、支原體、酵母、病毒、和甚至脂質(zhì)包封的病毒。特別相關(guān)的有機(jī)體包括腸桿菌(Enterobacteriaceae)科成員，或者葡萄球菌屬(Staphylococcus spp.)、鏈球菌屬(Streptococcus spp.)、假單孢菌屬(Pseudomonas spp.)、腸球菌屬(Enterococcus spp.)、埃希菌屬(Esherichia spp.)、桿菌屬(Bacillus spp.)、利斯特菌屬(Listeria spp.)、弧菌屬(Vibrio spp.)、以及肝炎病毒、曲霉菌屬(Aspergillus spp.)、鐮刀菌屬(Fusarium spp.)、和假絲酵母屬(Candida spp.)。特別劇毒的有機(jī)體包括金黃色葡萄球菌(包括耐藥菌株如耐甲烯土霉素的金黃色葡萄球菌(MRSA))、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)、無乳鏈球菌(S.agalatiae)、化膿性鏈球菌(S.pyogenes)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、耐受萬古霉素的腸球菌(VancomycinResistant Enterococcus，VRE)、耐受萬古霉素的金黃色葡萄球菌(Vancomycin Resistant Staphyulococcus aureus，VRSA)、萬古霉素中介度耐受金黃色葡萄球菌(Vancomycin intermediate Staphyulococcus aureus，VISA)、碳疽桿菌(Bacillus anthracis)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、大腸埃希菌(Escherichia coli)、黑曲霉(Aspergillus niger)、煙熏曲霉(A.fumigatus)、棒曲霉(A clavatus)、腐皮鐮刀霉(Fusariumsolani)、尖鐮孢霉(F.oxysporum)、厚垣鐮孢(F.chlamydosporum)、單核細(xì)胞增生性李斯物菌(Listeria monocytogenes)、霍亂弧菌(Vibriocholera)、副溶血性弧菌(V.parahemolyticus)、豬霍亂沙門氏菌(Salmonella cholerasuis)、傷寒沙門氏菌(S.typhi)、鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)、白色念珠菌(Candida albicans)、光滑念珠菌(C.glabrata)、克柔念珠菌(C.krusei)、和耐受多種藥物的革蘭氏陰性桿菌(MDR)。
特別關(guān)注的是革蘭氏陽性菌，如金黃色葡萄球菌。通常，通過檢測細(xì)菌的特征性細(xì)胞壁成分如細(xì)胞壁蛋白質(zhì)的存在，可檢測這些微生物。而且，特別關(guān)注的是耐受抗生素的微生物，包括MRSA、VRSA、VISA、VRE、和MDR。通常，通過額外檢測內(nèi)部細(xì)胞組分如膜蛋白的存在，可檢測這些微生物。
能夠在測試樣品中分析這些微生物或其它相關(guān)的種類，測試樣品可源自任何來源，例如生理液體如血液、唾液、眼晶體液、滑膜液體、腦脊液、膿液、汗液、排泄物、尿液、粘液、乳汁等。而且，測試樣品可以源自身體部位，例如創(chuàng)傷、皮膚、鼻孔、頭皮、指甲等。在用于本文時(shí)，“測試樣品”指包含靶分析物的樣品。優(yōu)選地，樣品為液體或氣體，更優(yōu)選液體。
本領(lǐng)域描述了用于檢測金黃色葡萄球菌的各種患者采樣技術(shù)。這些采樣技術(shù)也適用于本發(fā)明的方法。通過擦拭患者的鼻孔來獲得樣品很常見。特別優(yōu)選的采樣技術(shù)包括用無菌人造纖維拭子擦拭對(duì)象(如患者)的前鼻孔。一個(gè)拭子可用于采集一個(gè)對(duì)象的樣品，即一個(gè)藥簽用于兩個(gè)鼻孔。通過將干燥或預(yù)先用合適溶液潤濕的拭子(購自Puritan，EastGrinstead，UK，商品名為“Pure-Wraps”)插入對(duì)象鼻孔的前頂端，將拭子沿著鼻孔粘膜表面完整地旋轉(zhuǎn)兩周，來進(jìn)行采樣。然后將藥簽直接培育，或者用合適的溶液提取，該溶液典型地包括任選地組合有緩沖劑和至少一種表面活性劑的水。
除了生理液體外，其它測試樣品可以包括其它液體以及溶于液體介質(zhì)中的固體。關(guān)注的樣品可以包括工藝物料流、水、土壤、種植物或其它植物、空氣、表面(例如被污染的表面)等。
可以對(duì)測試樣品(例如液體)進(jìn)行預(yù)處理，例如稀釋粘性液體。在注入樣品口前，可以對(duì)測試樣品(例如液體)進(jìn)行其它的處理方法，例如濃縮(通過過濾、蒸餾、透析等)、稀釋、過濾、天然組分的失活、添加試劑、化學(xué)處理等。
可增強(qiáng)靶分析物檢測信號(hào)的一種處理方法涉及將細(xì)胞裂解以形成細(xì)胞壁片段，然后分析該細(xì)胞壁片段，如美國專利公開2005/0153370中所述。尤其是，這些方法可用于檢測微生物、尤其是金黃色葡萄球菌特征性細(xì)胞壁的一種或多種組分。該方法包括提供包括未培養(yǎng)細(xì)胞的測試樣品；將未培養(yǎng)細(xì)胞裂解以形成包括細(xì)胞壁片段的裂解產(chǎn)物；分析細(xì)胞壁片段的分析物特征性細(xì)胞壁組分；其中相對(duì)于未裂解細(xì)胞中的相同組分，分析物特征性的細(xì)胞壁組分可增強(qiáng)信號(hào)。
細(xì)胞壁組分包括例如細(xì)胞壁蛋白如蛋白A，和微生物表面組分識(shí)別粘著基質(zhì)分子(MSCRAMM)如纖維蛋白原結(jié)合蛋白(例如聚集因子)、纖連蛋白結(jié)合蛋白、膠原結(jié)合蛋白、肝素/肝素相關(guān)的多糖結(jié)合蛋白等。在用于檢測金黃色葡萄球菌存在的方法中，蛋白A和聚集因子如纖維蛋白原結(jié)合因子和聚集因子A、B、和Efb也特別有用。其它細(xì)胞壁組分包括莢膜多糖和細(xì)胞壁碳水化合物(例如磷壁酸和脂磷壁酸質(zhì))。
裂解可能包括使細(xì)胞與裂解劑接觸或物理裂解細(xì)胞。裂解可以在常規(guī)條件進(jìn)行，舉例，約5℃至約37℃的溫度、優(yōu)選約15℃至約25℃的溫度下。重要的是，能夠使用未培養(yǎng)的細(xì)胞即直接測試樣品進(jìn)行裂解，盡管也可能使用經(jīng)培育的細(xì)胞。
裂解細(xì)胞的結(jié)果是形成細(xì)胞壁片段和產(chǎn)生細(xì)胞壁組分信號(hào)增強(qiáng)，能夠評(píng)價(jià)具有相對(duì)低濃度的關(guān)注的樣品種類。例如，對(duì)于某些實(shí)施方案，測試樣品可以包括相對(duì)低濃度的微生物，尤其是金黃色葡萄球菌。這些相對(duì)低的濃度包括例如小于約5×104菌落形成單位(“cfu”)/毫升(cfu/ml)的微生物、小于約5×103cfu/ml、小于約1000cfu/ml、甚至低至約500cfu/ml。也能夠在高水平下檢測微生物如金黃色葡萄球菌，例如其范圍高至5×107cfu/ml。
合適的裂解劑包括例如酶，例如溶葡萄球菌素、溶菌素、肽鏈內(nèi)切酶、N-乙酰胞壁酰-L-丙胺酸酰胺酶、內(nèi)-β-N-乙?；咸前访?、和ALE-1。如果需要，可以使用酶的各種組合。在檢測金黃色葡萄球菌存在的方法中，溶葡萄球菌素是特別有用的。
其它裂解劑包括鹽(例如離液序列高的鹽)、增溶劑(例如清潔劑)、還原劑(例如DTT、DTE、半胱氨酸、N-乙?；腚装彼?、酸(例如HCl)、堿(例如NaOH)。如果需要，可能使用這些裂解劑的組合。
一個(gè)例子是如果金黃色葡萄球菌存在，則能夠分析檢測樣品中裂解細(xì)胞的蛋白A，它是金黃色葡萄球菌特有的，能夠用固定在生物傳感器表面的蛋白A特異性抗體來檢測。此外，裂解的細(xì)胞如金黃色葡萄球菌可從細(xì)胞內(nèi)部部分(與細(xì)胞的細(xì)胞壁部分相反)中釋放蛋白質(zhì)標(biāo)記物。能夠通過探針如抗體檢測這些蛋白質(zhì)標(biāo)記物。
可以以各種合適的手段結(jié)合測試樣品和探針。在一方面，向傳感器提供探針，向比色傳感器提供測試樣品，成為分開的部分，或者以任何順序。例如，可以用包含纖維蛋白原的溶液涂覆表面并任選干燥。在另一方面，將測試樣品和探針組合作為混合物，向比色傳感器提供該混合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在接觸比色傳感器之前，使探針與包含分析物的測試樣品發(fā)生相互作用。
有益地，本發(fā)明的方法具有改進(jìn)的靈敏度。如下面實(shí)施例中的進(jìn)一步描述，可以在5×104菌落形成單位(“cfu”)/毫升、5×103cfu/ml、和5×102cfu/ml的濃度檢測到金黃色葡萄球菌。因此，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)理解，本發(fā)明的方法能夠用于檢測濃度低至5×102cfu/ml的靶分析物(例如，所示濃度以10cfu/ml遞增之間的任何具體濃度)。也能夠在高水平檢測靶分析物，例如其范圍高至5×107cfu/ml。
作為替代或者附加，本發(fā)明的方法還有益地導(dǎo)致改進(jìn)的檢測速率。本文所用的設(shè)備能夠在相對(duì)短暫的時(shí)間段內(nèi)檢測分析物。例如，可以在小于120分鐘內(nèi)(例如90分鐘、60分鐘、30分鐘、10分鐘)檢測上述任何濃度的金黃色葡萄球菌。
應(yīng)用由所公開的二乙炔化合物形成的本發(fā)明比色傳感器可用于實(shí)驗(yàn)室外要求成本有效、穩(wěn)定、精確、一致和快速診斷的各種用途。應(yīng)用包括醫(yī)療點(diǎn)測試、家庭測試診斷、空氣或水源病原體和VOC的軍用和工業(yè)用檢測、及食物處理。
在一個(gè)實(shí)施方案中，比色傳感器可用于檢測生物體液中的革蘭氏陰性菌，以診斷感染的存在。例如，在尿中存在革蘭氏陰性菌是尿路感染的指示。通過溶液中或作為基底涂層的顏色變化，包括本發(fā)明聚二乙炔組裝體的比色傳感器可以指示生物體液中革蘭氏陰性菌如金黃色葡萄球菌的存在。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的比色傳感器可與其他已知診斷方法配合使用，以對(duì)細(xì)菌或其他分析物的存在提供多項(xiàng)(multi-prong)檢測。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的比色傳感器可與創(chuàng)傷敷料結(jié)合使用，以檢測感染的存在。傳感器可與敷料整合成一層，直接或間接與創(chuàng)傷接觸。在使用時(shí)，傳感器也可插入敷料中?；蛘?，可以構(gòu)思如下敷料結(jié)構(gòu)，其中通過如美國專利6,420,622 B1所述的微流體通道，創(chuàng)傷分泌液可從創(chuàng)傷導(dǎo)向一部分沒有接觸創(chuàng)口的敷料，其中放置著傳感器。通過分析從創(chuàng)傷藥簽提取的分析物，傳感器也可在創(chuàng)傷評(píng)定中用于獨(dú)立診斷。
可以得到包括聚二乙炔組裝體的傳感器，而不需要在將其轉(zhuǎn)移到合適的支撐物上之前，通過常規(guī)LB(Langmuir-Blodgett)方法形成薄膜。或者，可使用如A.Ulman，超薄有機(jī)薄膜入門(An Introduction toUltrathin Organic Films)，Academic Press，New York(1991)，pp.101-219中所述的已知LB方法，在基底上形成聚二乙炔組裝體。
本發(fā)明能夠在一次性粘著產(chǎn)品中提供生物傳感能力。這種傳感器是獨(dú)立的，不需要額外儀器來傳輸測量結(jié)果?；蛘?，可能與其他分析儀器一起使用以進(jìn)一步增強(qiáng)靈敏度，如具有在檢測分析物之后顯現(xiàn)出熒光“紅”相的熒光。當(dāng)需要檢測特定分析物的存在閾時(shí)，傳感器用于提供快速篩選裝置，即小于30分鐘，優(yōu)選小于15分鐘。此外，本發(fā)明的傳感器是一次性的，相對(duì)廉價(jià)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，比色傳感器包括將受體摻入聚二乙炔組裝體溶液中而形成的轉(zhuǎn)導(dǎo)物。溶液可以在簡單的小瓶系統(tǒng)中提供，分析物可直接添加到含有溶液的小瓶中，溶液具有對(duì)關(guān)注的分析物特異的轉(zhuǎn)導(dǎo)物?；蛘?，比色傳感器可包括試劑盒中的多個(gè)小瓶，每個(gè)小瓶含有包括聚二乙炔組裝體的轉(zhuǎn)導(dǎo)物，所述轉(zhuǎn)導(dǎo)物具有特別針對(duì)不同分析物摻入的受體。對(duì)于分析物不能直接添加到聚二乙炔轉(zhuǎn)導(dǎo)物中的那些應(yīng)用，可以使用兩部分小瓶系統(tǒng)。小瓶的一個(gè)分隔間可以包含用于制備分析物樣品的試劑，其與第二分隔間物理分離，該第二分隔間包含從聚二乙炔組裝體形成的轉(zhuǎn)導(dǎo)物。一旦完成樣品制備，就移除分離兩個(gè)分隔間的物理障礙物，以使分析物與轉(zhuǎn)導(dǎo)物混合而進(jìn)行檢測。
然后通過向基底上點(diǎn)樣并使水蒸發(fā)，或者通過具有適當(dāng)孔徑大小的膜擠出懸浮液、俘獲聚二乙炔組裝體并得到經(jīng)涂覆的膜，將所制備的比色傳感器涂覆到固體基底上，然后使其干燥。合適的膜通常是孔徑大小為200nm或更小的那些膜，包括材料如聚碳酸酯、尼龍、PTFE、聚乙烯(可能列舉其它種類)。可以用二乙炔組裝體的聚合懸浮液涂覆這些基底，或者懸浮液可以以未聚合的形式涂覆，隨后在經(jīng)涂覆的狀態(tài)下聚合。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，比色傳感器是帶狀或標(biāo)簽形式的快速指示器，如圖1所示。圖1表示用壓敏粘合劑20涂覆的帶子或標(biāo)簽10和涂覆在基底40上的轉(zhuǎn)導(dǎo)物30。如美國公開申請(qǐng)2004-0132217-A1所述，使用milli-Q(Millipore)水和二碘甲烷(Aldrich)，通過接觸角測量可描繪用于本發(fā)明的合適基底的特征。
基底40可以包括在非常平坦的基底，例如在原子級(jí)平坦硅(111)晶片上的蒸發(fā)金、原子級(jí)平坦硅(111)晶片、或浮法玻璃，它們是裸露的，并且被自組裝單層(SAM)修飾以按系統(tǒng)方式改變其表面能；或者基底具有高度網(wǎng)紋形狀，包括紙質(zhì)基底、聚合油墨吸收涂層、結(jié)構(gòu)聚合物薄膜、微孔薄膜、及膜材料。
在經(jīng)干燥仍保持聚二乙炔組裝體的原始“藍(lán)”相的本發(fā)明實(shí)施方案中，基底40對(duì)于二碘甲烷的前進(jìn)接觸角低于50°。這種條件對(duì)應(yīng)于如下特征的基底其分散組分的表面能大于40達(dá)因/cm。在替代實(shí)施方案中，具有這些性質(zhì)、且其與水的前進(jìn)接觸角小于90°的基底導(dǎo)致包含藍(lán)相和紅相混合物的干燥涂料。這種條件將對(duì)應(yīng)如下表面，其中分散表面能組分可能小于40達(dá)因/cm，但極性表面能組分大于至少10達(dá)因/cm。
再次參考圖1，壓敏粘合劑20可將帶子或標(biāo)簽10固定到表面上，以直接檢測分析物。壓敏粘合劑20與包含聚二乙炔組裝體的轉(zhuǎn)導(dǎo)物30分離，以潛在地使不利影響最小化。在圖1中，壓敏粘合劑20包圍位于帶子或標(biāo)簽10中心的轉(zhuǎn)導(dǎo)物30。在替代實(shí)施方案(未顯示)中，壓敏粘合劑和轉(zhuǎn)導(dǎo)物組合在一起。
任選地，在帶子或標(biāo)簽10的側(cè)面，帶子或標(biāo)簽10將包含不含壓敏粘合劑20的透明窗口。窗口可以集中在轉(zhuǎn)導(dǎo)物30的下面，以允許使用者觀察顏色變化，而不用從含有分析物的表面上除去帶子或標(biāo)簽10。
在圖2中，帶子或標(biāo)簽110表示為由多個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)物112、113、114、115和116構(gòu)成的陣列111。轉(zhuǎn)導(dǎo)物112、113、114、115和116中的每一個(gè)可由相同或不同的聚二乙炔組裝體形成，而每個(gè)聚二乙炔組裝體摻有相同或不同的受體。通過改變轉(zhuǎn)導(dǎo)物112、113、114、115和116，陣列111可被設(shè)計(jì)成檢測各種濃度水平的多個(gè)分析物?；蛘?，可用替代診斷測試代替轉(zhuǎn)導(dǎo)物112、113、114、115中的任一個(gè)。本發(fā)明考慮的其它實(shí)施方案提供于美國專利系列號(hào)10/738,573中。
對(duì)于那些需要制備分析物樣品的應(yīng)用，在接觸涂覆在二維基底上的比色傳感器之前，試劑盒可以包含用于保存試劑和混合分析物的小瓶。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒可以包括用于保存試劑及制備分析物的小瓶，其蓋子裝置包含涂覆在基底上的本發(fā)明轉(zhuǎn)導(dǎo)物。
實(shí)施例本發(fā)明不應(yīng)被認(rèn)為限于下述特定實(shí)施例，而應(yīng)理解為包括如所附權(quán)利要求清楚描述的本發(fā)明所有方面。在閱讀本說明書之后，本發(fā)明可應(yīng)用的各種修改、等價(jià)過程、以及多種結(jié)構(gòu)對(duì)本發(fā)明指導(dǎo)的本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。在說明書的實(shí)施例和其余部分中，除非另有說明，所有的份數(shù)、百分?jǐn)?shù)、比例等都按摩爾計(jì)。沒有列出供應(yīng)商的所有溶劑和試劑均購自Aldrich Chemical；Milwaukee，WI。水通過使用U-V Milli-Q水純化器來純化，其電阻為18.2兆歐/cm(Millipore，Bedford MA)。
使用由數(shù)字相機(jī)采集的圖片確定比色響應(yīng)(CR)。用來自AdobeSystems Incorporated(商品名ADOBE PHOTOSHOP version 5.0，SanJose，CA)的軟件掃描圖片，以獲得各聚二乙炔傳感器測試的RGB(紅、綠、藍(lán))通道值。紅色和藍(lán)色通道值由等式CR＝((PR初始-PR樣品)/PR初始)給出，其中PR＝樣品的紅色值百分比，它由等式PR＝R值/(R值+B值)*100給出，其中R值和B值分別對(duì)應(yīng)聚二乙炔傳感器的紅色通道值和藍(lán)色通道值。
簡寫表
制備例1-二乙炔脂質(zhì)體懸浮液的制備按照美國專利申請(qǐng)公開2004/0132217的實(shí)施例6，制備二乙炔HO(O)C(CH2)2C(O)O(CH2)4C≡C-C≡C(CH2)4O(O)C(CH2)12CH3?；境绦虬ㄊ?，7-十二炔-1，12-二醇(HO(CH2)4C-≡C-C≡C(CH2)4OH)與豆蔻酰氯反應(yīng)，然后使該產(chǎn)物與琥珀酸酐反應(yīng)以獲得二乙炔HO(O)C(CH2)2C(O)O(CH2)4C≡C-C≡C(CH2)4O(O)C(CH2)12CH3，為白色固體。
將二乙炔化合物HO(O)C(CH2)2C(O)O(CH2)4C≡C-C≡C(CH2)4O(O)C(CH2)12CH3(琥珀酸單-(12-四癸酰氧基-十二-5，7-二炔基)酯)、和兩性磷脂1，2-二肉豆蔻?；?sn-甘油酰-3-磷酸膽堿(DMPC，式量(F.W.)678，來自Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的(6∶4)混合物稱重到玻璃瓶中，懸浮在N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)緩沖劑(5mM，pH 7.2)中，以制備1nM溶液。然后使用Misonix XL202探針超聲儀(購自Misonix Inc.，F(xiàn)armington，NY)將該溶液探針超聲2分鐘，在4℃的冷藏室中放置約20小時(shí)。該過程導(dǎo)致形成穩(wěn)定的脂質(zhì)體懸浮液。
制備例2-二乙炔脂質(zhì)體懸浮液的聚合將制備例1中制備的懸浮液通過1.2μm的針筒過濾器過濾，通過以3cm的距離在254nm UV燈(購自VWR Scientific Products；WestChester，PA)下將樣品照射10分鐘，使之聚合，從而生成可觀察到的藍(lán)色。
制備例3-二乙炔脂質(zhì)體懸浮液的涂覆樣品的制備將制備例1中制備的懸浮液涂覆到直徑為25(mm)、具有200(nm)直徑小孔的多孔聚碳酸酯膜(Avestin，Inc.Ottawa，Canada)上，以制備比色傳感器樣品。使用下述手持?jǐn)D壓過程涂覆膜。將要涂覆的聚碳酸酯膜放置到手持?jǐn)D壓器(商品名為LIPOFAST，來自Avestin，Inc.(Ottawa，Canada))的不銹鋼室中。膜覆蓋了特氟隆(TEFLON)為基本成分的底部O-型環(huán)。注意避免將膜彎曲和/或弄皺。將頂部TEFLON O-型環(huán)塞放置到膜頂部的不銹鋼室內(nèi)。然后用手上緊不銹鋼帽來密封膜。用二乙炔脂質(zhì)體懸浮液填充氣密注射器(Hamilton 500-微升(μl))，將注射器連接到基底，將第二注射器連接到其它帽上。用恒定的壓力將第一注射器的脂質(zhì)體緩慢推動(dòng)通過室。
膜的表面捕獲脂質(zhì)體，從而使得清澈的緩沖劑緩慢流過并進(jìn)入第二注射器。將該作用看作1道涂布。在該實(shí)施例中用作檢測器的膜樣品使用2道涂布。通過將第二個(gè)0.5毫升(ml)脂質(zhì)體部分應(yīng)用到已經(jīng)涂覆的膜上，與第一道涂料類似地實(shí)施第二道涂料。除去包含經(jīng)過濾緩沖劑的第二注射器，棄去內(nèi)容物。擰開不銹鋼端帽，除去TEFLON O-型環(huán)塞。取出濕膜，將涂覆側(cè)向上放置在玻璃載片上，在5℃的冰箱中放置至少3小時(shí)。然后在包含CaSO4的干燥器中將樣品干燥30分鐘，暴露至254納米(nm)UV光下30-90秒。
將PDA涂布的基片(25毫米(mm)的圓形)切成四個(gè)正方形。每個(gè)正方形樣品被用作實(shí)驗(yàn)樣品。
制備例4-磷酸鹽緩沖鹽水(PBS緩沖溶液)的制備通過將10×PBS液體濃縮物(購自EMD Biosciences，SanDiego CA)稀釋十倍，來制備磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶液。這樣得到具有如下鹽組成的PBS緩沖溶液10mM磷酸鈉、137mM氯化鈉、2.7mM氯化鉀。該P(yáng)BS緩沖溶液在25℃的pH為7.5。
制備例5-用PLURONIC L64制備磷酸鹽緩沖鹽水(PBS L64緩沖溶液)取出按制備例4制備的PBS緩沖溶液并添加0.2％(w/v)PLURONIC L64表面活性劑(來自BASF Corporation，Mount Olive，NJ)，來制備PBS L64緩沖溶液。該P(yáng)BS L64緩沖溶液在25℃的pH為7.5。
制備例6-金黃色葡萄球菌懸浮液的制備從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，MD)以商品名“ATCC25923”獲得金黃色葡萄球菌。使細(xì)菌在肉湯培育基中生長過夜(37℃，17-22小時(shí))，肉湯培養(yǎng)基通過用細(xì)菌接種5-10毫升制備好的無菌胰酶大豆肉湯(Hardy Diagnostics，Santa Maria，CA)來制備。離心洗滌培養(yǎng)基(8,000-10,000rpm 15分鐘，Eppendorf型號(hào)504R離心機(jī)(BrinkmanInstruments，Westbury，NY)，將其懸浮到PBS L64緩沖劑中，并用該溶液再離心3個(gè)循環(huán)來洗滌。
制備例7-表皮葡萄球菌懸浮液的制備從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，MD)以商品名“ATCC12228”獲得表皮葡萄球菌。使細(xì)菌在肉湯培育基中生長過夜(37℃，17-22小時(shí))，該肉湯培養(yǎng)基通過用細(xì)菌接種5-10毫升制備無菌胰酶大豆肉湯(Hardy Diagnostics，Santa Maria，CA)來制備。離心洗滌培養(yǎng)基(8,000-10,000rpm 15分鐘，Eppendorf型號(hào)504R離心機(jī)(BrinkmanInstruments，Westbury，NY)，將其懸浮到PBS L64緩沖溶液中，并用該溶液再離心3個(gè)循環(huán)來洗滌。
制備例8-大腸桿菌懸浮液的制備從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，MD)以商品名“ATCC25922”獲得大腸桿菌。使細(xì)菌在肉湯培育基中生長過夜(37℃，17-22小時(shí))，該肉湯培養(yǎng)基通過用細(xì)菌接種5-10毫升制備無菌胰酶大豆肉湯(Hardy Diagnostics，Santa Maria，CA)來制備。離心洗滌培養(yǎng)基(8,000-10,000rpm 15分鐘，Eppendorf型號(hào)504R離心機(jī)(BrinkmanInstruments，Westbury，NY)，將其懸浮到HEPES緩沖劑中，并用該溶液再離心3個(gè)循環(huán)來洗滌。
實(shí)施例1-纖維蛋白原蛋白質(zhì)探針的溶液相檢測將來自人血漿的纖維蛋白原(來自Sigma Aldrich，St.Louis，MO，cat.No FR4129)溶于咪唑緩沖劑中，成0.5％(w/v)的濃度。將纖維蛋白原的咪唑緩沖溶液(100μl)與100μl按制備例2制備的藍(lán)色聚二乙炔脂質(zhì)體溶液混合。還制備了對(duì)照樣品，其中包含100μl不含纖維蛋白原的咪唑緩沖劑、和100μl按制備例2制備的藍(lán)色聚二乙炔脂質(zhì)體溶液。盡管兩個(gè)樣品在最初20分鐘內(nèi)都從藍(lán)色變?yōu)榧t色，但是在總計(jì)30分鐘內(nèi)，包含纖維蛋白原的懸浮液樣品發(fā)生絮凝并隨后沉淀。對(duì)照樣品的懸浮液在全部觀察時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定。
實(shí)施例2-兔抗金黃色葡萄球菌IgG抗體蛋白質(zhì)探針的溶液相檢測將兔抗金黃色葡萄球菌IgG抗體(來自AccurateChemical andScientific Corporation，Westbury，NY，cat.No.YVS6881)溶于咪唑緩沖劑中，濃度為100μg/ml。將抗體的咪唑緩沖溶液(100μl)與100μl藍(lán)色聚二乙炔脂質(zhì)體溶液(在制備例2中制備)混合。還制備了對(duì)照樣品，其中包含100μl不含抗體的咪唑緩沖劑、和100μl藍(lán)色聚二乙炔脂質(zhì)體溶液(在制備例2中制備)。盡管兩個(gè)樣品在最初30分鐘內(nèi)都從藍(lán)色變?yōu)榧t色，但是在24小時(shí)后，包含抗體的懸浮液樣品發(fā)生絮凝并隨后沉淀。對(duì)照樣品的懸浮液在全部觀察時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定。
實(shí)施例3-在金黃色葡萄球菌和PBS L64緩沖溶液存在的情況下，纖維蛋白原蛋白質(zhì)探針的溶液相檢測將按實(shí)施例1制備的纖維蛋白原的咪唑緩沖溶液(100μl)與100μl藍(lán)色聚二乙炔脂質(zhì)體溶液(在制備例2中制備)和100μl按制備例6制備、包含106cfu/ml金黃色葡萄球菌的PBS L64緩沖溶液混合。通過將100μl纖維蛋白原的咪唑緩沖溶液、100μl藍(lán)色聚二乙炔脂質(zhì)體溶液、和100μl不含金黃色葡萄球菌的PBS L64緩沖溶液混合，還制備了對(duì)照樣品。兩個(gè)樣品在最初30分鐘內(nèi)都從藍(lán)色變?yōu)榧t色，但是與實(shí)施例1相反，兩個(gè)樣品的懸浮液在24小時(shí)的觀察期內(nèi)都保持穩(wěn)定。
實(shí)施例4-在金黃色葡萄球菌和PBS L64緩沖溶液存在的情況下，兔抗金黃色葡萄球菌IgG抗體蛋白質(zhì)探針的溶液相檢測使用三種不同的組合，將按制備例2制備的藍(lán)色聚二乙炔脂質(zhì)體溶液與按實(shí)施例2制備的抗體的咪唑緩沖溶液和按制備例6制備的包含金黃色葡萄球菌的PBS緩沖溶液混合樣品4A-100μl藍(lán)色聚二乙炔脂質(zhì)體溶液+100μl抗體的咪唑緩沖溶液+100μl包含107cfu/ml金黃色葡萄球菌的PBS緩沖溶液。
樣品4B-100μl藍(lán)色聚二乙炔脂質(zhì)體溶液+100μl抗體的咪唑緩沖溶液+100μl不含細(xì)菌的PBS緩沖溶液。
樣品4C-100μl藍(lán)色聚二乙炔脂質(zhì)體溶液+100μl不含抗體的咪唑緩沖劑+100μl不含細(xì)菌的PBS緩沖溶液。
下面表1中記錄了45分鐘后樣品的顏色。
表1
實(shí)施例5-使用聚二乙炔的涂覆樣品，檢測纖維蛋白原蛋白質(zhì)探針將按制備例3制備的三個(gè)聚二乙炔涂覆基片放置到24-孔微量滴定板(購自Corning Incorporated，Corning NY，cat.No 3524，商品名為COSTAR)的孔底部，隨后添加下列溶液樣品5A-250μl按實(shí)施例1制備的纖維蛋白原的咪唑緩沖溶液+250μl PBS L64緩沖溶液。
樣品5B-250μl纖維蛋白原的咪唑緩沖溶液+250μl按制備例6制備、包含107cfu/ml金黃色葡萄球菌的PBS L64緩沖溶液。
樣品5C-250μl纖維蛋白原的咪唑緩沖劑+250μl按制備例7制備、包含107cfu/ml表皮葡萄球菌的PBS L64緩沖溶液。
下面表2記錄了各樣品從藍(lán)色變?yōu)榧t色所需的時(shí)間。
表2
實(shí)施例6-使用纖維蛋白原蛋白質(zhì)探針的咪唑緩沖溶液，在PBSL64緩沖溶液中檢測不同濃度的金黃色葡萄球菌將按制備例3制備的六個(gè)聚二乙炔涂覆基片放置到24-孔微量滴定板的分開的孔底部。將按實(shí)施例1制備的纖維蛋白原的咪唑緩沖溶液(250μl)與250μl按制備例6制備、包含金黃色葡萄球菌的PBS L64緩沖溶液混合，獲得包含不同細(xì)菌濃度的一系列樣品混合物。細(xì)菌濃度列于下面表3中。將不同的樣品混合物渦旋，放置5分鐘，然后添加到包含聚二乙炔涂覆基片的各孔中。在Eberbach Model 6000搖床(Eberbach Corp.，Ann Arbor，MI)上攪動(dòng)微量滴定板。在6分鐘時(shí)，使用數(shù)碼相機(jī)采集圖片。使用Adobe Systems Incorporated的軟件掃描圖片。如上所述確定比色響應(yīng)(CR)。下面表3的數(shù)據(jù)將比色響應(yīng)報(bào)告為細(xì)菌濃度的函數(shù)。
表3
實(shí)施例7-使用抗體-鏈霉親和素共軛的蛋白質(zhì)探針和聚二乙炔的涂覆樣品，在PBS L64緩沖溶液中檢測金黃色葡萄球菌將按制備例3制備的兩個(gè)聚二乙炔涂覆基片放置到24-孔微量滴定板的分開的孔底部。按照下列方式制備鏈霉親和素共軛的兔抗金黃色葡萄球菌IgG抗體蛋白質(zhì)探針。將鏈霉親和素共軛的抗體溶于咪唑緩沖劑中，濃度為100μg/ml。
然后制備下列樣品溶液樣品7A-250μl鏈霉親和素共軛抗體的咪唑緩沖溶液+250μl按制備例4制備的PBS緩沖溶液。
樣品7B-250μl鏈霉親和素共軛抗體的咪唑緩沖溶液+250μl PBS緩沖溶液，所述緩沖劑包含按制備例6制備的106cfu/ml金黃色葡萄球菌的PBS緩沖溶液。
在混合后，將溶液渦旋，放置5分鐘，然后添加到包含聚二乙炔傳感器的各孔中。在Eberbach Model 6000搖床(Eberbach Corp.，AnnArbor，MI)上攪動(dòng)微量滴定板。下面表4記錄了各傳感器從藍(lán)色變?yōu)榧t色所需的時(shí)間。
表4
實(shí)施例8-使用抗體-生物素共軛的蛋白質(zhì)探針，使用聚二乙炔的涂覆樣品檢測鏈霉親和素將按制備例3制備的四個(gè)聚二乙炔涂覆基片放置到24-孔微量滴定板的分開的孔底部。以100μg/ml的濃度，將生物素共軛的鼠抗蛋白AIgG單克隆抗體(購自Sigma Aldrich，St.Louis，MO，cat.No 13-3150)蛋白質(zhì)探針溶于PBS緩沖溶液中。將鏈霉親和素(購自Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA，Cat.No 016-050-084)溶于PBS緩沖溶液中，濃度為100μg/ml。
然后制備下列樣品溶液樣品8A-300μl咪唑緩沖劑。
樣品8B-150μl咪唑緩沖劑+150μl鏈霉親和素的PBS緩沖溶液。
樣品8C-100μl咪唑緩沖劑+100μl鏈霉親和素的PBS緩沖溶液+100μl生物素共軛抗體的PBS緩沖溶液。
樣品8D-150μl咪唑緩沖劑+150μl生物素共軛抗體的PBS緩沖溶液。
在混合后，將溶液渦旋，放置5分鐘，然后添加到包含聚二乙炔傳感器的分開的孔中。在Eberbach Model 6000搖床(Eberbach Corp.，Ann Arbor，MI)上攪動(dòng)微量滴定板。下面表5記錄了各傳感器從藍(lán)色變?yōu)榧t色所需的時(shí)間。
表5
實(shí)施例9-使用纖維蛋白原蛋白質(zhì)探針的PBS L64緩沖溶液，檢測PBS L64緩沖溶液中不同濃度的金黃色葡萄球菌將按制備例3制備的六個(gè)聚二乙炔涂覆基片放置到24-孔微量滴定板的分開的孔底部。將纖維蛋白原溶于PBS L64緩沖溶液中，濃度為0.5％(w/v)。類似地，還將纖維蛋白原溶于PBS L64緩沖溶液中，濃度為0.05％(w/v)。
制備下列樣品溶液樣品9A-250μl 0.5％濃度的纖維蛋白原的PBS L64緩沖溶液+250μl不含細(xì)菌的PBS L64緩沖溶液。
樣品9B-250μl 0.5％濃度的纖維蛋白原的PBS L64緩沖溶液+250μl按照制備例6制備、包含103cfu/ml金黃色葡萄球菌的PBS L64緩沖溶液。
樣品9C-250μl 0.5％濃度的纖維蛋白原的PBS L64緩沖溶液+250μl按照制備例6制備、包含105cfu/ml金黃色葡萄球菌的PBS L64緩沖溶液。
樣品9D-250μl 0.05％濃度的纖維蛋白原的PBS L64緩沖溶液+250μl不含細(xì)菌的PBS L64緩沖溶液。
樣品9E-250μl 0.05％濃度的纖維蛋白原的PBS L64緩沖溶液+250μl包含103cfu/ml金黃色葡萄球菌的PBS L64緩沖溶液。
樣品15F-250μl 0.05％濃度的纖維蛋白原的PBS L64緩沖溶液+250μl包含105cfu/ml金黃色葡萄球菌的PBS L64緩沖溶液。
為了比較，還制備兩種其它樣品樣品9G-250μl 0.5％濃度的纖維蛋白原的PBS L64緩沖溶液+250μl按制備例7制備、包含105cfu/ml表皮葡萄球菌的PBS L64緩沖溶液。
樣品9H-250μl 0.05％濃度的纖維蛋白原的PBS L64緩沖溶液+250μl包含105cfu/ml表皮葡萄球菌的PBS L64緩沖溶液。
將不同的樣品混合物渦旋，放置5分鐘，然后添加到包含聚二乙炔涂覆基片的分開的孔中。在Eberbach Model 6000搖床(Eberbach Corp.，Ann Arbor，MI)上攪動(dòng)微量滴定板。在30分鐘時(shí)，使用數(shù)碼相機(jī)采集圖片。使用Adobe Systems Incorporated的軟件(商品名ADOBEPHOTOSHOP version 5.0，San Jose，CA)掃描圖片。下面表6的數(shù)據(jù)報(bào)告了這些樣品的比色響應(yīng)(CR)。
表6
實(shí)施例10-使用纖維蛋白原蛋白質(zhì)探針的PBS L64緩沖溶液，檢測臨床樣品中的完整金黃色葡萄球菌收集來自6名患者的鼻孔拭子樣品，從每位患者收集兩個(gè)拭子，共計(jì)12個(gè)樣品。通過用無菌人造纖維拭子(購自Puritan，East Grinstead，UK，商品名“Pure-Wraps”)擦拭患者的前鼻孔獲得鼻孔拭子樣品。通過將人造纖維拭子插入對(duì)象的鼻孔的前端，將拭子沿著鼻孔粘膜表面完整地旋轉(zhuǎn)兩周，來進(jìn)行采樣。使用1ml PBS L64緩沖溶液洗脫各拭子樣品。使用按制備例3制備的涂覆聚二乙炔傳感器分析分別來自6位患者的一個(gè)樣品。使用1ml PBS L64緩沖溶液洗脫來自相同患者的第二個(gè)樣品并培養(yǎng)，以獲得下面表7報(bào)告的用于比較的細(xì)菌計(jì)數(shù)。用于這些樣品的培養(yǎng)程序依照“人類疾病中的葡萄球菌”(TheStaphylococci in Human Disease)；Crossley，K.B.和Archer，G.L.editors，Churchill Livingston，NY，1997，pp.233-252中的一般性描述。通過將250μl以0.5％(w/v)的濃度溶于PBS L64緩沖溶液的纖維蛋白原與250μl從各患者拭子洗脫的溶液混合，制備要用聚二乙炔傳感器分析的樣品。將樣品溶液渦旋并放置5分鐘，然后放置在聚二乙炔涂覆的傳感器上，該傳感器已經(jīng)被放置在24-孔微量滴定板的分開的孔底部。在EberbachModel 6000搖床(Eberbach Corp.，Ann Arbor，MI)上攪動(dòng)微量滴定板。在45分鐘時(shí)，使用數(shù)字相機(jī)采集圖片。使用Adobe Systems Incorporated的軟件(商品名ADOBE PHOTOSHOP version 5.0，San Jose，CA)掃描圖片。下面表7的數(shù)據(jù)將比色響應(yīng)報(bào)告為細(xì)菌濃度的函數(shù)。
表7
實(shí)施例11-使用纖維蛋白原蛋白質(zhì)探針的PBS L64緩沖溶液，檢測臨床樣品中的裂解金黃色葡萄球菌收集5名患者的鼻孔拭子樣品，從每位患者收集兩個(gè)擦拭物，共計(jì)10個(gè)樣品。按照實(shí)施例10獲得樣品。使用按制備例3制備的涂覆聚二乙炔傳感器分析分別來自5位患者的一個(gè)樣品。使用1ml PBS L64緩沖溶液洗脫來自相同患者的第二個(gè)樣品并培養(yǎng)，以獲得如實(shí)施例10所述的細(xì)菌計(jì)數(shù)。如下制備要用聚二乙炔傳感器分析的樣品。首先，通過與等體積的裂解緩沖劑混合，將1ml洗脫的拭子樣品中所含的金黃色葡萄球菌裂解，裂解緩沖劑由濃度為3μg/ml的溶葡萄球菌素(目錄號(hào)L-4402，Sigma-Aldrich)的PBS L64緩沖溶液組成。第二，將250μl裂解溶液與250μl以0.5％(w/v)的濃度溶于PBS L64緩沖溶液的纖維蛋白原混合。將樣品溶液渦旋并放置5分鐘，然后放置在聚二乙炔涂覆的傳感器上，該傳感器已經(jīng)被放置在24-孔微量滴定板的分開的孔底部。在Eberbach Model 6000
搖床(Eberbach Corp.，Ann Arbor，MI)上攪動(dòng)微量滴定板。在42分鐘時(shí)，使用數(shù)字相機(jī)采集圖片。使用來自Adobe Systems Incorporated的軟件(商品名ADOBE PHOTOSHOP version 5.0，San Jose，CA)掃描圖片。下面表8的數(shù)據(jù)將比色響應(yīng)報(bào)告為細(xì)菌濃度的函數(shù)。
表8
實(shí)施例12-使用兔抗金黃色葡萄球菌IgG抗體蛋白質(zhì)探針的PBSL64緩沖溶液，檢測臨床樣品中的裂解金黃色葡萄球菌收集6名患者的鼻孔擦拭樣品，從每位患者收集兩個(gè)擦拭物，共計(jì)12個(gè)樣品。按照實(shí)施例10所述獲得樣品。使用按制備例3制備的涂覆聚二乙炔傳感器分析分別來自6位患者的一個(gè)樣品。使用1ml PBSL64緩沖溶液洗脫來自相同患者的第二個(gè)樣品并培養(yǎng)，以獲得下面表9報(bào)告的用于比較的細(xì)菌計(jì)數(shù)。按實(shí)施例10所述進(jìn)行培養(yǎng)程序。如下制備要用聚二乙炔傳感器分析的樣品。首先，通過與等體積的裂解緩沖劑混合，將1ml洗脫擦拭樣品中所含的金黃色葡萄球菌裂解，裂解緩沖劑由濃度為3μg/ml的溶葡萄球菌素(目錄號(hào)L-4402，Sigma-Aldrich)的PBS L64緩沖溶液組成。第二，將250μl裂解溶液與250μl以100μg/ml的濃度溶于PBS L64緩沖溶液的兔抗金黃色葡萄球菌IgG抗體(從Accurate Chemicals獲得)混合。將樣品溶液渦旋并放置5分鐘，然后放置在聚二乙炔涂覆的傳感器上，該傳感器已經(jīng)被放置在24-孔微量滴定板的分開的孔底部。在Eberbach Model 6000搖床(Eberbach Corp.，AnnArbor，MI)上攪動(dòng)微量滴定板。在20分鐘時(shí)，使用數(shù)字相機(jī)采集圖片。使用來自Adobe Systems Incorporated的軟件(商品名ADOBEPHOTOSHOP version 5.0，San Jose，CA)掃描圖片。下面表9的數(shù)據(jù)將比色響應(yīng)報(bào)告為細(xì)菌濃度的函數(shù)。
表9
實(shí)施例13-使用兔抗金黃色葡萄球菌IgG抗體蛋白質(zhì)探針的PBSL64緩沖溶液，比較聚二乙炔涂覆的傳感器對(duì)裂解金黃色葡萄球菌相對(duì)于完整金黃色葡萄球菌的檢測效率將制備例1中制備的二乙炔HO(O)C(CH2)2C(O)O(CH2)4G≡C-C≡C(CH2)4O(O)C(CH2)12CH3與1，2-二肉豆蔻?；?sn-甘油酰-3-磷酸膽堿(DMPC)的(60/40)制劑涂覆到直徑為25mm、具有200nm直徑小孔的多孔聚碳酸酯膜(Avestin，Inc.Ottawa，Canada)上，以制備比色檢測器樣品。按照制備例3制備檢測器樣品。
將聚二乙炔涂覆的基片(25毫米(mm)圓形)剪切成四個(gè)正方形。每個(gè)正方形樣品被用作實(shí)驗(yàn)樣品。將基片放置到24-孔微量滴定板的分開的孔中。通過將250μl包含完整金黃色葡萄球菌ATCC 25923的PBSL64緩沖溶液與250μl抗體溶液混合，制備完整細(xì)菌樣品溶液?？贵w溶液包含濃度為100μg/ml兔抗金黃色葡萄球菌(目錄號(hào)YVS6881，Accurate Chemical and Scientific Corp.)的PBS L64緩沖溶液。使用裂解緩沖劑制備包含裂解金黃色葡萄球菌ATCC 25923的PBS L64緩沖溶液，裂解緩沖劑由濃度為3微克/毫升的溶葡萄球菌素(購自Sigma-Aldrich，目錄號(hào)L-4402)的PBS L64緩沖溶液組成。裂解細(xì)菌樣品溶液由250μl裂解金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)的PBS L64緩沖溶液與250μl按上述制備的抗體溶液混合組成。測試樣品所用的細(xì)菌濃度在0至105cfu/ml之間變化，如下面表10所報(bào)告的。將細(xì)菌與抗體溶液的混合物放置5分鐘，然后添加到包含聚二乙炔涂覆基片的24-孔板上。還制備了對(duì)照樣品用于比較。對(duì)照樣品不包含細(xì)菌，僅由250μlPBS-L64緩沖劑與250μl按上述制備的抗體溶液混合組成。
使用數(shù)字相機(jī)，每5分鐘采集圖片。使用Adobe SystemsIncorporated的軟件(商品名ADOBE PHOTOSHOP version 5.0，San Jose，CA)掃描圖片。下面表10的數(shù)據(jù)報(bào)告了在15分鐘測量時(shí)，對(duì)照樣品與含菌樣品(完整的或裂解的)之間比色響應(yīng)的差別。
表10
實(shí)施例14-使用兔抗金黃色葡萄球菌IgG抗體蛋白質(zhì)探針和涂覆聚二乙炔傳感器，緩沖劑組成對(duì)檢測裂解金黃色葡萄球菌和完整金黃色葡萄球菌的影響將按制備例3制備的三十二個(gè)聚二乙炔涂覆基片放置在24-孔微量滴定板的分開孔底部。
制備下列樣品溶液樣品14A-500μl按實(shí)施例2制備的抗體的PBS L64緩沖溶液，其中包含103cfu/ml完整金黃色葡萄球菌或按實(shí)施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黃色葡萄球菌。
樣品14B-400μl按實(shí)施例2制備的抗體的PBS L64緩沖溶液，其中包含103cfu/ml完整金黃色葡萄球菌或按實(shí)施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黃色葡萄球菌+100μl HEPES緩沖劑。
樣品14C-350μl按實(shí)施例2制備的抗體的PBS L64緩沖溶液，其中包含103cfu/ml完整金黃色葡萄球菌或按實(shí)施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黃色葡萄球菌+150μl HEPES緩沖劑。
樣品14D-300μl按實(shí)施例2制備的抗體的PBS L64緩沖溶液，其中包含103cfu/ml完整金黃色葡萄球菌或按實(shí)施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黃色葡萄球菌+200μl HEPES緩沖劑。
樣品14E-250μl按實(shí)施例2制備的抗體的PBS L64緩沖溶液，其中包含103cfu/ml完整金黃色葡萄球菌或按實(shí)施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黃色葡萄球菌+250μl HEPES緩沖劑。
樣品14F-200μl按實(shí)施例2制備的抗體的PBS L64緩沖溶液，其中包含103cfu/ml完整金黃色葡萄球菌或按實(shí)施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黃色葡萄球菌+300μl HEPES緩沖劑。
樣品14G-150μl按實(shí)施例2制備的抗體的PBS L64緩沖溶液，其中包含103cfu/ml完整金黃色葡萄球菌或按實(shí)施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黃色葡萄球菌+350μl HEPES緩沖劑。
樣品14H-500μl HEPES緩沖劑，其中兔抗金黃色葡萄球菌(目錄號(hào)YYS6881，Accurate Chemical and Scientific Corp.)的濃度為100μg/ml，并包含103cfu/ml完整金黃色葡萄球菌或按實(shí)施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黃色葡萄球菌。
還制備了一系列對(duì)照樣品，它們的組成與樣品14A-14H相同，除了它們不含完整或裂解的細(xì)菌。
將不同的樣品混合物渦旋，放置5分鐘，然后添加到包含聚二乙炔涂覆基片的分開的孔中。在Eberbach Model 6000搖床(Eberbach Corp.，Ann Arbor，MI)上攪動(dòng)微量滴定板。在40分鐘時(shí)，使用數(shù)字相機(jī)采集圖片。使用Adobe Systems Incorporated的軟件(商品名ADOBEPHOTOSHOP version 5.0，San Jose，CA)掃描圖片。下面表11的數(shù)據(jù)顯示了在15分鐘測量時(shí)，對(duì)照樣品和含菌樣品(完整的或裂解的)之間的比色響應(yīng)差異。
表11
實(shí)施例15-使用高濃度的纖維蛋白原蛋白質(zhì)探針和涂覆聚二乙炔傳感器，緩沖劑組成對(duì)檢測裂解金黃色葡萄球菌和完整金黃色葡萄球菌的影響將按制備例3制備的三十二個(gè)聚二乙炔涂覆基片放置在24-孔微量滴定板的分開的孔底部。
制備下列樣品溶液樣品15A-500μl纖維蛋白原的PBS L64緩沖溶液，其中包含103cfu/ml完整金黃色葡萄球菌或按實(shí)施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黃色葡萄球菌。
樣品15B-400μl纖維蛋白原的PBS L64緩沖溶液，其中包含103cfu/ml完整金黃色葡萄球菌或按實(shí)施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黃色葡萄球菌+100μl HEPES緩沖劑。
樣品15C-350μl纖維蛋白原的PBS L64緩沖溶液，其中包含103cfu/ml完整金黃色葡萄球菌或按實(shí)施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黃色葡萄球菌+150μl HEPES緩沖劑。
樣品15D-300μl纖維蛋白原的PBS L64緩沖溶液，其中包含103cfu/ml完整金黃色葡萄球菌或按實(shí)施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黃色葡萄球菌+200μl HEPES緩沖劑。
樣品15E-250μl纖維蛋白原的PBS L64緩沖溶液，其中包含103cfu/ml完整金黃色葡萄球菌或按實(shí)施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黃色葡萄球菌+250μl HEPES緩沖劑。
樣品15F-200μl纖維蛋白原的PBS L64緩沖溶液，其中包含103cfu/ml完整金黃色葡萄球菌或按實(shí)施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黃色葡萄球菌+300μl HEPES緩沖劑。
樣品15G-150μl纖維蛋白原的PBS L64緩沖溶液，其中包含103cfu/ml完整金黃色葡萄球菌或按實(shí)施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黃色葡萄球菌+350μl HEPES緩沖劑。
樣品15H-500μl HEPES緩沖溶液，其中纖維蛋白原(來自Sigma，cat.No FR4129，Lot# 083K7604)的濃度為0.5％(w/v)，包含103cfu/ml完整金黃色葡萄球菌或按實(shí)施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黃色葡萄球菌。
在所有樣品溶液15A-15H中，將纖維蛋白原溶于緩沖劑中，濃度為0.5％(w/v)。還制備了一系列對(duì)照樣品溶液，它們的組成與樣品15A-15H相同，除了它們不含完整或裂解的細(xì)菌。
將不同的樣品混合物渦旋，放置5分鐘，然后添加到包含聚二乙炔涂覆基片的分開的孔中。在Eberbach Model 6000搖床(Eberbach Corp.，Ann Arbor，MI)上攪動(dòng)微量滴定板。在40分鐘時(shí)，使用數(shù)字相機(jī)采集圖片。使用Adobe Systems Incorporated的軟件(商品名ADOBEPHOTOSHOP version 5.0，San Jose，CA)掃描圖片。測定比色響應(yīng)(CR)。下面表12的數(shù)據(jù)顯示了在15分鐘測量時(shí)，對(duì)照樣品和含菌樣品(完整的或裂解的)之間的比色響應(yīng)差異。
表12
實(shí)施例16-使用低濃度的纖維蛋白原蛋白質(zhì)探針和涂覆聚二乙炔傳感器，緩沖劑組成對(duì)檢測裂解金黃色葡萄球菌和完整金黃色葡萄球菌的影響將按制備例3制備的三十二個(gè)聚二乙炔涂覆基片放置在24-孔微量滴定板的分開的孔底部。制備下列樣品溶液樣品16A-500μl纖維蛋白原的PBS L64緩沖溶液，其中包含103cfu/ml完整金黃色葡萄球菌或按實(shí)施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黃色葡萄球菌。
樣品16B-400μl纖維蛋白原的PBS L64緩沖溶液，其中包含103cfu/ml完整金黃色葡萄球菌或按實(shí)施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黃色葡萄球菌+100μl HEPES緩沖劑。
樣品16C-350μl纖維蛋白原的PBS L64緩沖溶液，其中包含103cfu/ml完整金黃色葡萄球菌或按實(shí)施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黃色葡萄球菌+150μl HEPES緩沖劑。
樣品15D-300μl纖維蛋白原的PBS L64緩沖溶液，其中包含103cfu/ml完整金黃色葡萄球菌或按實(shí)施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黃色葡萄球菌+200μl HEPES緩沖劑。
樣品16E-250μl纖維蛋白原的PBS L64緩沖溶液，其中包含103cfu/ml完整金黃色葡萄球菌或按實(shí)施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黃色葡萄球菌+250μl HEPES緩沖劑。
樣品16F-200μl纖維蛋白原的PBS L64緩沖溶液，其中包含103cfu/ml完整金黃色葡萄球菌或按實(shí)施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黃色葡萄球菌+300μl HEPES緩沖劑。
樣品16G-150μl纖維蛋白原的PBS L64緩沖溶液，其中包含103cfu/ml完整金黃色葡萄球菌或按實(shí)施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黃色葡萄球菌+350μl HEPES緩沖劑。
樣品16H-500μl HEPES緩沖溶液，纖維蛋白原(來自Sigma，cat.NoFR4129，Lot#083K7604)的濃度為0.05％(w/v)，包含103cfu/ml完整金黃色葡萄球菌或按實(shí)施例11所述的裂解程序得到的103cfu/ml裂解金黃色葡萄球菌。
在所有樣品溶液16A-16H中，將纖維蛋白原溶于緩沖劑中，濃度為0.05％(w/v)。還制備了一系列對(duì)照樣品，它們的組成與樣品15A-15H相同，除了它們不含完整或裂解的細(xì)菌。
將不同的樣品混合物渦旋，放置5分鐘，然后添加到包含聚二乙炔涂覆基片的分開的孔中。在Eberbach Model 6000搖床(Eberbach Corp.，Ann Arbor，MI)上攪動(dòng)微量滴定板。在40分鐘時(shí)，使用數(shù)字相機(jī)采集圖片。使用Adobe Systems Incorporated的軟件(商品名ADOBEPHOTOSHOP version 5.0，San Jose，CA)掃描圖片。下面表13的數(shù)據(jù)顯示了在15分鐘測量時(shí)，對(duì)照樣品和含菌樣品(完整的或裂解的)之間的比色響應(yīng)差異。
表13
實(shí)施例17-使用與蛋白A預(yù)反應(yīng)的單克隆抗體和涂覆聚二乙炔的傳感器，檢測耐受甲烯土霉素的金黃色葡萄球菌(MRSA)使抗MRSA的PBP2′的單克隆IgG1K抗體與蛋白A交叉反應(yīng)。該抗體與蛋白A預(yù)反應(yīng)，然后暴露于裂解的MRSA(3M Culture collection#360)。用于裂解MRSA的程序按照實(shí)施例11進(jìn)行。按實(shí)施例13所述，在PBS L64中制備裂解的MRSA。本實(shí)施例中裂解和使用的細(xì)菌濃度為105和103cfu/ml。使用不含細(xì)菌而僅含裂解劑的PBS L64作為對(duì)照樣品。在HEPES緩沖劑中制備抗PBP2′的單克隆抗體，濃度為100μg/ml。還在HEPES緩沖劑中制備蛋白A(Zymed，San Fransisco，CA，目錄號(hào)10-1006)，濃度為200μg/ml。按下面所述，使用細(xì)菌溶液與包含抗體和蛋白A的HEPES緩沖劑的兩種不同組合。
樣品17A-將150μl抗PBP2′單克隆抗體的HEPES緩沖溶液與100μl蛋白A的HEPES緩沖溶液混合。將小瓶渦旋并放置五分鐘。
然后將樣品17A與250μl包含103或105cfu/ml細(xì)菌的PBS L64溶液或不含細(xì)菌的對(duì)照樣品混合。將小瓶渦旋并放置5分鐘。將制備例3所述的三個(gè)涂覆PDA的聚碳酸酯膜樣品放置在24孔板的底部。將具有不同細(xì)菌水平的溶液吸移到各孔中。下面表14跟隨并報(bào)告了從藍(lán)色的顏色變化。
表14
樣品17B-將150μl抗PBP2′單克隆抗體的HEPES緩沖溶液與50μl蛋白A的HEPES緩沖溶液混合。將小瓶渦旋并放置五分鐘。
然后將樣品17B與300μl包含103或105cfu/ml細(xì)菌的PBS L64溶液或不含細(xì)菌的對(duì)照樣品混合。將小瓶渦旋并放置5分鐘。將如制備例3所述的三個(gè)涂覆PDA的聚碳酸酯膜樣品放置在24孔板的底部。將具有不同細(xì)菌水平的溶液吸移到各孔中。下面表15跟隨并報(bào)告了從藍(lán)色的顏色變化。
表15
實(shí)施例18-使用單克隆抗體作為蛋白質(zhì)探針和涂覆聚二乙炔的傳感器，檢測耐受甲烯土霉素的金黃色葡萄球菌(MRSA)裂解MRSA的程序按照實(shí)施例11進(jìn)行。按實(shí)施例13所述，在PBSL64中制備裂解的MRSA。本實(shí)施例中裂解和使用的細(xì)菌濃度為105和103cfu/ml。使用不含細(xì)菌而僅包含裂解劑的PBS L64作為對(duì)照樣品。在HEPES緩沖劑中制備抗PBP2′的單克隆IgG1K抗體，濃度為100μg/ml。
然后制備下列樣品溶液樣品18A-將250μl抗PBP2′單克隆抗體的PBS L64緩沖溶液與250μl不含細(xì)菌的PBS L64緩沖溶液混合。將小瓶渦旋并放置5分鐘。
樣品18B-將250μl抗PBP2′單克隆抗體的PBS L64緩沖溶液與250μl包含103cfu/ml裂解MRSA的PBS L64緩沖溶液混合。將小瓶渦旋并放置5分鐘。
樣品18C-將250μl抗PBP2′單克隆抗體的PBS L64緩沖溶液與250μl包含105cfu/ml裂解MRSA的PBS L64緩沖溶液混合。將小瓶渦旋并放置5分鐘。
將如制備例3所述的三個(gè)涂覆PDA的聚碳酸酯膜樣品放置在24孔板的底部。將具有不同細(xì)菌水平的溶液吸移到各孔中，在EberbachModel 6000搖床(Eberbach Corp.，Ann Arbor，MI)上攪動(dòng)微量滴定板。在45分鐘時(shí)，使用數(shù)字相機(jī)采集圖片。使用Adobe Systems Incorporated的軟件(商品名ADOBE PHOTOSHOP version 5.0，San Jose，CA)掃描圖片。下面表16的數(shù)據(jù)報(bào)告了各樣品的比色響應(yīng)。
表16
實(shí)施例19-使用多粘菌素蛋白質(zhì)探針的HEPES緩沖溶液，檢測不同濃度的大腸桿菌的HEPES緩沖溶液將按制備例3制備的五個(gè)聚二乙炔涂覆基底放置在24孔微量滴定板的各孔底部。，將硫酸多粘霉菌B(購自Aldrich)溶于HEPES緩沖劑中，濃度為26納摩爾/ml。
制備下列樣品溶液樣品19A-500μl硫酸多粘霉菌B的HEPES緩沖溶液，不含細(xì)菌。
樣品19B-500μl硫酸多粘霉菌B的HEPES緩沖溶液，包含按制備例8制備的103cfu/ml大腸桿菌。
樣品19C-500μl硫酸多粘霉菌B的HEPES緩沖溶液，包含按制備例8制備的105cfu/ml大腸桿菌。
樣品19D-500μl硫酸多粘霉菌B的HEPES緩沖溶液，包含按制備例8制備的107cfu/ml大腸桿菌。
樣品19E-500μl硫酸多粘霉菌B的HEPES緩沖溶液，包含按制備例8制備的109cfu/ml大腸桿菌。
將不同的樣品混合物渦旋，放置5分鐘，然后添加到包含聚二乙炔涂覆基片的各孔中。在Eberbach Model 6000搖床(Eberbach Corp.，Ann Arbor，MI)上攪動(dòng)微量滴定板。在30分鐘時(shí)，使用數(shù)字相機(jī)采集圖片。使用Adobe Systems Incorporated的軟件(商品名ADOBEPHOTOSHOP version 5.0，San Jose，CA)掃描圖片。測定比色響應(yīng)(CR)。下面表17的數(shù)據(jù)將比色響應(yīng)報(bào)告為細(xì)菌濃度的函數(shù)。
表17
在不背離本發(fā)明范圍和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明的各種修改和替代對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。應(yīng)該理解本發(fā)明將不受本文所述說明性實(shí)施方案的不適當(dāng)限制，這些實(shí)施方案僅僅作為例子出現(xiàn)，本發(fā)明的范圍將僅將權(quán)利要求書限定。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測分析物的比色體系，包括比色傳感器，其包括受體；聚合組合物，其包括至少一種二乙炔化合物；其中所述受體被摻入到所述聚合組合物中以形成轉(zhuǎn)導(dǎo)物；和緩沖組合物，其介導(dǎo)分析物與轉(zhuǎn)導(dǎo)物之間的相互作用；其中所述轉(zhuǎn)導(dǎo)物在與分析物接觸時(shí)表現(xiàn)出顏色變化；并且其中所述二乙炔化合物在聚合前具有下式 其中R1包括C1-C20烷基、 R2包括 R3、R8、R13、R21、R24、R31和R33獨(dú)立地為C1-C20烷基；R4、R5、R7、R14、R16、R19、R20、R22、R25和R32獨(dú)立地為C1-C14亞烷基；R6、R15、R18和R26獨(dú)立地為C1-C14亞烷基、C2-C8亞烯基、或C6-C13亞芳基；R9為C1-C14亞烷基或-NR34-；R10、R12、R27和R29獨(dú)立地為C1-C14亞烷基或(C1-C14亞烷基)-(C2-C8亞芳基)；R11和R28獨(dú)立地為C2-C30炔基；R17為酯活化基團(tuán)；R23為C6-C13亞芳基；R30為C1-C14亞烷基或-NR36-；R34和R36為C1-C4烷基；p為1-5；和n為1-20；其中R1和R2不相同。
2.如權(quán)利要求1所述的比色體系，其中所述緩沖組合物選自HEPES緩沖劑、咪唑緩沖劑、PBS緩沖劑及其組合。
3.如權(quán)利要求1所述的比色體系，還包括探針。
4.如權(quán)利要求1所述的比色體系，其中所述探針選自纖維蛋白原、鏈霉親和素、IgG、及其組合。
5.如權(quán)利要求1所述的比色體系，還包括表面活性劑。
6.如權(quán)利要求1所述的比色體系，其中所述轉(zhuǎn)導(dǎo)物為脂質(zhì)體。
7.如權(quán)利要求1所述的比色體系，其中所述轉(zhuǎn)導(dǎo)物在與所述緩沖組合物接觸時(shí)表現(xiàn)出顏色變化。
8.如權(quán)利要求1所述的比色體系，其中所述緩沖劑通過與轉(zhuǎn)導(dǎo)物的離子相互作用來介導(dǎo)分析物的相互作用。
9.如權(quán)利要求1所述的比色體系，其中所述緩沖組合物通過增強(qiáng)與轉(zhuǎn)導(dǎo)物的疏水相互作用來介導(dǎo)分析物的相互作用。
10.如權(quán)利要求1所述的比色體系，其中R1為 其中R7為亞乙基、1，3-亞丙基、1，4-亞丁基、1，5-亞戊基、1，6-亞己基、1，7-亞庚基、1，8-亞辛基、或1，9-亞壬基，R6為亞乙基、1，3-亞丙基、亞乙烯基、或亞苯基；和其中R2為 其中R20為亞乙基、1，3-亞丙基、1，4-亞丁基、1，5-亞戊基、1，6-亞己基、1，7-亞庚基、1，8-亞辛基、或1，9-亞壬基，其中R21為十一烷基、十三烷基、十五烷基、十七烷基；和其中p為1。
11.如權(quán)利要求10所述的比色體系，其中R1為 R7為亞乙基；和R2為 R20為1，4-亞丁基，其中R21為十三烷基；和p為1。
12.如權(quán)利要求1所述的比色體系，其中所述受體包括磷脂。
13.如權(quán)利要求12所述的比色體系，其中所述磷脂選自磷酸膽堿、磷酸乙醇胺、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、及其組合。
14.如權(quán)利要求1所述的比色體系，其中所述緩沖組合物包括兩種或多種不同的緩沖劑。
15.一種用于檢測分析物的方法，包括形成比色傳感器，該傳感器包括受體和含二乙炔的聚合組合物，其中所述受體被摻入到聚合組合物中以形成轉(zhuǎn)導(dǎo)物，該轉(zhuǎn)導(dǎo)物能夠表現(xiàn)出顏色變化；使傳感器與探針接觸；在緩沖組合物存在的情況下，還使傳感器與懷疑包含靶分析物的樣品接觸；和如果分析物存在，則觀察顏色變化；其中所述二乙炔化合物在聚合前具有下式 其中R1包括C1-C20烷基、 R2包括 R3、R8、R13、R21、R24、R31和R33獨(dú)立地為C1-C20烷基；R4、R5、R7、R14、R16、R19、R20、R22、R25和R32獨(dú)立地為C1-C14亞烷基；R6、R15、R18和R26獨(dú)立地為C1-C14亞烷基、C2-C8亞烯基、或C6-C13亞芳基；R9為C1-C14亞烷基或-NR34-；R10、R12、R27和R29獨(dú)立地為C1-C14亞烷基或(C1-C14亞烷基)-(C2-C8亞芳基)；R11和R28獨(dú)立地為C2-C30炔基；R17為酯活化基團(tuán)；R23為C6-C13亞芳基；R30為C1-C14亞烷基或-NR36-；R34和R36為C1-C4烷基；p為1-5；和n為1-20；其中R1和R2不相同。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述緩沖組合物包括兩種或多種不同的緩沖劑。
17.一種用于檢測分析物的方法，包括形成比色傳感器，該傳感器包括受體和含二乙炔的聚合組合物，其中所述受體被摻入到聚合組合物中以形成轉(zhuǎn)導(dǎo)物，該轉(zhuǎn)導(dǎo)物能夠在探針存在的情況下表現(xiàn)出顏色變化；在緩沖組合物存在的情況下，使轉(zhuǎn)導(dǎo)物與懷疑包含靶分析物的樣品、和對(duì)靶分析物和受體兩者都有親和力的探針接觸；和如果分析物存在，則基本觀察不到顏色變化；其中所述二乙炔化合物在聚合前具有下式 其中R1包括C1-C20烷基、 R2包括 R3、R8、R13、R21、R24、R31和R33獨(dú)立地為C1-C20烷基；R4、R5、R7、R14、R16、R19、R20、R22、R25和R32獨(dú)立地為C1-C14亞烷基；R6、R15、R18和R26獨(dú)立地為C1-C14亞烷基、C2-C8亞烯基、或C6-C13亞芳基；R9為C1-C14亞烷基或-NR34-；R10、R12、R27和R29獨(dú)立地為C1-C14亞烷基或(C1-C14亞烷基)-(C2-C8亞芳基)；R11和R28獨(dú)立地為C2-C30炔基；R17為酯活化基團(tuán)；R23為C6-C13亞芳基；R30為C1-C14亞烷基或-NR36-；R34和R36為C1-C4烷基；p為1-5；和n為1-20；其中R1和R2不相同。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述靶分析物選自金黃色葡萄球菌(S.aureus)、蛋白A、PBP2′、大腸桿菌(E.coli)、和銅綠假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa)。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，其中在轉(zhuǎn)導(dǎo)物與懷疑包含靶分析物的樣品接觸60分鐘內(nèi)，發(fā)生可觀察到的顏色變化。
20.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述緩沖組合物包括兩種或多種不同的緩沖劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于檢測分析物的比色傳感器。本發(fā)明還公開了使用比色傳感器和試劑盒來比色檢測分析物的方法。
文檔編號(hào)G01N33/544GK101080637SQ200580043429
公開日2007年11月28日 申請(qǐng)日期2005年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月17日
發(fā)明者G·馬爾科·博馬里托, 布林達(dá)·B·拉克希米 申請(qǐng)人:3M創(chuàng)新有限公司