專利名稱：：檢測(cè)糖類的傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及傳感器、制備傳感器的方法和^f吏用傳感器的方法。該傳感器可以用于使用光學(xué)技術(shù)測(cè)量或監(jiān)測(cè)流體中的糖類，例如體液中的葡萄糖。該傳感器特別適用于必須精密地監(jiān)測(cè)葡萄糖水平和/或必須重復(fù)地測(cè)量葡萄糖的情況，例如在糖尿病監(jiān)護(hù)中。
背景技術(shù)：
：在糖尿病監(jiān)護(hù)中，血液中葡萄糖的常規(guī)測(cè)量是必要的，以便保證恰當(dāng)?shù)囊葝u素劑量。另外，已經(jīng)表明在糖尿病患者的長(zhǎng)期護(hù)理中較好地控制血糖水平可以延緩，如果不能預(yù)防，視網(wǎng)膜病、循環(huán)問題和其它與糖尿病相關(guān)的變性疾病的發(fā)作。因此，糖尿病患者需要可靠和精確地自我監(jiān)測(cè)血糖水平。希望測(cè)量可能發(fā)生在糖尿病患者中的濃度范圍內(nèi)的血糖，即，0~35mM或甚至更高。目前，糖尿病患者利用可商業(yè)得到的比色測(cè)試條或電化學(xué)生物傳感器(例如酶電極)來監(jiān)測(cè)血糖，但是它們?cè)跍y(cè)量時(shí)每次都需要常規(guī)地使用柳葉刀型的工具以取出合適量的血液。大多數(shù)糖尿病患者平均每天要使用這種工具測(cè)量血糖兩次。但是，美國NationalInstituteofHealth推薦每天應(yīng)該進(jìn)行至少四次血糖測(cè)試，美國糖尿病協(xié)會(huì)(AmericanDiabetesAssociation)已經(jīng)認(rèn)可了這個(gè)推薦。血糖測(cè)試頻率的增加給糖尿病患者施加了相當(dāng)大的負(fù)擔(dān)，不僅在金錢方面而且在疼痛和不適方面，尤其是不得不常規(guī)地使用柳葉刀從指尖采血的長(zhǎng)期糖尿病患者。因此，亳無疑問地，需要不用從患者采血的較好的長(zhǎng)期葡萄糖監(jiān)測(cè)體系。已經(jīng)有許多不需要從患者采血的葡萄糖測(cè)量技術(shù)的提議。觀察到分析物在皮下流體中的濃度與所述分析物在血液中的濃度相關(guān)，因此已經(jīng)有幾個(gè)使用位于皮下位置中的葡萄糖監(jiān)測(cè)裝置的報(bào)告。對(duì)可以遠(yuǎn)程訊問的葡萄糖竟?fàn)幗Y(jié)合檢測(cè)物(assay)的使用是尤其感興趣的。一種測(cè)定竟?fàn)幗Y(jié)合的方法為使用基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分對(duì)(proximity-basedsignalgenerating/modulatingmoietypair)(在US6232120中討論)，所述部分對(duì)通常是能量轉(zhuǎn)移供體-受體對(duì)(包含能量供體部分和能量受體部分)。能量供體部分是光致發(fā)光的(通常是熒光的)。在該方法中，使能量轉(zhuǎn)移供體-受體對(duì)與待分析的樣品接觸(例如皮下流體)。然后樣品發(fā)光并且檢測(cè)所產(chǎn)生的發(fā)射。供體-受體對(duì)的或者能量供體部分或者能量受體部分與受體載體結(jié)合，而供體-受體對(duì)的另一部分(結(jié)合到配體栽體)和存在的任何分析物竟?fàn)幵谑荏w栽體上的結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)使供體和受體在一起時(shí)它們之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，這產(chǎn)生能量供體部分的熒光性的可檢測(cè)的壽命變化(減少)。由能量供體部分發(fā)射的部分熒光信號(hào)也猝滅。通過分析物的竟?fàn)幗Y(jié)合使壽命變化減少或甚至消失。因此，通過測(cè)量明顯的發(fā)光壽命，例如通過相調(diào)制熒光計(jì)或時(shí)間分辨熒光計(jì)(參見Lakowicz,PrinciplesofFluorescenceSpectroscopy,PlenumPress,1983，第3章)，可以測(cè)定樣品中分析物的量。應(yīng)當(dāng)注意能量轉(zhuǎn)移的效率取決于供體的量子產(chǎn)率、供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光鐠的重疊、和供體與受體之間的相對(duì)距離和方向。在EP0561653中，7>開了一種如上所述的訊問受體和配體的方法。供體-受體能量轉(zhuǎn)移的例子為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(F6rster共振能量轉(zhuǎn)移，F(xiàn)RET)，其是從初始激發(fā)的供體(D)到受體(A)的非輻射的激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移。供體通常在較短波長(zhǎng)處發(fā)射，并且它的發(fā)射光譜與受體的吸收光鐠重疊。沒有出現(xiàn)光子地發(fā)生能量轉(zhuǎn)移并且是供體和受體之間的長(zhǎng)程偶極-偶極相互作用的結(jié)果。術(shù)語共振能量轉(zhuǎn)移(RET)是更準(zhǔn)確的，因?yàn)镕RET方法不包括光子的出現(xiàn)。但是FRET和RET通?？梢蕴鎿Q使用。RET的重要特性在于它可以在相當(dāng)于生物大分子尺寸的距離內(nèi)發(fā)生。被稱為F6rster距離的FRET50。/。有效的距離，通常為20~60A。20~90人的F6rster距離i更于竟?fàn)幗Y(jié)合研究。用供體(D)標(biāo)記分析物結(jié)合部分并用受體(A)標(biāo)記分析物類似物，或者反之亦然，將會(huì)生成可產(chǎn)生基于供體-受體距離的可測(cè)量響應(yīng)的檢測(cè)抽-因此，D-"分析物結(jié)合部分"結(jié)合到A-"分析物類似物"導(dǎo)致供體強(qiáng)度或壽命的降低。樣品中的分析物與在D-"分析物結(jié)合部分"上的分析物結(jié)合部分竟?fàn)?，從受體(A)釋放D-"分析物結(jié)合部分"。因此期望供體的強(qiáng)度衰減時(shí)間和相角隨葡萄糖濃度的增加而增加。將這些原理用于通過能量轉(zhuǎn)移的葡萄糖感測(cè)。WO91/09312描述了一種采用基于通過光學(xué)裝置遠(yuǎn)程訊問的葡萄糖(引入能量轉(zhuǎn)移供體-受體對(duì))的親和檢測(cè)物的皮下方法和裝置。每個(gè)例子W097/19188、WO00/02048、WO03/006992和WO02/30275描述通過產(chǎn)生可以被遠(yuǎn)程讀取的光學(xué)信號(hào)的能量轉(zhuǎn)移的葡萄糖感測(cè)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解受體可以是熒光團(tuán)。在能量受體部分的吸收光鐠內(nèi)的波長(zhǎng)的入射輻射束激發(fā)后，由能量受體部分發(fā)射的任何熒光信號(hào)未受到FRET過程的影響。因此，可以將由能量受體部分發(fā)射的熒光信號(hào)的強(qiáng)度用作內(nèi)參比信號(hào)，例如在傳感器的連續(xù)校準(zhǔn)中，或者可以監(jiān)測(cè)傳感器降級(jí)的程度并因此指示需要植入或注入新傳感器。該信號(hào)下降到可接受的基線水平之下表明需要植入或注入新傳感器。但是，能量受體部分可以是非熒光染料。在這種情況下用具有熒光猝滅性能的化合物代替特定的能量受體部分。由Tyagi等人NatureBiotechnology(1998)18:49頁給出強(qiáng)有力的和非特定的熒光猝滅劑的例子。上述體系基于伴刀豆球蛋白A(ConA)作為葡萄糖綴合劑。伴刀豆球蛋白A是凝集素。術(shù)語"凝集素"包括不明顯地涉及糖代謝的和不屬于任何免疫球蛋白主類的任何糖綴合蛋白。凝集素通過糖類識(shí)別域(carbohydraterecognitiondomaiiis(CRDs))對(duì)糖類表現(xiàn)出選擇性結(jié)合。凝集素以單體或多聚體形式天然地存在，后者通常包含許多子單元，每個(gè)子單元具有幾個(gè)CRDs。在檢測(cè)物條件下的伴刀豆球蛋白A不是長(zhǎng)期穩(wěn)定的。本申請(qǐng)人的實(shí)驗(yàn)(見實(shí)施例8)表明伴刀豆球蛋白A在體溫下穩(wěn)定小于20天。另外，伴刀豆球蛋白A是有毒的和可能產(chǎn)生免疫性的(但是，它以在人體中被認(rèn)為是安全的小量用于葡萄糖分析)。還表明香豌豆和小扁豆凝集素可以在該體系中用作葡萄糖類綴合部分("APotentiallyImplantableFluorescentGlucoseSensorBasedonMolecularRecognitioninPoly(ethyleneglycol)Hydrogels"，RyanJ.Russell等人,提交到AmericanInstituteofChemicalEngineers).但是，估計(jì)這些凝集素具有與ConA類似的缺點(diǎn)。US6232130公開一種使用低價(jià)凝集素("糖類綴合配體")的檢測(cè)物。其具有3個(gè)或更少的CRDs。該檢測(cè)物使用包含糖類、標(biāo)記物(例如FRET組分)和載體分子的分析物類似物(糖類綴合物(glycoconjugate))。該載體分子可以為蛋白(例如牛血清白蛋白，BSA)或合成聚合物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人意識(shí)到需要發(fā)現(xiàn)具有良好穩(wěn)定性并且不具有與ConA相關(guān)缺點(diǎn)的糖類綴合部分。它們研究了可替代的糖類綴合部分的使用。它們驚奇地發(fā)現(xiàn)動(dòng)物凝集素包括人類凝集素可以用作糖類綴合部分。因此，在第一方面中，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)或測(cè)量流體中的糖類分析物的傳感器，所述傳感器包含其讀出為可檢測(cè)的或可測(cè)量的光學(xué)信號(hào)的竟?fàn)幗Y(jié)合檢測(cè)物組分，所述組分^JL許分析物擴(kuò)散但不允許檢測(cè)物組分?jǐn)U散的材料保留，所述檢測(cè)物組分包括動(dòng)物凝集素；和能夠與糖類竟?fàn)幍亟Y(jié)合到凝集素的分析物類似物。分析物優(yōu)選為單糖。在優(yōu)選實(shí)施方案中，分析物為葡萄糖。優(yōu)選地，傳感器適于檢測(cè)或測(cè)量體液中的葡萄糖，例如皮下流體。希望傳感器適合用于體內(nèi)，并且下面將詳細(xì)討論。優(yōu)選分析物類似物能夠在生理鈣濃度下與葡萄糖竟?fàn)?。生理鈣濃度通常在1.15~L29mM范圍內(nèi)。檢測(cè)合適的檢測(cè)技術(shù)包括FRET、熒光能量轉(zhuǎn)移、熒光偏振、熒光猝滅、磷光、發(fā)光增強(qiáng)、發(fā)光猝滅、衍射或等離激元共振。產(chǎn)生光學(xué)信號(hào)的結(jié)合檢測(cè)物應(yīng)該優(yōu)選為可逆的，以便可以實(shí)現(xiàn)分析物波動(dòng)水平的連續(xù)監(jiān)測(cè)。該可逆性是^"吏用結(jié)合檢測(cè)物形式的特別優(yōu)點(diǎn)，其中不消耗檢測(cè)物組分。優(yōu)選地，使用基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分對(duì)來產(chǎn)生可檢測(cè)的或可測(cè)量的光學(xué)信號(hào)。當(dāng)使該對(duì)的第一元件與該對(duì)的第二元件緊緊地接近時(shí)，產(chǎn)生或調(diào)制信號(hào)。優(yōu)選地，基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分對(duì)為能量供體部分和能量受體部分對(duì)。能量供體部分和能量受體部分也分別指供體和受體發(fā)色團(tuán)。不發(fā)射熒光的能量受體是指猝滅部分。在這種情況下，用能量供體和能量受體部分對(duì)之一來標(biāo)記凝集素，用能量供體和能量受體部分的另一個(gè)對(duì)來標(biāo)記分析物類似物。本發(fā)明傳感器的最優(yōu)選實(shí)施方案引入使用FRET技術(shù)產(chǎn)生光讀出的檢測(cè)物。當(dāng)將檢測(cè)物用于體內(nèi)時(shí)，希望供體在550到約700nm處發(fā)熒光，受體在約650nm處吸收光。這避免了供體熒光和體內(nèi)較短波長(zhǎng)自身熒光之間的重疊。AlexaFluor5947、例如為琥珀酰亞胺酯)是用于體內(nèi)的具有合適發(fā)射光諉的能量供體部分。該染料在594nm處吸收，并在620nm處發(fā)熒光。在WO05/059037中描述的HMCV染料是用于本發(fā)明的合適的能量受體部分。這些染料是穩(wěn)定的碳正離子。一個(gè)例子是六曱氧基-結(jié)晶紫琥珀酰亞胺酯(HMCV-1)。作為可替代方案，可以將QSY21tm用作能量受體部分，將AIexaFluor594TM用作能量供體部分?？梢赃M(jìn)行熒光壽命或熒光強(qiáng)度的測(cè)量。可以通過相位調(diào)制技術(shù)測(cè)量熒光壽命(下文討論)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用AlexaFluor594來標(biāo)記凝集素作為能量供體部分，用HMCV-1來標(biāo)記分;f斤物類似物作為能量受體部分，并且通過相位調(diào)制技術(shù)測(cè)量熒光壽命。保持檢測(cè)物組分的物質(zhì)優(yōu)選為能量供體和能量受體部分提供足夠的空間，以當(dāng)彼此不結(jié)合時(shí)分開以便可以終止能量轉(zhuǎn)移。凝集素凝集素優(yōu)選在檢測(cè)物中在至少10天內(nèi)提供穩(wěn)定的信號(hào)，更優(yōu)選至少14天。尤其優(yōu)選當(dāng)傳感器被植入體內(nèi)后提供穩(wěn)定的信號(hào)。本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)MBL在葡萄糖檢測(cè)物中穩(wěn)定至少17天(見實(shí)施例8)。早先的記錄報(bào)導(dǎo)了MBL的生物半衰期為4~7天(Kilpatrick(2002)Transfus.Med.12，335)。凝集素優(yōu)選為C-型(鉤依賴型)凝集素。動(dòng)物凝集素優(yōu)選為脊推動(dòng)物凝集素，例如哺乳動(dòng)物凝集素，更優(yōu)選人類或人源化凝集素。但是，作為可替代方案，它可以是鳥凝集素、魚凝集素或無脊推動(dòng)物凝集素例如昆蟲凝集素。合適地，凝集素為源于人體的人類凝集素。作為可替代方案，凝集素可以是重組制造的凝集素。作為另外的可替代方案，凝集素可以是人源化的動(dòng)物凝集素，例如人源化的牛凝集素。這適用于存在相應(yīng)的人類凝集素時(shí)?？梢砸灶愃瓶贵w的方式人源化凝集素。合適地，凝集素為多聚體形式。多聚體凝集素可以源于人類或動(dòng)物體。作為可替代方案，凝集素可以為單體形式?？梢酝ㄟ^重組法或通過破壞在源于人類或動(dòng)物體的天然多聚體凝集素中的子單元之間的結(jié)合來形成單體凝集素。在US6232130中描述了該例子。優(yōu)選地，凝集素具有三個(gè)或更多個(gè)CRDs。更優(yōu)選地，凝集素具有6個(gè)或更多個(gè)CRDs。優(yōu)選地，凝集素為膠原凝素(膠原狀的凝集素)。這些是具有膠原狀序列(Gly-Xaa-Yaa三聯(lián)體(triplet))的C型動(dòng)物凝集素。MBL是C型膠原凝素，而伴刀豆球蛋白A是C型凝集素。可以通過膠原酶的作用來制備單體膠原凝素crds。優(yōu)選地，凝集素為甘露糖綴合凝集素、膠固素或膠原凝素-43(例如牛CL-43)(全血清膠原凝素)或肺表面活性劑蛋白(肺膠原凝素)。已經(jīng)證明甘露糖綴合凝集素(也被稱為甘露聚糖綴合凝集素或甘露聚糖綴合蛋白，MBL，MBP)例如人類MBL是特別引人注意的。MBL為在"花束型"(bouquet)排列中包含幾個(gè)(通常是3~4個(gè)(MALDI-MS)，盡管很可能出現(xiàn)1~6個(gè)的分布(SDS-PAGE))子單元的膠原狀防御分子(defencemolecule),每個(gè)所述子本元由三個(gè)相同的多肽組成。每個(gè)子單元具有約75kDa的分子量，并可以任選地與一個(gè)或多個(gè)MBL相關(guān)絲氨酸蛋白酶(MASPs)絡(luò)合。每個(gè)多肽包含CRD。因此，每個(gè)子單元存在三個(gè)糖類結(jié)合位點(diǎn)。三聚MBL和四聚MBL(其為存在于人血清中的主要形式，Teillet等人，JournalofImmunology,2005，2870-2877頁)分別存在九個(gè)和十二個(gè)糖類結(jié)合位點(diǎn)。MBL作為先天免疫系統(tǒng)的一部分天然地存在于體內(nèi)，其中它結(jié)合覆蓋在細(xì)菌表面的甘露糖部分。人MBL是無毒的并且對(duì)人類是非產(chǎn)生免疫性的。期望其它物種的MBL是產(chǎn)生免疫性的但對(duì)人類是無毒的。人MBL是以源于人體的形式和以重組制造的形式可商業(yè)得到的。在被認(rèn)為對(duì)傳染性疾病具有增加易感性的MBL缺乏患者的治療中，將它用作替代治療。合適地，凝集素基本上是三聚和/或四聚形式的MBL。如上說明，認(rèn)為三聚MBL和四聚MBL是天然地存在于人血清中的主要的多聚體形式。作為可替代方案，凝集素可以是選自SP-A和SP-D的肺表面活性劑蛋白。這些蛋白與MBL相似。它們是在先天宿主防御(host-defence)功能中作為鈣依賴型糖綴合蛋白的水溶性的膠原凝素。SP-D也綴合脂質(zhì)。SP-A具有與MBL相似的"花束型"結(jié)構(gòu)(Kilpatrick,D.C.(2000)HandbookofAnimalLectins,37頁)。SP-D具有四聚體的"X，，結(jié)構(gòu)，在"X"的每一端具有CRDs。其它合適的動(dòng)物凝集素為如下列出的那些PC-凝集素(US20030216300、US20040265898)CTL-l(US179528/10)角質(zhì)形成細(xì)胞膜(Keratinocytemembrane)凝集素(ParfuemerieundKosmetik74，164-80)CD94(EurJImmunol25,2433-7)P35(又名人類L-纖維膠凝蛋白，一組凝集素)(ImmunolLett67，109-12)ERGIC-53(又名MR60)(Mo1BiolCell,7，483-93)HIP/PAP(EurJBiochem267,1665-71)CLECSF8(EurJImmunol34，210-20)DCL(凝集素組)(申請(qǐng)No.00231996/US)GLUT家族蛋白，尤其是GLUT1、GLUT4和GLUTll(PNAS97,1125-30)其它合適的動(dòng)物凝集素如列于"HandbookofAnimalLectins:PropertiesandBiomedicalApplications",DavidC.Kilpatrick,Wiley2000的附錄A、B和C的。優(yōu)選如上述標(biāo)記凝集素。更優(yōu)選用能量供體部分標(biāo)記凝集素。分析物類似物分析物類似物優(yōu)選包含綴合到凝集素的綴合位點(diǎn)的多個(gè)糖類或糖類模擬部分。術(shù)語"糖類"包括蔗糖。合適的糖類模擬部分包括肽，例如模擬N-乙酰基葡糖胺的角蛋白肽(SFGSGFGGGY)。已經(jīng)表明角蛋白肽可以抑制MBL(Mantacto等人2001J.Immunol.166，4148-4153)。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)普通糖類部分對(duì)MBL的親合力如下D-甘露糖、N-乙?；?D-甘露糖胺、D-果糖、D-明串珠菌二糖、伊爾糖、N-乙?；?D-葡糖胺、L-巖藻糖〉肌醇、D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、D-帕拉金糖、D-松二糖、D-山梨糖醇、D-核糖、D-塔格糖》D-來蘇糖〉乳糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖。雖然不希望被該理論限制，但是本發(fā)明人相信對(duì)MBL和其他凝集素的強(qiáng)結(jié)合是在多個(gè)位點(diǎn)結(jié)合的結(jié)果。對(duì)每個(gè)位點(diǎn)的結(jié)合是相對(duì)弱的(低親和力)但累積效應(yīng)是強(qiáng)結(jié)合(高親和力)。因此，沒有結(jié)合全部結(jié)合位點(diǎn)的分析物類似物更易于被結(jié)合全部結(jié)合位點(diǎn)的分析物取代。這解釋了為什么對(duì)MBL具有比葡萄糖更高親合力的含有甘露糖的分析物類似物可以被葡萄糖取代。影響分析物類似物對(duì)指定凝集素的親合力的參數(shù)為-糖類或糖類模擬部分的數(shù)目；-糖類或糖類模擬部分對(duì)凝集素的親合力；-鈣濃度(至少對(duì)MBL);和-分析物類似物的柔性。不能控制生理鈣濃度。但是，可以選擇其它參數(shù)以得到具有合適測(cè)量范圍的分析物類似物。分析物類似物柔性對(duì)檢測(cè)物性能的影響之前沒有鑒別過或提出過。先前公開的分析物類似物(例如US6232130公開的那些)包含綴合糖類和能量供體或能量受體部分的球狀蛋白。在這種分子中糖類和能量供體或能量受體部分具有固定的位置。這意味著分析物類似物不能必要地采取使多個(gè)糖類部分綴合到凝集素CRDs的構(gòu)型。同樣地，當(dāng)分析物類似物和凝集素綴合時(shí)，在該分析物類似物中的糖類和能量供體或能量受體部分的相對(duì)位置可能不能使得能量供體和受體部分之間的最佳相互作用。這將影響FRET和減弱光信號(hào)。最后，這些分析物類似物在生理鈣濃度下通常不綴合到凝集素。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)甘露糖的糖類綴合物對(duì)MBL的最佳綴合所需的鈣濃度為約20mM。本發(fā)明人利用這些見解開發(fā)對(duì)相同凝集素具有不同親合力的各種分析物類似物，其因此可以用來測(cè)量不同濃度范圍內(nèi)的糖類濃度。優(yōu)選地，檢測(cè)物能夠測(cè)量在至少部分0~35mM葡萄糖范圍內(nèi)的血糖濃度，例如025mM葡萄糖范圍內(nèi)。合適地，ICs。值為約15mM葡萄糖。更優(yōu)選地，檢測(cè)物能夠測(cè)量在210mM葡萄糖范圍內(nèi)的葡萄糖濃度。希望在該范圍內(nèi)的劑量-響應(yīng)曲線盡可能地接近直線。對(duì)于分析物類似物，三種不同類型的結(jié)構(gòu)特別有意義。糖類-蛋白質(zhì)綴合物或糖類-樹狀聚體綴合物首先，分析物類似物可以為糖類-蛋白質(zhì)綴合物或糖類-樹狀聚體綴合物。在任一這些情況下，可以使用糖類模擬部分代替糖類部分，或除糖類部分之外使用糖類模擬部分。用于這種綴合物的合適的糖類的例子為單糖和寡糖。合適的單糖為任選地衍生的丁糖、戊糖、己糖、庚糖或較高的同源醛糖類或酮糖類，例如任選地衍生的D-葡萄糖、D-甘露糖、N-乙酰基-D-葡糖胺、L-巖藻糖、D-果糖、D-塔格糖或D-山梨糖醇。合適的低聚物可以為直鏈的或帶支鏈的均寡聚物或混合的寡聚物，例如包含2~50個(gè)糖類單元。優(yōu)選的糖基化為1—6或1—2，因?yàn)楣烙?jì)1—3和1—4糖基化會(huì)干擾MBL結(jié)合。例如，估計(jì)壬(l—6)-a-葡萄糖(葡聚糖1500Da)對(duì)MBL比1,3-!3-D-葡萄糖(lamiiianarihexaose)具有更高的親合力。合適的寡糖包括潘糖(pannose)、麥芽糖、麥芽三糖、異麥芽三糖、D-明串珠菌二糖、伊爾糖(erlose)、D-帕拉金糖(D-palatinose)、D-松二糖或1~250kDa的葡聚糖(優(yōu)選l40kDa的葡聚糖，例如lkDa、1.5kDa、5kDa、6kDa、10kDa、12kDa、20kDa、25kDa或40kDa的葡聚糖)。優(yōu)選地，分析物類似物包含選自D-果糖、D-明串珠菌二糖、N-乙酰基-葡糖胺、D-甘露糖、L-巖藻糖、N-乙?；?甘露糖胺、D-阿拉伯糖，肌醇、D-塔格糖、伊爾糖、D-葡萄糖、D-帕拉金糖、D-松二糖、D-核糖、D-山梨糖醇的至少一種糖類部分。更優(yōu)選地，分析物類似物包含至少一個(gè)葡萄糖部分和/至少一個(gè)N-乙?；?葡糖胺部分和/或至少一個(gè)甘露糖部分，因?yàn)樗鼈儗?duì)MBL和其它動(dòng)物凝集素具有高的親合力。認(rèn)為這些部分通過它們的C3和C4羥基基團(tuán)綴合到凝集素的結(jié)合位點(diǎn)。合成的帶支鏈的糖類的例子為用于構(gòu)建樹枝狀高分子(例如源于具有胺連接基的三糖的TRIS，如下所示)的樹枝狀高分子"楔(wedges)"。該"楔"能夠例如通過雙官能團(tuán)胺連接基，綴合在蛋白例如HSA(人類血清白蛋白)上。用于綴合物的優(yōu)選蛋白是具有至少10kDa分子量的人類蛋白，優(yōu)選至少20kDa。蛋白優(yōu)選具有非球狀的整體三級(jí)結(jié)構(gòu)。相信這有助于在多于一個(gè)的結(jié)合位點(diǎn)處結(jié)合，導(dǎo)致高的親合力。單克隆抗體例如赫賽汀(herc印tin)和RemicadeTM(含有帶有非球狀"Y，，形整體三級(jí)結(jié)構(gòu)的幾個(gè)球狀域的免疫球蛋白)是合適的。其它可替代的合適的蛋白為人類凝血酶、人類乳鐵蛋白和因子XIII。作為糖類-蛋白質(zhì)綴合物的另一個(gè)例子，蛋白可以是源于凝集素的蛋白，例如除去CRDs的凝集素。合適地，綴合物可以為糖類-白蛋白質(zhì)綴合物。例如，綴合物可以為甘露糖-HSA綴合物或甘露糖-BSA(牛血清白蛋白)綴合物。但是，該類型綴合物不是優(yōu)選的，因?yàn)槿缟纤?，已?jīng)發(fā)現(xiàn)對(duì)MBL的綴合依賴于鈣濃度。在生理鈣濃度下，發(fā)現(xiàn)具有20個(gè)甘露糖殘基的70kDa甘露糖-HSA綴合物不與MBL綴合。對(duì)鉀濃度的依賴隨甘露糖基化的增加而降低。本領(lǐng)域技術(shù)人類員應(yīng)當(dāng)知道這種類型綴合物的合成路線。作為例子，N-異氰疏基-4-氨基苯基-0-a-D-吡喃甘露糖苷(Man-ITC)可以綴合在HSA上。用于本發(fā)明的樹枝狀高分子優(yōu)選具有胺官能化的、羧酸官能化的或羥基官能化的表面。優(yōu)選地，樹枝狀高分子為聚酰胺胺(PAMAM)或聚丙烯亞胺(DAB)型。優(yōu)選地，分子量小于60kDa，例如約210kDa。通過腎可以清除這種樹枝狀高分子(Kobayashi等人,2004,J.Mag.Reson.Imaging20(3)512-518)。多糖類第二，分析物類似物可以任選地為糖類和/或糖類模擬部分的衍生聚合物(二者都包括在在此使用的術(shù)語"多糖類"內(nèi))。葡聚糖(葡萄糖聚合物，聚(l—6)-a-葡萄糖)極強(qiáng)地綴合到MBL和類似的凝集素上。本發(fā)明人認(rèn)為這是大量葡萄糖殘基(在70kDa葡聚糖中約430個(gè)殘基)和葡聚糖的柔性的結(jié)果。因此，從MBL中取代葡聚糖所需的葡萄糖的濃度是高的?；谄暇厶呛蚆BL的葡聚糖檢測(cè)物可以最佳地測(cè)量約30mM的葡萄糖濃度。這比血液中正常的5mM葡萄糖濃度高得多。該檢測(cè)物可以測(cè)量010mM的葡萄糖濃度，具有全部相位響應(yīng)(每mMGlc0.25°相移，見實(shí)施例7)的僅約三分之一的靈敏度。因此，本發(fā)明人尋找可以不太強(qiáng)地綴合MBL和類似凝集素的可替代的分沖斤物類似物，以^更可以在0~10mM葡萄糖范圍內(nèi)得到超過三分之一的全部相位響應(yīng)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)用高碘酸鹽(其氧化地打開2和3位或3和4位碳之間的葡萄糖吡喃糖環(huán)，以形成二醛)處理葡聚糖可以用來降低葡聚糖對(duì)MBL和類似凝集素的親合力。這似乎是因?yàn)槿缟险f明的，MBL綴合到葡萄糖的3和4位平伏羥基?？梢砸云渌绞?例如通過氧化、還原、烷基化、取代、糖基化或酯化)使3和4位羥基失活。本發(fā)明人非常驚奇地發(fā)現(xiàn)高碘酸鹽處理的葡聚糖-MBL綴合沒有被生理鈣濃度阻止。這和上面討論的甘露糖-HSA綴合物MBL綴合相反。本以為高碘酸鹽處理的葡聚糖-MBL綴合會(huì)被生理釣濃度阻止，尤其是因?yàn)槠暇厶堑钠咸烟遣糠謱?duì)MBL具有比甘露糖部分小的親合力。理論上，每個(gè)葡萄糖單元能夠消耗兩個(gè)當(dāng)量的高碘酸鹽(每個(gè)二醇一個(gè))。但是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對(duì)于70kDa葡聚糖，1~100當(dāng)量的高碘酸鹽是合適的。用氨或胺處理二醛隨后還原(例如用氰基硼氫化鈉)可以用來得到氨化的葡聚糖。還可以使用其中胺化二醛隨后任選地催化氳化以得到游離胺的方法。在這種情況下千胺是可用的胺，這是因?yàn)闅浠暗闹虚g體是具有親水部分的葡聚糖衍生物。使用分光光度測(cè)定技術(shù)，可以用千胺衍生的胺化葡聚糖來評(píng)估高碘酸鹽裂解的程度。如果通過催化氫化除去節(jié)基，可以將能量供體或能量受體部分偶連到剩余的胺上。作為替代方案，可以合成基于多糖類的分析物類似物，其具有對(duì)MBL和類似凝集素具有不同親合力的不同的糖類或糖類模擬部分。在Ballerstadt等人，DiabetesTechnology&Therapeutics,vol.6，no.2，2004中公開了在伴刀豆球蛋白AFRET檢測(cè)物中用甘露糖部分衍生葡聚糖，以調(diào)節(jié)葡萄糖的檢測(cè)范圍。半乳糖以非常低的親合力綴合MBL。因此，包含半乳糖部分(例如半乳糖衍生的葡聚糖)的分析物類似物對(duì)MBL具有比未衍生的分析物類似物更低的親合力。N-乙?；?葡糖胺對(duì)MBL具有高的親合力。因此包含N-乙?；?葡糖胺部分(例如GlcNAc衍生的直鏈淀粉)的分析物類似物對(duì)MBL具有比未衍生的分析物類似物更高的親合力。在該實(shí)施方案中，優(yōu)選地，分析物類似物選自任選衍生的葡聚糖、甘露聚糖、直鏈淀粉、支鏈淀粉、糖原、透明質(zhì)酸酯(鹽)、軟骨素、肝素、糊精、菊粉、木聚糖、果聚糖和殼多糖。由于半乳糖對(duì)MBL具有非常低的親合力，所以半乳糖的未衍生聚合物例如瓊脂糖作為分析物類似物不是優(yōu)選的。本領(lǐng)域技術(shù)人類員應(yīng)當(dāng)知道用糖類部分衍生多糖類的方法。作為例子，可以方便地衍生胺官能化的多糖類(例如氨基葡聚糖，其由CarboMer,SanDiego,California,USA,Cat.No.5-00060或MolecularProbes,Eugene,Oregon,USA，CatNo.D1862可商業(yè)得到)或上面提及的胺化葡聚糖。作為替代方案，可以用二乙烯基砜連接多糖類中的醇基和糖類或糖類模擬部分中的胺基。在EP594772中公開了衍生葡聚糖的方法。用于衍生多糖類的合適的糖類部分的例子為如上關(guān)于糖類-蛋白和糖類-樹狀聚體綴合物所述的那些。合成的聚合物第三，分析物類似物可以為合成的聚合物。合成人造聚合物而不是衍生蛋白或多糖類，使得易于控制聚合物的參數(shù)(例如分子柔性、水溶性、分子量、糖類或糖類模擬部分的性質(zhì)、糖類或糖類模擬部分的數(shù)目、基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分的數(shù)目)以改善檢測(cè)物性能。與多糖類相比，合成聚合物具有可以獨(dú)立于聚合物長(zhǎng)度而控制糖類部分?jǐn)?shù)目的優(yōu)點(diǎn)。此外，與葡聚糖相比，在聚合物中使用不含環(huán)的單體例如丙烯酸2-羥乙酯(HEA)得到增加的分子轉(zhuǎn)動(dòng)柔性。不希望被該理論限制，本發(fā)明人認(rèn)為重要的是基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分接近于結(jié)合部分以產(chǎn)生強(qiáng)信號(hào)。球狀配體將結(jié)合部分和基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分集中在球面上，使得它們是接近的。在直鏈葡聚糖中，主鏈由結(jié)合部分組成，并因此不能控制結(jié)合是接近還是遠(yuǎn)離基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分。在合成聚合物中，這可以通過接近于基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分定位結(jié)合部分來控制。在該實(shí)施方案中，分析物類似物優(yōu)選為具有糖類或糖類模擬部分側(cè)鏈的非糖類的柔性水溶性聚合物。術(shù)語"柔性的，，包含能夠明顯地在單體間轉(zhuǎn)動(dòng)的聚合物。優(yōu)選地，除了糖類或糖類模擬部分和基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分側(cè)鏈之外，聚合物不包含大的基團(tuán)(例如環(huán)結(jié)構(gòu)、叔丁基或其它空間位阻的大基團(tuán))。優(yōu)選地，該聚合物在主鏈結(jié)構(gòu)中具有很少的雙鍵(例如少于10%)。合適地，該聚合物不具有球狀三級(jí)結(jié)構(gòu)，盡管它們可能具有這種結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，聚合物是無支鏈的(與上面討論的樹枝狀高分子不同)，這改善了聚合物的柔性。但是，聚合物可以在一定程度上是帶支鏈的或交聯(lián)的，前提是這不會(huì)導(dǎo)致水凝膠的形成。例如，在具有100kDa整體分子量的聚合物中，1~5個(gè)支鏈?zhǔn)强梢越邮艿?。術(shù)語"水溶性的，，包含在室溫下具有至少4mg/ml水溶解度的聚合物，優(yōu)選至少25mg/ml，更優(yōu)選至少50mg/ml，例如至少100mg/ml。在體溫下溶解度將更高。聚合物為水溶性的是重要的，以便當(dāng)如下面討論的傳感器用于體內(nèi)時(shí)它可以溶于組織液。甚至當(dāng)被綴合到糖類結(jié)合分子例如MBL時(shí)聚合物應(yīng)該是水溶性的。優(yōu)選地，聚合物包含不多于1到5種類型的單體單元，更優(yōu)選不多于3種單體單元。合適地，聚合物為包含具有糖類或糖類模擬部分側(cè)鏈的第一單體單元?dú)埢途哂谢诮菩缘男盘?hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分側(cè)鏈的第二單體單元?dú)埢墓簿畚?。作為替代方案或附加方案，可以使用具有糖類或糖類模擬部分側(cè)鏈和基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分側(cè)鏈的單一單體單元?dú)埢?。?yōu)選使用笫一和第二單體單元，因?yàn)榭梢元?dú)立地控制糖類或糖類模擬部分和基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分的量。優(yōu)選地，共聚物為無規(guī)共聚物。但是，也可以為交替共聚物。不優(yōu)選使用具有大嵌段的嵌段共聚物。但是，可以使用具有低分子量(例如1~3kDa)嵌段的嵌段共聚物。優(yōu)選地，當(dāng)用于MBL作為糖類結(jié)合分子的檢測(cè)物時(shí)，聚合物在OmM葡萄糖下對(duì)MBL的綴合至少相當(dāng)于氨基葡聚糖綴合強(qiáng)度的50%，更優(yōu)選至少和氨基葡聚糖的強(qiáng)度一樣，但是易于被抑制。在0~35mM葡萄糖范圍內(nèi)，尤其是在215mM范圍內(nèi)，聚合物易于被抑制是特別重要的。這提供比使用氨基葡聚糖作為葡萄糖類類似物的類似檢測(cè)物更靈敏的在特定生理意義的葡萄糖濃度內(nèi)的檢測(cè)物?？梢源嬖诰哂刑穷惢蛱穷惸M部分的多于一種類型的單體單元?dú)埢Ｌ穷惢蛱穷惸M部分可以是不同的，對(duì)MBL和類似凝集素具有不同的親合力。合適地，每個(gè)第一單體單元(或單個(gè)單體單元)為糖類或糖類模擬部分的含雙鍵衍生物。但是，每個(gè)第一單體單元(或單個(gè)單體單元)可以為包含官能團(tuán)的含雙鍵分子，在聚合后，糖類或糖類模擬部分可以合適地連接到所述官能團(tuán)上。優(yōu)選地，糖類或糖類模擬部分的含雙鍵衍生物為糖類或糖類模擬部分的含烯丙基或乙烯基的衍生物。其它合適的糖類或糖類模擬部分的含雙鍵衍生物包括烯丙基衍生物的同系物，例如3-丁烯基或4-戊烯基衍生物，或在4位具有糖類或糖類模擬部分的苯乙烯衍生物。糖類或糖類模擬部分的其它合適的含雙鍵衍生物包括基于HEA、甲基丙烯酸2-羥乙酯(HEMA)或乙烯醇(VA)的衍生物。糖類或糖類模擬部分可以連接到第一單體單元(或單個(gè)單體單元)的胺、酸、醇和/或砜官能團(tuán)上。例如，可以使用二乙烯基砜連接單體單元中的醇基和糖類或糖類模擬部分中的胺基。當(dāng)糖類為甘露糖時(shí)，不應(yīng)該通過C3-OH或C4-OH基團(tuán)連接，因?yàn)檫@些基團(tuán)在對(duì)MBL的綴合中是重要的。在這種情況下，二乙烯基砜連接可能是不合適的。可以通過二糖的還原胺化產(chǎn)生氨基衍生的糖類部分。這使得糖類部分在其異頭位置(C1)處連接。可以通過費(fèi)歇爾(Fischer)苷化將糖類或糖類模擬部分連接到醇基(例如在HEA中)上。第一單體單元(或單個(gè)單體單元)不必包含雙鍵。用于共聚物的合適的糖類的例子為以上關(guān)于糖類-蛋白質(zhì)綴合物所討論的。合適地，每個(gè)第二單體單元(或單個(gè)單體單元)為包含官能團(tuán)的含雙鍵分子，在聚合后，基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分可以合適地連接到所述官能團(tuán)上。合適的官能團(tuán)包括酸、醇和/或砜。聚合后的連接有助于最小化昂貴的基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分的損失。但是，第二單體單元(或單個(gè)單體單元)可以包含基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分。在這種情況下，適用上面討論的合適的可聚合基團(tuán)和連接。在優(yōu)選實(shí)施方案中，每個(gè)第二單體單元為N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酏胺或其衍生物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，每個(gè)單個(gè)單體單元為含雙鍵的、含糖類或糖類模擬部分的賴氨酸衍生物。例子如下所示(多步反應(yīng)路線)在該反應(yīng)路線中的原料為甲基丙烯?；?L-賴氨酸，得自PolysSciencesEurope(Eppelheim，Germany)。聚合后,a氨基可以連接到基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分。優(yōu)選地，聚合物還包含不具有糖類或糖類模擬側(cè)鏈或基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分側(cè)鏈的第三單體單元?dú)埢?。這有助于增加柔性。通過使用非空間位阻的第三單體單元例如HEA增加柔性。還通過使用不帶電荷的第三單體單元增加柔性。不包含第三單體單元的聚合物具有大量帶正電荷的銨基，需要使其失活以最小化由靜電排斥導(dǎo)致的柔性降寸氐。聚合物內(nèi)可以包含多于一種類型的笫三單體。優(yōu)選地，每個(gè)第三單體單元為含親水基團(tuán)的含雙鍵分子，例如含羥基。不優(yōu)選第三單體單元是親油的含雙鍵分子例如苯乙烯。在優(yōu)選實(shí)施方案中，每個(gè)第三單體單元為HEA、乙烯基吡咯烷酮、MMA、HEMA、乙烯醇和/或乙二醇。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解存在許多其它可以使用的含親水基團(tuán)的含雙鍵分子。合適地，單體單元通過加成聚合反應(yīng)。該加成聚合可以是自由基引發(fā)的，例如使用過二硫酸鉀(PPS)或其它過氧化化合物。其它的可能性為縮合聚合(例如離子縮合聚合)、開環(huán)聚合和原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)。本領(lǐng)域技術(shù)人類員應(yīng)當(dāng)理解單體單元的性質(zhì)將取決于希望的聚合方法(例如對(duì)于縮合聚合反應(yīng)，含雙鍵的單體單元是不必需的)。合適地，在加入引發(fā)劑前，混合單體單元。優(yōu)選地，聚合反應(yīng)進(jìn)行小于兩天。聚合時(shí)間的長(zhǎng)短可以用來控制共聚產(chǎn)物的分子量。合適地，聚合反應(yīng)在無氧條件下發(fā)生。合適地，聚合反應(yīng)在室溫下進(jìn)行。當(dāng)不使用單個(gè)單體單元時(shí)，第一單體單元優(yōu)選以2070wt。/。的量存在于反應(yīng)混合物中，更優(yōu)選以30~50wt。/。的量。當(dāng)使用第三單體單元時(shí)，它們優(yōu)選以515wt。/o的量存在于反應(yīng)混合物中。應(yīng)當(dāng)理解聚合物的組成不能準(zhǔn)確地反映存在于反應(yīng)混合物中的單體單元的量。這是由于其它因素(例如位阻和溶解度)的影響。還應(yīng)當(dāng)注意分析物類似物可以由一起作為分析物類似物的兩種或更多種分離的實(shí)體組成。特別地，分析物類似物可以由具有至少兩個(gè)分析物類似物部分的第一實(shí)體和為分析物結(jié)合分子例如凝集素的第二實(shí)體組成。例如，可以將受體標(biāo)記的MBL和供體標(biāo)記的MBL與作為模板的未標(biāo)記的葡聚糖或未標(biāo)記的合成聚合物一起使用，以使受體標(biāo)記的MBL和供體標(biāo)記的MBL彼此接近，使得發(fā)生FRET。(使用ConA的例子由Gestwicki等人在(2002)ChemistryandBiology9,163頁中給出)。優(yōu)選用一種或多種上述的基于近似性的信號(hào)的產(chǎn)生/調(diào)制部分標(biāo)記分析物類似物。分析物類似物優(yōu)選包含一種或多種能量受體部分(例如HMCV-1或AlexaFluor594，如上所述)。但是，它也可以包含一種或多種能量供體部分。如以上關(guān)于糖類或糖類模擬部分所述的，可以將基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分連接到分析物類似物上。例如，可以通過直接二乙烯基砜偶連或通過胺化(如上所述)隨后偶連實(shí)現(xiàn)葡聚糖的標(biāo)記。當(dāng)將胺衍生的葡聚糖用作分析物類似物時(shí)，在連接基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分期間，必須小心以避免交聯(lián)，因?yàn)檫@可能導(dǎo)致不希望的沉淀。在EP594772中公開了用DVS衍生葡聚糖以最小化交聯(lián)的方法。分析物類似物應(yīng)該具有足夠高的分子量以防止從傳感器中漏出但應(yīng)該足夠低以便當(dāng)分析物類似物綴合到凝集素時(shí)不發(fā)生沉淀。分析物類似物優(yōu)選具有25~250kDa的重量，更優(yōu)選40~250kDa，還更優(yōu)選70~150kDa，高度優(yōu)選100~120kDa，例如優(yōu)選110kDa。基于U0kDa葡聚糖的分析物類似物是尤其優(yōu)選的。任選地，分析物類似物和凝集素級(jí)合在一起。傳感器構(gòu)造優(yōu)選地，通過具有允許分析物擴(kuò)散但不允許檢測(cè)物組分?jǐn)U散的孔徑的材料保留檢測(cè)物組分。但是，這種選擇性可以通過其它方式實(shí)現(xiàn)，例如通過使用允許不帶電荷的物質(zhì)擴(kuò)散的材料。優(yōu)選地，通過殼或基質(zhì)材料保留檢測(cè)物組分?？梢詫⒎治鑫镱愃莆锖?或凝集素接枝到該材料上。更優(yōu)選地，如在WO00/02048中所述的，該材料為可生物降解的。任選地，如在WO03/006992中所述的，傳感器可以包含通過可生物降解材料的殼保留的微粒子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過可生物降解材料的殼包嚢檢測(cè)物組分以保留檢測(cè)物組分，同時(shí)使葡萄糖與檢測(cè)物組分接觸，并且可生物降解材料包括具有疏水和親水單元的共聚物，如WO2005/110207所述的。一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)物組分室可以存在于殼內(nèi)。共聚物優(yōu)選為無規(guī)共聚物。共聚物優(yōu)選具有至少5.0xl(T1()cm2/s的滲透率。術(shù)語"滲透率"用來指可以在實(shí)驗(yàn)上測(cè)量的分析物(葡萄糖)通過水合共聚物的整體滲透率。優(yōu)選地，一旦被植入體內(nèi)，共聚物就在一周到一年的時(shí)間里降解，例如30天。對(duì)于厚度為5nm的普通聚合物來說，這相當(dāng)于0.17nm/天的降解速率。對(duì)于葡萄糖的流動(dòng)性，可生物降解材料優(yōu)選具有不大于25000Da的分子量截留限?？缮锝到獠牧细鼉?yōu)選具有不大于10000Da的分子量截留限。疏水單元的重量份數(shù)優(yōu)選占共聚物的10~90%，更優(yōu)選占共聚物的10~50%。每個(gè)親水單元的分子量?jī)?yōu)選為200~10000Da，更優(yōu)選400~4000Da。共聚物的每個(gè)親水單元優(yōu)選包含聚乙二醇和二元酸的酯。作為聚乙二醇的替代方案，可以使用乙二醇和丙二醇的混合的聚合物，和/或可以用疏水和/或親水基團(tuán)取代聚醚主鏈。作為聚乙二醇的其它的替代方案，可以4吏用聚四氬呋喃(聚-THF)。優(yōu)選地，親水單元包含對(duì)苯二甲酸和/或丁二酸作為二元酸。其它合適的二元酸為草酸、酒石酸、鄰苯二甲酸、天冬氨酸、丙二酸和寡聚或聚合的二元酸，例如聚(二聚酸-癸二酸)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，二酸僅為對(duì)苯二甲酸。在可替代的優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)苯二甲酸與丁二酸的摩爾比為l:2~2:1，合適地為1:1。作為可替代方案，共聚物的親水單元可以包含寡聚物。合適的寡聚物為甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)、乙烯吡咯烷酮、乙烯醇、糖類、環(huán)氧乙烷和/或2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸的寡聚物。當(dāng)親水單元包含HEMA，在聚合物中具有可生物降解的連接(例如酯連接，例如對(duì)苯二曱酸酯連接)以增加可生物降解性。優(yōu)選地，每個(gè)疏水單元的分子量為400~5000Da。優(yōu)選地，共聚物的疏水單元包含丁-l，4-二醇和二元酸的酯。作為對(duì)丁-l,4-二醇的替代方案，可以使用戊-l,5-二醇或己-l，6-二醇。優(yōu)選地，疏水單元包含對(duì)苯二甲酸和/或丁二酸作為二元酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)苯二甲酸與丁二酸的摩爾比為1:22:1，合適地為1:1。作為可替代方案，疏水單元僅包含對(duì)苯二甲酸作為二酸。其它合適的二元酸如上所述。作為可替代方案，共聚物的疏水單元可以包含甲基丙烯酸甲酯(MMA)的寡聚物、聚氨酯和/或聚酰胺(例如尼龍-6、寡聚-N-叔丁基丙烯酰胺或寡聚-N-異丙基丙烯酰胺)。當(dāng)疏水單元包含MMA時(shí)，在聚合物中提供可生物降解的連接(例如酯連接，例如對(duì)苯二甲酸酯連接)以增加可生物降解性。優(yōu)選的聚合物具有通式aPEG(T/S)bPB(T/S)c，其中"a，，表示PEG鏈的分子量，"b"表示PEG(T/S)(聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯/聚丁二酸乙二醇酯)在所得的聚合物中的重量份數(shù)，"c，，表示PB(T/S)(聚對(duì)苯二甲酸丁二酯/聚丁二酸丁二酯)在所得的聚合物中的重量份數(shù)。該聚合物的例子為600PEGT80PBT20、1000PEGT80PBT20、2000PEGT80PBT20、4000PEGT80PBT20、1000PEGT50PBT50和1000PEG(T/S)60PB(T/S)40(T/S50%)。聚合物是可生物降解的、具有高的葡萄糖滲透性，并具有約25000Da的分子量截留性能。在US6383220和EP1247522中公開了一些這些聚合物。共聚物的包膜優(yōu)選具有1~50jun厚度。在第二方面，本發(fā)明涉及制備在此描述的傳感器的方法。制備聚合物微嚢的化學(xué)方法包括相分離(凝聚)、溶劑蒸發(fā)和/或萃取。制備聚合物微嚢合適的物理方法包括噴霧干燥、噴涂、噴霧驟冷、轉(zhuǎn)盤霧化、流化床涂覆、共擠出(例如固定噴嘴共擠出、離心頭共擠出、或浸入式噴嘴共擠出)和平盤涂覆(pancoating)。傳感器的使用第三方面，本發(fā)明涉及使用在此描述的傳感器檢測(cè)葡萄糖的方法，包括將傳感器植入哺乳動(dòng)物皮膚中、使用外部光學(xué)裝置檢測(cè)或測(cè)量葡萄艫第四方面，本發(fā)明涉及使用上述要求保護(hù)的傳感器檢測(cè)葡萄糖的方法，包括通過使用外部光學(xué)裝置照射存在于哺乳動(dòng)物皮膚中或皮膚下的所述傳感器來檢測(cè)或測(cè)量葡萄糖。優(yōu)選地，本方法還包含可生物降解材料在傳感器中的降解?？梢酝ㄟ^注射將傳感器引入皮膚內(nèi)，優(yōu)選使用注射器，或者通過其它方法，特別是通過WO00/02048中描述的任何方法。傳感器優(yōu)選具有適于通過窄規(guī)格針注射的尺寸，以最小化患者的不適.傳感器優(yōu)選具有2(Hunlmm的最大尺寸。但是，可以使用具有更大尺寸的桿形傳感器?？梢詫鞲衅饕氲秸嫫ず穸葍?nèi)、或真皮下，或者可以引入到表皮，雖然在后面的情況下，其可能在可生物降解材料降解之前由于表皮的生長(zhǎng)而可能被排出皮膚。由于傳感器位于皮膚內(nèi)，優(yōu)選透皮(即，通過皮膚的較上層)檢測(cè)傳感器內(nèi)產(chǎn)生的光學(xué)信號(hào)，由此避免可能導(dǎo)致感染的傳感器和外部環(huán)境之間的任何直接接觸的需要。但是，作為替代方案，檢測(cè)可以通過中空的或透明的裝置(例如針或光學(xué)纖維)發(fā)生，其使傳感器被外部光學(xué)裝置照射而不使光通過皮膚。一旦傳感器置于皮膚內(nèi)的位置，則可以進(jìn)行需要次數(shù)的葡萄糖測(cè)量而沒有副作用。這對(duì)于糖尿病患者的長(zhǎng)期護(hù)理是特別有利的，因?yàn)槿绻咸烟菧y(cè)量越頻繁，就可以約嚴(yán)密地保持血液中葡萄糖水平的控制，并且將降低與血糖調(diào)節(jié)不良相關(guān)病癥的發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)，例如視網(wǎng)膜病、腎病、神經(jīng)病、普通的微血管損壞和大血管損壞和循環(huán)不良。由于本發(fā)明的傳感器本身不包含訊問檢測(cè)物讀出所需的任何光學(xué)元件(這些優(yōu)選單獨(dú)提供并位于體外)，所以傳感器可以很容易地以具有對(duì)患者最小不適感的可注射的形式提供?？梢酝ㄟ^供給在能量供體部分的吸收光鐠內(nèi)波長(zhǎng)的入射輻射、并測(cè)量發(fā)射的熒光強(qiáng)度或激發(fā)態(tài)的壽命，來訊問引入使用FRET技術(shù)的檢測(cè)物的傳感器。通常已知的方法為1.穩(wěn)態(tài)測(cè)量2.時(shí)域壽命測(cè)量a.單光子計(jì)數(shù)b.超高速掃描照相機(jī)c.門控檢測(cè)(Gateddetection)(脈沖取樣)d.上轉(zhuǎn)換3.頻域壽命測(cè)量a.相調(diào)制熒光測(cè)定法(外差檢測(cè))b.相敏檢測(cè)(零差檢測(cè))在Lakowicz，J.R."PrinciplesofFluorescenceSpectroscopy,SecondEdition",1999中可以發(fā)現(xiàn)原理的進(jìn)一步的描述。訊問檢測(cè)物優(yōu)選的方法為相調(diào)制熒光測(cè)定法。訊問檢測(cè)物合適的光學(xué)裝置(圖6)由發(fā)光二級(jí)管(LED)11組成，其在能量供體部分的發(fā)射光譜內(nèi)發(fā)射光。通過激勵(lì)電路13操作LED，所述激勵(lì)電路在導(dǎo)致充分相移的頻率下調(diào)制LED,優(yōu)選在45。范圍內(nèi)。對(duì)于具有3ns壽命的熒光團(tuán)，優(yōu)選的頻率為50MHz。LED發(fā)射的光通過激發(fā)濾光片15過濾，并通過二向色分光鏡n導(dǎo)向到傳感器i6，并通過透鏡19聚焦在注射的傳感器16上的傳感器/皮膚上。傳感器發(fā)射的熒光通過透鏡19收集。光經(jīng)過二向色分光鏡并通過發(fā)射濾光片21過濾。濾過的光通過透鏡23聚焦在檢測(cè)器25上，在這種情況下為雪崩光電二極管(APD)。APD通過APD偏壓電源27反偏壓，所述偏壓電源通過信號(hào)處理和控制單元29控制。來自APD的信號(hào)通過跨阻放大器31放大，通過帶通濾光片33過濾，并通過模擬-數(shù)字轉(zhuǎn)換器(ADC)35釆樣。相應(yīng)地，LED的調(diào)制驅(qū)動(dòng)信號(hào)通過第二ADC37采樣。在第一ADC35上釆集的信號(hào)為Y工(t)-A丄*sin(2*兀*f*t+((^1,)Ai為從檢測(cè)物檢測(cè)的信號(hào)的振幅，f為調(diào)制頻率，他為由供體熒光團(tuán)引起的相位滯后，化為由電子和光學(xué)裝置引起的固定相位滯后。在第二ADC37上采集的信號(hào)為Y2(t)=A2*sin(2H*t+q>2)A2為L(zhǎng)ED的調(diào)制驅(qū)動(dòng)信號(hào)的振幅，且92為由電子裝置引起的固定相位滯后。通過比較兩個(gè)采集的信號(hào)并補(bǔ)償通過電子和光學(xué)引入的固定的且已知的相位滯后，信號(hào)處理和控制單元驅(qū)動(dòng)由能量供體部分引起的相位滯后通過使熒光計(jì)接近皮膚并與傳感器對(duì)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)量。通過使用相位-分析物-校準(zhǔn)功能，將相位滯后轉(zhuǎn)換為分析物濃度，例如分析物濃度=A+Bx/(k+x)，其中A是不存在分析物時(shí)的相位，B是最大響應(yīng)時(shí)的相位，x是所測(cè)量的相位，并且k是受體和分析物類似物之間的解離常數(shù)?？商娲臏y(cè)量技術(shù)為測(cè)量熒光強(qiáng)度。在這種情況下，光學(xué)裝置應(yīng)該提供在能量供體部分的吸收光鐠內(nèi)波長(zhǎng)的第一束入射輻射，和優(yōu)選提供在能量受體部分的吸收光鐠內(nèi)波長(zhǎng)的第二束入射輻射(這適用于能量受體部分也是熒光團(tuán)的情況)。此外，光學(xué)裝置應(yīng)該優(yōu)選能夠在兩個(gè)不同的波長(zhǎng)處測(cè)量在傳感器中產(chǎn)生的光信號(hào)；波長(zhǎng)1在能量供體部分的發(fā)射光鐠內(nèi)(與分析物的測(cè)量相關(guān)的產(chǎn)生的信號(hào))，并且波長(zhǎng)2在能量受體部分的發(fā)射光譜內(nèi)(其可能是分析物信號(hào)或內(nèi)參比或校準(zhǔn)信號(hào))。焚光計(jì)分別測(cè)量下列參數(shù)在波長(zhǎng)1處(能量供體部分)激發(fā)光強(qiáng)度，1(1，0)環(huán)境光強(qiáng)度，1(1，1)熒光和環(huán)境光結(jié)合的強(qiáng)度，1(1，2)在波長(zhǎng)2處(能量受體部分)激發(fā)光強(qiáng)度，1(2，0)環(huán)境光強(qiáng)度，1(2，1)熒光和環(huán)境光結(jié)合的強(qiáng)度，1(2，2)再次，通過使熒光計(jì)接近皮膚并與傳感器對(duì)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)量。當(dāng)對(duì)在傳感器中產(chǎn)生的熒光信號(hào)進(jìn)行透皮測(cè)量時(shí)，必須考慮皮膚對(duì)信號(hào)的吸收。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在400nm900nm范圍內(nèi)人類皮膚的吸收率最小。提供的最終輸出為來自兩個(gè)熒光團(tuán)的熒光強(qiáng)度之間的歸一化的比，由下列關(guān)系式定義(方程1):最終輸出=(1(1，2)-1(1，1))*1(2，0)/(1(2，2)-1(2，1))*1(1,0)(1)優(yōu)選通過使用校準(zhǔn)數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)將如上述方程1給出的來自光學(xué)裝置(例如熒光計(jì))的最終輸出轉(zhuǎn)換為分析物濃度，所述校準(zhǔn)數(shù)據(jù)可以基于在WO00/02048中所述的原理得到。本發(fā)明的其他方面在第五方面，本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)或測(cè)量流體中的糖類分析物的傳感器，該傳感器包含其讀出為可檢測(cè)的或可測(cè)量的光學(xué)信號(hào)的竟?fàn)幗Y(jié)合檢測(cè)物組分，所述檢測(cè)物組分被允許分析物擴(kuò)散但不允許檢測(cè)物組分?jǐn)U散的材料保留，所述檢測(cè)物組分包括凝集素；和包含任選地衍生的葡聚糖的分析物類似物，其中至少一個(gè)葡萄糖單元的3-和/或4-羥基已經(jīng)失活，該分析物類似物能夠與分析物竟?fàn)幗Y(jié)合到凝集素。優(yōu)選地，葡聚糖為高碘酸鹽處理的葡聚糖。在第六方面，本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)或測(cè)量流體中的糖類分析物的傳感器，該傳感器包含其讀出為可檢測(cè)的或可測(cè)量的光學(xué)信號(hào)的竟?fàn)幗Y(jié)合檢測(cè)物組分，所述檢測(cè)物組分被允許分析物擴(kuò)散但不允許檢測(cè)物組分?jǐn)U散的材料保留，所述檢測(cè)物組分包括凝集素；和包含能夠與分析物竟?fàn)幗Y(jié)合到凝集素的甘露糖-蛋白質(zhì)綴合物的分析物類似物。優(yōu)選甘露糖-蛋白質(zhì)綴合物是使用摩爾比在10:1~150:l范圍內(nèi)，例如15:1、30:1、60:1或120:1的甘露糖與HSA制備的。在第七方面，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)或測(cè)量流體中的糖類分析物的傳感器，該傳感器包含其讀出為可檢測(cè)的或可測(cè)量的光學(xué)信號(hào)的竟?fàn)幗Y(jié)合檢測(cè)物組分，所述檢測(cè)物組分被允許分析物擴(kuò)散但不允許檢測(cè)物組分?jǐn)U散的材料保留，所述檢測(cè)物組分包含用基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分對(duì)之一標(biāo)記的糖類結(jié)合分子；能夠與分析物竟?fàn)幗Y(jié)合糖類結(jié)合分子的糖類類似物，該糖類類似物為柔性的水溶性的聚合物，包含聚合的笫一單體單元的殘基，該第一單體單元?dú)埢哂刑穷惢蛱穷惸M部分側(cè)鏈和為基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分對(duì)的另一個(gè)的側(cè)鏈部分；和/或共聚合的第二單體單元和第三體單元的殘基，該第二單體單元?dú)埢哂刑穷惢蛱穷惸M部分側(cè)鏈，第三單體單元?dú)埢哂袨榛诮菩缘男盘?hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分對(duì)的另一個(gè)的側(cè)鏈部分。在第八方面，本發(fā)明涉及一種制造上述聚合物的方法，包括下列步驟之一a)聚合每個(gè)具有糖類或糖類模擬部分側(cè)鏈和基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分側(cè)鏈的單體單元、和任選的第三單體單元；b)共聚合每個(gè)具有糖類或糖類模擬部分側(cè)鏈的第一單體單元、和每個(gè)具有基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分側(cè)鏈的第二單體單元、和任選的笫三單體單元；c)聚合每個(gè)具有糖類或糖類模擬部分側(cè)鏈和用于連接基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分的側(cè)官能團(tuán)的單體單元、和任選的第三單體單元，然后使單體單元?dú)埢c基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分反應(yīng)；d)共聚合每個(gè)具有糖類或糖類模擬部分側(cè)鏈的第一單體單元、和每個(gè)具有用于連接基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分的側(cè)官能團(tuán)的第二單體單元、和任選的第三單體單元，然后使第二單體單元?dú)埢c基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分反應(yīng)；e)聚合每個(gè)具有用于連接糖類或糖類模擬部分的側(cè)官能團(tuán)和用于連接基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分的不同側(cè)官能團(tuán)的單體單元、和任選的第三單體單元，然后使單體單元?dú)埢c糖類或糖類模擬部分和基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分反應(yīng)；f)共聚合每個(gè)具有用于連接糖類或糖類模擬部分的側(cè)官能團(tuán)的第一單體單元、和每個(gè)具有用于連接基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分的不同側(cè)官能團(tuán)的第二單體單元、和任選的第三單體單元，然后使第一單體單元?dú)埢c糖類或糖類模擬部分反應(yīng)、使第二單體單元?dú)埢c基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分反應(yīng)。關(guān)于本發(fā)明任何方面所描述的特征可適用于本發(fā)明的其他方面。-將參照實(shí)施例和附圖進(jìn)一步說明本發(fā)明，附圖中圖1表示人類MBL和用于各種葡聚糖分子量的葡聚糖檢測(cè)物體系的葡萄糖劑量響應(yīng)(實(shí)施例6);圖2表示由(a)人類MBL和110kDa葡聚糖檢測(cè)物體系和(b)ConA和110kDa葡聚糖檢測(cè)物體系的葡萄糖劑量響應(yīng)(實(shí)施例8);圖3表示人類MBL和HSA甘露糖ELLA檢測(cè)物體系的葡萄糖劑量響應(yīng)(實(shí)施例11);圖4表示人類MBL和高碘酸鹽處理的葡聚糖ELLA檢測(cè)物體系的葡萄糖劑量響應(yīng)(實(shí)施例11);圖5表示人類MBL和70kDa葡聚糖FRET檢測(cè)物體系的葡萄糖劑量響應(yīng)(實(shí)施例15);圖6表示訊問檢測(cè)物的合適的光學(xué)裝置。實(shí)施例概要使用下列原料對(duì)氨基苯基-a-D-吡喃甘露糖基異硫氰酸酯，牛血清白蛋白-a-D-吡喃甘露糖基異硫氰酸酯(每BSA23摩爾當(dāng)量甘露糖)，人類血清白蛋白，高碘酸鈉(NaICXO，生物素-N-雍基琥珀酰亞胺，o-亞苯基二鹽酸鹽，芐胺，氨，氰基硼氳化鈉(Sigma－Aldrich)。NuncF96MaxiSorp板(Nunc,Denmark),PD-10柱(column),Streptavidin－HRP(AmershamBioscience).葡聚糖(Pharmacosmos,Denmark)。甘露聚糖綴合凝集素(由幾種來源得到，例如StatensSerumInstitute,Copenhagen,Denmark)。透析管Spectra/Por(SpectrumLaboratories,Inc.,California,USA)。Float-A-LyzerTM25.000MWCO透析管來自SpectrumLaboratoriesEurope(Breda,TheNetherlands),脫水山梨糖醇單油酸酯(Span⑧80)、偶氮二異丁腈(AIBN)和丙烯酸2-羥基乙酯來自Sigma-Aldrich。N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺鹽酸鹽來自PolysSciencesEurope(Eppelhdm，Germany),2，2，國偶氮二[2-(2-咪唑啉-2-基)丙垸二鹽酸鹽(VA-044)來自WakoGmbH(Neuss,Germany),烯丙基a-D-吡喃葡萄糖苷和烯丙基2-乙酰^J^-2-脫氧-a-D-吡喃葡萄糖香來自GlyconBiochemicals，Germany.烯丙基a-D-吡喃半乳糖普來白Sigma-Aldrich。PBS為20mM的磷酸鹽、150mM的NaCl，pH值為7.4，且TBS為20mM的TRIS、150mM的NaCl、1.25mM的CaCl2，除非另作i兌明pH值為7.4?？s寫MBL，甘露聚糖綴合凝集素；PBS，磷酸鹽緩沖鹽水；TBS，TRIS緩沖鹽水；ELLA，酶聯(lián)凝集素檢測(cè)物。實(shí)施例1:MBL的染色將人類MBL緩沖變?yōu)?通itit:析)含有150mM的NaCl和1.25mM的Ca2+、pH值為8.7的lOmM的NaHC03。用于染色的染料為AlexaFluorTM594琥珀酰亞胺酯(AF594-SE)(MolecularProbes,Eugene,Oregon,USA)。將染料溶于干燥的DMSO中，并緩慢地(IO分鐘)加到在碳酸氬鹽緩沖液中的MBL中。佳反應(yīng)進(jìn)行l(wèi)h。用15倍摩爾過量(相對(duì)于多肽單元)的染料進(jìn)行染色。通過用對(duì)pH值為7.4的10mM的Tris緩沖液、150mM的NaCl和1.25mM的Ca"透析進(jìn)行純化。通過UV光鐠測(cè)定得到的染色蛋白的標(biāo)記度為每MBL子單元2.3個(gè)染料。實(shí)施例2:氨基葡聚糖的制備將150kDa葡聚糖(6.00g，0.4nmol)溶于pH值為11.5的250mM的K2HPO4(600mL)+。加入硼氫化鈉(3g，0.08mol)，隨后加入二乙烯基砜(15ml，0.15mol)。在用濃鹽酸中和到pH值為7.2之前，^Jl混合物在RT下攪拌30分鐘。攪拌30分鐘后，所得的混合物在水(3x25L)中透析(MWCO10-12kDa)。將內(nèi)含物轉(zhuǎn)移到Erlenmeyer燒瓶中，并加入24。/o氨水(200mL)。2h后，將pH值調(diào)到10.5,并攪拌反應(yīng)過夜。通過在水(8x25L)中透析(MWCO10-12kDa)除去過量的氨，并且凍干全部?jī)?nèi)含物以得到為白色絨毛狀物質(zhì)的氨基葡聚糖5.75g(78。/。，基于185kDaMW的氨基葡聚糖)。使用元素分析法進(jìn)行分子量、胺引入、和引入的二乙烯基砜的量的粗略估計(jì)。(發(fā)現(xiàn)C39.86;H6.26;N0.16;S3.08%葡聚糖150k，~22DVS-NH2，~160DVS-OH，和~720H20,理論C39.55;H6.60;N0.16;S3.07%)。實(shí)施例3:六曱氧基-結(jié)晶紫琥珀酰亞胺酯(HMCV-l)的制備HMCV-1的合成合成路線1:1)4-(N-甲基^J^)-丁酸鹽酸鹽(1當(dāng)量)、二異丙基乙胺，在乙腈中，20'C，2他。n)二甲胺(過量)。m)TSTU、二異丙基乙胺，在乙腈中，20'C，2h。4a(BF4):將4畫(甲基氨基)丁酸鹽酸鹽(l,36g;8.8mmol)、1(5.0g;8.3mmo1)、和二異丙基乙胺(5mL)溶于乙腈(120mL)中。在干燥的氮?dú)夥障?、?0~35。C下攪拌反應(yīng)混合物22h。加入二—胺水溶液(40mL的40%溶液)，并再攪拌反應(yīng)混合物四天。在真空下除去溶劑和過量的二甲胺，并將剩下的物質(zhì)溶于氯仿。用鹽水洗氯仿溶液兩次并用MgS04干燥，然后蒸發(fā)溶劑并從CH2Cl2/乙醚中再沉淀產(chǎn)物。產(chǎn)量4.4g(70%)深藍(lán)色粉末。MS(FAB+):m/z624(M+)iH-NMR(400固z，DMSO-d6):58.34(1H,bs),6.03(2H，s)，5.83(4H，s),3.49(2H，m),3.46(6H，s)，3.44(12H,s),3.12(3H，s(掩蔽的))，3,08(12H，s),1.94(2H,t),1.70(2H，m)。HMCV-l(Cr):將TSTU(2-琥珀酰亞氨基-l，l,3,3-四甲基脲四氟硼酸酸鹽；0.8g,2.6mmol)加到4a(0.9g,1.26mmol)和二異丙基乙胺(0.55g，4.5mmol)在乙腈(15mL)中的溶液中。在將反應(yīng)混合物傾入用HCl-水溶液(4mL，2M)酸化的冰冷卻的接近飽和的NaCl溶液(約150mL)中之前，在封閉的燒瓶中攪拌2h。用氯仿(2xl50mL)萃取水相。用鹽水(2x50mL)洗合并的氯仿相，并用MgS04干燥。蒸發(fā)溶劑并從CH2Cl2/乙醚中再沉淀，得到深藍(lán)色粉末(0.80g，84%)。MS(FAB+):m/z72攀+)工H國NMR^誦NMRbr.(400MHz,DMSO-d6):35.88(2H，s)，5.85(4H，s),3.60(2H,s),3.46(12H,s)，3.45(6H，s)，3.15(12H，s),3.12(3H，s),2.85(4H,s)，2.即H，t)，1.95(2H，m)。實(shí)施例4:葡聚糖的染色將通過與實(shí)施例2類似的方法制備的70kDg氨基葡聚糖(0.5mmo1的NH2/g葡聚糖，即，每摩爾葡聚糖35摩爾胺)用HMCV-1(實(shí)施例3)在pH值為8.5的、150mMNaCl的10mM的NaHCO3中染^。將染料溶于干燥的DMSO中，并緩慢地(IO分鐘)加入到在碳酸氫鹽緩沖液中的葡聚糖中。使反應(yīng)進(jìn)行l(wèi)h。用8倍摩爾過量的染料進(jìn)行染色。通過用pH值為7.4的、150mM的NaCl、1.25mM的Ca2+、2mM的NaN3的10mM的Tris緩沖液透析進(jìn)行純化。通過UV光鐠測(cè)定得到的染色蛋白的標(biāo)記度為每葡聚糖7.0個(gè)染料。實(shí)施例5:葡萄糖測(cè)量在TBS緩沖液(同上)中混合AF594染色的人類MBL(實(shí)施例l)和HMCVl-葡聚糖(實(shí)施例4)到兩種組分為10jiM的濃度(4吏用MBL-AF594糖類識(shí)別域的濃度，CRD，分別具有約25kDa的Mw)。將檢測(cè)物的化學(xué)混合物吸入中空纖維(再生纖維素，直徑為0.2mm)中。在KOALA自動(dòng)樣品室(ISS,ChampaignIL)中進(jìn)行熒光壽命測(cè)量(頻域)。在水浴中將所有溶液預(yù)熱到34。C，并且在34'C下記錄在KOALA儀器中的所有測(cè)量值。將包含纖維和纖維固定器裝置的熒光池置于KOALA的樣品固定器中，并且熒光池充滿含有葡萄糖的緩沖液。測(cè)量的相位是至少四十個(gè)相角記錄的平均值。測(cè)量完成后，^:用吸液管清空熒光池，并再次充滿含有下一濃度葡萄糖的緩沖液。在測(cè)量之間間隔20min以使檢測(cè)物的化學(xué)達(dá)到平衡。為了生成葡萄糖劑量-響應(yīng)曲線，在0、5、10、30、100和500mM葡萄糖處測(cè)量相位。在500mM葡萄糖處測(cè)量相角后，在60分鐘時(shí)間內(nèi)用10mM的TRIS緩沖液洗幾次纖維。此時(shí)，對(duì)OmM葡萄糖得到相同的相角。這表明分析的可逆性。表1AF594-MBL和HMCV1-Dex70的絕對(duì)相移。PMT計(jì)數(shù)反映體系的強(qiáng)度增加。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>實(shí)施例6:HMCVl-葡聚糖分子量的影響4吏用分子量為20kDa~250kDa的HMCVl-葡聚糖(以與實(shí)施例5中使用的HMCVl-葡聚糖類似的方法制備)重復(fù)實(shí)施例5。發(fā)現(xiàn)使用UOkDa的HMCVl-葡聚糖得到最高相移。結(jié)果如圖1所示。實(shí)施例7:染色的MBL:HMCVl-葡聚糖的比的影響使用一定范圍的染色的MBL:HMCVl-葡聚糖的比重復(fù)實(shí)施例5。發(fā)現(xiàn)染色的MBL:HMCVl-葡聚糖的比為1:4(5^M濃度的MBL-AF594糖類識(shí)別域，CRD，分別具有約25kDa的Mw,和20nM的HMCV1-葡聚糖，分子量為110kDa)時(shí)得到增加的響應(yīng)。結(jié)果如表2所示。表2AF594-MBL1:4HMCVl-DexllO的絕對(duì)相移。<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>實(shí)施例8:MBL和ConA的穩(wěn)定性的比較使用MBL-AF594和ConA-AF594作為凝舉素和110kDa的HMCVl-葡聚糖作為分析物類似物，在生理TRIS緩沖液(pH值為7.4，存在生理濃度的鈉、鉀和鈣)中重復(fù)實(shí)施例5。葡萄糖濃度在12天內(nèi)在2.5、5mM、25mM和50mM之間循環(huán)變化。使用小型的時(shí)間分辨熒光計(jì)每隔5分鐘測(cè)量一次。在用MBL-AF594的試驗(yàn)中，在每個(gè)葡萄糖水平上的相位測(cè)量值隨時(shí)間是恒定的。在用ConA的試驗(yàn)中觀察到顯著的相移，導(dǎo)致20天后測(cè)量的相位降低超過10%。結(jié)果如圖2所示。實(shí)施例9:胺化的高碘酸鹽氧化的葡聚糖的將70kDa的葡聚糖(200mg，0.00286mmol)溶于水(2.8mL)中并加到100mM在水(2.8mL，100倍摩爾過量)中的高碘酸鈉溶液中?；旌衔镌谑覝叵略诤诎抵袛嚢鑜h。將所得的混合物轉(zhuǎn)移到透析管(MWCO10-12k)中，并用5L水透斗斤過夜。透析后，將體積調(diào)整到8mL。將高碘酸鹽氧化的葡聚糖分成兩個(gè)等分檢測(cè)物(每個(gè)4mL,100mg)并分別用28。/。氨水(200jiL)和節(jié)胺(300nL)處理半小時(shí)。然后在室溫和pH值約為10下用氰基硼氰化鈉(45mg)還原亞胺和亞胺镥衍生物過夜。第二天用2xlL的20mM的TBS透析反應(yīng)混合物。使用元素分析法測(cè)定引入高硤酸鹽氧化的葡聚糖中的胺的程度。實(shí)施例10:甘露糖基化的HSA的制備以如下方式制備4種綴合物。將溶于20mM碳酸鹽緩沖液(0.4mL，pH值為9.2)的HSA(10mg)加到每個(gè)4x;2ml的Eppendorf小瓶中。以15、30、60和120^爾過量加入p-氨基苯基-a-D-吡喃甘露糖基異硫氰酸酯(Man-ITC,1.6mL)，以制備下面說明的四種溶液。將Man-ITC(11.9mg)溶于DMSO(0.1mL)和20mM的碳酸鹽緩沖液(3.9mL，pH值為9.2)中。將該溶液(相當(dāng)于120倍摩爾過量)的等分檢測(cè)物(1.6mL)加到含有HSA(0.4mL)的Eppendorf小瓶中。將剩下的Man-ITC溶液稀釋到兩倍體積，并且將稀釋體積的等分檢測(cè)物(1.6mL)加到另一個(gè)E卯endorf小瓶中。重復(fù)該步驟直到制備四種不同的HSA:Man-ITC混合物。四種反應(yīng)混合物在室溫下在震動(dòng)器中培養(yǎng)過夜。所得的糖類綴合物在PD-10柱上純化。在純化過程中，緩沖液變?yōu)門BS。使用MALDI-TOF-MS確定綴合度。表3使用MALDI-TOF-MS確定綴合度。在半高度附近測(cè)定峰寬度的估計(jì)值。使用下式測(cè)定甘露糖的數(shù)目(在MS-66500中的峰)/313。m/2T(]^1ALD工-TOF)每HSA的甘露糖數(shù)目HSA-甘露糖1:1567500--700003-11HSA-甘露糖1:3067700--706004-13i!SA-甘露糖1:6068100--723005-18HSA-甘露糖1:12068600--73麵7-22不同的HSA-甘露糖類綴合物對(duì)MBL具有不同的親合力。實(shí)施例11:ELLA檢測(cè)物生物素化的MBL的制備將生物素-NHS(20jiL,在DMSO中7mg/ml，每MBL單體約10~15當(dāng)量)加到MBL(3ml，0.530mg)的PBS(3mL)溶液中。輕輕地?cái)嚢枞芤?h,并且然后轉(zhuǎn)移到透析管(MWCO10-12k)中，并用TBS(2xlL)透析24h。不用進(jìn)一步純化地使用所得的生物素化的MBL(在TBS中0.2mg/ml)。MBLEIXA檢測(cè)物在ELLA檢測(cè)物中使用的TBS緩沖液為20mM的TRIS、150mM的NaCl，pH值為7.4。當(dāng)抗原為HSA-甘露糖時(shí)使用20mM的CaCl2，且當(dāng)抗原為胺化的高碘酸鹽處理的葡聚糖時(shí)使用1.25mM的CaCl2(模擬生理鈣濃度)。用在TBS中的每個(gè)都具有抗原(例如來自實(shí)施例10的HSA-甘露糖，氨基葡聚糖，來自實(shí)施例9的芐氨基高碘酸鹽處理的葡聚糖)(100jiL,20照/mL)的兩個(gè)柱(column)，在5'C下涂覆96孑L微量滴定板過夜。然后通#入在TBS(150nL)中的l%(w/v)HSA阻擋剩余的結(jié)合位點(diǎn)。然后洗孔(2x200pL的TBS)。將葡萄糖(從lOOmM到OmM)在上述制備的生物素化的MBL(2照/mL)中的稀釋液加到lOOpL的總體積。培養(yǎng)化后，清空并清洗(2x200fiL的TBS)板。加入在TBS中的0.1%(v/v)Streptavidin-HRP(lOOnL)。1^培養(yǎng)lh,清空并清洗(3x200pL的TBS)板。通過加入培養(yǎng)基溶液(lmg的o-亞苯基二鹽酸鹽)使HRP的存在可見，并在2分鐘后用1N的硫酸溶液淬滅。通過減去在630nm處的背景，讀取在4卯nm處的吸光率來確定顯色。結(jié)果如圖3和4所示。實(shí)施例12:共聚物的合成如下通過乳液聚合制備水溶性的40%的甘露^^共聚物。將Span80表面活性劑(5.7g;HLB[親水親油平衡值4.3，基于甲苯10%w/w)、AIBN(30mg)和甲苯(57.3經(jīng))加到配備有機(jī)械攪拌器和氮?dú)夤艿?50ml三口圓底燒瓶中。密封燒瓶、用氮?dú)獯祾卟⒃谡麄€(gè)聚合過程中保持在氮?dú)夥障?。將烯丙基a-D-吡喃甘露糖苷(3,52g)、丙烯酸2-羥乙酯(2.552g)、和N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺鹽酸鹽((U56g)溶于水(12.7g)，并過濾以除去不溶解的物質(zhì)。通過橡膠隔膜將該混合物加到在圓底燒瓶中的劇烈攪拌的混合物中。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物直到形成穩(wěn)定的乳狀液(30分鐘)，然后在60。C下4h。通過隔膜注入VA-044溶液(lml，60mg/ml)，繼續(xù)聚合過夜(17h)。將反應(yīng)混合物冷卻到室溫，并加入丙酮破乳。這使得聚合物沉淀，收集沉淀、再溶于水、并加入丙酮沉淀。產(chǎn)物在真空下干燥過夜，以得到3.2g(50％)粗淺黃色聚合物。將部分粗聚合物(1.0g)溶于水(10ml)，并在水中透析(MWCO[分子量截留]25,000)以除去低分子量物質(zhì)。冷凍干燥得到0.46g(46%)毛絨狀的白色聚合物。實(shí)施例13:共聚物的染色通常地，共聚物的標(biāo)記遵循由MolecularProbes(產(chǎn)品信息MP00143,Rev.June2001)提供的描述。將共聚物(實(shí)施例12)(88.6mg)溶于10mM的NaHC03溶液(3ml;pH值為8.5)。將聚合物溶液平均地分到三個(gè)Eppendorf小瓶中。將HMCV-1(實(shí)施例3)(19.6mg;26.1jimol)溶于干燥的DMSO(600ul)。將染料以每30秒lOul等分檢測(cè)物加到聚合物溶液中，以這樣的方式使得第一小瓶總共得到100ul、第二小瓶得到200ul，第三小瓶得到300ul。在加入最后一份后，輕輕地?cái)嚢栊∑縧h，然后在10mM的TRIS緩沖液中透析溶液(MWCO10-12,000)，并幾次更換緩沖液，直到在透析緩沖液中看不見顏色(通常72小時(shí)更換6~8次500ml的緩沖液)。實(shí)施例14:FRET檢測(cè)物混合在10mM的TRIS緩沖液中(12,5nL)的包含染色共聚物溶液(實(shí)施例13)(4jiL)和染色MBL溶液(實(shí)施例1)(8.5nL)的檢測(cè)物化學(xué)品，并在混合后使其靜置至少lh。然后用注射器將檢測(cè)物化學(xué)品轉(zhuǎn)移到如實(shí)施例5的纖維中。該纖維被安裝在適合于標(biāo)準(zhǔn)熒光池(10mmxl0mm)的常規(guī)設(shè)計(jì)的纖維固定器中。如實(shí)施例5進(jìn)行測(cè)量且結(jié)果示于表4。<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>實(shí)施例15:傳感器的配制和植入通過將直徑為700nm的玻璃棒浸入在二氯曱烷(DCM)中的15%w/w的聚合物溶液中并使其在室溫下干燥，由1000PEGT80PBT20聚合物(如在S.Fakirov和T.Gogeva,Macromol.Chem.191(1990)603-614中所描述的制備，目標(biāo)是具有80wt。/。親水鏈段和20wt。/。疏水鏈段)制造纖維。這得到具有內(nèi)徑為700jan、外徑為900pm的中空纖維。該纖維充滿關(guān)于CRD為5jiM的AlexaFluorTM染色的MBL(實(shí)施例1)、和20pM的HMCV-1染色的150kDa的氨基葡聚糖(通過與實(shí)施例4類似的方法制備)。加熱聚合物使其熔化以封閉纖維。在測(cè)試和插入之前通過使用時(shí)間分辨熒光光鐠(頻域)測(cè)量的葡萄糖響應(yīng)如圖5所示。可以通過使用針將該類型纖維置于皮膚的上部。合適尺寸(足夠大以包含濕纖維)的針以約lmm深度平行于皮膚表面放置，使得針通過皮膚作為陰影可見。將纖維(仍然是濕的)置于針內(nèi)并且移走針。在插入步驟完成之后，在插入位置處通常觀察不到出血。當(dāng)纖維在適當(dāng)?shù)奈恢脮r(shí)，將讀取裝置直接置于纖維上方并可以開始測(cè)量。權(quán)利要求1.一種用于檢測(cè)或測(cè)量流體中的糖類分析物的傳感器，所述傳感器包含其讀出為可檢測(cè)的或可測(cè)量的光學(xué)信號(hào)的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合檢測(cè)物的組分，所述競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合檢測(cè)物的組分被允許分析物擴(kuò)散但不允許檢測(cè)物組分?jǐn)U散的材料保留，所述檢測(cè)物組分包含動(dòng)物凝集素；和能夠與分析物競(jìng)爭(zhēng)地綴合凝集素的分析物類似物。2.權(quán)利要求l的傳感器，其中所述分析物為葡萄糖。3.權(quán)利要求2的傳感器，其中所述分析物類似物能夠在生理鈣濃度下與葡萄糖竟?fàn)帯?.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的傳感器，其中所述凝集素為人類或人源化凝集素。5.權(quán)利要求4的傳感器，其中所述凝集素源于人體或者為重組凝集素。6.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的傳感器，其中所述凝集素處于多聚體形式。7.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的傳感器，其中所述凝集素為選自甘露糖綴合凝集素、肺表面活性劑蛋白、膠固素或膠原凝素-43中的膠原凝素。8.從屬于權(quán)利要求6的權(quán)利要求7的傳感器，其中所述凝集素為處于三聚體和/或四聚體形式的甘露糖綴合凝集素。9.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的傳感器，其中所述分析物類似物包含多個(gè)糖類或糖類模擬部分。10.權(quán)利要求9的傳感器，其中所述分析物類似物包含選自D-果糖、D-明串珠菌二糖、N-乙?；?葡糖胺、D-甘露糖、L-巖藻糖、N-乙?；?甘露糖胺、D-阿拉伯糖、肌醇、D-塔格糖、伊爾糖、D-葡萄糖、D-帕拉金糖、D-松二糖、D-核糖、D-山梨糖醇中的至少一種糖類部分。11.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的傳感器，其中所述分析物類似物具有一種或多種能量供體或能量受體部分。12.權(quán)利要求911任一項(xiàng)的傳感器，其中所述分析物類似物為糖類和/或糖類模擬部分的任選衍生的聚合物。13.權(quán)利要求12的傳感器，其中所述分析物類似物選自任選衍生的葡聚糖、甘露聚糖、直鏈淀粉、支鏈淀粉、糖原、透明質(zhì)酸酯/鹽、軟骨素、肝素、糊精、菊粉、木聚糖、果聚糖和殼多糖。14.權(quán)利要求13的傳感器，其中所述分析物類似物為任選衍生的葡聚糖，其中至少一個(gè)葡萄糖單元的3-和/或4-羥基已經(jīng)失活。15.權(quán)利要求14的傳感器，其中所述分析物類似物為用高碘酸鹽處理過的任選衍生的葡聚糖。16.權(quán)利要求13~15任一項(xiàng)的傳感器，其中所述葡聚糖為胺化的。17.權(quán)利要求9~11任一項(xiàng)的傳感器，其中所述分析物類似物為糖類-蛋白質(zhì)綴合物或糖類-樹狀聚體綴合物。18.權(quán)利要求17的傳感器，其中所述分析物類似物為糖類-白蛋白綴合物。19.權(quán)利要求911任一項(xiàng)的傳感器，其中所述分析物類似物為具有糖類或糖類模擬部分側(cè)鏈的柔性水溶性非多糖聚合物。20.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的傳感器，其中所述檢測(cè)物組分通過殼或基質(zhì)材料保留。21.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的傳感器，其中所述保留材料為可生物降解的。22.從屬于權(quán)利要求20的權(quán)利要求21的傳感器，其中所述檢測(cè)物組分通過包嚢所述檢測(cè)物組分的可生物降解材料的殼保留、同時(shí)允許葡萄糖接觸所述檢測(cè)物組分，其中所述可生物降解材料包含具有疏水和親水單元的共聚物。23.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的傳感器，其中通過基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分產(chǎn)生所述可檢測(cè)的或可測(cè)量的光學(xué)信號(hào)。24.權(quán)利要求23的傳感器，其中用基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分對(duì)中的一個(gè)來標(biāo)記所述凝集素，并用所述基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分對(duì)中的另一個(gè)來標(biāo)記所述分析物類似物。25.—種制備前i^k利要求任一項(xiàng)的傳感器的方法，包括相分離、溶劑蒸發(fā)、萃取、噴霧干燥、噴涂、噴霧驟冷、轉(zhuǎn)盤霧化、流化床涂覆、共擠出和平盤涂覆中的一種或多種。26.—種使用權(quán)利要求124任一項(xiàng)的傳感器檢測(cè)葡萄糖的方法，包括將所述傳感器^到哺乳動(dòng)物的皮膚中、使用外部光學(xué)裝置檢測(cè)或測(cè)量葡萄糖、和所述可生物降解材料的降解。27.—種使用權(quán)利要求124任一項(xiàng)的傳感器檢測(cè)葡萄糖的方法，包括通過照射存在于哺乳動(dòng)物皮膚中或皮膚下的所述傳感器，使用外部光學(xué)裝置來檢測(cè)或測(cè)量葡萄糖。28.—種用于檢測(cè)或測(cè)量流體中的糖類分析物的傳感器，所述傳感器包括其讀出為可檢測(cè)的或可測(cè)量的光學(xué)信號(hào)的竟?fàn)幗Y(jié)合檢測(cè)物組分，所述竟?fàn)幗Y(jié)合檢測(cè)物組分通過允許分析物擴(kuò)散但不允許檢測(cè)物組分?jǐn)U散的材料保留，所述檢測(cè)物組分包含用基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分對(duì)中的一個(gè)標(biāo)記的糖類結(jié)合分子；能夠與所述分析物竟?fàn)幗Y(jié)合所述糖類結(jié)合分子的糖類類似物，所述糖類類似物為柔性的水溶性聚合物，包含聚合的單體單元的殘基，第一單體單元?dú)埢哂刑腔蛱悄M部分側(cè)鏈和為基于近似性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分對(duì)的另一個(gè)的側(cè)鏈部分；和/或共聚的第一單體單元和第二單體單元的殘基，所述第一單體單元?dú)埢哂刑穷惢蛱穷惸M部分側(cè)鏈，所述第二單體單元?dú)埢哂袨榛诮菩缘男盘?hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分對(duì)中的另一個(gè)的側(cè)鏈部分。全文摘要一種用于檢測(cè)或測(cè)量流體中的糖類分析物(例如葡萄糖)的傳感器，包含其讀出為可檢測(cè)的或可測(cè)量的光學(xué)信號(hào)的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合檢測(cè)物(例如FRET檢測(cè)物)組分，所述組分通過允許分析物擴(kuò)散但不允許檢測(cè)物組分?jǐn)U散的材料保留，所述檢測(cè)物組分包括動(dòng)物凝集素、和能夠與分析物競(jìng)爭(zhēng)地結(jié)合到凝集素的分析物類似物。文檔編號(hào)G01N33/543GK101107524SQ200580046306公開日2008年1月16日申請(qǐng)日期2005年12月7日優(yōu)先權(quán)日2004年12月7日發(fā)明者余藝華,克勞斯·格里戈里厄斯,卡斯珀·斯特魯韋,約翰·米勒·弗雷德里克森,耶斯佩爾·斯文寧·克里斯滕森申請(qǐng)人:帕瑞薩森思公司