專(zhuān)利名稱：獲取生物源樣本的圖像的裝置和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對(duì)諸如細(xì)胞、細(xì)菌和其他生物樣本的生物源樣本(或標(biāo) 本)發(fā)出的微光成像的方法和裝置，更具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及通過(guò)對(duì)生物發(fā) 光現(xiàn)象產(chǎn)生的弱光成像而對(duì)這種樣本進(jìn)行觀察和各種測(cè)量的方法和裝置。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，在生命科學(xué)領(lǐng)域的研究中越來(lái)越多的使用對(duì)生物源的樣本成
像的技術(shù)，該生物源樣本如細(xì)胞，具有熒光蛋白質(zhì)例如GFP，和/或發(fā)光蛋 白質(zhì)，例如熒光素酶、發(fā)光蛋白質(zhì)通過(guò)轉(zhuǎn)基因而在任意細(xì)胞中表達(dá)?？梢?表達(dá)熒光或發(fā)光蛋白質(zhì)，同時(shí)與細(xì)胞內(nèi)另外任意的某種蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)標(biāo)記) 混合，并且，如果將熒光或發(fā)光蛋白質(zhì)編碼基因插入或替換特定遺傳調(diào)節(jié) 區(qū)域的下游側(cè)，將僅基于特定遺傳調(diào)節(jié)區(qū)域的激活而表達(dá)該熒光或發(fā)光蛋 白質(zhì)。因此，至今為止，在細(xì)胞內(nèi)和/或外發(fā)生的各種生物現(xiàn)象中，想要使 得與蛋白質(zhì)表示或遺傳區(qū)域的激活一起表達(dá)的熒光或發(fā)光蛋白質(zhì)被觀察 到，以及在使用光學(xué)顯微鏡檢測(cè)和/或探測(cè)所觀察的蛋白質(zhì)或遺傳區(qū)域何時(shí) 以及如何表示，和/或得到的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)和外將如何表現(xiàn)，就使用這種 熒光或發(fā)光蛋白質(zhì)作為報(bào)告分子或探針?lè)肿印?br> 熒光蛋白質(zhì)，諸如GFP在細(xì)胞內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定，且從中發(fā)出的熒光明亮， 因此廣泛使用這些蛋白質(zhì)來(lái)穩(wěn)定和簡(jiǎn)便地執(zhí)行細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的成像(例如，參 見(jiàn)Mason(1999年)Fluorescent and luminescent probes for biological activity,
第二版)。另一方面，諸如熒光素酶的發(fā)光蛋白質(zhì)通過(guò)化學(xué)發(fā)光和/或生物發(fā) 光現(xiàn)象發(fā)光而沒(méi)有激勵(lì)熒光染料的激發(fā)光(激發(fā)光通常對(duì)于細(xì)胞或其他生 物樣本有害)。因此，對(duì)于在光學(xué)顯微鏡下觀察期間，期待發(fā)光蛋白質(zhì)作為
一種探頭對(duì)生物樣本成像而不對(duì)其形成傷害，并且也報(bào)道了 一些使用這種 發(fā)光蛋白質(zhì)的成像技術(shù)的例子。例如，Rutter等人通過(guò)使用光子計(jì)數(shù)攝像機(jī) 在單個(gè)活細(xì)胞中對(duì)熒光素酶的基因表達(dá)成像，觀測(cè)到在胰島素發(fā)出的信號(hào)
中包括MAP致活酶(Rutter, White, Tavare (1995年)"Involvement of MAP kinase in insulin signalling revealed by non-invasive imaging of luciferase gene expression in single living cells" Current Biology Vol. 5 890-899.)。 Sternberg 等人也報(bào)道了使用光子計(jì)數(shù)攝像機(jī)和冷卻CCD攝像機(jī)探測(cè)生物發(fā)光 (Sternberg, Eberl， Kongsbak, Molin (1997年),"Detection of bioluminescence from individual bacterial cells: a comparison of two different low-light imaging system" J. Bioluminescence and Chemiluminescence Vol. 12: 7-13.)。此夕卜， Takasuka等人也報(bào)告通過(guò)使用光子計(jì)數(shù)攝像機(jī)在單個(gè)活細(xì)胞中對(duì)熒光素酶 的基因表達(dá)成像觀察到泌乳刺激素促進(jìn)劑活性的動(dòng)態(tài)變化(Takasuka, White: Wood, Robertson, Davis (1998年)，"Dynamic changes in prolactin promoter activation in individual living lactotrophic cells" Endocrinology Vol, 139: 1361-1368.)。
如上所述，在對(duì)上述細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的熒光和/或發(fā)光蛋白質(zhì)成像時(shí)， 該熒光蛋白質(zhì)的熒光相對(duì)較亮，因此通過(guò)成像系統(tǒng)中配備的常規(guī)光學(xué)顯微 鏡可以獲得它們熒光的相對(duì)清楚的顯微鏡圖像。然而，來(lái)自細(xì)胞或其他生 物樣本(此后稱作"細(xì)胞等")的發(fā)光蛋白質(zhì)的光強(qiáng)通常非常弱或細(xì)微，因此很 難使用用于正常顯微鏡圖像的攝像機(jī)和成像系統(tǒng)獲得發(fā)光的顯微鏡圖像 (實(shí)際上，通常通過(guò)人眼不能觀察到發(fā)光蛋白質(zhì)的發(fā)光)。因此，在對(duì)發(fā)光蛋 白質(zhì)成像的常規(guī)系統(tǒng)中，專(zhuān)用于探測(cè)微光的攝像機(jī)或圖像采集設(shè)備，諸如 超高靈敏度攝像機(jī)或光子計(jì)數(shù)攝像機(jī)被安裝到光學(xué)顯微鏡上(但是，即使具 有超高靈敏度攝像機(jī)，還是需要在攝像機(jī)的光接收面上對(duì)來(lái)自樣本的光積 分至少數(shù)分鐘或數(shù)十分鐘以產(chǎn)生一幅圖像)。
以此方式，在光學(xué)顯微鏡的熒光或發(fā)光觀察中，顯微鏡圖像中的光原 理上僅是蛋白質(zhì)發(fā)出的光。因此，在樣本中沒(méi)有蛋白質(zhì)存在的區(qū)域中的條 件或形態(tài)是不能觀察到的。在觀察熒光蛋白質(zhì)的情況下，然而，可以觀察 到細(xì)胞的形態(tài)和條件等，因?yàn)樗鼈兙哂邢鄬?duì)較亮的熒光，并且由于應(yīng)用了 激發(fā)光而來(lái)自細(xì)胞內(nèi)熒光蛋白質(zhì)之外材料的自熒光發(fā)射等。另一方面，在 發(fā)光蛋白質(zhì)的發(fā)光觀察的情況下，來(lái)自樣本的光，諸如來(lái)自發(fā)光蛋白質(zhì)的 光非常微弱，以至于不能產(chǎn)生圖像，除非將其積分若干至數(shù)十分鐘，并且， 在發(fā)光蛋白質(zhì)之外沒(méi)有材料發(fā)射光的情況下，就很難獲得在樣本中細(xì)胞等
位置、形態(tài)以及這些改變(在沒(méi)有光的區(qū)域不能知道是否有細(xì)胞存在)。然而， 在觀察期間，尤其是長(zhǎng)時(shí)間觀察活細(xì)胞樣本等時(shí)，光強(qiáng)會(huì)變化，和/或細(xì)胞 會(huì)移動(dòng)或變形，并且因此很難確定哪個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞的哪個(gè)部分發(fā)光。例如， 很難分析細(xì)胞質(zhì)中發(fā)光改變現(xiàn)象以及某些神經(jīng)細(xì)胞中的神經(jīng)突起。
在一些現(xiàn)有技術(shù)中，為了觀察細(xì)胞等的位置和形態(tài)，與發(fā)光蛋白質(zhì)的 發(fā)光觀察一起執(zhí)行透射光觀察。在此情況下，然而，透射光觀察和發(fā)光觀 察中攝像機(jī)光接收面上的光量非常不同。因此，對(duì)于透射光觀察和發(fā)光觀 察，使用不同攝像機(jī)(使用不同的物鏡)，并且由此不同的攝像機(jī)分別產(chǎn)生發(fā) 光圖像(來(lái)自發(fā)光蛋白質(zhì)的光的圖像)和照明圖像(透射光的圖像)。因此，顯 微鏡圖像示出細(xì)胞的形態(tài)等，且在不同的圖像上創(chuàng)建出示出發(fā)光蛋白質(zhì)的 分布的顯微鏡圖像，這就使得很難精確確定樣本中發(fā)光蛋白質(zhì)的實(shí)際分布 或位置(通常，攝像機(jī)對(duì)于透射光觀察和發(fā)光觀察的視場(chǎng)的尺寸和/或位置會(huì) 偏移，并且在這種情況下，在樣本中確定發(fā)光蛋白質(zhì)的實(shí)際分布和位置就 變得更困難)。此外，在一次觀察很多細(xì)胞的時(shí)候，不容易找到與照明圖像 中細(xì)胞對(duì)應(yīng)的、發(fā)光圖像中對(duì)應(yīng)的發(fā)光細(xì)胞。
在上述使用發(fā)光蛋白質(zhì)的"發(fā)光成像"中，如果可以探測(cè)或限定樣本中 發(fā)光蛋白質(zhì)的分布，同時(shí)獲得同一樣本中細(xì)胞的形態(tài)和/或條件等，就可以 加寬"發(fā)光成像"的應(yīng)用范圍，并且將在對(duì)于各種生物過(guò)程中涉及的反應(yīng)等 的分析中變得有用。如上所述，然而，在現(xiàn)有技術(shù)中，由于發(fā)光蛋白質(zhì)的 光很微弱且在樣本中不包括發(fā)光蛋白質(zhì)的區(qū)域沒(méi)有光，就很難關(guān)于某些細(xì) 胞中什么位置和/或樣本中哪個(gè)細(xì)胞表現(xiàn)出發(fā)光蛋白質(zhì)的信息，盡管可以探 測(cè)樣本中發(fā)光蛋白質(zhì)表示的存在或不存在。實(shí)際上，通過(guò)超高靈敏度圖像 探測(cè)元件，可以執(zhí)行弱光探測(cè)，但是在此情況下，可以獲得的圖像僅僅是 鑲嵌圖像，并且因此很難執(zhí)行詳細(xì)分析，同時(shí)限定其中要測(cè)量發(fā)光量的區(qū) 域。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種裝置和方法，用于對(duì)上述生物 發(fā)光現(xiàn)象產(chǎn)生弱光的細(xì)胞和/或其他生物樣本成像，其中以這樣的方式獲得 細(xì)胞等的發(fā)光圖像，其中可以確定發(fā)光細(xì)胞和/或細(xì)胞中的發(fā)光位置。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供這樣一種方法和裝置，其可以從特定區(qū)域 獲取數(shù)據(jù)，并且在細(xì)胞中用于分析各種現(xiàn)象。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，通過(guò)光學(xué)成像裝置獲得生物源的樣本圖像的 裝置的特征在于該裝置包括照明部分，用于照射樣本；照明圖像獲取部 分，用于獲得樣本的照明圖像；發(fā)光圖像獲取部分，其獲取樣本中細(xì)胞的 發(fā)光圖像；以及圖像處理部分，用于疊加照明圖像和發(fā)光圖像，以產(chǎn)生疊 加圖像，并確定或指定疊加圖像中所分析區(qū)域。在此結(jié)構(gòu)中，通常光學(xué)成 像設(shè)備可以是光學(xué)顯微鏡。在此情況下，照明圖像是在光學(xué)顯微鏡下使用 來(lái)自照明部分的照明光通過(guò)執(zhí)行透射光觀察獲得的透射光顯微鏡圖像，且 發(fā)光圖像是通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)發(fā)光現(xiàn)象獲得的發(fā)光顯微鏡圖像。 該照明圖像獲取部分和發(fā)光圖像獲取部分優(yōu)選包括共用的顯微鏡圖像采集 設(shè)備，通過(guò)該設(shè)備采集透射光顯微鏡圖像和發(fā)光顯微鏡圖像。
根據(jù)上述結(jié)構(gòu)，通過(guò)觀察樣本細(xì)胞中的發(fā)光現(xiàn)象獲得的發(fā)光圖像與通 過(guò)照明樣本獲得的照明圖像相疊加，因此其中細(xì)胞的形態(tài)和/或條件等可以 被觀察到，并且因此，可以比以往更加精確的在樣本和/或細(xì)胞中定位發(fā)光 圖像中細(xì)胞的發(fā)光位置。尤其是，通過(guò)通用顯微鏡圖像采集設(shè)備獲得照明 圖像(透射光顯微鏡圖像)和發(fā)光圖像(發(fā)光顯微鏡圖像)時(shí)，疊加圖像就變得 非常容易。甚至在觀察區(qū)域中具有類(lèi)似形態(tài)的很多細(xì)胞的時(shí)候，其中通過(guò) 觀看將發(fā)光圖像與照明圖像疊加得到的、示出樣本中細(xì)胞形態(tài)的圖像，可 以立即確定發(fā)光的細(xì)胞，并且因此，在圖像中要觀看的區(qū)域，即分析發(fā)光 現(xiàn)象中要監(jiān)視的區(qū)域等(分析區(qū)域)就很容易被找到。此外，可以在發(fā)光圖像 中獲得樣本的條件，因此，甚至在細(xì)胞移動(dòng)和/或變形的時(shí)候，可以容易地 判斷哪個(gè)細(xì)胞、在何處或如何移動(dòng)和/或變形，并且相應(yīng)的，可以容易地發(fā) 現(xiàn)發(fā)光如何變化。此外，依照本發(fā)明的結(jié)構(gòu)，盡管僅通過(guò)在發(fā)光圖像中觀 察，在樣本的細(xì)胞密度中很難區(qū)別隨機(jī)發(fā)生的多個(gè)細(xì)胞的重疊，但是可以 指定具有適當(dāng)細(xì)胞密度的區(qū)域并隨后判斷是否存在重疊細(xì)胞，由此使得可 以更精確的分析發(fā)光量。
在本發(fā)明的裝置中，如上所述，要彼此疊加的透射光顯微鏡圖像和發(fā) 光顯微鏡圖像優(yōu)選通過(guò)共用顯微鏡圖像采集設(shè)備采集。此時(shí)，依照本申請(qǐng) 發(fā)明人的研究，已經(jīng)知道，在顯微鏡圖像采集設(shè)備的光接收面上形成樣本
圖像的物鏡和光學(xué)顯微鏡的透鏡組件設(shè)計(jì)為使得物鏡的數(shù)值孔徑(NA)與投 射在光接收面上的樣本圖像的放大率((3)之間比率(NA/p)的平方值為0.01或 更大，使用諸如CCD攝像機(jī)的圖像采集設(shè)備僅從單個(gè)細(xì)胞發(fā)出的光可產(chǎn)生 圖像(參見(jiàn)日本專(zhuān)利申請(qǐng)No.2005-267531)。此外，令人驚訝的，此成像條件 可以用于所有源于生物樣本的成像，而其在過(guò)去很難成像，并且已經(jīng)知道 即使是在光學(xué)顯微鏡下眼睛很難直接看到的微弱的發(fā)光分量，諸如生物發(fā) 光，細(xì)胞的圖像等可以在較短時(shí)間段內(nèi)獲得(例如20分鐘)。此外，依照發(fā) 明人研究的光學(xué)條件，已經(jīng)知道在圖像采集設(shè)備物鏡的數(shù)值孔徑(NA)/投影 圖像的放大率(P)的平方值表示的光學(xué)條件是0.071或更高的時(shí)候，可以在1 到5分鐘的短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行成像，使得可以獲得甚至在圖像分析中可用的細(xì) 胞等的圖像。因此，在本發(fā)明裝置的一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)設(shè)置顯微鏡圖像 采集設(shè)備的光接收面和物鏡以及透鏡組件，以將其N(xiāo)A/p的平方值設(shè)置為 0.01或更高，更優(yōu)選的為0.071或更高，就可以創(chuàng)建透射光顯微鏡圖像和發(fā) 光顯微鏡圖像的更好的疊加圖像。
此外，在本發(fā)明的裝置中，還可以提供獲取細(xì)胞熒光圖像的熒光圖像 獲取部分。在光學(xué)成像設(shè)備是光學(xué)顯微鏡的時(shí)候，熒光圖像是用光學(xué)顯微 鏡執(zhí)行樣本熒光觀察獲得的熒光顯微鏡圖像。同樣在此情況下，熒光顯微 鏡圖像和發(fā)光顯微鏡圖像可以通過(guò)共用顯微鏡圖像采集設(shè)備獲得。本領(lǐng)域 技術(shù)人員公知的，在熒光觀察中，通過(guò)使用對(duì)環(huán)境條件諸如pH、 Ca濃度 或膜電位等敏感的各種熒光染料，可以探測(cè)各種細(xì)胞間的反應(yīng)。因此，應(yīng) 該理解，將這種熒光觀察獲得的熒光圖像和發(fā)光圖像結(jié)合可以揭示細(xì)胞中 發(fā)光位置與各種細(xì)胞內(nèi)現(xiàn)象間的關(guān)系。需要說(shuō)明，樣本中細(xì)胞形態(tài)等與發(fā) 光位置間的空間關(guān)系可以通過(guò)疊加發(fā)光圖像和照明圖像而容易地獲得，并 且，依照此特征，還可以進(jìn)一步增加結(jié)合發(fā)光圖像和熒光圖像的用處。
在本發(fā)明裝置的一個(gè)實(shí)施例中，可以提供顯示疊加圖像的顯示部分， 以給用戶容易地在顯示部分上觀看樣本中或細(xì)胞中的發(fā)光位置。此外，在 本發(fā)明的裝置中，可以提供記錄部分來(lái)記錄疊加圖像，用于圖像的分析和 顯示。
另外，如上所述，在觀察細(xì)胞發(fā)光中，尤其對(duì)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的諸如熒光 素酶、發(fā)光蛋白質(zhì)的發(fā)光蛋白質(zhì)的發(fā)光成像的過(guò)程中，將發(fā)光蛋白質(zhì)基因
引入細(xì)胞，使得表達(dá)相應(yīng)的發(fā)光蛋白質(zhì)，同時(shí)與任意的蛋白質(zhì)(觀察對(duì)象) 混在一起，或者，該基因可以被替換、或插入遺傳調(diào)控區(qū)的下游側(cè)，并因 此將得到的表達(dá)的發(fā)光蛋白質(zhì)用作報(bào)告分子，用于探測(cè)何時(shí)何地表達(dá)測(cè)量 中的任意目標(biāo)蛋白質(zhì)。這樣，在細(xì)胞接收各種激勵(lì)之一的時(shí)候，在細(xì)胞中 經(jīng)常通過(guò)發(fā)光蛋白質(zhì)表達(dá)要報(bào)告的蛋白質(zhì)。因此，在本發(fā)明裝置的一個(gè)實(shí) 施例中，可以提供用于給細(xì)胞提供任意激勵(lì)的細(xì)胞激勵(lì)供給部分。例如， 該細(xì)胞激勵(lì)供給部分可以包括至少一個(gè)從具有以下部分的組中選出的部 分試劑供給部分，給細(xì)胞提供試劑；溫度調(diào)節(jié)部分，用于調(diào)節(jié)樣本的溫 度；以及氣體供給部分，用于給細(xì)胞提供氣體。
此外，在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的上述裝置可以是獲取生物源的樣本 的圖像的裝置，包括光學(xué)顯微鏡；顯微鏡圖像采集設(shè)備，用于采集光學(xué)顯 微鏡觀察的顯微鏡圖像；以及圖像處理設(shè)備，用于獲得顯微鏡圖像作為圖 像數(shù)據(jù)并執(zhí)行圖像處理，其特征在于該圖像處理設(shè)備包括圖像疊加部分， 用于通過(guò)疊加透射光圖像和發(fā)光圖像產(chǎn)生疊加圖像，其中在光學(xué)顯微鏡下 用顯微鏡圖像采集設(shè)備在樣本的透射光觀察中采集樣本圖像獲得透射光圖 像，以及通過(guò)用顯微鏡圖像采集設(shè)備對(duì)樣本中細(xì)胞內(nèi)發(fā)光現(xiàn)象發(fā)出的光進(jìn) 行采集獲得發(fā)光圖像；還包括圖像區(qū)域指定部分，用于指定疊加圖像中的 分析區(qū)域。在此裝置中，^t選的，該顯微鏡圖像采集設(shè)備具有光接收面， 且該光學(xué)顯微鏡包括物鏡和透鏡組件，其在顯微鏡圖像采集設(shè)備的光接收 面上形成樣本的圖像，其中將光學(xué)顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)構(gòu)建為使得物鏡的數(shù) 值孔徑與在光接收面上投影樣本圖像的放大率之間的比率的平方值為0.01 或更高。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種利用光學(xué)成像設(shè)備獲取生物源的 樣本的圖像的方法，包括下面的步驟照射樣本并獲取其照明圖像；不照 明樣本獲得樣本細(xì)胞中發(fā)光現(xiàn)象發(fā)出的光的發(fā)光圖像；疊加照明圖像和發(fā) 光圖像以產(chǎn)生疊加圖像；確定疊加圖像中的分析區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明的方法， 如上裝置所述的，可以產(chǎn)生照明圖像和發(fā)光圖像的疊加圖像，并且由此執(zhí) 行發(fā)光現(xiàn)象的分析，其中在照明圖像中出現(xiàn)的樣本或細(xì)胞中獲得找到發(fā)光 的區(qū)域。這樣，可以用上述裝置執(zhí)行本發(fā)明的方法，但是也可以用其他任 意的設(shè)備進(jìn)行。此外，在本發(fā)明的方法中，可以執(zhí)行在樣本細(xì)胞中獲取熒
光圖像以及發(fā)光圖像和照明圖像的步驟，并且因此可以將發(fā)光現(xiàn)象與從熒 光獲得的信息關(guān)聯(lián)起來(lái)，同時(shí)獲得在細(xì)胞或樣本中哪里發(fā)生發(fā)光現(xiàn)象。
在上述方法中，以及在上述裝置中，光學(xué)成像設(shè)備可以是光學(xué)顯微鏡。 此時(shí)，照明圖像是使用光學(xué)顯微鏡執(zhí)行透射光觀察獲得的透射光顯微鏡圖 像，且發(fā)光圖像是用光學(xué)顯微鏡觀察樣本細(xì)胞中發(fā)光現(xiàn)象獲得的發(fā)光顯微 鏡圖像，其中優(yōu)選的是，通過(guò)通用顯微鏡圖像采集設(shè)備采集透射光顯微鏡 圖像和發(fā)光顯微鏡圖像。此外，在光學(xué)顯微鏡中，優(yōu)選將在顯微鏡圖像采 集設(shè)備的光接收面上形成樣本圖像的物鏡和透鏡組件設(shè)計(jì)為使物鏡的數(shù) 值孔徑與在光接收面上投影樣本圖像的放大率之間的比率的平方值為0.01 或更高。
在一個(gè)實(shí)施例中，例如在長(zhǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)光現(xiàn)象成像時(shí)，照射樣本并獲取 照明圖像的步驟執(zhí)行多次，因此可以任意檢査樣本中細(xì)胞等形態(tài)的改變和/ 或位置的移動(dòng)等。此外，在其細(xì)胞內(nèi)基因中要觀察的細(xì)胞結(jié)合了給細(xì)胞提 供某特定激勵(lì)如試劑激勵(lì)、電激勵(lì)、氣體激勵(lì)或熱激勵(lì)而表達(dá)的發(fā)光蛋白 質(zhì)基因時(shí)，有選擇的給細(xì)胞提供上述至少一種激勵(lì)的步驟可以在獲得照明 圖像和發(fā)光圖像(或還可以獲得熒光圖像)的步驟之前進(jìn)行。此時(shí)，為了在提 供激勵(lì)前檢査條件，優(yōu)選將獲得細(xì)胞照明圖像和發(fā)光圖像的步驟在提供細(xì) 胞激勵(lì)之前進(jìn)行。
此外，獲得一系列上述各種圖像以及疊加照明圖像和發(fā)光圖像的步驟 之后，可以執(zhí)行顯示和/或記錄照明圖像和發(fā)光圖像的疊加圖像的步驟，以 允許用戶檢査圖像和/或隨后執(zhí)行任意處理。
此外，可選的，在指定分析區(qū)域之后，為了詳細(xì)檢查或觀察分析區(qū)域 的條件，可以執(zhí)行顯示對(duì)應(yīng)于分析區(qū)域的照明圖像區(qū)域，對(duì)應(yīng)于分析區(qū)域 的發(fā)光圖像區(qū)域以及對(duì)應(yīng)于分析區(qū)域的熒光圖像區(qū)域中至少兩個(gè)(在也需 要熒光圖像時(shí))的步驟。在發(fā)光現(xiàn)象的分析中，可以執(zhí)行測(cè)量發(fā)光圖像中與 分析區(qū)域?qū)?yīng)的區(qū)域的光強(qiáng)的步驟和顯示該光強(qiáng)改變的步驟。
從上面的描述可以知道，在發(fā)光圖像中，通常樣本中沒(méi)有發(fā)光蛋白質(zhì) 的區(qū)域條件是本質(zhì)上不能觀察的，且圖像采集設(shè)備或攝像機(jī)中觀察的光很 微弱，因此，即使可以探測(cè)發(fā)光蛋白質(zhì)的發(fā)光現(xiàn)象，也很難正確獲得樣本 中何處出現(xiàn)發(fā)光現(xiàn)象。依照本發(fā)明的裝置和方法，產(chǎn)生通過(guò)疊加照明圖像
和發(fā)光圖像獲得的圖像，因此可以分析發(fā)光現(xiàn)象同時(shí)獲得樣本中出現(xiàn)發(fā)光 的位置。根據(jù)本發(fā)明的特征，由于發(fā)光細(xì)胞和非發(fā)光細(xì)胞分別可以從照明 圖像和發(fā)光圖像的疊加圖像中立即確定，就可以對(duì)觀察到發(fā)光的細(xì)胞數(shù)量 以及沒(méi)有觀察到發(fā)光的細(xì)胞的數(shù)量執(zhí)行任意統(tǒng)計(jì)分析。此外，與現(xiàn)有技術(shù) 相比，可以容易地執(zhí)行僅監(jiān)視發(fā)光細(xì)胞的發(fā)光強(qiáng)度的隨時(shí)間的觀察。例如， 在測(cè)量過(guò)程中樣本內(nèi)細(xì)胞移動(dòng)時(shí)，就可以跟蹤照明圖像和發(fā)光圖像的疊加 圖像中的發(fā)光細(xì)胞。過(guò)去，在增加顯微鏡物鏡的放大率的時(shí)候，由于增加 了物鏡的放大率，來(lái)自發(fā)光位置的信號(hào)相對(duì)減少，因此可能錯(cuò)過(guò)發(fā)光位置。 然而，根據(jù)本發(fā)明，由于可以在發(fā)光圖像和照明圖像的疊加圖像上確定樣 本的發(fā)光位置，就減少了失敗，例如錯(cuò)過(guò)發(fā)光位置。
可以說(shuō)，上述的本發(fā)明增加了在細(xì)胞和/或其他生物樣本成像中發(fā)光蛋 白質(zhì)的用處。根據(jù)本發(fā)明，過(guò)去僅對(duì)報(bào)告分子使用發(fā)光蛋白質(zhì)以光譜執(zhí)行 的、對(duì)細(xì)胞內(nèi)各種蛋白質(zhì)的表達(dá)的各種試驗(yàn)、測(cè)量和分析，可通過(guò)成像來(lái) 進(jìn)行，其中標(biāo)識(shí)了各個(gè)細(xì)胞。
本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點(diǎn)通過(guò)下面的說(shuō)明將變得顯而易見(jiàn)。


圖1A是示意圖，示出微光測(cè)量裝置第一實(shí)施例的結(jié)構(gòu)的概況，其包括 依照本發(fā)明的反轉(zhuǎn)的光學(xué)顯微鏡，且圖1B是圖1A的樣本容器附近的結(jié)構(gòu) 的詳細(xì)的示意圖，包括給樣本中的細(xì)胞提供激勵(lì)的設(shè)備；
圖2A以功能框圖的形式示出微光測(cè)量裝置的計(jì)算機(jī)80的結(jié)構(gòu)(圖像處 理設(shè)備)，且圖2B示出與計(jì)算機(jī)80連接的控制面板的示意圖3以流程圖的形式示出本發(fā)明獲得生物源樣本圖像的方法的步驟， 其通過(guò)本發(fā)明的微光測(cè)量裝置進(jìn)行；
圖4示意示出在NIH3T3細(xì)胞中觀察的發(fā)光強(qiáng)度的周期性變化，其中 通過(guò)將熒光素酶基因連接到具有時(shí)鐘基因結(jié)合其中的表達(dá)載體，來(lái)表現(xiàn)出 質(zhì)體。在24小時(shí)的周期中當(dāng)發(fā)光變得很微弱的時(shí)候(a)，就不能獲得發(fā)光的 圖像；
圖5示出本發(fā)明微光測(cè)量裝置的第二實(shí)施例的結(jié)構(gòu)(光學(xué)系統(tǒng))的示意 圖，其同時(shí)執(zhí)行熒光和生物發(fā)光測(cè)量；
圖6是本發(fā)明微光測(cè)量裝置的第三實(shí)施例的結(jié)構(gòu)(光學(xué)系統(tǒng))的示意圖， 其同時(shí)執(zhí)行熒光和生物發(fā)光測(cè)量，以及分別進(jìn)行數(shù)字變焦和光學(xué)變焦的圖 像擴(kuò)展；
圖7是說(shuō)明將要引入用作例子1的樣本Hda細(xì)胞中的質(zhì)體中預(yù)計(jì)的分 子條件的圖，質(zhì)體中將熒光素酶基因連接到具有四環(huán)素操縱子(Tet02)的表 達(dá)載體。如圖7A所示，將TetR同型二聚體與Tet02區(qū)域結(jié)合時(shí)，不表達(dá) 連接到Tet02的熒光素酶基因。另一方面，在給細(xì)胞四環(huán)素時(shí)，TetR同型 二聚體結(jié)構(gòu)改變并且與Tet02區(qū)域分開(kāi)，如圖7B所示，導(dǎo)致表達(dá)熒光素酶；
圖8是示出例子1中添加四環(huán)素和曝光照明圖像和發(fā)光圖像的時(shí)間；
圖9A、 9B和9C的每個(gè)示出例子l中獲得的照明圖像、發(fā)光圖像以及 疊加圖9A中照明圖像和圖9 B中發(fā)光圖像得到的圖像(圖9A的框內(nèi)的擴(kuò)展 圖像)。在圖9C中，表示為ROI-l和ROI-2的方框指定為分析區(qū)域；
圖10示出圖9C中指定的分析區(qū)域中(Hela細(xì)胞)發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí)間變化 的圖IIA、 11B和11C的每個(gè)示出例子2中獲得的照明圖像、發(fā)光圖像 以及疊加圖IIA中照明圖像和圖11B中發(fā)光圖像得到的圖像。發(fā)光位置在 實(shí)際的裝置中通過(guò)偽彩色顯示，但是，圖11C中以白色顯示；
圖12為示出圖11中PP-1區(qū)域中發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的圖13A、 13B和13C的每個(gè)示出例子3中獲得的照明圖像、發(fā)光圖像 以及疊加圖13A中照明圖像和圖13B中發(fā)光圖像得到的圖像；
圖14是示出例子3中隨時(shí)間進(jìn)展的發(fā)光細(xì)菌移動(dòng)的疊加圖像(左)和照 明圖像(右)；
圖15是例子3中發(fā)光細(xì)菌(V.t.)的發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的圖。 最佳實(shí)施方式
下面，對(duì)參照附圖的若干優(yōu)選實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，其中相同參考 標(biāo)記表示相同的部件。
本發(fā)明裝置的第一實(shí)施例 裝置的結(jié)構(gòu)
圖1A是本發(fā)明第一實(shí)施例優(yōu)選裝置的示意圖，其獲取生物源樣本的圖
像，以測(cè)量生物發(fā)光現(xiàn)象產(chǎn)生的微光，并執(zhí)行細(xì)胞和/或其他生物樣本的成 像。(此后稱作"微光測(cè)量裝置")。
參照附圖，本發(fā)明的微光測(cè)量裝置包括反轉(zhuǎn)的顯微鏡，包括光源2、照 明光學(xué)系統(tǒng)l，使得光源2發(fā)出的光成為平行束并引導(dǎo)得到的束到樣本4、 觀察光學(xué)系統(tǒng)5，用于形成樣本4的圖像、以及目鏡6，用于擴(kuò)展樣本4的 圖像進(jìn)行眼睛觀察；CCD攝像機(jī)8(圖像獲取部分或顯微鏡圖像采集設(shè)備)， 具有圖像傳感器7，用于采集樣本4的顯微鏡圖像；以及計(jì)算機(jī)80(圖像處 理部分或圖像處理設(shè)備)，具有TV監(jiān)視器，CCD攝像機(jī)8通過(guò)信號(hào)線81 連接到計(jì)算機(jī)。
光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)
上述光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)可以是正常的反轉(zhuǎn)顯微鏡，其中從光源2開(kāi)始 以所描述的順序，照明光學(xué)系統(tǒng)1構(gòu)建有會(huì)聚透鏡10、偏轉(zhuǎn)鏡12，用于偏 轉(zhuǎn)照明光的光軸ll、以及會(huì)聚透鏡14。光源2可以是相干光源，具有可見(jiàn) 范圍內(nèi)的波長(zhǎng)，諸如鹵素?zé)簟ED光源、鎢燈、水銀燈等。此夕卜，來(lái)自相 干光源的光諸如激光，并通過(guò)漫射片等轉(zhuǎn)換成非相干光，還可以用作光源2。 盡管光源的波長(zhǎng)通常在可見(jiàn)光范圍內(nèi)，也可以使用紅外光。
觀察光學(xué)系統(tǒng)5構(gòu)建為具有物鏡15，用于形成樣本4的圖像、第一中 繼透鏡16、偏轉(zhuǎn)鏡17，用于偏轉(zhuǎn)來(lái)自物鏡15的光以及第二中繼透鏡18， 與第一中繼透鏡16結(jié)合用于將來(lái)自物鏡15的圖像(樣本4的圖像)形成到成 像面上。在第二中繼透鏡18和成像面19之間，轉(zhuǎn)換(change over)鏡20可 以安裝為使得任意改變樣本4的圖像在眼睛通過(guò)目鏡6觀察和通過(guò)CCD攝 像機(jī)8觀察之間的觀察路徑。此時(shí)，對(duì)于轉(zhuǎn)換鏡20，不必使用機(jī)械轉(zhuǎn)換的 類(lèi)型，可以使用半反半透鏡將光路分成兩個(gè)。
在上述結(jié)構(gòu)的樣本透射光觀察中，以Koehler照明源照射樣本4，如正 常光學(xué)顯微鏡觀察透射光的情形一樣。因此，來(lái)自光源2的光首先通過(guò)會(huì) 聚透鏡IO變?yōu)槠叫泄馐?，并?dǎo)致照射樣本4，同時(shí)在聚光透鏡14的光瞳位 置形成光源2的圖像。隨后，照射樣本4的光通過(guò)樣本4進(jìn)入物鏡15以在 成像面19上通過(guò)第一中繼透鏡16和第二中繼透鏡18形成樣本圖像，且在 成像面19上得到的樣本4的圖像通過(guò)目鏡6被觀察者觀察到。此外，在 CCD攝像機(jī)8采集樣本4的圖像時(shí)，通過(guò)第二中繼透鏡18的光被轉(zhuǎn)換鏡
20反射，并由此樣本4的圖像形成在CCD攝像機(jī)8的圖像傳感器7上。 此時(shí)，物鏡的放大率可以例如為20倍。
如圖所示，樣本4設(shè)置在樣本臺(tái)3上，其中優(yōu)選如圖1B詳細(xì)所示，樣 本4可以和培養(yǎng)基一起放置到樣本容器21中，該容器諸如具有蓋子26的 試驗(yàn)盤(pán)。樣本容器21的底部由具有與用于顯微鏡的0.17mm厚度的光學(xué)透 明蓋玻璃一樣的特性，因此樣本容器21的底部的樣本可以使用正常物鏡觀 察到(此時(shí)，樣本容器21不限于這種試驗(yàn)室盤(pán)，以及可以使用載片、微片 等)。此外，為了保持樣本容器21中的潮濕，樣本容器21可以置于水浴22 中，其中通過(guò)管嘴23提供純凈水，并且與水浴22—起通過(guò)有蓋的關(guān)閉容 器30保持。隨后，如圖1B詳細(xì)所示，通過(guò)供氣管24以及來(lái)自測(cè)量設(shè)備之 外的氣缸25的Co2管嘴84將Co2氣體供給水浴22的上表面。氣缸25中 的氣體例如5%0)2和95%02混合氣體。供應(yīng)Q)2氣體到蓋上的關(guān)閉容器30 的流速是約50mL/min。此外，加熱片27可以設(shè)在樣本容器21下面。該加 熱片27通常以溫度控制器(未示出)通過(guò)0.5°C的步幅調(diào)整樣本容器內(nèi)的溫 度。
此外，如隨后所述，為了通過(guò)激勵(lì)細(xì)胞執(zhí)行產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象的試驗(yàn)(使得 表達(dá)發(fā)光蛋白質(zhì))，可以設(shè)置自動(dòng)分配設(shè)備100，作為給細(xì)胞激勵(lì)的裝置。 在自動(dòng)分配設(shè)備100中，泵102從試劑容器101獲得試劑溶液并使用管嘴 103將預(yù)定量的試劑溶液釋放到樣本容器21中。如圖所示，在將樣本容器 21放到蓋上的關(guān)閉容器30中時(shí)，優(yōu)選的，在從管嘴103釋放試劑溶液前， 關(guān)閉容器30的蓋31和樣本容器的蓋26通過(guò)馬達(dá)(未示出)打開(kāi)，與自動(dòng)分 配設(shè)備100協(xié)調(diào)操作，在釋放溶液后，蓋131和樣本容器蓋26通過(guò)馬達(dá)關(guān) 閉。此時(shí)，在下述的計(jì)算機(jī)控制下，自動(dòng)分配設(shè)備100可以在獲取顯微鏡 圖像前后和/或在其間的任意時(shí)間操作。
此外，在樣本臺(tái)3上，優(yōu)選的，為了任意水平移動(dòng)樣本臺(tái)3(X方向和 Y方向)，兩個(gè)步進(jìn)馬達(dá)沐示出)分別安裝為彼此方向分開(kāi)90。。兩個(gè)步進(jìn)馬 達(dá)可以基于計(jì)算機(jī)90的指令通過(guò)樣本臺(tái)控制器(未示出)而驅(qū)動(dòng)，使得自動(dòng) 控制樣本臺(tái)3的定位。
此外，優(yōu)選的，在樣本臺(tái)3下的物鏡15周?chē)?，可以安裝物鏡加熱器28 與物鏡15接觸，因此可以在溫度調(diào)節(jié)設(shè)備(未示出)的控制下通過(guò)步進(jìn)間隔
0.5°C以物鏡加熱器28調(diào)整物鏡15的溫度，因此物鏡15外部將保持在任 意溫度。同樣，在物鏡加熱器28周?chē)?，配?Z軸物鏡驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)9"，用于 自動(dòng)沿Z軸(光軸方向)運(yùn)動(dòng)物鏡15。 Z軸物鏡驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)9通過(guò)齒輪齒條機(jī) 構(gòu)(未示出)上下移動(dòng)物鏡15。通過(guò)計(jì)算機(jī)控制的步進(jìn)馬達(dá)(未示出)執(zhí)行齒輪 齒條機(jī)構(gòu)旋鈕的旋轉(zhuǎn)操作?；蛘?，Z軸物鏡驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)9可以是摩擦輥機(jī)構(gòu)。
顯微鏡圖像采集設(shè)備的結(jié)構(gòu)
CCD(電荷耦合器件)攝像機(jī)8用于接收樣本4的圖像，其中的圖像傳感 器7可以具有例如1360x1024個(gè)像素。在本發(fā)明的設(shè)備中，如下所示，CCD 攝像機(jī)8采集通過(guò)樣本4的透射光觀察獲得的透射光顯微鏡圖像，和通過(guò) 樣本4的發(fā)光觀察獲得的發(fā)光顯微鏡圖像，即觀察由于樣本4中細(xì)胞發(fā)光 現(xiàn)象發(fā)射的微光。因此，CCD攝像機(jī)8作為光探測(cè)器采集發(fā)光觀察中的微 光，優(yōu)選選擇具有盡可能高靈敏度的探測(cè)器。因此，對(duì)于CCD攝像機(jī)8優(yōu) 選使用致冷CCD，在其底部配備有具有Peltier器件的冷卻系統(tǒng)29，其可以 將攝像機(jī)的溫度降低到+5。C到-70。C的范圍內(nèi)，以抑制來(lái)自CCD攝像機(jī)8 的暗電流。此外，優(yōu)選在CCD攝像機(jī)8的光接收面上安裝紅外截濾波器 13，以截止作為背景光的紅外照射。CCD攝像機(jī)8采集的圖像通過(guò)信號(hào)線 81傳送到計(jì)算機(jī)80并在與其連接的TV監(jiān)視器37上顯示。此夕卜，CCD攝 像機(jī)8可以是3板型彩色攝像機(jī)，以釆集彩色照明圖像。對(duì)于顯微鏡圖像 的圖像采集設(shè)備，例如，可以使用CMOS圖像傳感器、SIT攝像機(jī)等。
圖像處理設(shè)備的結(jié)構(gòu)
計(jì)算機(jī)80可以構(gòu)建為具有CPU的計(jì)算機(jī)，并可以進(jìn)行任意類(lèi)型的本 領(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種圖像處理。計(jì)算機(jī)80控制本發(fā)明的微光測(cè)量裝置 的各個(gè)部分的操作，以獲取顯微鏡圖像作為圖像數(shù)據(jù)，并且還執(zhí)行從透射 光觀察獲得的照明圖像和從發(fā)光觀察獲得的發(fā)光圖像產(chǎn)生疊加圖像，以及 使用該圖像數(shù)據(jù)的各種處理，諸如使用疊加圖像確定分析區(qū)域。
圖2A表示功能塊形式的計(jì)算機(jī)80。參照附圖，計(jì)算機(jī)80包括CPU 35、 存儲(chǔ)器41，用于存儲(chǔ)控制CPU35操作的控制程序、信號(hào)處理電路33以及 數(shù)字變焦電路34，用于轉(zhuǎn)換CCD攝像機(jī)8采集的圖像為圖像數(shù)據(jù)、顯示
控制電路36和TV監(jiān)視器37，用于顯示CCD攝像機(jī)8采集的圖像、記錄 和再現(xiàn)控制電路38以及記錄介質(zhì)39的驅(qū)動(dòng)器，用于記錄和/或在TV監(jiān)視 器37上顯示CCD攝像機(jī)8采集的圖像和/或通過(guò)圖像處理獲得的圖像、以 及控制面板40，用于輸入用戶的命令。在控制面板40上，如圖2B所示， 提供各種類(lèi)型的按鈕，諸如再現(xiàn)按鈕43、記錄按鈕47、快門(mén)按鈕44、變焦 放大按鈕42、變焦縮小按鈕143、十字光標(biāo)按鈕45、以及模式開(kāi)關(guān)48，以 及由此通過(guò)與CPU 35連接的控制面板40，將用戶的命令輸入計(jì)算機(jī)80。
在上述結(jié)構(gòu)中，形成在CCD攝像機(jī)8的圖像傳感器7上的樣本4的顯 微鏡圖像通過(guò)圖像傳感器轉(zhuǎn)換成模擬電信號(hào)，即模擬圖像信號(hào)。得到的信 號(hào)隨后在CPU 35的控制下傳送到信號(hào)處理電路33，其中對(duì)于圖像信號(hào)執(zhí) 行放大處理、濾波處理和/或如邊緣增強(qiáng)的任何圖像處理。隨后，處理的圖 像信號(hào)發(fā)送到數(shù)字變焦電路34(數(shù)字信號(hào)處理部分)。數(shù)字變焦電路34對(duì)來(lái) 自信號(hào)處理電路33的模擬圖像信號(hào)執(zhí)行A/D轉(zhuǎn)換以產(chǎn)生數(shù)字圖像信號(hào)，并 且在任何數(shù)字處理之后按照需要執(zhí)行諸如gamma校正，得到的數(shù)字圖像信 號(hào)傳送到顯示控制電路36，用于在TV監(jiān)視器37上顯示圖像，以及傳送到 記錄和再現(xiàn)控制電路38，用于記錄圖像數(shù)據(jù)到存儲(chǔ)槽(未示出)中的可拆卸 的記錄介質(zhì)39上(例如，存儲(chǔ)卡、硬盤(pán)、磁盤(pán)、磁光盤(pán)等)。此時(shí)，本發(fā)明 裝置的數(shù)字變焦電路34設(shè)計(jì)為可以剪切整個(gè)CCD攝像機(jī)8的釆集像素區(qū) 域內(nèi)的任何區(qū)域，并傳送剪切的圖像區(qū)域到顯示控制電路36或記錄和再現(xiàn) 控制電路38，同時(shí)以任意放大率將其放大。因此，可以在TV監(jiān)視器37上 僅顯示CCD攝像機(jī)8采集的部分被放大的顯微鏡圖像，和/或僅記錄該部 分圖像。
此外，在上述結(jié)構(gòu)中，記錄和再現(xiàn)控制電路38可以設(shè)計(jì)為響應(yīng)于來(lái)自 CPU 35的再現(xiàn)控制信號(hào)讀取當(dāng)前記錄到記錄介質(zhì)39中的數(shù)字圖像信號(hào)， 且該讀出數(shù)字圖像信號(hào)可以通過(guò)顯示控制電路36輸入TV監(jiān)視器37中， 因此可以在TV監(jiān)視器37的屏幕上顯示樣本4的記錄圖像。
操作上述圖像處理設(shè)備時(shí)，在用戶打開(kāi)控制面板上的記錄按鈕47時(shí)， 本發(fā)明的裝置執(zhí)行記錄模式，其中CPU 35提供記錄控制信號(hào)給記錄和再現(xiàn) 控制電路38。隨后記錄和再現(xiàn)控制電路38響應(yīng)于記錄控制信號(hào)記錄從數(shù)字 變焦電路34提供的圖像信號(hào)到記錄介質(zhì)中。另一方面，打開(kāi)再現(xiàn)按鈕43
時(shí)，本發(fā)明的裝置開(kāi)始再現(xiàn)模式，其中CPU35提供再現(xiàn)控制信號(hào)給記錄和 再現(xiàn)控制單元38，其在TV監(jiān)視器37上顯示上述記錄的圖像數(shù)據(jù)。此夕卜， 在模式開(kāi)關(guān)48設(shè)置為圖像采集模式時(shí)，來(lái)自CPU 35的控制信號(hào)就響應(yīng)于 推動(dòng)快門(mén)按鈕44輸出到數(shù)字變焦電路34，且此時(shí)來(lái)自CCD攝像機(jī)8的一 幀圖像就經(jīng)受數(shù)字信號(hào)處理并結(jié)合到存儲(chǔ)器41中。隨后，結(jié)合到存儲(chǔ)器41 中的圖像數(shù)據(jù)通過(guò)任意壓縮電路進(jìn)行壓縮，并通過(guò)卡讀取器/寫(xiě)入設(shè)備記錄 在存儲(chǔ)卡上。
在數(shù)字變焦電路34上執(zhí)行的CCD攝像機(jī)8獲得的整個(gè)像素區(qū)域內(nèi)任 意區(qū)域的剪切設(shè)置通過(guò)使用變焦放大按鈕42、變焦縮小按鈕143和十字光 標(biāo)按鈕45來(lái)執(zhí)行。在圖像區(qū)域的剪切設(shè)置中，在TV監(jiān)視器37上顯示表 示數(shù)字變焦電路34要剪切的圖像區(qū)域的中心的"變焦中心位置"以及圖像區(qū) 域的框。允許用戶操作十字光標(biāo)按鈕45來(lái)設(shè)置變焦中心位置在任意位置， 同時(shí)觀看TV監(jiān)視器37，并且還允許通過(guò)變焦放大按鈕42和變焦縮小按鈕 143來(lái)確定要剪切的圖像區(qū)域的尺寸。從剪切過(guò)程獲得的圖像的放大率可以 在M= l.OO(CCD攝像機(jī)采集的整個(gè)區(qū)域)到4.00(CCD攝像機(jī)采集的整個(gè)區(qū) 域的l/4)的范圍內(nèi)任意設(shè)置。
此時(shí)，上述圖像的放大可以通過(guò)調(diào)整顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行(光學(xué)變 焦)，而不使用數(shù)字變焦電路34。例如，通過(guò)步進(jìn)馬達(dá)的馬達(dá)驅(qū)動(dòng)，沿著光 軸偏移CCD攝像機(jī)8和第二中繼透鏡18間的焦距進(jìn)行這種光學(xué)變焦。此 外，在執(zhí)行光學(xué)變焦的透鏡結(jié)構(gòu)中(變焦透鏡)，使用三個(gè)可變放大率的透鏡 組、執(zhí)行像差補(bǔ)償?shù)难a(bǔ)償透鏡組等、以及執(zhí)行對(duì)焦調(diào)整的會(huì)聚透鏡(未示出)， 透鏡的焦距可以分10步手動(dòng)或自動(dòng)變化?？梢詧?zhí)行驅(qū)動(dòng)變焦透鏡，使得安 裝在變焦透鏡周?chē)淖兘柜R達(dá)(超聲波馬達(dá))基于CPU 35輸出的控制信號(hào)而 操作，以沿著光軸移動(dòng)變焦透鏡。
此外，為了控制自動(dòng)分配設(shè)備100和照射設(shè)備82(包括光源2)的操作， 計(jì)算機(jī)80可以連接到這些設(shè)備從而獲得CCD攝像機(jī)8采集的圖像信號(hào)可 以與通過(guò)自動(dòng)分配設(shè)備100的分配操作的執(zhí)行同步進(jìn)行。
通過(guò)第一實(shí)施例的裝置對(duì)樣本的觀察和測(cè)量
如上所述，在發(fā)光蛋白質(zhì)的發(fā)光現(xiàn)象測(cè)量中，其發(fā)光強(qiáng)度很弱，因此
很難用CCD攝像機(jī)探測(cè)光信號(hào)，且通常不能觀察到細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。因此， 不可以像顯微鏡正常的觀察中一樣，調(diào)整物鏡的焦點(diǎn)同時(shí)檢查樣本中觀察 的細(xì)胞。因此，發(fā)光觀察中物鏡的焦點(diǎn)位置基于用顯微鏡透射光觀察中獲 得的樣本照明圖像而確定，其中用來(lái)自諸如鹵素?zé)舻墓庠吹墓馔ㄟ^(guò)照明光
學(xué)系統(tǒng)照射樣本。例如，通過(guò)設(shè)置物鏡的焦點(diǎn)位置為在增加生物發(fā)光蛋 白質(zhì)發(fā)光強(qiáng)度的時(shí)候，物鏡在透射光觀察中獲得高對(duì)比度圖像的位置和在
CCD攝像機(jī)上獲得匯聚的清楚的發(fā)光圖像的位置之間的光軸上的近似中間 位置。此后，將說(shuō)明使用上述本發(fā)明的裝置對(duì)發(fā)光蛋白質(zhì)的發(fā)光進(jìn)行成像 的成像方法。
圖3以流程圖示出本發(fā)明發(fā)光成像的方法中的處理過(guò)程。參照附圖， 首先，樣本4(細(xì)胞等)和培養(yǎng)溶液放入試驗(yàn)盤(pán)中(樣本容器21)，其隨后設(shè)置 在裝置中(步驟l)，且打開(kāi)照明光(步驟2)。隨后，在CCD攝像機(jī)8的圖像 傳感器7的光接收面上形成通過(guò)物鏡15的樣本4的顯微鏡圖像，且用來(lái)自 圖像傳感器7的信號(hào)獲得樣本的照明圖像(步驟3)。下面，在獲得的照明圖 像上指定所需區(qū)域，即具有適當(dāng)細(xì)胞密度的區(qū)域(步驟4)。此后，臺(tái)移動(dòng)以 偏移具有適當(dāng)細(xì)胞密度的指定區(qū)域到視場(chǎng)的中心(步驟5)。隨后，照明圖像 的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)到存儲(chǔ)設(shè)備中(步驟6)，且關(guān)閉照明(步驟7)，并且隨后完成第 一照明圖像的獲取。
下面，為了在樣本的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)發(fā)光蛋白質(zhì)，以激勵(lì)細(xì)胞的裝置來(lái)激 勵(lì)細(xì)胞。激勵(lì)細(xì)胞的試劑可以通過(guò)自動(dòng)分配設(shè)備提供(步驟8)。此時(shí)，在臺(tái) 上，在步驟8之后完成照射步驟，且得到的照明圖像數(shù)據(jù)可以保存到存儲(chǔ) 器件中(步驟9)。隨后，不通過(guò)照射，獲得發(fā)光信號(hào)(步驟IO)并保存到存儲(chǔ) 器件中(步驟11)，且由此完成第一發(fā)光圖像的獲取。隨后，對(duì)于獲取發(fā)光 圖像重復(fù)步驟10和步驟11直到預(yù)定時(shí)間、預(yù)定發(fā)光強(qiáng)度或完成了預(yù)定次 數(shù)上述過(guò)程的執(zhí)行。此時(shí)，可以以這樣的方式執(zhí)行這些處理，其中照明圖 像獲取和發(fā)光圖像獲取成對(duì)，或者，每執(zhí)行預(yù)定次數(shù)的發(fā)光圖像獲取，執(zhí) 行一次照明圖像獲取。對(duì)于細(xì)胞的活性、測(cè)量的條件等以適當(dāng)?shù)姆绞綀?zhí)行 這些圖像獲取。
在完成照明圖像和發(fā)光圖像獲取之后，產(chǎn)生照明圖像和發(fā)光圖像的疊 加圖像并在圖像處理設(shè)備(計(jì)算機(jī)80)中顯示(步驟12)。通過(guò)參照得到的照
明圖像和發(fā)光圖像的顯示的疊加圖像可以確定發(fā)光細(xì)胞，并且因此，即使 在測(cè)量期間移動(dòng)了也可以容易地指定某些細(xì)胞。
下面，判斷在疊加圖像內(nèi)是否可以分辨細(xì)胞內(nèi)發(fā)光位置，以及如果可 以分辨發(fā)光位置(步驟13:是)，指定測(cè)量區(qū)域(步驟15)。測(cè)量區(qū)域可以通 過(guò)任意裝置在監(jiān)視器上指定，諸如鼠標(biāo)、光標(biāo)或指針等，其可以通過(guò)手動(dòng) 操作或通過(guò)執(zhí)行其中閾值進(jìn)行各種改變的圖像處理來(lái)限定屏幕上的區(qū)域。 例如， 一個(gè)細(xì)胞可以指定為一個(gè)測(cè)量區(qū)域，且細(xì)胞的一部分也可以指定為 一個(gè)測(cè)量區(qū)域。
另一方面，在很難分辨細(xì)胞中發(fā)光位置的時(shí)候(步驟13:否)，就在以
偽彩色顯示CCD攝像機(jī)的輸出之后指定測(cè)量區(qū)域(步驟14)，因此將發(fā)光繪 制為容易可見(jiàn)(步驟15)。此時(shí)，例如， 一個(gè)細(xì)胞可以指定為一個(gè)測(cè)量區(qū)域， 并且細(xì)胞內(nèi)的部分還可以指定為一個(gè)測(cè)量區(qū)域。此時(shí)，不僅可以在激勵(lì)如 細(xì)胞的分析對(duì)象之前指定區(qū)域，還可以在之后進(jìn)行，并且，基于激勵(lì)之后 獲得的發(fā)光圖像或照明圖像，要測(cè)量的區(qū)域可以偏移到存在可以進(jìn)行適當(dāng) 測(cè)量的對(duì)象的區(qū)域。如果一區(qū)域在選擇激勵(lì)的時(shí)候沒(méi)有很微弱或很小的發(fā) 光，要測(cè)量的區(qū)域就可以改變到其中可以探測(cè)到適當(dāng)發(fā)光的區(qū)域?；蛘?， 在激勵(lì)的時(shí)候具有微弱或沒(méi)有發(fā)光的所分析細(xì)胞中，響應(yīng)于激勵(lì)增加發(fā)光 量的細(xì)胞可以被指定為要分析的對(duì)象，并且隨后，可以選擇性地跟蹤探測(cè) 的對(duì)象用于數(shù)據(jù)獲取和分析。
此外，隨時(shí)間變化的發(fā)光強(qiáng)度可以以動(dòng)畫(huà)形式顯示，或數(shù)字化并以圖 表形式顯示(步驟16)。這樣，最后執(zhí)行分析(步驟17)。詳細(xì)的說(shuō)，使用得 到的數(shù)據(jù)，執(zhí)行比較每個(gè)細(xì)胞的發(fā)光強(qiáng)度、比較一個(gè)相同的細(xì)胞內(nèi)各個(gè)位 置的發(fā)光強(qiáng)度、確定細(xì)胞的發(fā)光模式、比較發(fā)光模式隨時(shí)間的變化等。從 這些結(jié)果，可以分析細(xì)胞對(duì)于試劑、電、氣體和熱激勵(lì)的反應(yīng)。此外，還 可以在不執(zhí)行激勵(lì)的時(shí)候分析細(xì)胞的活動(dòng)。
根據(jù)本發(fā)明的使用，例如，如圖4所示，在觀察發(fā)光強(qiáng)度周期性變化 的樣本時(shí)，即使發(fā)光消失也可以觀察所需細(xì)胞發(fā)光強(qiáng)度的變化，而不錯(cuò)過(guò) 在發(fā)光消失前和后所關(guān)心的細(xì)胞，因此，可以指定某些細(xì)胞并連續(xù)追蹤其 發(fā)光強(qiáng)度。
本發(fā)明裝置的第二實(shí)施例
圖5示意性地示出本發(fā)明裝置的第二實(shí)施例，其中將執(zhí)行熒光觀察的 結(jié)構(gòu)進(jìn)一步添加到本發(fā)明第一實(shí)施例的圖1所示的微光測(cè)量裝置中。
參照附圖，在本發(fā)明第二實(shí)施例的裝置中，其中與第一實(shí)施例的裝置 類(lèi)似，數(shù)字變焦和/或光學(xué)變焦同時(shí)執(zhí)行，用于激發(fā)光的光學(xué)系統(tǒng)49被添 加到其中，并且將觀察光學(xué)系統(tǒng)5修改為使得來(lái)自樣本4的熒光被引導(dǎo)到 CCD攝像機(jī)中。
用于激發(fā)的光學(xué)系統(tǒng)49構(gòu)建有激發(fā)光源50、準(zhǔn)直透鏡51、偏轉(zhuǎn)鏡52 以及可切換二向色鏡53。激發(fā)光源50通常是氬激光器，具有10mW的輸 出功率和488nm的波長(zhǎng)。此時(shí)，激發(fā)光源50可以是可見(jiàn)范圍內(nèi)的氣體激 光器，諸如氦氖激光器。激光通過(guò)準(zhǔn)直透鏡51轉(zhuǎn)換成圓形平行束，具有特 定束寬，在偏轉(zhuǎn)鏡52上反射，并進(jìn)入安裝在觀察光學(xué)系統(tǒng)5中的可切換二 向色鏡58。
可切換二向色鏡58具有反射激發(fā)光源50的激光波長(zhǎng)的光并透過(guò)樣本4 的熒光和發(fā)光信號(hào)的譜的譜特征。因此，進(jìn)入觀察光學(xué)系統(tǒng)5的激光在可 切換二向色鏡53上反射，并隨后從其底部進(jìn)入物鏡15，朝向樣本容器21 中的樣本4匯聚并激發(fā)樣本4中的熒光分子。此時(shí)，可切換二向色鏡58安 置在保持器中(未示出)，并且根據(jù)激發(fā)激光的波長(zhǎng)波動(dòng)而可交換地安裝。此 外，如果不需要改變激發(fā)光源50的波長(zhǎng)，可以安裝常規(guī)的二向色鏡替換使 用可切換的二向色鏡58。
對(duì)于物鏡15，可以使用具有高NA(數(shù)值孔徑)，例如0.9或1.0或更高 的浸液型物鏡。在從樣本4發(fā)出并且進(jìn)入物鏡15的熒光信號(hào)和發(fā)光信號(hào)穿 過(guò)裝置的觀察光學(xué)系統(tǒng)5時(shí)，這些信號(hào)穿過(guò)可切換二向色鏡58，前進(jìn)到第 一中繼透鏡16和第二中繼透鏡18，并在切換鏡20上反射，并最終在CCD 攝像機(jī)8的圖像傳感器7的光接收面上形成各圖像。隨后，在第一實(shí)施例 的裝置中，來(lái)自CCD攝像機(jī)8的光信號(hào)被發(fā)送到計(jì)算機(jī)80，其中顯示并 分析該發(fā)光圖像，執(zhí)行發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí)間的測(cè)量和信號(hào)分析等，且得到的分 析結(jié)果在計(jì)算機(jī)80的TV監(jiān)視器37的屏幕上顯示。
可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方式進(jìn)行熒光觀察。例如熒光觀察中使 用的熒光染料可以是羅達(dá)明綠(RhG); TMR(四甲基異硫氰酸羅達(dá)明)和
5-Tamra(5-羧基四甲基異硫氰酸羅達(dá)明)。為了激發(fā)TMR和5-Tamra等，波 長(zhǎng)514.5nm的氬激光器和波長(zhǎng)543.5nm的氦氖激光器等可以用來(lái)分別激發(fā) 激光源。此外，F(xiàn)ITC(熒光素異硫氰酸酯)，TOTOl，吖啶橙、得克薩斯紅 等可以用作熒光染料。
本發(fā)明裝置的第三實(shí)施例
圖6示出本發(fā)明的微光測(cè)量裝置的另一個(gè)實(shí)施例的示意圖，其可以進(jìn) 行數(shù)字變焦或光學(xué)變焦，以及如圖5裝置一樣同時(shí)進(jìn)行測(cè)量熒光和生物發(fā) 光。
參照附圖，在實(shí)施例中，測(cè)量設(shè)備本身即光學(xué)顯微鏡封閉在隔光盒54 中，其中隔光盒54的底部通過(guò)障礙物56固定在底盤(pán)55上，且由此該盒設(shè) 計(jì)為防止外部光進(jìn)入觀察光學(xué)系統(tǒng)5。在隔光盒54的上表面，安裝分離的 阻光蓋57，且阻光蓋57的一端通過(guò)鉸鏈58連接到隔光盒54的主體上，使 得可以旋轉(zhuǎn)開(kāi)關(guān)該阻光蓋57。
為了獲取照明圖像，例如來(lái)自如鹵素?zé)?、金屬鹵化物燈等的光源2的 用于照明的光通過(guò)光纖60被引入以照明樣本臺(tái)3上樣本容器21的上表面， 并照射整個(gè)樣本4。此外，為了獲取熒光圖像，將激光(激發(fā))光源50安裝 在裝置主體外的光源盒62上，且從激光光源50激發(fā)出的激光通過(guò)外框架 上的激光入射開(kāi)口 64進(jìn)入該裝置的主體。激光例如可以是具有10mW輸出 和488nm波長(zhǎng)的氬激光。通過(guò)激光入射開(kāi)口 64進(jìn)入裝置體的激光首先進(jìn) 入觀察光學(xué)系統(tǒng)，在可切換二向色鏡53上反射，從其底部進(jìn)入物鏡15，并 向樣本4匯聚以將其照明。可切換二向色鏡53安裝在保持器上且根據(jù)激發(fā) 激光的波長(zhǎng)振蕩而可交換地安裝。
用緊固銷(xiāo)將樣本容器21固定在XY樣本臺(tái)3上。XY樣本臺(tái)3設(shè)計(jì)為 使得其在XY平面上的位置可以通過(guò)齒輪-齒條機(jī)構(gòu)在XY平面上任意移動(dòng)。 安裝在樣本容器21之下的物鏡15裝有在Z軸上驅(qū)動(dòng)物鏡的機(jī)構(gòu)9，以使 其可以沿著光軸(Z軸)移動(dòng)。通過(guò)引線，Z軸物鏡驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)9與微光測(cè)量裝 置之外安裝的焦點(diǎn)探測(cè)部分77通信并受其控制。
在觀察光學(xué)系統(tǒng)5中，物鏡15收集的信號(hào)光穿過(guò)可切換二向色鏡53， 并隨后不受偏轉(zhuǎn)，如上述第一和第二實(shí)施例所示，信號(hào)光通過(guò)安裝在鏡桶66下部的透鏡67并匯聚到CCD攝像機(jī)8的光接收面上。透鏡67位于用 緊固銷(xiāo)安裝在底盤(pán)55的基座75上的鏡桶66的下部，且在基座75上，CCD 攝像機(jī)8設(shè)置為使得透鏡67的Z軸的焦點(diǎn)位置與光接收面的近似中心一 致。攜帶樣本臺(tái)3且物鏡15安裝其上的主體座76通過(guò)固定在底盤(pán)55上的 柱73安裝，相對(duì)于鏡桶的上下部分72和66上下移動(dòng)。此時(shí)，可選的，可 以提供物鏡焦點(diǎn)探測(cè)部分70，其連接到位置探測(cè)部分71，因此來(lái)自位置探 測(cè)部分71的輸出信號(hào)可以輸出到TV監(jiān)視器37。
對(duì)于CCD攝像機(jī)8，由于來(lái)自樣本的光微弱，優(yōu)選使用具有盡可能高 靈敏度的攝像機(jī)，如第一和第二實(shí)施例中一樣。CCD攝像機(jī)8的像素?cái)?shù)量 可以是例如1360xl024。為了抑制來(lái)自CCD攝像機(jī)8的暗電流，包括Peltier 器件的致冷系統(tǒng)29配備在CCD攝像機(jī)的底部以降低并保持CCD攝像機(jī)8 的溫度在0。C附近。CCD攝像機(jī)8的光接收面上，設(shè)置紅外截濾波器13， 以截止可以是背景光的紅外光。然而，將紅外光作為信號(hào)光的時(shí)候，在測(cè) 量之前從鏡桶66的下部去除紅外截濾波器13。 CCD攝像機(jī)8的輸出部分 連接到信號(hào)線69，并且由此將來(lái)自CCD攝像機(jī)的樣本圖像通過(guò)信號(hào)處理 部分74傳送到計(jì)算機(jī)80，并在TV監(jiān)視器37上顯示。3片型彩色攝像機(jī) 可以用作CCD攝像機(jī)8，因此可以獲得彩色的照明圖像。
操作中，首先基于光源2照射的樣本4的照明圖像，物鏡的焦點(diǎn)調(diào)節(jié) 到樣本上。為此，通過(guò)Z軸物鏡驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)將物鏡15沿著光軸移動(dòng)足夠量， 并且在其每個(gè)移動(dòng)步驟中，通過(guò)信號(hào)處理部分74分析來(lái)自CCD攝像機(jī)8 的光學(xué)輸出信號(hào)，用于探測(cè)物鏡15在光軸上的位置，其中獲得高對(duì)比度的 圖像。隨后，找到提供高對(duì)比度圖像的物鏡15在光軸上的上側(cè)和下側(cè)的兩 個(gè)位置，并且通過(guò)信號(hào)處理部分74的計(jì)算，將上下位置間的近似中間位置 確定為發(fā)光觀察的焦點(diǎn)位置。此后，通過(guò)操作Z軸物鏡驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)9，移動(dòng) 物鏡15并固定到得到的焦點(diǎn)位置，并且此后，樣本4射出的熒光信號(hào)和發(fā) 光信號(hào)用CCD攝像機(jī)8接收。
在Z軸物鏡驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)9中，可交換地安裝多個(gè)物鏡15。在具有大放大 率的物鏡15用于觀察細(xì)胞等時(shí)，移動(dòng)樣本4中的培養(yǎng)基，由于較小的視野， 在一些情況下就可以使得細(xì)胞等的樣本4移到視野之外。因此，優(yōu)選的， 樣本4首先用具有低放大率的物鏡15觀察，諸如xl0和x20，且在確認(rèn)并
利用鼠標(biāo)和鍵盤(pán)指定樣本4的所需位置之后，通過(guò)本發(fā)明裝置中的放大功 能擴(kuò)大圖像。此時(shí)，計(jì)算機(jī)可以用作信號(hào)處理部分74。
為了研究本發(fā)明的用途，進(jìn)行下面的試驗(yàn)。此時(shí)，應(yīng)該理解下面的例 子用于說(shuō)明本發(fā)明的用處且不應(yīng)限制本發(fā)明的范圍。
例子l
在例子1中，使用微光測(cè)量裝置，其中圖1中的該測(cè)量裝置提供有自 動(dòng)分配設(shè)備100，在引入熒光素酶基因的多個(gè)Hela細(xì)胞中的某些細(xì)胞中， 臨時(shí)觀察到試劑激勵(lì)導(dǎo)致的發(fā)光。
對(duì)于樣本來(lái)說(shuō)，使用其中載體"pcDNA6/TR(從In vitro gene co.獲得)" 持續(xù)表達(dá)四環(huán)素阻遏物(TetR)的Hela細(xì)胞，以及包括與具有已經(jīng)被轉(zhuǎn)基因 的四環(huán)素操縱子(Tet02)的表達(dá)載體"pcDNA4/TO(從In vitro gene co.獲得)" 相連的熒光素酶基因的質(zhì)體。在引入這兩種基因的細(xì)胞中，如圖7A示意所 示，TetRs首先以載體(pcDNA6/TR)表達(dá)為T(mén)etR，且TetRs形成同型二聚體， 其與Tet02基因區(qū)結(jié)合，由此抑制與Tet02區(qū)連接的熒光素酶基因的轉(zhuǎn)錄。 然而，如圖7B所示，將四環(huán)素給與細(xì)胞時(shí)(試劑激勵(lì))，導(dǎo)致TetR同型二 聚體的構(gòu)造改變，導(dǎo)致TetR同型二聚體從Tet02區(qū)分開(kāi)，因此將導(dǎo)致熒光 素酶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)熒光素酶蛋白質(zhì)。因此，在此試驗(yàn)例子中，導(dǎo)入上 述基因的細(xì)胞中，觀察到四環(huán)素激勵(lì)使得表達(dá)熒光素酶和細(xì)胞內(nèi)的發(fā)光現(xiàn) 象。
在圖1的裝置中，對(duì)于物鏡15來(lái)說(shuō)，使用Olympus UApo/340(20x， N.A. 0.75)以及顯微鏡的商用物鏡"Oil， 20x， N.A.0.8"或"5x， N.A.0.13"。對(duì)于 CCD攝像機(jī)8，使用5° C致冷的顯微鏡攝像機(jī)"DP30BW(Olympus)"。在 此CCD攝像機(jī)中，CCD元件(對(duì)應(yīng)于圖像傳感器7)為2/3英寸的類(lèi)型，其 像素?cái)?shù)量為1360x1024，且每個(gè)像素的尺寸為6平方nm。從物鏡穿過(guò)成像 透鏡(中繼透鏡)并在CCD元件上形成的樣本圖像的總放大率設(shè)置為4倍。 在觀察和對(duì)Hela細(xì)胞成像期間，整個(gè)裝置被暗箱覆蓋。
在下面的過(guò)程中執(zhí)行上述試驗(yàn)操作。
(l)制備Hda細(xì)胞樣本，其中共同表達(dá)始終表達(dá)TetR的載體和包括與 Tet02的表達(dá)載體相連的熒光素酶基因的質(zhì)體。對(duì)于培養(yǎng)基，可以使用包含
10mMHEPES，具有l(wèi)mM熒光素酶的D-MEM介質(zhì)。
(2) 下面，(l)中的樣本用作樣本，且采集照明圖像和發(fā)光圖像。 一直配 對(duì)采集照明圖像和發(fā)光圖像。 一次圖像獲取的曝光時(shí)間(在CCD攝像機(jī)上 信號(hào)的積分時(shí)間)對(duì)照明圖像設(shè)置為10msec，對(duì)發(fā)光圖像設(shè)置為5min。
(3) 隨后將四環(huán)素加入樣本以導(dǎo)致其中的熒光素酶基因轉(zhuǎn)錄，并且在添 加四環(huán)素之后立即如過(guò)程(2)所示成對(duì)采集樣本的照明圖像和發(fā)光圖像。
(4) 隨后，如圖8所示，過(guò)程(2)的采集圖像以10min的間隔重復(fù)約10 小時(shí)。采集圖像的過(guò)程通過(guò)計(jì)算機(jī)處理自動(dòng)執(zhí)行，其中在本發(fā)明的裝置中， CCD攝像機(jī)獲得的光信號(hào)自動(dòng)轉(zhuǎn)換成數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)。
(5) 在完成圖像獲取之后，獲取的照明圖像和發(fā)光圖像被疊加以確定表 達(dá)熒光素酶的Hela細(xì)胞。隨后，表達(dá)熒光素酶的Hela細(xì)胞隨時(shí)間變化的 發(fā)光強(qiáng)度被數(shù)字化并進(jìn)行分析。在疊加圖像上很難確定Hela細(xì)胞的發(fā)光位 置時(shí)，以偽彩色顯示CCD攝像機(jī)8的輸出值，為了可以通過(guò)人眼容易地識(shí) 別發(fā)光位置。
圖9A、 9B和9C分別示出照明圖像、發(fā)光圖像和疊加圖像。圖10示 出ROI-l和ROI-2區(qū)域中兩個(gè)細(xì)胞中發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化，每個(gè)區(qū)域都 環(huán)繞在圖9C的以上述方式獲得的疊加圖像的方框中。因此，已經(jīng)示出，根 據(jù)本發(fā)明，可以確定哪個(gè)細(xì)胞發(fā)光并測(cè)量其發(fā)光隨時(shí)間的變化。
例子2
在例子2中，使用與例子l中一樣的裝置，執(zhí)行發(fā)光細(xì)菌(P.發(fā)光菌)的 發(fā)光觀察，且監(jiān)視細(xì)胞中試劑激勵(lì)的發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化。發(fā)光細(xì)菌是 活動(dòng)的，發(fā)光生物體以下面的形式廣泛存在自然中，(i)海水中的獨(dú)立活生 物體，(ii)與魚(yú)或頭足類(lèi)動(dòng)物的發(fā)光器官共生，(iii)死魚(yú)、動(dòng)物尸體中的增殖， (iv)咸水魚(yú)消化道中或?yàn)踬\表皮上的習(xí)慣性寄生，且該細(xì)菌連續(xù)顯示出強(qiáng)的 發(fā)光，足以在氧氣條件下通過(guò)眼睛觀察。
觀察中，將Olympus UApo/340(40x， N.A. 1.35)或Oil Iris "Oil, 40x， N.A. 1.35"用作物鏡15。其他采集圖像的條件與例子1中一樣。
試驗(yàn)操作以下面的過(guò)程執(zhí)行。
(l)發(fā)光細(xì)菌，作為共生生物體存在于螢魷(fireflysquid)的發(fā)光器官內(nèi)，
其被隔絕開(kāi)并在包括3%NaCl的LB培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。將甘油添加到此培養(yǎng)基 內(nèi)以獲得25。/。的甘油溶液(v/v)為最終濃度。
(2) 將(1)中的樣本用作樣本，且采集照明圖像(觀察圖像)和發(fā)光圖像。 照明圖像和發(fā)光圖像始終成對(duì)采集。 一次圖像獲取的曝光時(shí)間(在CCD攝 像機(jī)上信號(hào)的積分時(shí)間)對(duì)照明圖像設(shè)置為10msec，對(duì)發(fā)光圖像設(shè)置為 lmin。
(3) 隨后使用自動(dòng)分配設(shè)備100，將氨比西林添加到樣本中，禁止發(fā)光 細(xì)菌中的細(xì)胞壁合成。由此，抑制發(fā)光細(xì)菌的增殖，使得細(xì)菌滅絕。這樣 執(zhí)行添加氨比西林，其中自動(dòng)分配設(shè)備100的操作與圖像采集同步，其中 在添加氨比西林之后立即執(zhí)行采集圖像，其中照明圖像和發(fā)光圖像成對(duì)采集。
(4) 隨后，上述過(guò)程(2)描述的圖像采集以5min的間隔重復(fù)直到添加氨 比西林之后經(jīng)過(guò)1小時(shí)。采集圖像的過(guò)程通過(guò)計(jì)算機(jī)處理自動(dòng)執(zhí)行，其中 在本發(fā)明的裝置中，CCD攝像機(jī)獲得的光信號(hào)自動(dòng)轉(zhuǎn)換成數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)。
(5) 在完成圖像獲取之后，獲取的照明圖像和發(fā)光圖像被疊加以從中確 定強(qiáng)的發(fā)光細(xì)菌。隨后，以采集各個(gè)圖像的時(shí)間順序排列疊加圖像以形成 動(dòng)畫(huà)，且追蹤伴隨著發(fā)光細(xì)菌運(yùn)動(dòng)的發(fā)光位置的改變，且數(shù)字化和分析發(fā) 光細(xì)菌的發(fā)光隨時(shí)間的改變。此時(shí)，用計(jì)算機(jī)處理自動(dòng)執(zhí)行發(fā)光細(xì)菌的跟
蹤o
圖11A、 11B和11C分別示出照明圖像、發(fā)光圖像和疊加圖像(表達(dá)為 偽彩色)。圖12示出圖11C中PP-1區(qū)域中發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí)間的變 化。根據(jù)例子2，已經(jīng)示出，即使在諸如細(xì)菌的微生物體在測(cè)量期間運(yùn)動(dòng)， 也可以確定哪個(gè)微生物體發(fā)光以及測(cè)量其發(fā)光隨時(shí)間的變化。
例子3
在例子3中，執(zhí)行發(fā)光細(xì)菌(V.tischeri)的發(fā)光觀察，其中跟蹤發(fā)光細(xì)菌 的位置和發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化。采集圖像的條件與例子2中一樣。 試驗(yàn)操作以下列步驟進(jìn)行。
(l)發(fā)光細(xì)菌，在包括3%NaCl的瓊脂LB培養(yǎng)基盤(pán)內(nèi)培養(yǎng)，這里將發(fā) 光強(qiáng)度高的群體分類(lèi)并懸浮在包括3%NaCl的液體LB培養(yǎng)基內(nèi)。
(2) 將(1)中的樣本用作樣本，且采集照明圖像(觀察圖像)和發(fā)光圖像。 照明圖像和發(fā)光圖像始終成對(duì)釆集。 一次圖像獲取的曝光時(shí)間(在CCD攝 像機(jī)上信號(hào)的積分時(shí)間)對(duì)照明圖像設(shè)置為5msec，對(duì)發(fā)光圖像設(shè)置為3min。
(3) 隨后，重復(fù)上述過(guò)程(2)描述的圖像采集。采集圖像的過(guò)程通過(guò)計(jì)算 機(jī)處理自動(dòng)執(zhí)行，其中在本發(fā)明的裝置中，從CCD攝像機(jī)獲得的光信號(hào)自 動(dòng)轉(zhuǎn)換成數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)。
(4) 在完成圖像采集之后，獲取的照明圖像和發(fā)光圖像被疊加。由于發(fā) 光細(xì)菌隨時(shí)間變化運(yùn)動(dòng)，就以采集各個(gè)圖像的時(shí)間順序排列疊加的圖像以 形成動(dòng)畫(huà)，且追蹤伴隨著發(fā)光細(xì)菌(V.t.)運(yùn)動(dòng)的發(fā)光位置的改變，且數(shù)字化 和分析發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光隨時(shí)間的改變。此時(shí)，可以用計(jì)算機(jī)處理自動(dòng)執(zhí)行 發(fā)光細(xì)菌的跟蹤。
圖13A、 13B和13C分別示出照明圖像、發(fā)光圖像和疊加圖像，且圖 14示出發(fā)光細(xì)菌隨時(shí)間變化移動(dòng)。圖15示出發(fā)光細(xì)菌(V.t.)發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí) 間變化。如例子3所示，即使在諸如細(xì)菌的微生物體在測(cè)量期間運(yùn)動(dòng)，本 發(fā)明也可以測(cè)量指定的發(fā)光部分隨時(shí)間變化的發(fā)光。如所示，僅通過(guò)跟蹤 動(dòng)態(tài)主體，而與有無(wú)激勵(lì)無(wú)關(guān)，例如行為性和/或細(xì)胞學(xué)分析(增殖活動(dòng)等) 都是可行的。此外，由于可以跟蹤細(xì)菌的動(dòng)態(tài)條件，就可以測(cè)量樣本中發(fā) 光區(qū)域的運(yùn)動(dòng)，而與有無(wú)激勵(lì)無(wú)關(guān)。
盡管對(duì)于具體實(shí)施例詳細(xì)描述了本發(fā)明，但是對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái) 說(shuō)，在本發(fā)明的范圍其他的各種可行的實(shí)施例也是顯而易見(jiàn)的。
權(quán)利要求
1、一種使用光學(xué)成像設(shè)備獲取生物源樣本圖像的裝置，包括照明部分，用于照明該樣本；照明圖像獲取部分，用于獲取該樣本的照明圖像；發(fā)光圖像獲取部分，用于獲取該樣本中細(xì)胞的發(fā)光圖像；圖像處理部分，用于疊加該照明圖像和該發(fā)光圖像以產(chǎn)生疊加圖像，并確定該疊加圖像中的分析區(qū)域。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l的裝置，其特征在于，該光學(xué)成像設(shè)備是光學(xué)顯微 鏡；該照明圖像是在該光學(xué)顯微鏡下利用該照明部分的照明光在透射光觀 察中獲得的透射光顯微鏡圖像，且該發(fā)光圖像是在該光學(xué)顯微鏡下觀察該 細(xì)胞內(nèi)發(fā)光現(xiàn)象發(fā)出的光而獲得的發(fā)光顯微鏡圖像；其中該照明圖像獲取 部分和該發(fā)光圖像獲取部分包括共用顯微鏡圖像采集設(shè)備，其采集該透射 光顯微鏡圖像和該發(fā)光顯微鏡圖像。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2的裝置，其特征在于，該顯微鏡圖像采集設(shè)備具有 光接收面，且該光學(xué)顯微鏡包括在該顯微鏡圖像采集設(shè)備的光接收面上形 成該樣本的圖像的物鏡和透鏡組件，其中該物鏡的數(shù)值孔徑與投射在該光 接收面上的該樣本圖像的放大率之間比率的平方值為0.01或更大。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l的裝置，其特征在于，該裝置包括熒光圖像獲取部 分，用于獲取該細(xì)胞的熒光圖像。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4的裝置，其特征在于，該光學(xué)成像設(shè)備是光學(xué)顯微 鏡；該熒光圖像是在該光學(xué)顯微鏡下的樣本熒光觀察中獲得的熒光顯微鏡 圖像，且該發(fā)光圖像是在該光學(xué)顯微鏡下觀察該細(xì)胞內(nèi)發(fā)光現(xiàn)象發(fā)出的光 而獲得的發(fā)光顯微鏡圖像；其中該熒光圖像獲取部分和該發(fā)光圖像獲取部 分包括共用顯微鏡圖像采集設(shè)備，其采集該熒光顯微鏡圖像和該發(fā)光顯微 鏡圖像。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l的裝置，其特征在于，該裝置包括顯示部分，用于 顯示該疊加圖像。
7、 根據(jù)權(quán)利要求l的裝置，其特征在于，該裝置包括記錄部分，用于 記錄該疊加圖像。
8、 根據(jù)權(quán)利要求l的裝置，其特征在于，該裝置包括細(xì)胞激勵(lì)供給部 分，用于激勵(lì)細(xì)胞。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8的裝置，其特征在于，該細(xì)胞激勵(lì)供給部分是從包 括以下部分的組中選出的至少一個(gè)試劑供給部分，用于給該細(xì)胞提供試 劑；溫度調(diào)節(jié)部分，用于調(diào)節(jié)該樣本的溫度；以及氣體供給部分，用于給 該細(xì)胞提供氣體。
10、 一種利用光學(xué)成像設(shè)備獲取生物源樣本圖像的方法，其特征在于 該方法包括下面的步驟照明該樣本并獲取其照明圖像；不照明樣本而獲取該樣本中的細(xì)胞的發(fā)光現(xiàn)象發(fā)出的光的發(fā)光圖像； 疊加該照明圖像和該發(fā)光圖像以產(chǎn)生疊加圖像；以及 確定該疊加圖像中的分析區(qū)域。
11、 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于，該方法包括顯示該疊加圖 像的步驟。
12、 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于，該方法包括記錄該疊加圖 像的步驟。
13、 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于，執(zhí)行兩次或更多次照明該 樣本和獲取該照明圖像的步驟。
14、 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于，該方法包括在獲取該照 明圖像和該發(fā)光圖像的步驟之前的給該細(xì)胞激勵(lì)的步驟。
15、 根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其特征在于，該方法包括在給該細(xì)胞 激勵(lì)的歩驟之前的獲取該照明圖像和該發(fā)光圖像的步驟。
16、 根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其特征在于，在給該細(xì)胞激勵(lì)的步驟中給該細(xì)胞的激勵(lì)是從包括以下激勵(lì)的組中選出的至少一個(gè)激勵(lì)試劑激勵(lì)；電激勵(lì)、通過(guò)氣體的激勵(lì)和通過(guò)熱的激勵(lì)。
17、 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于，還包括步驟測(cè)量該發(fā)光圖像中與該分析區(qū)域?qū)?yīng)的區(qū)域中的光強(qiáng)，并顯示該光強(qiáng)的變化。
18、 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于，該方法包括獲取該樣本中細(xì)胞的熒光圖像的步驟。
19、 根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其特征在于，該方法包括這樣的步驟顯示該照明圖像中與該分析區(qū)域?qū)?yīng)的區(qū)域、該發(fā)光圖像中與該分析區(qū)域 對(duì)應(yīng)的區(qū)域、和該熒光圖像中與該分析區(qū)域?qū)?yīng)的區(qū)域中的至少兩個(gè)區(qū)域。
20、 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于，該光學(xué)成像設(shè)備是光學(xué)顯 微鏡；該照明圖像是在該光學(xué)顯微鏡下的透射光觀察中獲得的透射光顯微鏡圖像，且該發(fā)光圖像是在該光學(xué)顯微鏡下觀察該細(xì)胞內(nèi)發(fā)光現(xiàn)象發(fā)出的光而獲得的發(fā)光顯微鏡圖像；其中該透射光顯微鏡圖像和該發(fā)光顯微鏡圖 像通過(guò)共用顯微鏡圖像采集設(shè)備而采集。
21、 根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其特征在于，該顯微鏡圖像采集設(shè)備具 有光接收面，且該光學(xué)顯微鏡包括在該顯微鏡圖像采集設(shè)備的光接收面上 形成該樣本的圖像的物鏡和透鏡組件，其中該物鏡的數(shù)值孔徑與投射在該 光接收面上的該樣本圖像的放大率之間比率的平方值為0.01或更大。
22、 一種獲取生物源樣本圖像的裝置，該裝置包括光學(xué)顯微鏡；顯微 鏡圖像采集設(shè)備，用于采集該光學(xué)顯微鏡觀察的該樣本的顯微鏡圖像；以 及圖像處理設(shè)備，用于獲得該顯微鏡圖像作為圖像數(shù)據(jù)并執(zhí)行圖像處理， 其中，該圖像處理設(shè)備包括圖像疊加部分，用于通過(guò)疊加透射光圖像和發(fā) 光圖像產(chǎn)生疊加圖像，其中在該光學(xué)顯微鏡下用該顯微鏡圖像采集設(shè)備在 該樣本的透射光觀察中采集該樣本的圖像而獲得該透射光圖像，以及在該 光學(xué)顯微鏡下用該顯微鏡圖像采集設(shè)備對(duì)該樣本中細(xì)胞內(nèi)發(fā)光現(xiàn)象發(fā)出的 光進(jìn)行采集而獲得該發(fā)光圖像；還包括圖像區(qū)域指定部分，用于指定該疊 加圖像中的分析區(qū)域。
23、 根據(jù)權(quán)利要求22的裝置，其特征在于，該顯微鏡圖像采集設(shè)備具 有光接收面，且該光學(xué)顯微鏡包括物鏡和透鏡組件，用于在該顯微鏡圖像 采集設(shè)備的光接收面上形成該樣本的圖像，其中該物鏡的數(shù)值孔徑與在該 光接收面上投影的該樣本圖像的放大率之間比率的平方值為0.01或更高。
全文摘要
提供了一種使用光學(xué)成像設(shè)備對(duì)生物源的樣本的發(fā)光現(xiàn)象成像的新裝置和新方法。在本發(fā)明的裝置和方法中，對(duì)通過(guò)照明樣本獲得的照明圖像和不照明樣本而對(duì)樣本中細(xì)胞的發(fā)光現(xiàn)象發(fā)射的光獲取的發(fā)光圖像進(jìn)行疊加，以產(chǎn)生疊加圖像。在疊加圖像中，確定分析區(qū)域。由此，即使在發(fā)光觀察中探測(cè)的光很微弱的時(shí)候，也可以指定樣本的細(xì)胞中發(fā)光細(xì)胞和/或發(fā)光位置。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101351735SQ20068004954
公開(kāi)日2009年1月21日 申請(qǐng)日期2006年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月27日
發(fā)明者福岡莊尚, 秋吉龍?zhí)? 鈴木浩文 申請(qǐng)人:奧林巴斯株式會(huì)社