專利名稱：檢測分析物的裝置和方法
檢測分析物的裝置和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對樣品中的分析物進(jìn)行檢測的檢測裝置，其依賴于分 析物傳感器受體分子與附著于支持物上的分析物傳感器分子的絡(luò)合物。
本發(fā)明還涉及一種使用所述檢測裝置對樣品中的分析物進(jìn)行檢測的方法。
此外，本發(fā)明涉及一種包括根據(jù)本發(fā)明所述的檢測裝置的設(shè)備。 微型檢測裝置已經(jīng)用于各種的化學(xué)和生化診斷應(yīng)用以及人工合成應(yīng)用
中。這類檢測裝置用于(例如)特別針對即時診斷的橫向流動測試(lateral flow test)和藥物濫用測試。
美國專利申請2003/0198967 Al描述了基于陣列的檢測裝置，其中A 蛋白通過酰氟官能性偶合到固體基質(zhì)上。在第二步中，抗體與加載A蛋白 的支持物結(jié)合。然后使用這一安排對樣品中與結(jié)合A蛋白的抗體特異性結(jié) 合的分析物進(jìn)行檢測。在這一裝置設(shè)置中，A蛋白用作分析物傳感器受體 分子，而抗體組成分析物傳感器分子。
然而，將分析物傳感器分子以功能性構(gòu)型固定在支持物上、提高分析 物檢測期間的信噪比以及降低通常昂貴的分析傳感器受體分子和分析物傳 感器分子的用量仍是使檢測裝置進(jìn)一步微型化高效發(fā)展的關(guān)鍵因素。
本發(fā)明的一個目的是提供一種確定待測試樣品中存在分析物的檢測裝 置和方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種能夠高效檢測樣品中的分析物同時改進(jìn) 待使用分析物傳感器受體分子和/或分析物傳感器分子的用量的檢測裝置。
為了實現(xiàn)上述目的，提供了如獨立權(quán)利要求1所定義的檢測裝置，以 及如獨立權(quán)利要求14所定義的檢測方法。
根據(jù)本發(fā)明的示例性實施例，提供了一種檢測裝置，包括至少一個支 持物；至少一個分析物傳感器受體分子，其位于所述至少一個支持物的至
6少一部分之上和/或之內(nèi)；以及至少一個分析物傳感器分子，其與所述至少 一個分析物傳感器受體分子相關(guān)聯(lián)，并且所述至少一個分析物傳感器分子 和所述至少一個分析物傳感器受體分子的摩爾比介于近似2:1和近似 I:IO，OOO之間。
在本發(fā)明的另一示例性實施例中，所述至少一個分析物傳感器分子和 所述至少一個分析物傳感器受體分子的摩爾比介于近似1.9:1和近似 1:1000之間、介于近似1.8:1和近似1:750之間、介于近似1.7:1和近4以 1:500之間、介于近似1.6:1和近似1:250之間、介于近似1.5:1和近似1:150 之間、介于近似1.4:1和近似1:125之間、介于近似1.3:1和近似1:100之 間、介于近似1.3:1和近似1:90之間、介于近似1.2:1和近似1:80之間、 介于近似1.1:1和近似1:70之間、介于近似1:1和近似1:60之間、介于近 似1:1.1和近似1:50之間、介于近似1:1.2和近似1:40之間、介于近似1:1.3 和近似1:30之間、介于近似1.4:1和近似1:20之間、介于近似1:1.5和近 似1:15之間或者介于近似1:1.5和近似1:10之間。
本發(fā)明又一示例性實施例涉及一種具有上述特征的檢測裝置，其中， 所述至少一個支持物表面積每一Hm2上的分析物傳感器分子的數(shù)目介于近 似50和250,000之間、介于近似100和近似100,000之間、介于近似150 和近似75,000之間、介于近似200和近似50,000之間、介于近似250和近 似25,000之間、介于近似300和近似21,000之間、介于近似350和近似 18,000之間、介于近似400和近似15,000之間、介于近似450和近似12,000 之間、介于近似500和近似11,000之間、介于近似550和近似9000之間或 者介于近似600和近似8000之間。
在本發(fā)明的又一實施例中，所述檢測裝置包括至少一個支持物表面積 每一^11112上的分析物傳感器受體分子的數(shù)目介于近似500和250,000之間、 介于近似1000和近似100,000之間、介于近似1500和近似50,000之間、 介于近似5000和近似25,000之間、介于近似6000和近似20,000之間、介 于近似6500和近似16,000之間、介于近似7000和近似15,000之間、介于 近似7500和近似13,000之間或者介于近似8000和近似12,000之間。
在另一實施例中，選擇支持物表面積每一pm2上的分析物傳感器受體 分子和分析物傳感器分子的數(shù)目以符合上述指定的摩爾比。在本發(fā)明的一個實施例中，所述檢測裝置的支持物可以是從包括含有 聚合物材料、玻璃、陶瓷、凝膠、離子材料、非織造物、金屬、濾紙、膜 及其復(fù)合材料的多孔或非多孔材料的組中選擇的固體基質(zhì)。
在特別優(yōu)選的實施例中，使用優(yōu)選主要由尼龍、硝酸纖維素、PVDF、 聚醚砜等制成的膜。
在一個實施例中，本發(fā)明涉及一種檢測裝置，其中分析物傳感器受體 分子能夠以功能性構(gòu)象的排列結(jié)合分析物傳感器分子。根據(jù)本發(fā)明，這種 檢測裝置包括至少一個分析物傳感器分子，其能夠借助于一個結(jié)合位點與 分析物傳感器受體分子特異性相互作用而借助于第二結(jié)合位點與感興趣的 分析物特異性相互作用，并且通過第二結(jié)合位點與分析物的結(jié)合基本上不 受伴隨而來通過第一結(jié)合位點與分析物傳感器受體分子的結(jié)合的影響。
在本發(fā)明的一個方面，分析物傳感器受體分子能夠結(jié)合到抗體的Fc部 分上。
這樣，在一個實施例中，分析物傳感器受體分子可以從特異性識別另 一抗體Fc部分的抗體中選擇，或者優(yōu)選從金黃色葡萄球菌(6top /o""w 的A蛋白、C株或G株鏈球菌的G蛋白、或者重組A/G蛋白中進(jìn) 行選擇。特別優(yōu)選的實施例使用重組A/G蛋白作為分析物傳感器受體分子。
在一個實施例中，檢測裝置使用選自適體、蛋白質(zhì)受體、酶、抗原、 配體和半抗原以及特別優(yōu)選是抗體的分析物傳感器分子。
本發(fā)明的一個實施例涉及一種檢測裝置，其中借助于共價或非共價相 互作用，將分析物傳感器受體分子置于支持物上，該支持物可以是諸如硝 酸纖維素膜的膜。在共價相互作用的情形中，通過至少一個化學(xué)鍵合，將 分析物傳感器受體分子鍵合到支持物(其可以是膜)上。為此目的，支持 物可以提供至少一個能夠在支持物和分析物傳感器受體分子之間建立化學(xué) 鍵的化學(xué)官能團(tuán)。在優(yōu)選實施例中，該官能團(tuán)包括COOH基團(tuán)。
本發(fā)明的又一實施例涉及一種檢測裝置，其中分析物傳感器分子通過 共價或非共價相互作用結(jié)合到分析物傳感器受體分子上。在非共價相互作 用的情形中，通過分析物傳感器受體分子與分析物傳感器分子之間由于兩 種分子三維結(jié)構(gòu)的互補而產(chǎn)生的親和力，來介導(dǎo)分析物傳感器分子與分析 物傳感器受體分子的結(jié)合。在又一實施例中，用能夠降低、防止和/或去除待測試樣品各成分與支 持物、分析物傳感器受體分子和/或分析物傳感器分子的非特異性結(jié)合的溶 液處理檢測裝置。在本發(fā)明的一個實施例中，在與待測試樣品接觸之前，
檢測裝置已經(jīng)用包括從BSA、 HAS、 FSA、酪蛋白、Fc尾和/或洗滌劑組成 的組中所選的化合物的封閉溶液進(jìn)行處理。
本發(fā)明還針對一種對至少一個樣品中的至少一個分析物進(jìn)行檢測的方 法，其包括如下步驟-
-提供至少一個如上所述的檢測裝置，
-用包括至少一個分析物的至少一個樣品接觸所述至少一個檢測裝置，
-任選地用能夠去除未結(jié)合或非特異性結(jié)合的樣品成分的溶液洗滌所 述至少一個檢測裝置。
-檢測所述至少一個分析物傳感器分子和所述至少一個樣品的至少一 個分析物之間的特異性相互作用。
為了檢測樣品分析物和分析物傳感器分子之間的相互作用，用檢測標(biāo) 記物修飾所述分析物。
根據(jù)本發(fā)明一個目的的這種方法可以用于臨床分析、新藥物的鑒定、 血液分析、藥物發(fā)現(xiàn)、結(jié)構(gòu)功能性研究、法醫(yī)、環(huán)境樣品測試、化學(xué)品暴 露、小分子文庫的測試、基于細(xì)胞的測定等。
圖l是根據(jù)本發(fā)明的檢測裝置的示意性表示，其示出了其中A/G蛋白 結(jié)合到固體膜的實施例。用BSA和Fc片段封閉包被了 A/G蛋白的膜組件 (membrane assembly)。此外，圖片描繪出抗體(分析物傳感器分子)與 A/G蛋白和偶合有可檢測Cy5標(biāo)記物的結(jié)合分析物的結(jié)合；
圖2示出了對施加到如示例1所述硝酸纖維素膜的A/G蛋白包被的最 佳濃度的確定；
圖3示出了標(biāo)記Cy5的兔抗小鼠IgG抗體結(jié)合到包被A/G蛋白的膜的 結(jié)合能力與結(jié)合未包被膜的結(jié)合能力的對照；
圖4示出了根據(jù)EDAC的A/G蛋白的結(jié)合能力；
圖5示出了用包括標(biāo)記生物素(Biotine)的兔抗小鼠抗體的封閉溶液 來封閉包被了 A/G蛋白的膜；
9圖6示出了用于不同膜的包括BSA或酪蛋白的封閉溶液的封閉效率； 圖7示出了以捕獲抗體(分析物傳感器分子)與A/G蛋白(分析物傳 感器受體分子)的不同摩爾比進(jìn)行分析物檢測的靈敏度增加。
在一個實施例中，本發(fā)明針對一種檢測裝置，包括 -至少一個支持物，
-至少一個分析物傳感器受體分子，其位于所述至少一個支持物的至少 一部分之上和/或之內(nèi)，以及
-至少一個分析物傳感器分子，其與所述至少一個分析物傳感器受體分 子相關(guān)聯(lián)，
其中，所述至少一個分析物傳感器和所述至少一個分析物受體分子的 摩爾比介于近似2:1和近似1:10,000之間。
在過去，諸如抗體的分析物傳感器分子一直是附著于諸如微陣列、珠 等的固體基質(zhì)。然而，如果可用于檢測樣品中的分析物、諸如抗體的分析 物傳感器分子直接附著于固相支持物，則可能的結(jié)果是分析物傳感器分子 以非功能性構(gòu)象結(jié)合到所述支持物。這發(fā)生于(例如)不易接近結(jié)合位點 (其是檢測樣品中的分析物所需要的)時，因為通過這一結(jié)合位點發(fā)生與 固相支持物的鍵合。
為了解決這些困難，已經(jīng)考慮了首先將分析物傳感器受體分子置于支 持物上，然后支持物以功能性構(gòu)象結(jié)合分析物傳感器分子，這是指分析物 傳感器受體分子與分析物傳感器分子內(nèi)的一個結(jié)合位點相互作用，而分析 物傳感器分子中要求與待檢測分析物相結(jié)合的第二結(jié)合位點基本不受分析 物傳感器受體分子和分析物傳感器分子之間相互作用的影響。這種分析物 傳感器受體分子和分析物傳感器分子之間的構(gòu)象功能性性相互作用的示例 是用(例如)鏈親和素包被基質(zhì)，而將分析物傳感器分子偶合到生物素。 分析物傳感器分子然后通過生物素與置于基質(zhì)上的分析物傳感器受體分子 (其在這種情形中為鏈親和素)相互作用。這能夠使分析物傳感器分子在 支持物上以功能性構(gòu)象進(jìn)行取向，從而保持分析物傳感器分子中對容易自 由接近的樣品分析物進(jìn)行檢測所要求的結(jié)合位點。
本發(fā)明的發(fā)明者意外地發(fā)現(xiàn)一種檢測裝置，包括
10-至少一個支持物，
-至少一個分析物傳感器受體分子，其位于所述至少一個支持物的至少 一部分之上和/或之內(nèi)，以及
-至少一個分析物傳感器分子，其與所述至少一個分析物傳感器受體分 子相關(guān)聯(lián)，
其中，考慮到對樣品內(nèi)的分析物進(jìn)行高效且靈敏的檢測，而同時保持 分析物傳感器分子和分析物傳感器受體分子的用量相對較低，所述至少一
個分析物傳感器和所述至少一個分析物受體分子的摩爾比介于近似2:1和 近似1:10,000之間。
這樣，本發(fā)明在一方面針對檢測裝置，包括在其上布置至少一個分析 物傳感器受體分子的支持物。該分析物傳感器受體分子與至少一個分析物 傳感器分子相互作用，從而使至少一個分析物傳感器分子以功能性構(gòu)象能 夠與樣品中的分析物起反應(yīng)，而同時與分析物傳感器受體分子相結(jié)合。當(dāng) 根據(jù)本發(fā)明分析物傳感器分子和分析物傳感器受體分子以截然不同的比率 和/或數(shù)目存在于支持物上時，才實現(xiàn)待布置分子的數(shù)目和高效的分析物檢 測之間的最佳平衡。
在本發(fā)明中有用的支持物在實施例中是固相支持物。基質(zhì)可由能夠允 許在基質(zhì)表面至少一部分上布置分析物傳感器分子的多孔或非多孔材料制 成。如果基質(zhì)具有(例如)多孔特性，則分析物傳感器受體分子不但可置 于多孔支持物的至少一部分上，而且可置于多孔固相支持物的至少一部分 之內(nèi)。對本發(fā)明目的有用的基質(zhì)對于本領(lǐng)域而言當(dāng)然是己知的，并且本領(lǐng) 域的技術(shù)人員將會理解可從其他聚合物材料、玻璃、陶瓷、凝膠、天然纖 維、纖維、硅酮、金屬、非織造物、過濾材料、膜及其復(fù)合材料中制造這 些基質(zhì)。
優(yōu)選實施例使用膜作為固相支持物。這些膜優(yōu)選由尼龍、硝酸纖維素 或PVDF制成。
可獲得商品名稱為Protran、 Ultrabind、 Immunodyne、 Hybond禾口 Biodyne 的這類膜。尤其優(yōu)選Biodyne膜，其是從Pall獲得的負(fù)電荷尼龍膜(由于 羧基的存在)。
當(dāng)然，根據(jù)特定的使用，可將固相支持物制造成任意的形狀和大小。各種示例包括板狀、片狀、薄膜狀、絲狀、點狀等。優(yōu)選但非強求的形狀 是那些優(yōu)選能夠由自動診斷系統(tǒng)處理的扁平表面，例如膜、濾紙或微板。
在一個實施例中優(yōu)選尺寸可變，但膜具有的厚度介于1到15mm之間、 介于2到12mm之間、介于3到llmm之間、介于4到10mm之間、介于 4到10mm或大約8mm之間和/或孔徑大小為0.1到1)im、介于0.2到0.8|iim 之間、0.3到0.7nm之間以及0.4到0.6pm之間。如果膜(例如)是前述負(fù) 電荷尼龍膜的其中一種，則這也是有效的。
本發(fā)明有用的分析物傳感器受體分子能夠如上所述置于支持物上，同 時為分析物傳感器分子提供結(jié)合位點，以便保持分析物傳感器分子處于功 能性構(gòu)象。
分析物傳感器受體分子因而可以是能夠?qū)⒏鞣N生物材料或化學(xué)材料附 著或偶合到支持物的化合物、絡(luò)合物、配體或試劑。分析物傳感器受體分 子可以是蛋白質(zhì)、酶、碳水化合物、核酸、寡核苷酸、多核苷酸、適體、 半抗原、藥物、染料、有機小分子、細(xì)胞、細(xì)胞片段、受體或細(xì)胞表面結(jié) 合劑等。分析物傳感器受體分子的各種示例包括(例如)鏈親和素或生物 素、FLAG表位、myc表位、AL標(biāo)簽、GST標(biāo)簽、His標(biāo)簽、麥芽糖結(jié)合 蛋白標(biāo)簽等。
其中一個實施例涉及一種檢測裝置，其能用在免疫測定中，因而依賴 于作為分析物傳感器分子使用的各種抗體，在該實施例中分析物傳感器受 體分子優(yōu)選是所謂的Fc受體。
Fc受體是能夠結(jié)合抗體Fc部分的分子。在抗體作為分析物傳感器分子 的確切背景下，F(xiàn)c受體與抗體Fc部分的結(jié)合確?？贵w(其也可稱之為捕獲 抗體)經(jīng)Fc部分結(jié)合到分析物傳感器受體分子，并且所述抗體中介導(dǎo)了與 待檢測分析物特異性結(jié)合的可變區(qū)域?qū)@以后的相互作用仍保留容易自由 接近。
在Fc受體情形中的示例性分析物受體分子在優(yōu)選實施例中包括多種蛋 白質(zhì)，例如金黃色葡萄球菌的A蛋白、C株和G株鏈球菌的G蛋白、或重 組A/G蛋白。其他示例性Fc受體可包括多種抗體本身，只要這些抗體是針 對其他抗體的Fc部分產(chǎn)生的即可。當(dāng)然，F(xiàn)c受體例如還可包括適體或其他 蛋白質(zhì)，只要已經(jīng)培育這些分子能特異性識別抗體的Fc部分。特別優(yōu)選的是A/G蛋白，其是A和G蛋白的SC結(jié)合域的基因融合產(chǎn) 物。A/G蛋白對抗體具有比A蛋白或G蛋白更廣泛的結(jié)合特異性。這樣它 可化合到所有的人類IgG亞類IgA、 IgE、 IgM和IgD。 A和G蛋白的結(jié)合 偏好例如可從Harlow和Lane的教科書《抗體》，A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988年(例如，617頁)中獲得。
本發(fā)明中有用的分析物傳感器分子是能夠由前述具有功能性構(gòu)象的分 析物傳感器受體分子相結(jié)合的分子，這是指分析物傳感器分子在與分析物 傳感器受體分子結(jié)合時保留與通常稱之為分析物的靶結(jié)構(gòu)進(jìn)行特異性相互 作用的潛力。
如果將包括各種分析物的樣品與分析物傳感器分子進(jìn)行孵育，則分析 物傳感器分子將優(yōu)選與專門針對的分析物相互作用，從而導(dǎo)致隨后能檢測 到的特異性相互作用。這樣對本發(fā)明目的有用的分析物傳感器分子可以是 在如上所述地與分析物傳感器受體分子進(jìn)行結(jié)合時仍能與另一分子進(jìn)行特 異性相互作用的分子。這樣，分析物傳感器分子可以是蛋白質(zhì)、酶、受體、 配體、適體、DNA片段、抗原、半抗原、細(xì)胞、細(xì)胞片段、小分子、核苷 酸序列和抗體。
如上所述，如果Fc受體用作分析物傳感器受體分子，則分析物傳感器 分子應(yīng)當(dāng)提供Fc尾。雖然這當(dāng)然意味著分析物傳感器分子可以是抗體(其 在這種情形中還可稱之為捕獲抗體)，但是分析物傳感器分子決不限制為這 一后者類型的蛋白質(zhì)。如果Fc受體將要用作分析物傳感器受體分子，則能 夠結(jié)合另一分子或與另一分子進(jìn)行特異性相互作用、且已經(jīng)融合到Fc區(qū)域 的任何類型的分析物傳感器分子因而可用作所述分析物傳感器分子。例如， 小分子、適體、核苷酸序列、配體等可以通過(例如)化學(xué)交聯(lián)與Fc區(qū)域 進(jìn)行融合，從而與前述Fc受體之一相接觸。
在本發(fā)明的一個實施例中，抗體優(yōu)選作為分析物傳感器分子，假設(shè)這 些抗體具有能與前述Fc受體之一相互作用的Fc部分，和專門用于另一分 子的另一結(jié)合位點，所述另一結(jié)合位點與抗體的Fc部分明顯間隔開，從而 使得抗體與Fc受體的相互作用基本上不影響抗體與其專用的分子結(jié)構(gòu)之間 的相互作用。如果抗體用作分析物傳感器分子，則同樣將它們稱之為捕獲 抗體。將要用作分析物傳感器分子的抗體可以有任何來源，這些來源包括小 鼠、人體、大鼠、雞、綿羊、山羊等，并其所述抗體包括本領(lǐng)域公知的所 有類型的抗體，例如單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體等。
在Harlow and Lane (vide supra)中概述出能夠使用的不同類型抗體。 此外，可以使用所有類型的抗體亞類，例如前述的IgA、 IgE、 IgM、 IgG、 IgD等。在這一背景下再次參考Harlow and Lane (vide supra)。當(dāng)然，本領(lǐng) 域的技術(shù)人員將會意識到對某個抗體的選擇可能會需要使用某個Fc受體作 為分析物傳感器受體分子。
在本發(fā)明的特別優(yōu)選實施例中，將諸如A蛋白、G蛋白或特別是A/G 蛋白的Fc受體用作分析物傳感器受體分子，將抗體用作分析物傳感器分子， 而將有利地具有上述與厚度和孔徑大小有關(guān)的尺寸的膜(其可以是尼龍膜) 用于根據(jù)本發(fā)明的檢測裝置。
可以將分析物傳感器受體分子通過與任何一種前述支持物的共價鍵或 非共價鍵置于所述支持物的至少一部分之上和/或之內(nèi)。
支持物和分析物傳感器受體分子間的共價鍵是指形成化學(xué)鍵。為了共 價鍵，可以將該支持物功能化，以便提供允許在支持物和分析物傳感器受 體分子之間形成化學(xué)鍵合的功能性化學(xué)基團(tuán)。
因而，如果將(例如)Fc受體用作分析物傳感器受體分子，并應(yīng)當(dāng)共 價偶合到所述膜，則可以使用提供諸如羧基、酰胺基、羥基、巰基等的官 能團(tuán)的膜。
這些基團(tuán)然后可以直接與Fc受體交聯(lián)，或者使用可以為同型雙功能或 異型雙功能的交聯(lián)劑與Fc受體交聯(lián)。
這樣，通過(例如)用具有(例如)酰氟功能性的聚合物包被惰性固 體基質(zhì)來激活支持物，用于提供與分析物受體分子的化學(xué)鍵合。其他共價 結(jié)合的化學(xué)物同樣適用但并不局限于酸酐、環(huán)氧化物、醛、酰肼、酰疊氮、 芳香疊氮、重氮化合物、二苯甲酮、碳二亞胺、酰亞氨酯、異硫氰酸酯、 NHS酯、CNBr、馬來酰亞胺、甲苯磺酸鹽、三氟代乙烷磺酰氯、馬來酸酐 和羰基二咪唑。
在優(yōu)選實施例中，碳二亞胺功能性可用于建立支持物和諸如Fc受體的 分析物傳感器受體分子之間的連接。
14為此，可以用諸如EDAC (N- (3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亞胺鹽 酸鹽)的交聯(lián)劑對負(fù)電荷尼龍膜(例如包括COOH基的BiodyneC膜)進(jìn) 行預(yù)處理。這一活性中間體然后與分析物傳感器受體分子(例如Fc受體) 的氨基起反應(yīng)。
在如上所述使用Fc受體(例如A/G蛋白)和抗體以及膜的本發(fā)明特定 實施例中，通過使用低濃度的EDAC可以發(fā)生Fc受體(例如A蛋白)的 鍵合。
典型地，這些EDAC的濃度將按EDAC的重量在0到25%之間變動、 按重量在0.5到10%、按重量在0.5到8%、按重量在0.5到4%、按重量 在0.5到2%并且特別優(yōu)選按重量的1。％。
如果使用非共價相互作用將分析物傳感器受體分子置于支持物上，則 可使用諸如吸收、疏水作用等的機制。
使用共價相互作用或非共價相互作用同樣可以建立分析物傳感器受體 分子與分析物傳感器分子之間的相互作用。
非共價相互作用將典型地依賴于分析物傳感器受體分子與分析物傳感 器分子之間的結(jié)合親和力，其是這兩者互補三維結(jié)構(gòu)的結(jié)果。這些相互作 用的典型示例是指鏈親和素(分析物傳感器受體分子)與生物素(部分分 析物傳感器分子)、Fc受體(分析物傳感器受體分子)與所述分析物傳感器 分子的Fc部分之間的相互作用。
當(dāng)然，使用共價鍵合可以建立分析物傳感器受體分子與分析物傳感器 分子間的相互作用。為了這些目的，可以使用同型雙功能和/或異型雙功能、 和域同型多功能和域異型多功能的交聯(lián)劑。典型的交聯(lián)劑包括但不限于在 Harlow and Lane (vide supra)中己經(jīng)提到的那些包括但不限于，雙(硫 代丁二酰亞氨)雙(重氮聯(lián)苯胺)、二甲基己二亞酰胺、二甲基庚二亞胺、 二甲基辛二亞胺、二甲基辛二酸、戊二醛、in-馬來酰亞胺基苯甲酰-N-羥基 丁二酰亞胺、Sulfosuccinidyl 4- (N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-l-羧酸酯等。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員清楚地意識到，分析物傳感器受體分子和分析物傳 感器分子的處置可以立刻或順序發(fā)生。這樣，人們可以首先將分析物傳感 器受體分子置于基質(zhì)上，然后將分析物傳感器分子加到包被分析物傳感器 受體分子的支持物上。或者，人們可以首先建立分析物傳感器受體分子與
15分析物傳感器分子之間的相互作用，然后將該絡(luò)合物置于支持物上。在又 一替代方案中，人們可使用所謂的一步反應(yīng)，其中分析物傳感器受體分子 和分析物傳感器分子接觸基質(zhì)，而不會過早建立分析物傳感器受體分子和 分析物傳感器分子間的絡(luò)合物。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，其中將諸如A/G蛋白的Fc受體用作分析物 傳感器受體分子、將抗體用作分析物傳感器分子而將膜用作支持物，在一 步反應(yīng)中可以實現(xiàn)沉積(其也被稱之為支持物的包被)，即直接將Fc受體 和抗體包被到成為膜的支持物上。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知當(dāng)使分析物傳感器受體分子(例如Fc受體)接觸 支持物并且當(dāng)用分析物傳感器分子(例如抗體)接觸分析物傳感器受體分 子(例如Fc受體)時，必須注意的反應(yīng)條件。典型的反應(yīng)條件取決于特定 的緩沖液、溫度、pH條件等。然而，這些條件將取決于分析物傳感器受體 分子及對應(yīng)分析物傳感器分子的類型并取決于在共價鍵合背景下所用的化 學(xué)功能性，并且通?？蓮奈墨I(xiàn)知曉或者由(例如)化學(xué)交聯(lián)劑制造商提供。
在本發(fā)明的一個實施例中，檢測裝置僅包括一種類型的分析物傳感器 受體分子和對應(yīng)一種類型的均勻分布在支持物的至少一部分之上和/或之 內(nèi)的分析物傳感器分子。
然而，在本發(fā)明的同樣優(yōu)選的另一實施例中，分析物傳感器受體分子 和對應(yīng)的分析物傳感器分子以建立通常稱之為"陣列"的支持物模式的空 間順序和間隔方式分布在基質(zhì)的至少一部分之上和/或之內(nèi)。
從將分析物傳感器受體分子和分析物傳感器分子以陣列形式置于支持 物之上得到的一種優(yōu)勢在于，不同類型的分析物傳感器受體分子和對應(yīng)的 不同分析物傳感器分子能以已知的取向和分布置于陣列之上。這樣的取向 將能夠在樣品中進(jìn)行多分析物的并行檢測。
典型地，這種陣列包括代表分析物傳感器受體分子和分析物傳感器分 子特定組合的點。當(dāng)已知該點中分析物傳感器受體分子和分析物傳感器分 子的對一致時，可以建立復(fù)雜的陣列。下列工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中，陣列型式將具有 一定的密度，這是指點的用量在從10至'J 100,000、從50到50，000、從100 到10，000的范圍，或是1000、 2000、 3000、 4000或5000。
在又一實施例中，可以將多種檢測裝置組件到常常稱之為微量滴定板的器件中，并且每個孔代表根據(jù)本發(fā)明的一個檢測裝置。這種組件檢測裝
置將能夠執(zhí)行若干的對應(yīng)于可購得微量滴定板孔數(shù)的96、384或1,536倍的
、、本發(fā)明后面的這些方面的優(yōu)勢在于，可以研制出允許反應(yīng)體積中樣品
大小更小的微型支持物平臺，這會導(dǎo)致規(guī)模經(jīng)濟(jì)和時間節(jié)省。另外，這些 分析物與常規(guī)微型測定型式相比能獲得可比較或更大的靈敏度。
為了以空間安排陣列的順序布置分析物傳感器受體分子以及分析物傳 感器分子，人們可以依靠從諸如微型陣列印刷技術(shù)等的微型陣列技術(shù)中已 知的各種技術(shù)。
需要指出的是，根據(jù)本發(fā)明，在迄今為止所述的任意一個實施例中， 分析物傳感器受體分子和分析物分子將以某一不同摩爾比和/或支持物表 面積每一^11112上的數(shù)目存在。
根據(jù)本發(fā)明，分析物傳感器分子和分析物傳感器受體分子的摩爾比介 于近似2:1和近似1:10,000之間。
在本發(fā)明的其他實施例(其可以是優(yōu)選的)中，分析物傳感器分子和 分析物傳感器受體分子的摩爾比優(yōu)選介于近似1.9:1和近似1:1000之間、 介于近似1.8:1和近似1:750之間、介于近似1.7:1和近似1:500之間、介 于近似1.6:1和近似1:250之間、介于近似1.5:1和近似1:150之間、介于 近似1.4:1和近似1:125之間、更優(yōu)地介于近似1.3:1和近似1:100之間、 介于近似1.3:1和近似1:90之間、介于近似1.2:1和近似1:80之間、介于 近似1.1:1和近似1:70之間、介于近似1:1和近似1:60之間、甚至更優(yōu)地 介于近似1:1.1和近似1:50之間、介于近似1:1.2和近似1:40之間、介于 近似1:1.3和近似1:30之間、介于近似1.4:1和近似1:20之間、并且最佳 地介于近似1:1.5和近似1:15之間或介于近似1:1.5和近似1:10之間。
特別優(yōu)選的是1:1.5和近似1:10的比率。
同樣特別優(yōu)選的是分析物傳感器分子與分析物傳感器受體分子的比率 為1:1.5、 1:2、 1:3、 1:4、 1:5、 1:6、 1:7、 1:8、 1:9、 1:10、 1:11、 1:12、 1:13、 1:14或1:15。
在本發(fā)明的示例性實施例中，支持物表面積每一^m2上的分析物傳感 器分子的數(shù)目介于50和近似250,000之間、介于近似100和近似1000,000之間、介于近似150和近似75,000之間、介于近似200和近似50,000之間、 介于近似250和近似25,000之間、介于近似300和近似21,000之間、介于 近似350和近似18,000之間、優(yōu)選介于近似400和近似15,000之間、介于 近似450和近似12,000之間、介于近似500和近似11,000之間并且更優(yōu)選
在特別優(yōu)選的實施例中，支;物表面積每一pm;上的分析物傳感器分
子的數(shù)目可以是600、 700、 900、 1300、 1600、 1900、 2200、 2500、 2800、 3100、 3400、 3700、 4000、 4300、 4600、 4900、 5200、 5500、 5亂7訓(xùn)、 7400、 7700或8000。
在本發(fā)明的又一示例性實施例中，支持物表面積每一lLim2上的分析物 傳感器受體分子的數(shù)目介于近似500和近似250,000之間、介于近似1000 和近似100,000之間、介于近似1500和近似50,000之間、優(yōu)選介于近似5000 和近似25,000之間、介于近似6000和近似20,000之間、介于近似6500和 近似16,000之間、介于近似7000和近似15，000之間、介于近似7500和近 似13,000之間、介于近似8000和近似12,500之間。
在特別優(yōu)選的實施例中，支持物表面積每一pm2上的分析物傳感器受 體分子的數(shù)目可以是8000、 8500、 9000、 9500、 IO，OOO、 10,500、 11,000、 11,500、 12,000或12,500。
當(dāng)然，上面提到的支持物表面積每一^im2上的分析物傳感器分子和分 析物傳感器受體分子的數(shù)目可以進(jìn)行組合，只要它們在上面指定的摩爾比 內(nèi)。
上面提到的摩爾比和支持物表面積每一pm2上的分子數(shù)目特別應(yīng)用于 本發(fā)明的優(yōu)選實施例，其中將諸如A蛋白、G蛋白和A/G蛋白的Fc受體 用作分析物傳感器受體分子、將抗體用作分析物傳感器分子而將膜用作支 持物。在這一背景下，應(yīng)當(dāng)特別考慮如上面特別指定為優(yōu)選的摩爾比和支 持物表面積每一pr^上的分析物傳感器受體分子及分析物傳感器分子的數(shù) 目。
在一個優(yōu)選實施例中，將Fc受體(例如A/G蛋白)用作分析物傳感器 受體分子而將抗體用作分析物傳感器分子，并且抗體對Fc受體的摩爾比介 于近似1:1.5和近似1:10之間。在該實施例中，抗體分子的數(shù)目可以在支持物表面積每一pm2上介于近似600和近似8000之間，而受體分子的數(shù)目 可以在支持物表面積每一|^12上介于近似8000和近似125,000之間。
如果使用(例如)Fc受體(例如A/G蛋白)和抗體，則Fc受體的包 被溶液通常將包括25-500nM、 50-250nM、 75-200nM或150nM的濃度，而 抗體印刷溶液通常將是lpM、 750nM、 500nM、 300nM、 250nM、 200nM、 150nM、 125nM、 100nM、 75nM、 50nM、 25nM、 10nM、 1，5nM、 lnM、 750fM 的濃度。在一個實施例中優(yōu)選對于Fc受體其濃度為100nM、 150nM或 200nM以及對于捕獲抗體其濃度低于150nM或低于10nM。如果對整個膜 尺寸為近似12.5cm乘5cm(和每陣列l(wèi)cm乘lcm)并且孔隙率為近似50|um 到500nm、 100|imi到400nm、 200|im或300)im的膜支持物進(jìn)行包被，則 這些濃度特別有用。
眾所周知，在分析物檢測期間，例如對于樣品中的蛋白質(zhì)，在檢測裝 置上可以發(fā)生待測樣品成分的非特異性結(jié)合。這一非特異性結(jié)合可以發(fā)生 在支持物上、分析物傳感器受體分子和/或分析物傳感器分子上。雖然人們 為去除非特異性結(jié)合成分而通常使用所謂的洗滌溶液，在已經(jīng)用樣品接觸 檢測裝置之后，通過去除非特異性結(jié)合成分來試圖處理這種非特異性結(jié)合， 但是本發(fā)明的發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明的一個實施例中，理想地是用能 夠減少和/或去除和/或防止與支持物、分析物傳感器受體分子和/或分析物 傳感器分子進(jìn)行非特異性結(jié)合的溶液或液體來處理檢測裝置。這類液體溶 液通常稱之為封閉溶液。
能夠減少和/或防止樣品成分與前述成分在檢測裝置中進(jìn)行非特異性 結(jié)合的封閉成分通常取決于支持物、分析物傳感器受體分子和/或分析物傳 感器分子的性質(zhì)和用量。
這種封閉成分例如可以包括諸如SDS、 TrtionXlOO、 TrtionX80、 NP-40、 Tween-80、 Tween-20等的洗滌劑。在另一實施例中，封閉溶液的封閉成分 可以是不能與分析物傳感器分子連接的BSA、 FSA、 HSA、酪蛋白或Fc尾。 當(dāng)然，也可使用上述提到的封閉試劑的組合。
在本發(fā)明的一個實施例中，其中使用Fc受體(例如A蛋白、G蛋白以 及特別是A/G蛋白)作為分析物傳感器受體分子、使用抗體作為分析物傳 感器分子、而使用膜作為支持物，優(yōu)選的是后面的封閉成分，即BSA、HSA、
19FSA以及特別是酪蛋白和Fc尾。
封閉溶液通常以溶液或液體的形式施加，例如封閉緩沖液。這類(例如)封閉緩沖液的其它成分根據(jù)具體的用途將是鹽、酸等。典型的封閉緩沖液將是PBS、 PH7,4，其包括前述成分按BSA、 FSA、 HAS或酪蛋白的重量濃度為1%、 2%、 3%、 4%、 5%、 6%、 7%、 8%、 9%、 10%并上到15%或20%的任一種。
當(dāng)然，人們同樣可以使用抗體作為封閉試劑，只要其Fc尾不能在所用分析物傳感器受體分子Fc受體上被特異性識別。
如果將諸如酪蛋白、BSA、 HSA的成分用作封閉溶液中的封閉成分，則它們的濃度通常將介于1和15%之間、介于2和10%之間并優(yōu)選介于5和10%之間。這些濃度是按重量計算的百分比。
如果將(例如)不能被分析物傳感器受體分子識別的Fc片段或抗體用作封閉成分，則后面這些成分的濃度通常將介于0.5到10pM之間、介于l到5iuM之間并優(yōu)選為lpM、 2pM、 3pM、 4nM或5iaM。
在優(yōu)選實施例中，封閉溶液將包括按重量計算5%到10%的酪蛋白，和作為添加劑的l^M的Fc尾。
封閉的時間點可以不同。這樣，在分析物傳感器受體分子(例如Fc受體)結(jié)合到支持物之前，可以預(yù)先封閉支持物(例如膜)。同時，如果分析物傳感器受體分子(例如A/G蛋白)在分析物傳感器分子(在這種情形中為抗體)添加到檢測裝置之前已經(jīng)偶合到膜上，則會發(fā)生封閉。在支持物(例如膜)上己經(jīng)形成分析物傳感器受體分子(例如Fc受體)與分析物傳感器分子(例如抗體)的絡(luò)合物之后，也會發(fā)生封閉。
雖然上述檢測裝置大部分情況都是參考作為分析物傳感器受體分子的Fc受體和作為分析物傳感器分子的抗體進(jìn)行的描述，但是這決不意味著檢測裝置局限于這些成分。根據(jù)本發(fā)明的檢測裝置可以用于多種目的，例如為判斷是否存在與(例如)某一蛋白質(zhì)或酶(在這種情形中是分析物傳感器分子)特異性的分子而篩選小分子文庫。在另一實施例中，通過病毒的蛋白質(zhì)或核酸成分具有與特異性抗體結(jié)合的能力，可以檢測血液樣品中的病毒，所述特異性抗體已經(jīng)事先固定在根據(jù)本發(fā)明的檢測裝置上。類似地，可以使用抗體、受體或其它能夠與下述成分進(jìn)行特異性相互作用的分子，
20檢測環(huán)境樣品中的微生物或其中的有毒且危害環(huán)境的化學(xué)物。
因而本發(fā)明的另一目的涉及一種檢測至少一個樣品中的至少一個分析
物的方法，該方法包括如下步驟
-提供至少一個如上所述的檢測裝置，
-用包括至少一個分析物的至少一個樣品接觸所述至少一個檢測裝置，-任選地用能夠去除未結(jié)合或非特異性結(jié)合樣品的溶液洗滌所述至少一個檢測裝置，
-檢測所述至少一個分析物傳感器分子和所述至少一個樣品的至少一個分析物之間的特異性相互作用。
為了實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的方法，可以使用如上所述的檢測裝置。在優(yōu)選實施例中，使用這樣的檢測裝置，其將膜用作支持物、將Fc受體(例如A
蛋白、G蛋白以及特別是A/G蛋白)用作分析物傳感器受體分子而將對某
一分析物特異性的抗體用作分析物傳感器分子，并且分析物傳感器受體分子和分析物傳感器分子的摩爾比以及表面積每一pmS上分析物傳感器受體
分子和分析物傳感器分子的數(shù)目的優(yōu)選值是如上所述的那些值，并且封閉成分和濃度也如上所述。
在允許分析物傳感器分子與樣品中的分析物進(jìn)行相互作用的條件下，這些根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選檢測裝置，還有其他檢測裝置然后可以與至少一個樣品接觸。
在樣品和檢測裝置已經(jīng)接觸從而在檢測裝置上能夠使樣品內(nèi)的至少一個分析物和(一個或多個)分析物傳感器分子進(jìn)行特異性相互作用之后，人們可以任選地包括所謂的洗滌步驟，其目的在于去除和/或減少分析物樣品中與基質(zhì)、分析物傳感器受體分子和/或分析物傳感器分子非特異性相互作用的非特異性結(jié)合成分。在這一任選洗滌步驟之后，將進(jìn)行分析物傳感器分子與至少一個樣品分析物之間的特異性相互作用檢測。
存在對樣品中的分析物和分析物傳感器分子之間的特異性相互作用進(jìn)行檢測的多種手段。這將參考作為分析物傳感器分子的抗體與樣品成分(例如蛋白質(zhì)或由可以是樣品成分的抗體特異性識別的典型化合物)之間的相互作用進(jìn)行描述。然而，這些解釋決不意味著局限于本發(fā)明的這些示例性實施例。通過用可檢測標(biāo)記物修飾分析物可進(jìn)行分析物傳感器分子(例如抗體)與分析物之間相互作用的檢測。在用樣品接觸檢測裝置之前，在用樣品接觸檢測裝置期間或者在已經(jīng)發(fā)生分析物傳感器分子與分析物之間的特異性相互作用之后，能夠用可檢測標(biāo)記物對分析物進(jìn)行修飾。
通過利用例如熒光成分(例如Cy5、 Cy3、 Texas Red、 FITC、 Attodye、Cydye、 Alexa647等)、放射性基團(tuán)等進(jìn)行修飾，可以使用可檢測標(biāo)記物來修飾分析物。如果分析物傳感器分子(例如抗體)與(例如)標(biāo)記Cy5的分析物之間發(fā)生相互作用，則可以通過洗滌步驟去除樣品中任何其他有標(biāo)記的成分，并且可以通過(例如)由于分析物傳感器分子和分析物(其借助于與分析物傳感器分子的相互作用保留在檢測裝置上)之間相互作用而產(chǎn)生的熒光信號，來檢測樣品中是否存在特異性分析物。
可以使用其它方法，例如誘導(dǎo)銀染色(induced silver staining)進(jìn)行檢測。其它的可檢測標(biāo)記物取決于產(chǎn)生染色的酶反應(yīng)，例如辣根過氧化物酶可以偶合到樣品中的分析物，并且稍后通過提供對應(yīng)基質(zhì)可以啟動反應(yīng)，從而導(dǎo)致劑量位置處的染色，在該位置處用辣根過氧化物酶修飾的分析物已經(jīng)與分析物傳感器分子相互作用。
這種酶連接物還可以包括堿性磷酸酶或化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)。可檢測標(biāo)記物的其它示例(其也被稱之為報道分子)包括但不限于染料、化學(xué)發(fā)光化合物、金屬絡(luò)合物、磁性顆粒、生物素、半抗原、射頻發(fā)射物以及放射發(fā)光化合物。
同樣可以使用檢測分析物和分析物傳感器分子之間相互作用的其它方
法。例如，如果分析物傳感器分子是抗體，分析物可以從樣品中與該抗體
特異性結(jié)合。如果使用洗滌步驟從樣品中去除任何未結(jié)合和非特異性結(jié)合
的成分，則可以向檢測裝置添加另一抗體，其同樣對分析物的另一部分具
有特異性。該抗體例如可以連接到可檢測標(biāo)記物。

圖1中示出了這一原理。
這種可檢測標(biāo)記物可以是熒光標(biāo)記物，例如圖1中所描繪的Cy5;然而，
這種標(biāo)記物例如還可以是具有已知序列的寡核苷酸。如果隨后使用所謂二抗與保留在檢測裝置上的分析物的相互作用進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，則可以
檢出測樣品中是否存在分析物。這一所謂的免疫PCR非常靈敏并且可以用來可靠地檢測溶液中微量的nanolite。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將知曉其它修飾。如上所述，如果以陣列型式將分析物傳感器受體分子和分析物傳感器分子置于支持物上，則可以使用根據(jù)本發(fā)明的方法以并行處理樣品并且并行檢測一個或多個樣品中的眾多分析物。由于每個檢測點可能對應(yīng)于對某一分析物特異性的不同的分析物傳感器受體和分析物傳感器分子對，因此在這種檢測裝置已經(jīng)用樣品進(jìn)行培育并以上述方式進(jìn)行處理之后，源自這一檢測點的信號將指示樣品中是否存在分析物。
這樣，本發(fā)明的一個方面涉及使用檢測裝置可靠且特異性檢測樣品中的分析物，同時使用相對少量的十分昂貴的分析物傳感器受體分子和分析物傳感器分子。根據(jù)本發(fā)明，可以將這歸于分析物傳感器分子和分析物傳
感器受體分子的不同摩爾比和/或支持物表面積每一pm2上分析物傳感器分子和/或分析物傳感器受體分子前述特定的分子數(shù)目。根據(jù)支持物的型式，根據(jù)本發(fā)明的檢測裝置可以用于并行同步檢測多個樣品中的多個分析物。
在下文中，借鑒一些實驗示例來描述本發(fā)明。然而，這些示例決不意味著對本發(fā)明范圍的限制。相反通過列舉一些實驗示例來說明本發(fā)明。實驗
實驗h緣^^f包^^^"/^著佳爿歪力^e度
使用包括COOH基團(tuán)的BiodyneC膜。該膜具有如下尺寸近似lcm乘lcm。該膜在室溫下于水中用16%的EDAC預(yù)處理10分鐘。然后用水簡單地洗滌該膜。
隨后，該膜在室溫下用濃度范圍從0.001nM到10nM、標(biāo)記FITC的A蛋白包被一小時。使用未包被的Biodyne-C膜作為對照膜。
在用帶標(biāo)記的A蛋白對膜進(jìn)行涂布之后，該膜在室溫下于pH值7.4的PBS中用5%的BSA封閉30分鐘。為了從該膜中去除未結(jié)合的A蛋白，使用含有體積百分比為0.05%Tween-20的1XPBS，在室溫下洗滌所述膜3遍達(dá)5分鐘。使用帶有480/40nm激發(fā)濾光片和527/30nm發(fā)散濾光片的熒光顯微鏡來測量結(jié)合的標(biāo)記的A蛋白。
圖2中所示數(shù)據(jù)示出了用于對具有近似lcm乘lcm或者12.5cm乘5cm尺寸的膜進(jìn)行包被的A蛋白的最佳濃度被認(rèn)為在l)LiM處具有最大值。
實澄l錄定包J^4歪A游篪,未包,篪游拔沐碧^激力使用兩塊Biodyne-C膜，其中一塊包被A/G蛋白而另一塊未包被。
通過如上所述用按重量百分比為16%的EDAC對所述膜活化10分鐘，隨后在水中進(jìn)行洗滌來執(zhí)行用A/G蛋白進(jìn)行的包被。
隨后，在室溫下于pH值7.4的1XPBS中用lpM的A/G蛋白包被上述尺寸的膜1小時。另一塊膜用不含蛋白質(zhì)的緩沖液進(jìn)行假處理。
包被的膜隨后在室溫下于pH值7.4的1XPBS中用5X的BSA封閉30分鐘。然后將這一標(biāo)記Cy5的兔抗小鼠IgG以濃度范圍從10nM到500nM印刷到所述膜上。對于第二、對照膜(其沒有用A/G蛋白進(jìn)行包被)，在相同的濃度下使用抗體。
為了從所述膜中去除任何未結(jié)合的抗體，使用含有體積百分比為0.05%的Tween-20、 pH值為7.4的PBS，在室溫下洗滌所述膜3遍達(dá)5分鐘。
使用熒光測量來觀察抗體和A/G蛋白之間的相互作用并定量。
如從圖3中的數(shù)據(jù)可得到的，包被A/G蛋白的膜與未包被的膜相比在結(jié)合抗體方面具有更高的能力。
實凝3..緣定原f搭爿/G歪A連麥^/蘑游著絲五A4C濃度交聯(lián)劑EDAC是高活性分子，并能與蛋白質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)，從而潛在危害這些蛋白質(zhì)的構(gòu)象功能性。這樣，目的是盡可能地限制EDAC的濃度。
為此目的，在Biodyne-C膜上于室溫下溫育標(biāo)記FITC的A蛋白達(dá)1小時，并用按重量百分比從0%到16X的不同濃度的EDAC進(jìn)行活化。在與上述相同的條件下于水中施加EDAC。在溫育之后，所述膜在pH值為7.4的1 XPBS中用包括按重量百分比為5%酪蛋白的封閉緩沖液進(jìn)行封閉，并用pH值為7.4的PBS和按體積百分比為0.05%的Tween-20洗滌3遍達(dá)5分鐘。
從圖4中可以得到低到1%的EDAC量已經(jīng)能夠用于A/G蛋白與所述膜的有效偶合。
鄉(xiāng)(.爐7腐鋭鰣游糊
再次，如示例1和2所述在一步測定中使用Biodyne-C膜并用A/G蛋白連同兔抗羊抗體進(jìn)行包被。作為對照，相同類型的膜僅用兔抗羊抗體而不用A/G蛋白進(jìn)行包被。
隨后，兩塊膜在pH值為7.4的PBS中用5X的BSA和1^M生物素標(biāo)記的兔抗小鼠抗體封閉1小時。隨后，用pH值為7.4的PBS和按體積0.05%的Tween-20洗滌所述膜3遍達(dá)5分鐘。
然后用標(biāo)記Cy5的鏈親和素溫育包被了 A/G蛋白的膜和未包被的膜。如果標(biāo)記生物素的兔抗小鼠抗體確實可有效封閉包被了 A/G蛋白的膜，則包被了 A/G蛋白的膜應(yīng)當(dāng)比未包被的膜給出更強的信號。這在圖5中得到證實。
這樣，可以使用適當(dāng)濃度的抗體來封閉已經(jīng)加載有分析物傳感器分子(例如抗體)的包被了A/G蛋白的膜。
實驗5.'真勉娜成，遂一步淑
隨后，可測試是否其他成分同樣適于封閉包被了 A/G蛋白的膜。為此目的，在不同的條件下用不同的封閉緩沖液溫育不同的膜，如圖6中所見。在圖6中，用標(biāo)記Cy5的羊抗小鼠抗體溫育不同指示的膜。隨后，這些包被捕獲抗體的膜用包括pH值為7.4的PBS和指示用量的BSA或酪蛋白在4匸下處理一整夜、在室溫下處理1小時或在37匸下處理1小時。
圖6中的結(jié)果清晰地示出最佳封閉化合物和最佳封閉濃度取決于特定的膜。然而，通常發(fā)現(xiàn)兩種化合物均給出合適的結(jié)果，并且酪蛋白在這種情形中效果更佳。
鄉(xiāng)6.'鄉(xiāng)媳鄉(xiāng)蕩歡微拔沐,
包被整個膜伴隨的一個問題在于，將必須使用大量的A/G蛋白和相應(yīng)的封閉試劑。鑒于A/G蛋白的多化合價和結(jié)合模式，需要封閉更多結(jié)合位點。
在執(zhí)行用印刷溶液(例如，包括捕獲抗體的溶液)進(jìn)行包被過程之前，溫育A/G蛋白。該溶液然后用于對所述膜的印刷。
這樣，將作為捕獲抗體的10nM到800nM濃度的兔抗羊抗體連同150nM的A/G蛋白在pH值為7.4、具有5%甘油的1XPBS印刷溶液中印制到Biodyne-C膜上。
25所述膜然后在pH值為7.4的PBS中用5。^的酪蛋白、lpM的山羊Fc 尾在室溫下封閉l小時。隨后，用標(biāo)記Cy5的分析物羊抗小鼠抗體溫育捕 獲抗體/包被A/G蛋白的膜。通過作為分析物傳感器分子的兔抗羊抗體將該 抗體保留在所述膜上。室溫下1小時溫育之后，用pH值為7.4的PBS和按 體積0.05%的Tween-20在室溫下洗滌所述膜3遍達(dá)5分鐘。
然后將結(jié)果相對于保留在包被或未包被的膜上的標(biāo)記Cy5的羊抗小鼠 抗體進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。這一標(biāo)準(zhǔn)化執(zhí)行如下首先，用背景和激發(fā)強度校正所 測的強度。然后相對于來自已經(jīng)存在于所述膜上的標(biāo)記Cy5的抗體的校正 強度對結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。這是校正所述膜/A/G蛋白結(jié)合能力的方法。
圖7描述了分析物(為標(biāo)記Cy5的羊抗小鼠抗體)與分析物傳感器分 子(為兔抗羊抗體)結(jié)合效率的結(jié)果。人們可清晰地看到濃度在低于300nM 的兔抗羊抗體下，包被的膜相對于未包被的膜發(fā)現(xiàn)信號得到增強。
這一特殊效果開啟了在構(gòu)象狀態(tài)下以不同比率和少量蛋白質(zhì)，使用包 被Fc受體的膜將捕獲抗體保留在這種膜上，同時保留高檢測靈敏度的可能 性。
這樣，如果人們降低捕獲抗體的數(shù)目和用量以及用于Fc受體的包被溶 液濃度，則發(fā)現(xiàn)功能性抗體的數(shù)目得到增加，從而在包被抗體與分析物抗 體之間產(chǎn)生相對更強的信號。
當(dāng)然，這能夠使基于前述測定原理的檢測裝置以及檢測方法微型化。
2權(quán)利要求
1、一種檢測裝置，包括-至少一個支持物，-至少一個分析物傳感器受體分子，其位于所述至少一個支持物的至少一部分之上和/或之內(nèi)，以及-至少一個分析物傳感器分子，其與所述至少一個分析物傳感器受體分子相關(guān)聯(lián)，-其中，所述至少一個分析物傳感器和所述至少一個分析物傳感器受體分子的摩爾比介于近似2:1和近似1:10,000之間。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測裝置，其中，所述至少一個分析物傳感器和所述至少一個分析物受體分子的 摩爾比介于近似1.9:1和近似1:1000之間、介于近似1.8:1和近似1:750 之間、介于近似1.7:1和近似1:500之間、介于近似1.6:1和近似1:250之 間、介于近似1.5:1和近似1:150之間、介于近似1.4:1和近似1:125之間、 介于近似1.3:1和近似1:100之間、介于近似1.3 :1和近似1:90之間、介 于近似1.2:1和近似1:80之間、介于近似1.1:1和近似1:70之間、介于近 似1:1和近似1:60之間、介于近似1:1.1和近似1:50之間、介于近似1:1.2 和近似1:40之間、介于近似1:1.3和近似1:30之間、介于近似1.4:1和近 似1:20之間、介于近似1:1.5和近似1:15之間或者介于近似1:1.5和近似 1:10之間。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測裝置，其中，所述至少一個支持物表面積每一pm2上的所述分析物傳感器分 子的數(shù)目介于近似50和250,000之間、介于近似100和近似100,000之間、 介于近似150和近似75,000之間、介于近似200和近似50,000之間、介于 近似250和近似25,000之間、介于近似300和近似21,000之間、介于近似 350和近似18,000之間、介于近似400和近似15,000之間、介于近似450 和近似12，000之間、介于近似500和近似11,000之間、介于近似550和近似9000之間或者介于近似600和近似8000之間。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的檢測裝置，其中，所述至少一個支持物表面積每一pm2上的所述分析物傳感器受體分子的數(shù)目介于近似500和250,000之間、介于近似1000和近似100,000之間、介于近似1500和近似50,000之間、介于近似5000和近似25,000之間、介于近似6000和近似20，000之間、介于近似6500和近似16,000之間、介于近似7000和近似15,000之間、介于近似7500和近似13,000之間或者介于近似8000和近似12,000之間。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測裝置，其中，所述至少一個支持物是固體基質(zhì)，其優(yōu)選從包括含有聚合物材料、玻璃、陶瓷、凝膠、纖維材料、非織造物、金屬、濾紙、膜及其復(fù)合材料的多孔或非多孔材料的組中選擇。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測裝置，其中，膜優(yōu)選由尼龍、硝酸纖維素、PVDF、或聚醚砜制成。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測裝置，其中，所述至少一個分析物傳感器受體分子能夠結(jié)合到抗體的Fc部分。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測裝置，其中，所述分析物傳感器受體分子從包括金黃色葡萄球菌(&op/^/ococcws m^ews)的A蛋白、C株和G株鏈球菌的G蛋白、或重組A/G蛋白的組中進(jìn)行選擇。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測裝置，其中，所述至少一個分析物傳感器分子能夠借助于一個結(jié)合位點與所述至少一個分析物傳感器受體分子進(jìn)行特異性相互作用，而借助于第二結(jié)合位點與感興趣的分析物進(jìn)行特異性相互作用，并且與所述分析物的結(jié)合基本上不受相伴而來與所述分析物傳感器受體分子的結(jié)合的影響。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測裝置，其中，所述分析物傳感器分子優(yōu)選從包括蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)受體、酶、抗體、抗原、適體、配體和半抗原的組中進(jìn)行選擇。
11、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測裝置，其中，所述至少一個分析物傳感器受體分子借助于共價化學(xué)鍵合置于所述至少一個支持物上，所述基質(zhì)優(yōu)選提供至少一個將所述分析物傳感器受體分子偶合到所述基質(zhì)的化學(xué)官能團(tuán)，所述至少一個化學(xué)官能團(tuán)從包括羧基、酸酐、環(huán)氧化物、醛、酰肼、酰疊氮、芳香疊氮、重氮化合物、二苯甲酮、碳二亞胺、酰亞氨酯、異硫氰酸酯、NHS酯、CNBr、馬來酰亞胺、甲苯磺酸鹽、三氟代乙烷磺酰氯、馬來酸酐和羰基二咪唑的組中進(jìn)行選擇。
12、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測裝置，其中，所述檢測裝置用能夠減少和/或防止與所述至少一個支持物、與所述至少一個分析物傳感器受體分子和/或與所述至少一個分析物傳感器分子非特異性結(jié)合的溶液進(jìn)行處理。
13、 根據(jù)權(quán)利要求12所述的檢測裝置，其中，所述溶液為從包括BSA、 HAS、 FSA、酪蛋白、Fc尾或洗滌劑的組中選擇的化合物，所述洗滌劑包括TrtionX100、 TrtionX80、 Tween 80、Tween 20禾口NP-40。
14、 一種對至少一個樣品中的至少一個分析物進(jìn)行檢測的方法，包括如下步驟-提供至少一個根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測裝置，-用包括至少一個分析物的至少一個樣品接觸所述至少一個檢測裝置，-任選地用能夠去除結(jié)合或非特異性結(jié)合的樣品的溶液洗滌所述至少一個檢測裝置，-檢測所述至少一個分析物傳感器分子和所述至少一個樣品的至少一個分析物之間的特異性相互作用。
15、 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，用至少一個可檢測標(biāo)記物修飾所述至少一個樣品的所述至少一個分析物。
16、 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述至少一個可檢測標(biāo)記物從包括熒光團(tuán)、酶、染料、化學(xué)發(fā)光化合物、放射性同位素、金屬絡(luò)合物、磁性顆粒、生物素、半抗原、射頻發(fā)射物以及放射發(fā)光化合物的組中進(jìn)行選擇。
17、 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述方法可以用于臨床分析、新藥物的鑒定、血液分析、藥物發(fā)現(xiàn)、結(jié)構(gòu)功能性研究、法醫(yī)、環(huán)境樣品測試、化學(xué)品暴露、小分子文庫的測試、或者基于細(xì)胞的測定。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用固定在固相支持物上的最佳濃度的Fc受體-抗體絡(luò)合物，檢測樣品中分析物的裝置和方法。
文檔編號G01N33/543GK101460847SQ200780020204
公開日2009年6月17日 申請日期2007年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月2日
發(fā)明者C·普涅德拉, R·M·L·范利斯豪特 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司