專利名稱：血細胞分離的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)前診斷領域，特別是涉及從母體外周血中分離胎兒細 胞。具體而言，本發(fā)明涉及從母體外周血中分離胎兒細胞的方法以及用 于從母體外周血中分離胎兒血細胞的裝置。
背景技術：
現(xiàn)有的疾病產(chǎn)前診斷方法涉及侵入性技術。例如，這類技術包括羊 瞎H會蓉擊il太.^6瞎戰(zhàn)J.泡；ldH昧空擊il 曰箭在主扭巫'擊田；S i:f罷入脫
樣的物質進行數(shù)百萬例這類分析來檢測染色體異常(例如唐氏綜合征) 和其他遺傳病癥。僅在美國，每年就實施約200000例侵入性產(chǎn)前檢測操 作，例如羊膜腔穿刺術和絨膜絨毛取樣。這類測試通常是在年齡超過35 歲的婦女以及那些具有其他危險因子的婦女身上進行的，但是大多數(shù)具 有染色體或遺傳缺陷的孩子仍然是年齡在35歲以下的婦女生的。目前， 這些遺傳性障礙僅能利用在侵入性操作中獲得的物質來加以檢測。在英 格蘭和威爾士，過去十年間每年平均有約630000名嬰兒安全出生，但是 母親平均年齡已經(jīng)從1995年的28.5歲上升到2005年的29.5歲。胎兒攜 帶遺傳異常的可能性隨母親年齡的增長而急劇增加，并且預計該年齡還 將會繼續(xù)增加。侵入性產(chǎn)前診斷通常被認為對母親和胎兒有危險，所有 操作中有1-2%會導致胎兒的自發(fā)性流產(chǎn)。
已知需要為現(xiàn)有的疾病產(chǎn)前診斷方法提供非侵入性的替代方法。人 們希望非侵入性產(chǎn)前診斷技術將會消除或者降低上文所述的風險并且將 會使得常規(guī)的產(chǎn)前檢測得以擴展。使用分離的胎兒細胞的非侵入性產(chǎn)前 診斷還將會比羊膜腔穿刺術和絨膜絨毛取樣更加經(jīng)濟實用(即不需要手 術操作)。
已知孕婦的血漿中同時含有胎兒和母體的循環(huán)胞外DNA和RNA。 已知可以根據(jù)這些胎兒和母體DNA之間的大小差異來分離這兩類DNA， 使得胎兒物質得以富集(參見，例如EP-A-1524321 )。然而，由于游離的母體循環(huán)核酸DNA水平較高，目前循環(huán)胎兒核酸僅,皮用于檢測由父親遺 傳的等位基因。胎兒DNA，特別是多態(tài)型形式的胎盤編碼的種類，已經(jīng) 被用于產(chǎn)前唐氏綜合征診斷。
數(shù)十年前就已經(jīng)知道胎兒細胞存在于所有孕婦的外周血中。因此， 它們代表了 一種用于非侵入性產(chǎn)前診斷的重要的潛在靶標，因為這些胎 兒細胞中的大多數(shù)均是有核的。所述已經(jīng)在母體血液中鑒別出的胎兒細 胞類型包括成紅血細胞(有核的紅細胞)、'淋巴細胞、間質干細胞和胎盤 來源的營養(yǎng)細胞。如果這些細胞可以被分離至同質程度(即不含污染性 母體細胞)，則可以對所述分離的細胞進行遺傳檢測。這將會使得常規(guī)且 安全的非侵入性遺傳檢測成為可能，所述遺傳檢測用于例如非整倍體、 嚢性纖維化病、p地中海貧血和其他遺傳性單基因障礙的障礙。
然而，遺憾的是，用于利用諸如熒光原位雜交(FISH)、密度梯度/ 熒光激活細胞分選(FACS)和磁珠激活細胞分選(MACS)細胞分離技 術的方法使用來源自母體外周血的胎兒細胞評估所述非侵入性孕前診斷 的可;f于性的研究(例如,Hahn， S a/" Molecular Human Reproduction (1998) 4 515-521)沒有使用獨特的胎兒標記，而是使用了存在于某些母 體細胞上的細胞表面標記(例如，轉鐵蛋白受體CD71或血型糖蛋白A CD235a，參見例如WO96/09409 )。此外，已經(jīng)試圖使用固有的胎兒特異 性珠蛋白s和y來分離胎兒成紅血細胞，但是由于所述蛋白也會在成年細 胞(所謂的"F-細胞")中很少量地表達，且其利用會導致對所述胎兒細 胞的破壞，因此它們的利用受到了限制。目前，用于分離胎兒成紅血細 胞的技術方法利用例如血型糖蛋白A的標記，所述標記事實上同樣會在 母體和胎兒紅系細胞上表達(例如Al Mufti C /. (2004) Clin. Lab. Hematol. 26 123-128 )。
在文獻中，除了已知的關于所述s和Y珠蛋白和K血型抗原(其中i 為胎兒特異性的)的具體細節(jié)外，沒有關于胎兒和成人紅系細胞之間的 明顯生化差異的具體細節(jié)。
因此，需要提供真正的胎兒細胞特異性標記。
國際專利申請WO 2004/078999公開了一種使用胎兒細胞特異性標 記從母體外周血中分離胎兒細胞的方法。所述方法包括鑒別一種存在于 胎兒細胞DNA中但不存在于母體DNA中的編碼抗原的等位基因，使胎 兒細胞與一種可識別所述抗原的親和試劑結合并且利用所述親和試劑對細胞進行篩選。優(yōu)選的抗原為細胞表面蛋白，特別是人淋巴細胞抗原
(HLA)蛋白。然而，該方法存在許多缺點。例如，該系統(tǒng)需要確定所
述胎兒的父親的HLA類型(當考慮到可疑的譜系的情況時是眾所周知地
不可靠的)，并且該結果可能不是能夠清楚地重復的。
還需要用于培養(yǎng)分離自母體外周血的胎兒細胞的有效方法。
已知可使用物理分離技術從母體外周血中分離胎兒細胞，例如參見
WO00/060351,它涉及密度梯度離心。然而，現(xiàn)有的基于密度梯度的方
法可能會改變細胞的生理學特性(Hahn， S " Molecular Human
Reproduction (1998) 4 515-521 )。這可能會包括凋亡的發(fā)生，在一項最近
的研究(Babochkina， " Haematologica (2005) 90 740-745 )中在分離 自母體外周血的成紅血細胞的很大一部分中均可見到發(fā)生凋亡的標志
(通過核濃縮來判斷)?；蛘?，如WO 2004/076653中所公開的那樣，可 以利用密度梯度分離和抗體介導的篩選的組合來從宮頸管抽吸物中分離 胎兒細胞并且加以富集。
Hohmann等人(Fetal Diagn. Ther. (2001) 16 52-56 )評估了使用各 種抗體來檢測胎兒來源的細胞。
US-A-2006/0105353和Bianchi等人(Prenatal Diagnosis (1996) 16 289-298 )7>開了一種4吏用CD45抗體和CD71抗體分離胎兒細胞的方法， W094/25873^^開了一種4吏用CD45抗體的分離方法。
發(fā)明內容
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種從母體血液樣品(優(yōu)選 分離的)中分離胎兒細胞的方法，所述方法包括鑒別具有至少一種胎兒 標記(優(yōu)選l、 2、 3、 4或5種標記)的表達模式不同于所述標記在等價 母體細胞中的表達模式的細胞，并且篩選所鑒別的細胞，其特征在于所 述胎兒標記選自HSP-60(熱激蛋白60，GenBank登記號P10809)、單胺 氧化酶、谷氨酰胺合酶(登記號P15104)、 Ara-70 (雄激素受體相關蛋白70， 登記號Q13772)、 Ara-54(雄激素受體相關蛋白54，登記號Q9UBS8)、人 假定蛋白MGC10526 (登記號Q5JSZ7)或MGC10233 (登記號 NP—689928) 、 FLJ20202(HGNC FAM46C) 、 DCN-1蛋白(登記號 NM—020640)、 RAB5A(登記號P20339,也稱為HCC-IO、宮頸癌基因10蛋白)、HSP-7C (熱激同源71kDa蛋白，登記號P11142)、 EF1A1 (延伸 因子l-al，登記號P68104)、GRP78 (MkDa葡萄糖調節(jié)蛋白[前體GRP 78, 登記號P11021)、 MYL4 (肌球蛋白輕鏈多肽4肌球蛋白輕鏈1，登記號 P12829)、 DimJ同系物亞家族B成員14(登記號Q8TBM8)、粘著斑蛋白(登 記號P18206)、橋粒斑蛋白(登記號P15924)、 AMMECRl-樣蛋白(登記號 Q6DCA0)、胞外基質蛋白2前體蛋白(登記號094769)、非典型蛋白 Cxorf57 ( uncharacterised protein Cxorf57 )(登記號Q6NS14)、過氧化 物還原酶1 (登記號Q06830)、過氧化物還原酶2 (登記號P32119)。優(yōu)選 地，所述方法還包括將所鑒別的細胞從所述至少一種胎兒標記具有不同 表達模式的其他細胞中分離出來。
本說明書通篇中所使用的術語"不同表達模式，，是指一種標記在胎兒 細胞中的表達不同于該標記在等價母體細胞即在來自母親的相同細胞類 型(例如，紅系細胞如成紅血細胞)中的表達。所述標記表達的比較是 在來自母親和胎兒的對等細胞之間進行的，例如在胎兒成紅血細胞中的 表達模式與在母體成紅血細胞中的表達模式比較。
所述表達模式的差異可以是，例如所述標記在胎兒細胞而非等價母 體細胞中的特定細胞區(qū)室(例如到細胞膜)的定位；胎兒細胞的總蛋白 中某種標記蛋白的量與等價母體細胞的總蛋白中該標記蛋白的量相比增 加或減少；或者某種標記在胎兒細胞中表達而不在等價母體細胞中表達。 它可能還涉及某種特定生化途徑的活性的升高或降低，在所述生化途徑 中所述蛋白種類發(fā)揮重要作用。
在給定細胞中的表達模式可以通過標準分子生物學技術(例如本說 明書中所描述的那些分子生物學技術)來測量，例如通過確定細胞中 mRNA的量，或者通過測定存在于細胞或細胞區(qū)室(例如細胞表面膜) 中的給定蛋白的量。
本說明書通篇中所使用的術語"量增加，，是指目的細胞(例如胎兒來 源的紅系細胞)中表達的胎兒標記的量高于非目的細胞(即母體來源的 細胞)中表達的所述胎兒標記的量。優(yōu)選地，其中至少一種胎兒標記的 每一種的表達量均未增加的細胞(即與胎兒來源細胞相比，表達量非常 低的細胞)為母體細胞。
本說明書通篇中所使用的術語"量降低，，是指目的細胞(例如胎兒來 源的紅系細胞)中表達的胎兒標記的量低于非目的細胞(即母體來源的細胞)中表達的所述胎兒標記的量。優(yōu)選地，其中至少一種胎兒標記的 每一種的表達量均未降低的細胞(即與胎兒來源細胞相比，表達量非常 高的細胞)為母體細胞。這類生物標記——被發(fā)現(xiàn)與胎兒紅系細胞相比， 在成人(母體)紅系細胞上上調——允許從胎兒紅系細胞和母體紅系細 胞的混合物中清除母體細胞。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法包括鑒別在其細胞表面上 表達至少一種胎兒標記的細胞并且篩選那些細胞。所述胎兒標記可以是
HSP-60、 GRP78、 HSP-7C、 MYL4或EF1A1，并且優(yōu)選地為HSP-60。 優(yōu)選地，所述方法還包括將所鑒別的細胞從未在其細胞表面上表達所述 胎兒標記的細胞中分離出來。
所述熱激蛋白為高度保守的保護性(伴侶蛋白)蛋白家族，且已知 它們的表達受到下列因素的誘導應激例如熱激、與重金屬、有毒物質 例如乙醇接觸、與紫外線接觸、感染、饑餓、脫水和缺氧。具體而言， HSP-60的細胞表面表達是通過將所述蛋白從細胞的線粒體易位至質膜來 對所述細胞與缺氧環(huán)境(低氧環(huán)境，已知胎兒紅系細胞會與該環(huán)境接觸) 的接觸做出應答。當再氧合時HSP-60會減少，并且據(jù)報道HSP-60會在 人胎盤中表達。更加值得注意的是，已經(jīng)證明缺乏HSP-60的小鼠不能進 行胚胎發(fā)育，證明了該蛋白至少在這種物種的發(fā)育過程中的重要性。自 身HSP-60充當先天性免疫系統(tǒng)的危險信號，并且該蛋白到細胞(例如淋 巴細胞和單核細胞)膜上的易位與疾病或者與應激反應有關(Pfister (2005) J. Cell. Sci. 118 1587-1594; Lang C a/. (2005) J. Am. Soc. N印hrol. 16 383-391; Multhoff (2006) Handbook Exp. Pharmacol, 172 279-304; Romano C /. (2004) Int. Immunopharmacol. 4 1067-1073; Belles C (1999) Infect. Immun. 67 4191-4200 )。因此，該蛋白非常不可能出現(xiàn)在健 康個體(包括孕婦)的成熟成人紅細胞的表面上。
發(fā)明人已經(jīng)唯一地且吃驚地發(fā)現(xiàn)胎兒紅系細胞膜含有HSP-60，而在 成人紅細胞膜上完全沒有這種蛋白。在正常條件下，HSP-60定位到線粒 體，但是在細胞應激過程中易位到細胞表面。這類應激的一個實例為胎 兒紅系細胞在其中生存的缺氧環(huán)境。先前已經(jīng)提出大腸桿菌HSP-60的免 疫接種用于治療類風濕性關節(jié)炎(Bloemendal W "/. (1997) Clin. Exp. Immunol. 110 72-78; WO 2006/032216 )。
在進行所述分離過程之前，可以例如才艮據(jù)紅系標記(erythroidmarker)的表達，例如通過依次使用密度離心和MACS/FACS以及抗血 型糖蛋白A或抗-Rh相關血型糖蛋白(RhAG)，或者通過使用任何紅系 細胞特異性生物標記來從母體細胞中部分地純化胎兒細胞或其亞群。將 紅譜系細胞從母體外周血中預先富集出來會極大地提高胎兒細胞分離和 富集的效率，目的是達到同質。
或者，本發(fā)明的方法中使用的標記使得可以從母體成紅血細胞中分 離出胎兒成紅血細胞和母體非成紅血細胞的混合物。隨后，可以利用成 紅血細胞特異性標記(例如血型糖蛋白A ( GPA))將胎兒成紅血細胞從 該混合物中分離出來?；蛘?，根據(jù)存在一種已知的紅系標記和一種本發(fā) 明鑒別的標記來同時分離紅系細胞將會分離到純的胎兒成紅血細胞。
所選擇的胎兒細胞可以利用常規(guī)分離技術如免疫磁學(MACS )或其 他細胞分選方法例如FACS從母體外周血中分離或者富集?；蛘?，所選 擇的胎兒細胞可以利用物理粘合劑例如親和劑(抗體、適體或模擬肽) 來分離或富集。適合的親和劑包括但不限于抗體、親和體分子和結構域 抗體。所述親和劑可結合在與諸如珠子的表面上。優(yōu)選地，所述親和劑 為抗體。當所述胎兒特異性標記為HSP-60時，所述抗體優(yōu)選地為抗 HSP-60抗體或者可與HSP-60反應的適體。
在一個備選的或附加的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的方法包括鑒別表 達單胺氧化酶的細胞并且篩選這些細胞。出乎意料地，已經(jīng)確定這些胎 兒標記在胎兒細胞而非母體細胞中唯一地表達。優(yōu)選地，所述方法還包 括將所鑒別的細胞從不^^單胺氧化酶的細胞中分離出來。
在根據(jù)本發(fā)明這一方面的方法的另 一個優(yōu)選的實施方案中，鑒別了 這樣的細胞，即所述細胞在其細胞表面上表達HSP-60以及
量增加的至少一種其他胎兒標記，所述至少一種其他胎兒標記選自 單胺氧化酶、谷氨酰胺合酶、Ara-70、 Ara-54、人假定蛋MGC10526或 MGC10233、 FLJ20202、 DCN畫1蛋白、RAB5A、 HSP國7C、 EF1A1、 GRP78、 MYL4、 DnaJ同系物亞家族B成員14、粘著斑蛋白、橋粒斑蛋白、 AMMECRl-樣蛋白、非典型蛋白Cxorf57;或
量減少的至少一種其他胎兒標記，所述至少一種其他胎兒標記選自 胞外基質蛋白2前體蛋白、過氧化物還原酶l、過氧化物還原酶2。
對于所有標記來說，對各種標記的表達的鑒別或者表達增加或減少 的鑒別可以是同時的。在根據(jù)本發(fā)明這一方面的方法的一個附加的或備選的優(yōu)選實施方案
中，鑒別了這樣的細胞，即所述細胞表達單胺氧化酶并且
量增加的至少一種其他胎兒標記，所述至少一種其他胎兒標記選自
HSP-60、谷氨酰胺合酶、Ara-70、 Ara-54、人假定蛋MGC10526或
MGC10233、 FLJ20202、 DCN-1蛋白、RAB5A、 HSP-7C、 EF1A1、 GRP78、
MYL4、 DnaJ同系物亞家族B成員14、粘著斑蛋白、橋粒斑蛋白、
AMMECRl-樣蛋白、非典型蛋白Cxorf57;或
量減少的至少一種其他胎兒標記，所述至少一種其他胎兒標記選自
胞外基質蛋白2前體蛋白、過氧化物還原酶l、過氧化物還原酶2。
對于所有標記來說，對各種標記的表達的鑒別或者表達增加或減少
的鑒別可以是同時的。
或者，在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案中，在所述方法中會使用 兩種或多種胎兒標記的任一組合，所述兩種或多種標記的每一種均選自 HSP-60、單胺氧化酶、谷氨酰胺合酶、Ara-70、 Ara-54、人假定蛋 MGC10526或MGC10233、 FLJ20202、 DCN國1蛋白、RAB5A、 HSP國7C、 EF1A1、 GRP78、 MYL4、 DnaJ同系物亞家族B成員14、粘著斑蛋白、 橋粒斑蛋白、AMMECRl-樣蛋白、胞外基質蛋白2前體蛋白。優(yōu)選地， 至少一種所述胎兒標記為HSP-60或單胺氧化酶。所述標記可以同時4吏用 或單獨使用。
因此，可以使用第一胎兒標記對所述胎兒細胞進行最初分離，然后 再根據(jù)另一種胎兒標記對其進行進一步的分離或富集。所述第一標記可 以是一種標記物，例如一種蛋白，其在胎兒細胞表面上表達而不在母體 細胞表面上表達，例如HSP-60;或者其在胎兒細胞中表達而不在母體細 胞中表達，例如單胺氧化酶。優(yōu)選地，所述第一標記為位于細胞表面上 的標記，例如HSP-60。所述另一種胎兒標記可以是例如酶(例如單胺氧 化酶)的表達。
因此，本發(fā)明的方法中所用的這些標記可以被方便地用于使用對胎 兒非侵入的操作從母體細胞中分離胎兒細胞，先將所述母體血液從母體 中分離出來，再對所述胎兒細胞進行任何處理。然后，所述胎兒細胞可 以被用于檢測胎兒體內可能的疾病(例如唐氏綜合征和其他非整倍體、 脊柱裂、嚢性纖維化病、p地中海貧血和其他遺傳性病癥)，所述細胞最 終均來源于所述胎兒。
13當所述標記是可以將所提供的底物轉化為可檢測產(chǎn)物的酶時，優(yōu)選 地可以采用熒光標記/探針以使得只在所述胎兒細胞中產(chǎn)生的底物代謝產(chǎn) 物可見。這種技術將使得可以在胎兒和母體血細胞的分離中使用基于
FACS的方法。
優(yōu)選地，所述胎兒標記或其他胎兒標記為單胺氧化酶，更優(yōu)選MAOA (登記號NP—000231)或MAOB ( AAB27229 )。這些酶都催化生物活性 胺(例如血清素、腎上腺素和去曱腎上腺素)的氧化脫氨反應，并且因 此可以用于保護所述胎兒防止這些生物活性胺由母體循環(huán)系統(tǒng)進入胎盤。
在一個備選的優(yōu)選實施方案中，所述胎兒標記或其他胎兒標記為谷 氨酰胺合酶(也被稱為谷氨酸氨連接酶)。該酶通過結合氨和谷氨酸來催 化產(chǎn)生具有生物活性的氨基酸谷氨酰胺。
在另一個備選的優(yōu)選實施方案中，所述胎兒標記或其他胎兒標記為 Ara-70 (也被稱為核輔激活因子4)。該蛋白屬于核輔激活因子轉錄因子 家族，所述家族基本上會參與調節(jié)特定基因的表達。
在一個附加的備選的優(yōu)選實施方案中，所述胎兒標記或其他胎兒標 記為Ara-54 (也^皮稱為RNF14 )。值得注意的是，同ARA-70 —樣，這 是另 一種與轉錄輔激活因子相關的雄激素受體。
在另一個備選的優(yōu)選實施方案中，所述胎兒標記或其他胎兒標記為 人假定蛋MGC10526或MGC10233、 FLJ20202、 DCN國1蛋白、RAB5A、 HSP-7C (也被稱為熱激70 kDa蛋白8)、 EF1A1 (也被稱為EF-1 a國l、 延伸因子1A-1、 eEFlA-l、延伸因子Tu和EF-Tu)、 GRP78 (也被稱為 免疫球蛋白重鏈結合蛋白、BiP、內質網(wǎng)腔Ca"結合蛋白grp 78 )、 MYL4 (也被稱為肌球蛋白輕鏈堿GT-1同種型)、DnaJ同系物亞家族B成員 14、粘著斑蛋白、橋粒斑蛋白、AMMECRl-樣蛋白、胞外基質蛋白2前 體蛋白、非典型蛋白Cxorf57、過氧化物還原酶1或過氧化物還原酶2。
本發(fā)明的方法還可以會包括將樣品中所選擇的胎兒細胞從非等價母 體細胞中分離出來的步驟，該步驟包括鑒別具有至少一種非胎兒標記的 表達模式不同于所述標記在非等價母體細胞中的表達模式的細胞，并且 將所述樣品中所鑒別的細胞從其他細胞中分離出來。在所選擇的胎兒細 胞為成紅血細胞或其他紅系細胞的情況下，這種非胎兒標記可以是紅系 特異性標記，例如血型糖蛋白A、 B、 C或D、 Rh蛋白、Rh相關蛋白、Kell糖蛋白。優(yōu)選地，所述標記為血型糖蛋白A。
所述母體血液的分離樣品適合于被輸回到受試者體內，所述母體血 液的樣品獲取自該受試者。例如，所述樣品可以是管線系統(tǒng)(line system) 的一部分，籍此可以將血液從母親身上移出然后再輸回，例如在血漿分 離置換(aphaeresis)過程中。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)胎兒細胞的方法， 所述方法包括富集具有至少一種胎兒標記的表達模式不同于所述標記在 等價母體細胞中的表達模式的細胞，所述至少一種胎兒標記選自
HSP-60、單胺氧化酶、谷氨酰胺合酶、Ara-70、 Ara-54、人假定蛋 MGC10526或MGC10233、 FLJ20202、 DCN畫1蛋白、RAB5A、 HSP-7C、 EF1A1、 GRP78、 MYL4、 DnaJ同系物亞家族B成員14、粘著斑蛋白、 橋粒斑蛋白、AMMECRl-樣蛋白、胞外基質蛋白2前體蛋白、非典型蛋 白Cxorf57、過氧化物還原酶l、過氧化物還原酶2。
優(yōu)選地，所述待培養(yǎng)的胎兒細胞已經(jīng)使用一種包括根據(jù)本發(fā)明的第 一方面的方法的方法分離出來。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供了一種含有被分離細胞的細胞 樣品，所述被分離細胞利用 一種包括根據(jù)本發(fā)明的第一方面的方法的方 法可獲得或已獲得的。優(yōu)選地，所述細胞樣品含有利用一種根據(jù)本發(fā)明 的第二方面的方法培養(yǎng)的細胞。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的第一或第二方面的方法的細胞和才艮據(jù)本發(fā)明 的第三方面的樣品為紅系細胞，例如成紅血細胞。優(yōu)選地，i人為胎兒成 紅血細胞存在于母體循環(huán)系統(tǒng)中的濃度為一個胎兒細胞/1 x 106-1 x 107個 母體有核細胞?？紤]到了其他存在于母體血中的胎兒細胞類型，例如淋 巴細胞、間質干細胞和胎盤來源的營養(yǎng)細胞，但是特別優(yōu)選成紅血細胞， 因為胎兒(Y染色體攜帶的)淋巴細胞會持續(xù)存在數(shù)十年，包括在以后 的妊娠中。此外，營養(yǎng)細胞表現(xiàn)出染色體嵌合性，并且由于其較大的體 積而會在母體的肺被快速捕獲。成紅血細胞會按照紅系路徑發(fā)育，并且 不可能會持續(xù)存在于以后的妊娠中。它們以相對高的豐度存在于母體循 環(huán)中。因此，它們是適合用于產(chǎn)前診斷的細胞，因為母體血液中存在的 任何胎兒紅系細胞均來源自現(xiàn)在的胎兒。
根據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供了一種胎兒細胞分離試劑盒， 包括用于檢測一種細胞所具有的至少一種胎兒標記的表達模式是否不同于所述標記在等價母體細胞中的表達模式的工具，以及用于將具有所述 至少一種胎兒標記的不同表達模式的細胞從不具有所述至少一種胎兒標 記的不同表達模式的細胞中分離出來的工具，其特征在于所述胎兒標記
選自HSP-60、單胺氧化酶、谷氨酰胺合酶、Ara-70、 Ara-54、人假定 蛋MGC10526或MGC10233、FLJ20202、DCN-1蛋白、RAB5A、HSP-7C、 EF1A1、 GRP78、 MYL4、 DnaJ同系物亞家族B成員14、粘著斑蛋白、 橋粒斑蛋白、AMMECRl-樣蛋白、胞外基質蛋白2前體蛋白、非典型蛋 白Cxorf57、過氧化物還原酶l、過氧化物還原酶2。
根據(jù)本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)前疾病診斷方法，所 述方法包括利用 一種包括根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法的方法獲得分離的 胎兒細胞的步驟。
優(yōu)選地，所述方法還包括確定所述分離的胎兒細胞是否含有疾病標 識的步驟。例如，對于唐氏綜合征的情況，這可以通過在胎兒細胞中存 在一份額外的21號染色體的拷貝來指示。許多其他疾病的診斷使得對特 定基因的已知突變的遺傳分析成為必需。例如，在嚢性纖維化病診斷中， 可以檢測CTiF7 基因的已知突變(例如突變AF508)，所述突變?yōu)樾∑?缺失、大片段缺失或單個核苷酸交換。可以對提取自所述分離的胎兒細 胞的DNA進行這類分析，所述DNA是使用用于從單個或少量細胞中提 取DNA的手動或自動化操作分離的，這些操作是技術人員所公知的。所 提取DNA的擴增可以使用被稱為低拷貝數(shù)分析的通用擴增方案，例如鑒 證申請中所使用的那些擴增方案，也可以不使用。
根據(jù)本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提供了一種從母體血液中分離胎兒 細胞的方法，所述方法包括鑒別具有至少一種胎兒標記的表達方式不同 于其在等價母體細胞中的表達模式的細胞，并且篩選所鑒別的細胞，其 特征在于所述胎兒標記選自HSP-60、單胺氧化酶、谷氨酰胺合酶、 Ara畫70、 Ara隱54、人假定蛋MGC10526或MGC10233、 FLJ20202、 DCN國1 蛋白、RAB5A、 HSP-7C、 EF1A1、 GRP78、 MYL4、 DnaJ同系物亞家 族B成員14、粘著斑蛋白、橋粒斑蛋白、AMMECRl-樣蛋白、胞外基 質蛋白2前體蛋白、非典型蛋白Cxorf57、過氧化物還原酶l、過氧化物 還原酶2。
所述方法還可以包括將樣品中所選擇的胎兒細胞從非等價母體細胞 中分離出來的步驟，該步驟包括鑒別具有至少一種非胎兒標記的表達模式不同于所述標記在非等價母體細胞中的表達模式的細胞，并且將所述 樣品中所鑒別的細胞從其他細胞中分離出來。在所選擇的胎兒細胞為成 紅血細胞的情況下，這種非胎兒標記可以是紅系特異性標記，例如血型
糖蛋白A、 B、 C或D、 Rh蛋白、Rh相關蛋白、Kell糖蛋白。優(yōu)選地， 所述標記為血型糖蛋白A。
根據(jù)本發(fā)明的第七方面，本發(fā)明提供了用于根據(jù)本發(fā)明的第一或第 六方面的方法的裝置，所述裝置包括用于檢測一種細胞所具有的至少一 種胎兒標記的表達模式是否不同于其在母體細胞中的表達模式的工具， 以及用于將具有所述至少 一種胎兒標記的不同表達模式的細胞從不具有 所述至少一種胎兒標記的不同表達模式的細胞中分離出來的工具，其特 征在于所述胎兒標記選自HSP-60、單胺氧化酶、谷氨酰胺合酶、Ara-70、 Ara-54、人假定蛋MGC10526或MGC10233、 FLJ20202、 DCN畫1蛋白、 RAB5A、 HSP畫7C、 EF1A1、 GRP78、 MYL4、 DnaJ同系物亞家族B成 員14、粘著斑蛋白、橋粒斑蛋白、AMMECRl-樣蛋白、胞外基質蛋白2 前體蛋白、非典型蛋白Cxorf57、過氧化物還原酶l、過氧化物還原酶2。 當檢測到在其細胞表面膜上表達至少一種胎兒標記的細胞并且將該細胞 從未在表面膜上表達該標記的細胞中分離出來時，所述用于檢測細胞是 否表達所述標記的工具和/或用于分離表達所述標記的細胞的工具可采取 包括親和分離材料的栽體的形式。例如，當所述胎兒標記為HSP-60時， 所述親和分離材料可以是抗HSP-60抗體或適體。
根據(jù)本發(fā)明的第八方面，本發(fā)明提供了一種確定細胞是胎兒細胞的 方法，所述方法包括在所述細胞中(即在所述細胞中或所述細胞的表面 上)檢測至少一種胎兒標記，所述胎兒標記具有與其在等價母體細胞中 的表達模式不同的表達模式，其特征在于所述胎兒標記選自HSP-60、 單胺氧化酶、谷氨酰胺合酶、Ara-70、 Ara-54、人假定蛋MGC10526或 MGC10233、 FLJ20202、 DCN畫1蛋白、RAB5A、 HSP畫7C、 EF1A1、 GRP78、 MYL4、 DnaJ同系物亞家族B成員14、粘著斑蛋白、橋粒斑蛋白、 AMMECRl-樣蛋白、胞外基質蛋白2前體蛋白、非典型蛋白Cxorf57、 過氧化物還原酶l、過氧化物還原酶2。因此，所述方法可被用于確i人細 胞是胎兒細胞，例如作為細胞分離^^支術中的陽性對照的一部分。
現(xiàn)在，將僅利用實施例并且參照附圖1-13來描述選擇和分離胎兒細 胞的方法，其中
圖1示出了用于鑒別紅系細胞的胎兒標記的二維電泳方法的結果類 型的圖示。
圖2示出了其他二維電泳實驗的代表性結果。圖2A示出了使用成人 紅細胞膜進行的實驗的結果。圖2B示出了使用胎兒紅系細胞膜(22周) 進行的實驗的結果。圖2C示出了使用胎兒紅系細胞膜(26周)進行的 實驗的結果。
圖3示出了圖2中所述的二維電泳實驗的結果，其中在所述胎兒凝 膠中突出標識了熱激蛋白60的位置。圖3A對應于圖2A;圖3B對應于 圖2B;并且圖3C對應于圖2C;
圖4示出了 DIGE實驗的結果。圖4A示出了使用成人細胞和胎兒細 胞(妊娠26周)進行的實驗的結果，其中圏出了熱激蛋白60胎兒特異 性蛋白。圖4B示出了使用成人細胞和胎兒細胞(妊娠22周)進行的實 驗的結果，其中再次圈出了熱激蛋白60胎兒特異性蛋白。
圖5示出了上述每張凝膠的DeCyder軟件分析的分析屏幕圖像。圖 5A的屏幕圖像代表了成人和胎兒(妊娠22周)樣品之間的熱激蛋白60 點分析。圖5B的屏幕圖像代表了成人和胎兒(妊娠26周)樣品之間的 熱激蛋白60點分析；
圖6示出了成人和胎兒紅系細胞膜的蛋白質印跡分析的結果。圖6A
示出了來自臍穿刺樣品(26周)和6名具有不同恒河猴(Rh)表型的成
人的蛋白的印跡；圖6B示出了來源自臍穿刺樣品(22周)和6名隨機的
成人供血者的蛋白的印跡；圖6C示出了來源自臍穿刺(26周)、臍帶(39
周)、母體(15周)、母體(15周)、隨機成人的蛋白的印跡；圖6D示出
了來源自臍帶(39周，足孕)、隨機成人、臍穿刺(22周)、5名隨機成
人供體的蛋白的印跡；圖6E示出了一種持家基因-G3PDH的印跡，
用于作為陽性對照印跡所有相同的樣品以及用于相同蛋白上樣濃度的對 昭.
J"、 9
圖7示出了分離自成人外周血樣品的血型糖蛋白A和熱激蛋白60標 記的單核細胞的流式細胞術分析；圖8示出了分離自胎兒臍帶血樣品的血型糖蛋白A和熱激蛋白60標 記的單核細胞的流式細胞術分析；
圖9示出了獲取自成人外周血的經(jīng)標記的單核細胞的流式細胞術散 點圖，示出了成紅血細胞(GPA+)和HSP-60+單核細胞的表達鐠；
圖10示出了獲取自胎兒臍帶血的經(jīng)標記的單核細胞的流式細胞儀散 點圖，示出了成紅血細胞(GPA+)和HSP-60+單核細胞的表達鐠；
圖11示出了胎盤、胎兒成紅血細胞和成人成紅血細胞中MAOA和 MAOB的實時PCR分析的結果。圖IIA示出了 MAOA相關實驗的結果； 圖IIB示出了 MAOB相關實驗的結果；
圖12示出了圖2中的三張2D凝膠的PDQuest分析，用圓圏示出了 與母體細胞相比在胎兒細胞中上調并且利用MALDI-TOF分析鑒別的蛋 白的位置；并且
圖13示出了分離自胎兒和成人的經(jīng)培養(yǎng)的成紅血細胞的質膜蛋白的 2D電泳比較的結果，突出標識了被鑒別為與成人細胞相比在胎兒細胞中 具有不同表達模式的蛋白。
實施例
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通過比較胎兒紅系細胞膜和成人紅細胞膜表達的蛋白，將HSP-60鑒 別為胎兒紅系細胞表面特異性的。
具體地，使用制備并且貯藏在-80。C下的紅細胞血影膜。在優(yōu)化膜溶 解方案后，發(fā)現(xiàn)濃度分別為0.4%和1.2%的去污劑ASB-14和CHAPS的 混合物可產(chǎn)生最佳結果。在每個二維電泳實驗中均使用25jig溶解的膜。 通過使用固定的pH梯度來實現(xiàn)聚焦，并且通過將兩性電解質(具有各種 pl值的兩性物質的混合物)加入到所述樣品的上樣緩沖液中來加以增強。 將蛋白上樣到陽極上，并且在膠條上施加電流。當所述蛋白移向陰極時， 它們被固定在其凈電為零的位置處，即它們的等電點。然后將該膠條置 于預制SDS凝膠頂部的預先形成的孔中。然后按照基礎SDS-PAGE方案 進行，使得可以根據(jù)分子量來分離蛋白，如圖1的格式中舉例所示。將 凝膠用SyproRuby染色并且用Typhoon成像器掃描，結果在圖2中描述。 對圖2A、 2B和2C的比較示出了在所述三種細胞樣品中每一種的蛋白質組之間的相似性和差異。
使用設計用于比較二維凝膠圖像并且確定蛋白表達差異的PDQuest 軟件(Bio-Rad)進行凝膠分析。通過準確地記錄用于凝膠比對的標記蛋 白，該軟件可根據(jù)蛋白染色的強度來確定蛋白的上調或下調。對圖2中 所示的三張凝膠圖像的PDQuest分析突出標識了所有三張凝膠中的上調 和下調蛋白，但是更重要的是，發(fā)現(xiàn)了存在兩張?zhí)耗z但不存在于所 述成人凝膠中的單種蛋白。在用考馬斯亮藍襯染后，將蛋白點從每張凝 膠上切下來并且進行MALDI分析。通過MALDI-TOF分析將同時存在 于胎兒凝膠和成人凝膠中的單種蛋白鑒別為HSP-60。圖3中突出標識了 HSP-60在所述胎兒凝膠圖像中的位置?？梢钥闯觯趫D3A中所示的來 自成人膜的蛋白的凝膠中沒有HSP-60。
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為了確認HSP-60作為胎兒紅系細胞表面特異性標記的潛力，對上述 樣品進行差異凝膠電泳(DIGE)分析。在進行二維電泳前，DIGE利用 熒光染料來標記蛋白樣品并且允許最多達三種樣品在單獨一塊凝膠上同 時分離和顯影。通常使用染料Cy2、 Cy3和Cy5，每一種均具有不同的激 發(fā)波長，從而使得可以對同一張凝膠進行三次不同的掃描，每張圖像對 應于每種蛋白樣品。然后可以使用圖像分析軟件例如DeCyder (Amersham)將所述圖像合并并且確定它們之間的差異。由于可確認每 種染料均對蛋白濃度中的變化有線性應答，所以該技術是定量的?？梢?采用互染(reciprocal dying )來確保所述標記沒有偏差。如圖4中所示， 將來自R1R1細胞的成人細胞樣品與每種胎兒樣品一起電泳。如該圖中 所突出標識的，再次證明HSP-60為胎兒細胞表面特異性的。
在對所述三張凝膠進行比較的過程中，DeCyder軟件突出標識了所 有三種樣品中許多上調和下調的蛋白。對每張凝膠單獨進行了分析，即 確定成人胎兒凝膠之間的差異，然后將所述兩張凝膠彼此進行比較(也 結合了所述兩種胎兒樣品之間的差異)。再次突出標識了代表HSP-60的 點，因為其存在于兩種胎兒樣品中但不存在于成人樣品中。圖5中示出 了對每張凝膠中HSP-60的軟件分析屏幕。具體地，通過比較圖5A和5B, 可以看出HSP僅存在于胎兒樣品的膜中(這些圖中的右側3-D圖像)。對^乂斧崖乂乙iz:系勿^處迷存蛋冷^伊遂為、浙4確定^44'不^4 ,做勤60
如上文所述，利用兩種技術已經(jīng)確認了 HSP-60僅存在于胎兒紅系細 胞膜中但不存在于成人紅系細胞膜中，從BD Biosciences購買抗HSP-60 抗體以對大量樣品中的該蛋白進行蛋白質印跡分析。成熟成紅血細胞分 離自成人供血者或各個妊娠階段的胎兒紅系細胞。然后對紅系細胞進行 低滲裂解以產(chǎn)生純化的膜(或"血影膜")，然后使用抗HSP-60對其進行 SDS-PAGE和蛋白質印跡分析。紅系細胞膜分離自各種來源，包括隨機 的成人、26周胎兒、39周胎兒(即臍帶血)和母體成人成紅血細胞膜(妊 娠15周)。圖6圖解說明了抗HSP-60與來源自6名成人供血者完全缺乏 反應性，并且確認了該蛋白的胎兒特異性。重要的是，HSP-60似乎在臍 帶樣品(足孕)中以低得多的水平表達，提供了進一步的證據(jù)證明HSP-60 的表面表達為胎兒特異性的。在39周時，紅系細胞從胎兒細胞轉變?yōu)樾?生兒細胞并且所述細胞不存在于低氧環(huán)境中。
已經(jīng)使用熒光蛋白標記技術證明，將CD34+干細胞從臍帶血中分離 出來之后所產(chǎn)生的胎兒成紅血細胞的細胞表面表達HSP-60 (數(shù)據(jù)未示 出)。來自成人的等價細胞證明了所述蛋白的胞內定位。
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上文所概括的研究明確地證明了膜定位HSP-60是胎兒成紅血細胞 特異性的，但不是成人成紅血細胞特異性的。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)膜定位 HSP-60在成人單核細胞例如白細胞中占非常高的比例(5-26% )(參見圖 7和圖9的B圖)。因此，發(fā)明人開發(fā)了一種從母體血液樣品中富集或純 化胎兒成紅血細胞的方法，所述方法根據(jù)成人單核HSP-60+級分不表達 紅系特異性標記血型糖蛋白A (CD235a)這一事實將它們消除。在成人 樣品中基本上不存在雙陽性GPA和HSP-60+細胞(參見圖7和9 ),但是 在胎兒臍帶樣品中存在較小但顯著比例的胎兒單核細胞(即成紅血細胞) 為HSP-60和GPA雙陽性的(圖8和10)。這些雙標記的細胞為用于非 侵入性產(chǎn)前診斷的特異性靶細胞類型。
成人血沉棕黃層樣品和臍帶血(39周足孕胎兒)樣品均是按照下述方案處理的
1) 將30 ml每種樣品加入到Sigma Accuspin histopaque柱中并且在 18-26 CC以1000 g離心15分鐘。
2) 去除血漿層并且將單核細胞層轉移到50 ml falcon離心管中。
3) 將細胞用25 ml PBS清洗并且通過在18-26 °C以2000 rpm離心10 分鐘來加以沉淀。
4) 將細胞沉淀以25 ml紅細胞裂解緩沖液(150 mM氯化銨、130 EDTA、 10 mM重碳酸鉀)重懸并且置于震蕩器上以便于在室溫下恒定 混合10分鐘。
5) 通過以2000 rpm離心10分鐘來沉淀細胞。
6) 將細胞重懸于1 ml PBS中并且使用光學顯微鏡和血細胞計數(shù)器來 進行細胞計數(shù)。
7) 將每個樣品的1 x 106個細胞加入到10 jil PE綴合的抗CD235a (GPA )和10 pi FITC綴合的抗HSP-60單克隆抗體中，終體積為100 pl。
8) 然后將標記反應物在水箱中放置30分鐘。
9) 通過用臺式離心機將所述細胞以3000 rpm離心沉淀5分鐘并且移 除上清液來洗去未結合的抗體。
10) 將細胞用2 ml PBS清洗兩次。
11) 最終將細胞重懸于500 pi PBS中并且用FACS機器加以分析。
FL1-H通道=FITC FL2-H通道=PE
陰性對照
1) 未標記細胞
2) 同種型對照-小鼠IgG 1 FITC+小鼠IgG 1 RPE 抗體
FITC-綴合的抗Hsp60 (同種型小鼠IgG 1)
RPE-綴合的抗CD235a (血型糖蛋白A)(同種型小鼠IgGl)
圖7示出了三種不同的成人樣品，并且圖8示出了三種不同的胎兒樣品，以及它們的這兩種標記的表達百分數(shù)(門內的)。成人的雙標記(即
具有顯著水平的GPA和HSP-60)細胞表現(xiàn)出與陰性同種型對照樣品類 似的模式。成人外周血中非紅系單核細胞上有顯著水平的HSP-60表達， 范圍在5.12-26.72%。與陰性同種型對照樣品相比，胎兒雙標記細胞表現(xiàn) 出顯著高水平的表達。這與循環(huán)的成紅血細胞在胎兒血中的已知較高比 例一致。
圖9中，攜帶GPA的細胞的表ii^溪式在FL2通道中分析，而攜帶 HSP-60的細胞的表達模式在FL1通道中表達。在圖C和D的左上的四 分之一部分中可以見到成人成紅血細胞。在圖10中，攜帶GPA的細胞 的表達模式也在FL2通道中分析，而攜帶HSP-60的細胞的表達模式在 FL1通道中表達。在該圖中，在圖C和D的左上和右上的四分之一部分 中可以見到胎兒成紅血細胞。大量胎兒成紅血細胞(如通過它們表達GPA 來定義的)沒有表達HSP-60 (參見，左上側的四分之一部分)。這與妊 娠過程中HSP-60在胎兒紅系細胞上的強表達一致，但是表達水平在胎兒 臍帶紅系細胞膜上變小(圖6)。
與臍帶血相比，在妊娠過程中HSP-60在紅系細胞上的表達非常強 (本文中通過流式細胞術分析)，這一發(fā)現(xiàn)表明雙標記方法為一種從母體 血液中分離胎兒成紅血細胞的手段。因此，使用采用血型糖蛋白A和 HSP-60作為配體的細胞分離方案(磁激活細胞分選MACS或流式激活 細胞分選FACS)使得可富集或純化胎兒成紅血細胞。然后，這些細胞可 以被用在下游診斷測定中，以進一步開發(fā)使用胎兒細胞作為胎兒材料來 源的非侵入性產(chǎn)前診斷。
紅系細胞表面或胞質上的任何紅系特異性的表面標記(糖抗原或紅 系蛋白)(例如，Rh蛋白、Rh相關糖蛋白、血型糖蛋白B、 C或D; Kell 糖蛋白)均可以替代供選擇的與HSP-60偶聯(lián)的標記。
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已經(jīng)鑒別出編碼酶MAOA和MAOB的基因在胎兒成紅血細胞中上 調。然后，通過對成人骨髓和胎兒臍帶cDNA的定量實時PCR分析確認 了所述酶是胎兒特異性的。
通過使用MAOA-和MAOB-特異引物，擴增來源自血型糖蛋白A+成紅血細胞cDNA,并且使用SYBR綠色染料對其進行檢測。圖11中所 示的結果清楚地表明，MAOA和MAOB mRNA均在分離自胎兒臍帶的 成紅血細胞中表達，但不在成人來源的成紅血細胞中表達。包括了陽性 對照(胎盤cDNA)，已知其會表達高水平的MAOA和MAOB。標準化 對照甘油醛-3-磷酸氫化酶(G3PDH)在三種樣品中的表達均沒有差異。
這些酶在胎兒細胞中的表達可以產(chǎn)生一種選擇或富集胎兒細胞的方 法，所述方法與上文所述的針對胎兒細胞表面標記HSP-60的方法不同但 潛在一致?？梢允褂眠x擇性培養(yǎng)，所述培養(yǎng)利用被胎兒細胞中的這些酶 以不同方式代謝的良好表征的底物，例如血清素、腎上腺素和去曱腎上 腺素。MAOA選擇性地氧化血清素和腎上腺素；MAOB選擇性地氧化苯 乙胺、苯曱胺和酪胺；兩種單胺氧化酶均氧化多巴胺?；蛘?，可以采用 熒光標記/探針以使得僅在胎兒細胞中產(chǎn)生的底物代謝產(chǎn)物可見。這些底 物將被胎兒細胞中的單胺氧化酶轉化為熒光產(chǎn)物。這些探針最近已經(jīng)在 文獻中有所描述(Chen " (2005) J. Am. Chem. Soc. 127 4544-4545 )。 該技術將使得可以在分離胎兒細胞和母體細胞時采用基于FACS的方法， 籍此可以從母體成紅血細胞中分離出表達單胺氧化酶并且產(chǎn)生熒光底物 的胎兒成紅血細胞，達致同質。
與孝謬^^^^^^y^X勿^ *2錄^##標記^#身 圖2中所示的三張凝膠圖像的PDQuest分析在圖12中示出。幾種蛋 白被鑒別為在胎兒膜中的表達遠高于在母體膜中的表達。除上文所討論 的HSP誦60夕卜，其他的蛋白被鑒別為GRP78、 HSP-7C、 MYL4和EF1A1 (圏出的)。
^入和應X的經(jīng)潛祟^^iz:j6勿龍^^糜蛋冷^浙 最早的造血祖細胞具有細胞表面標記CD34。該標記被用于分離干細 胞，并且通過與特定細胞因子混合物接觸，所述細胞分化至紅系譜系。
臍帶血或成人外周血血沉棕黃層均被鋪于Histopaque上。在離心之 后，所述樣品已經(jīng)分為上部的血漿層、含有有核細胞的界面層和下部的 紅細胞層。移出所述界面層、清洗并且裂解任何剩余的紅細胞。然后， 將樣品用抗CD34的生物素化抗體以磁學方式進行標記，并JU吏用 MiniMACS系統(tǒng)(Direct CD34 Progenitor Cell Isolation Kit, MiltenyiBiotec)在磁場中過柱。經(jīng)標記的CD34+細胞被保留在所述磁柱中，而 未標記的細胞自由流過。然后將所述MiniMACS柱^^磁場中移出并且將 所述CD34+細胞洗脫過柱。將所述CD34+細胞在無血清培養(yǎng)基 (StemSpan， Stem Cell Technologies )中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基添加有紅細胞 生成素(3U/ml)、干細胞因子(IO ng/ml)、 IL-3 (1 ng/ml )、低密度脂蛋 白(40 fig/ml)和FK506/Prograf ( 0.1 ng/ml )。將它們維持在1 x 105細 胞/ml的濃度，并且使它們通過紅系途徑從未定型干細胞分化至成紅血細 胞階段。
使用質膜蛋白試劑盒(QIAGEN),按照生產(chǎn)商的說明書，從lx107 的胎兒和成人的經(jīng)培養(yǎng)的成紅血細胞中分級分離質膜蛋白。然后通過 TCA沉淀濃縮被分離的蛋白并且進行2D凝膠電泳。圖13示出了所得的 SyproRuby染色的凝膠的放大區(qū)域。
分離自胎兒和成人樣品的蛋白的表達數(shù)量和水平之間的清楚差異是 顯而易見的。質譜分析使得可以鑒別胎兒成紅血細胞特異性蛋白粘著斑 蛋白(登記號P18206,圓圏A)和DnaJ同系物亞家族B成員14 (登記 號Q8TBM8,圓圏B )。已證明蛋白橋粒斑蛋白(登記號P15924,圓圈C ) 和AMMECRl-樣蛋白(登記號Q6DCA0，圓圈D )在胎兒細胞中上調。 還鑒別出了胞外基質蛋白2前體蛋白(登記號094769,圓圈E),證明 其在成人細胞中上調。
炎^i/5P-60 #為標記灰##//7^^尹為SC^乂乙^iz:j&勿^ 胎兒細胞特異性標記(例如HSP-60)可以被用于從母體外周血中分 離胎兒成紅血細胞，如下文舉例概括列出的
1. 采集母體外周血樣品(10-20 mL)。
2. 使用1^1(^39肌@或Ficolf密度分離培養(yǎng)基，實行密度離心/紅細 胞裂解來將有核細胞從母體外周血樣品中分離出來?；蛘?，使用一步細 胞分離操作利用本發(fā)明的標記直接從外周血樣品分離，不需要有核血細 胞富集操作。
3. 使用抗HSP-60包被的珠子實行胎兒成紅血細胞的免疫親和分離。 3a.任選地，^使用(例如)抗血型糖蛋白A的珠子對成紅血細胞進
行預分離，然后使用抗HSP-60,以將成紅血細胞(胎兒的和母體的)從 母體外周血樣品中分離出來。3b.作為步驟3a的備選方案，在使用抗HSP-60后，可以利用例如 抗血型糖蛋白A的珠子將胎兒成紅血細胞從在其細胞膜上表達HSP-60 的非成紅血細胞中分離出來。
4. 洗脫胎兒成紅血細胞。
5. 使用基于去污劑的一步方法，裂解該細胞，并且立即使用熱循環(huán)方 案進行單細胞基因組DNA擴增，使用通用擴增方案對DNA進行預富集 或未進行預富集。
6. 使用該遺傳物質進行例如遺傳疾病標記的多重連接依賴性探針分 析(MLPA)、定量熒光PCR分析、PCR擴增操作、基因芯片、DNA序 列分析。
炎^AW04成'M^405 #為>^記雙##//7^^ ^力、/C^乂乙^irj&勿^ 胎兒細胞特異性標記(例如MAOA或MAOB)可以被用于從母體 外周血中分離胎兒成紅血細胞，如下文舉例概括地列出的
1. 采集母體外周血樣品(10-20 ml )。
2. 實行密度離心/紅細胞裂解以分離有核細胞。
3. 任選地，可以實行使用(例如)抗-血型糖蛋白A磁林的成紅血細 胞的預分離或富集。
4. 將成紅血細胞與染料共同孵育，所述染料將會^L轉運到細胞內部并 且在適當時可通過MAOA或MAOB的作用^皮轉化為熒光產(chǎn)物。
5. 使用流式激活細胞分選儀(或其他分離細胞的工具)將胎兒成紅血 細胞從成人成紅血細胞中分選出來。
6. 使用基于去污劑的一步方法，裂解該細胞并且立即使用熱循環(huán)方案 進行單細胞基因組DNA擴增。
7. 使用該遺傳物質進行例如遺傳疾病標記的MLPA分析、PCR擴增 操作、基因芯片、DNA序列分析。
權利要求
1. 一種從母體血液樣品中分離胎兒細胞的方法，所述方法包括鑒別具有至少一種胎兒標記的表達模式不同于所述標記在等價母體細胞中的表達模式的細胞，并且篩選所鑒別的細胞，其特征在于所述至少一種胎兒標記的每一種均選自HSP-60、單胺氧化酶、谷氨酰胺合酶、Ara-70、Ara-54、FLJ20202、DCN-1蛋白、RAB5A、HSP-7C、EF1A1、GRP78、MYL4、DnaJ同系物亞家族B成員14、粘著斑蛋白、橋粒斑蛋白、AMMECR1-樣蛋白、胞外基質蛋白2前體蛋白、非典型蛋白Cxorf57、過氧化物還原酶1、過氧化物還原酶2。
2. 根據(jù)權利要求1的方法，其中所述方法包括鑒別在其細胞表面上 表達至少一種胎兒標記的細胞并且篩選那些細胞。
3. ^L據(jù)權利要求1或2的方法，其中所述方法包括篩選在其細胞表 面上表達一種胎兒標記的細胞。
4. 根據(jù)權利要求2或3的方法，還包括將所鑒別的細胞從未在其細 胞表面上表達所述胎兒標記的細胞中分離出來。
5. 才艮據(jù)權利要求2、 3或4的方法，其中所述胎兒標記為HSP-60。
6. 根據(jù)前述權利要求任一項的方法，其中所述方法包括鑒別表達至 少一種胎兒標記的細胞并且篩選那些細胞，其中所述至少一種胎兒標記 的每一種均選自單胺氧化酶。
7. 根據(jù)權利要求6的方法，還包括將所鑒別的細胞從未表達所述胎 兒標記的細胞中分離出來。
8. 根據(jù)權利要求2-7任一項的方法，還包括將所篩選的胎兒細胞從 具有所述至少一種胎兒標記的表達模式與所迷所篩選的胎兒標記細胞 相同的非等價母體細胞中分離出來。
9. 根據(jù)前述權利要求任一項的方法，其中鑒別了這樣的細胞，即所 述細胞在其細胞表面上表達HSP-60以及量增加的至少一種其他胎兒標記，所述至少一種其他胎兒標記選 自單胺氧化酶、谷氨酰胺合酶、Ara-70、 Ara-54、 FLJ20202、 DCN-1 蛋白、RAB5A、 HSP-7C、 EF1A1、 GRP78、 MYL4、 DnaJ同系物亞家 族B成員14、粘著斑蛋白、橋粒斑蛋白、AMMECRl-樣蛋白、非典型 蛋白Cxorf57;或量減少的至少一種其他胎兒標記，所述至少一種其他胎兒標記選自胞外基質蛋白2前體蛋白、過氧化物還原酶l、過氧化物還原酶2。
10. 根據(jù)前述權利要求任一項的方法，其中鑒別了這樣的細胞，即 所述細胞表達單胺氧化酶以及量增加的至少一種其他胎兒標記，所述至少一種其他胎兒標記選 自谷氨酰胺合酶、Ara-70、 Ara-54、 FLJ20202、 DCN-1蛋白、RAB5A、 HSP-7C、 EF1A1、 GRP78、 MYL4、 DnaJ同系物亞家族B成員14、 粘著斑蛋白、橋粒斑蛋白、AMMECRl-樣蛋白、非典型蛋白Cxorf57; 或量減少的至少一種其他胎兒標記，所述至少一種其他胎兒標記選 自胞外基質蛋白2前體蛋白、過氧化物還原酶l、過氧化物還原酶2。
11. 根據(jù)前述權利要求任一項的方法，其中所述胎兒標記或其他胎 兒標記為單胺氧化酶。
12. 根據(jù)權利要求11的方法，其中所述單胺氧化酶為MAOA。
13. 根據(jù)權利要求11的方法，其中所述單胺氧化酶為MAOB。
14. 根據(jù)權利要求l-10任一項的方法，其中所述胎兒標記或其他胎 兒標記為谷氨酰胺合酶。
15. 根據(jù)權利要求l-10任一項的方法，其中所述胎兒標記或其他胎 兒標i己為Ara-70。
16. 根據(jù)權利要求l-10任一項的方法，其中所述胎兒標記或其他胎 兒標記為Ara-54。
17. 根據(jù)權利要求l-10任一項的方法，其中所述胎兒標記或其他胎 兒標記為FLJ20202。
18. 根據(jù)權利要求l-10任一項的方法，其中所述胎兒標記或其他胎 兒標記為DCN-1蛋白。
19. 根據(jù)權利要求1-10任一項的方法，其中所述胎兒標記或其他胎 兒標記為RAB5A。
20. 根據(jù)權利要求l-10任一項的方法，其中所述胎兒標記或其他胎 兒標記為HSP-7C。
21. 根據(jù)權利要求l-10任一項的方法，其中所述胎兒標記或其他胎 兒標記為EF1A1。
22. 根據(jù)權利要求l-10任一項的方法，其中所述胎兒標記或其他胎兒標記為GRP78。
23. 根據(jù)權利要求1-10任一項的方法，其中所述胎兒標記或其他胎 兒標記為MYL4。
24. 根據(jù)權利要求l-10任一項的方法，其中所述胎兒標記或其他胎 兒標"^己為DnaJ同系物亞家族B成員14。
25. 根據(jù)權利要求1-10任一項的方法，其中所述胎兒標記或其他胎 兒標記為粘著斑蛋白。
26. 根據(jù)權利要求l-10任一項的方法，其中所述胎兒標記或其他胎 兒標記為橋粒斑蛋白。
27 根據(jù)權利要求1-10任一項的方法，其中所述胎兒標記或其他胎兒 標記為AMMECRl-樣蛋白。
28. 根據(jù)權利要求l-10任一項的方法，其中所述胎兒標記或其他胎 兒標記為胞外基質蛋白2前體蛋白。
29. 根據(jù)權利要求l-10任一項的方法，其中所述胎兒標記或其他胎 兒標記為非典型蛋白Cxorf57。
30. 根據(jù)權利要求l-10任一項的方法，其中所述胎兒標記或其他胎 兒標記為過氧化物還原酶1。
31. 根據(jù)權利要求l-10任一項的方法，其中所述胎兒標記或其他胎 兒標記為過氧化物還原酶2。
32. 根據(jù)前述權利要求任一項的方法，其中所述母體血液的形式為 分離的樣品。
33. 根據(jù)權利要求l-32任一項的方法，其中所述母體血液適合于被 輸回到受試者體內，所述母體血液獲取自所述受試者。
34. —種從母體血液中分離胎兒細胞的方法，所述方法包括鑒別具 有至少一種胎兒標記的表達模式不同于所述標記在等價母體細胞中的 表達模式的細胞，并且篩選所鑒別的細胞，其特征在于所述胎兒標記選 自HSP-60、單胺氧化酶、谷氨酰胺合酶、Ara-70、 Ara-54、 FLJ20202、 DCN-1蛋白、RAB5A、 HSP國7C、 EF1A1、 GRP78、 MYL4、 DnaJ同 系物亞家族B成員14、粘著斑蛋白、橋粒斑蛋白、AMMECRl-樣蛋白、 胞外基質蛋白2前體蛋白、非典型蛋白Cxorf57、過氧化物還原酶1、 過氧化物還原酶2。
35. —種培養(yǎng)胎兒細胞的方法，所述方法包括富集具有至少一種胎兒標記的表達模式不同于所述標記在等價母體細胞中的表達模式的細胞，所述胎兒標記選自HSP-60、單胺氧化酶、谷氨酰胺合酶、Ara-70、 Ara-54、 FLJ20202、 DCN-1蛋白、RAB5A、 HSP-7C、 EF1A1、 GRP78、 MYL4、 DnaJ同系物亞家族B成員14、粘著斑蛋白、橋粒斑蛋白、 AMMECRl-樣蛋白、胞外基質蛋白2前體蛋白、非典型蛋白Cxorf57、 過氧化物還原酶l、過氧化物還原酶2。
36. 根據(jù)權利要求35的方法，其中所述胎兒細胞是使用一種包括根 據(jù)權利要求l-34任一項的方法的方法分離的。
37. —種細胞樣品，所述細胞樣品包含可通過一種包括根據(jù)權利要 求l-34任一項的方法的方法獲得的分離細胞。
38. —種細胞樣品，所述細胞樣品包含通過一種包括根據(jù)權利要求 l-34任一項的方法的方法獲得的分離細胞。
39. 根據(jù)權利要求37或38的細胞樣品，包含通過權利要求35或 36的方法培養(yǎng)的細胞。
40. 根據(jù)權利要求1-36任一項的方法或根據(jù)權利要求37-39任一項 的細胞樣品，其中所述細胞為成紅血細胞。
41. 一種胎兒細胞分離試劑盒，包括用于檢測一種細胞所具有的至 少一種胎兒標記的表達模式是否不同于所述標記在等價母體細胞中的 表達模式的工具，以及用于將具有所述至少一種胎兒標記的不同表達模 式的細胞從不具有所述至少一種胎兒標記的不同表達模式的細胞中分 離出來的工具，其特征在于所述胎兒標記選自HSP-60、單胺氧化酶、 谷氨酰胺合酶、Ara國70、 Ara畫54、 FLJ20202、 DCN-1蛋白、RAB5A、 HSP-7C、 EF1A1、 GRP78、 MYL4、 DnaJ同系物亞家族B成員14、 粘著斑蛋白、橋粒斑蛋白、AMMECRl-樣蛋白、胞外基質蛋白2前體 蛋白、非典型蛋白Cxorf57、過氧化物還原酶l、過氧化物還原酶2。
42. —種產(chǎn)前疾病診斷的方法，所述方法包括利用根據(jù)權利要求 l-34任一項的方法獲得分離的胎兒細胞的步驟。
43. 根據(jù)權利要求42的方法，還包括確定所述分離的胎兒細胞是否 含有疾病標識的步驟。
44. 用于根據(jù)權利要求l-34任一項的方法的裝置，所述裝置包括用 于檢測 一種細胞所具有的至少 一種胎兒標記的表達模式是否不同于在 等價母體細胞中的表達模式的工具，以及用于將具有所述至少一種胎兒標記的不同表達模式的細胞從不具有所述至少一種胎兒標記的不同表達模式的細胞中分離出來的工具，其特征在于所述胎兒標記選自 HSP曙60、單胺氧化酶、谷氨酰胺合酶、Ara畫70、 Ara-54、 FLJ20202、 DCN-1蛋白、RAB5A、 HSP-7C、 EF1A1、 GRP78、 MYL4、 DnaJ同 系物亞家族B成員14、粘著斑蛋白、橋粒斑蛋白、AMMECRl-樣蛋白、 胞外基質蛋白2前體蛋白、非典型蛋白Cxorf57、過氧化物還原酶1、 過氧化物還原酶2。
45. —種確定細胞為胎兒細胞的方法，所述方法包括在所述細胞中 檢測至少一種胎兒標記，所述胎兒標記具有與在等價母體細胞中的表達 模式不同的表達模式，其特征在于所述胎兒標記選自HSP-60、單胺氧 化酶、谷氨酰胺合酶、Ara-70、 Ara-54、人假定蛋MGC10526或 MGC10233、 FLJ20202、 DCN國1蛋白、RAB5A、 HSP國7C、 EF1A1、 GRP78、 MYL4、 DnaJ同系物亞家族B成員14、粘著斑蛋白、橋粒斑 蛋白、AMMECRl-樣蛋白、胞外基質蛋白2前體蛋白、非典型蛋白 Cxorf57、過氧化物還原酶l、過氧化物還原酶2。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從分離的母體血液樣品中分離胎兒細胞的方法，所述方法包括鑒別具有至少一種胎兒標記的表達模式不同于所述標記在等價母體細胞中的表達模式的細胞，并且篩選所鑒別的細胞，其特征在于所述胎兒標記選自HSP-60、單胺氧化酶、谷氨酰胺合酶、Ara-70、Ara-54、FLJ20202、DCN-I蛋白、RAB5A、HSP-7C、EF1A1、GRP78、MYL4、DnaJ同系物亞家族B成員14、粘著斑蛋白、橋粒斑蛋白、AMMECR1-樣蛋白、胞外基質蛋白2前體蛋白、非典型蛋白Cxorf57、過氧化物還原酶1、過氧化物還原酶2。本發(fā)明還提供了一種培養(yǎng)胎兒細胞的方法和胎兒細胞分離試劑盒。
文檔編號G01N33/50GK101523211SQ200780036868
公開日2009年9月2日 申請日期2007年8月10日 優(yōu)先權日2006年8月11日
發(fā)明者D·J·黑德, N·D·埃文特, Z·E·普盧默 申請人:英國西英格蘭大學，布里斯托爾