專利名稱：甲狀腺癌遺傳檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種檢測個(gè)體甲狀腺癌遺傳易感性的試劑 盒，通過同時(shí)檢測與甲狀腺癌密切相關(guān)的X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因(XRCC1)、 X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因3 (XRCC3)、血管內(nèi)皮生長因子A基因(VEGFA)、錯(cuò)配修復(fù)基因(hMSH2)上的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型 來評(píng)估個(gè)體甲狀腺癌遺傳易感性。
背景技術(shù)：
甲狀腺內(nèi)的異常新生物稱甲狀腺腫瘤或結(jié)節(jié)，是臨床常見病、多發(fā)病，以良性居多。其中4.8 16.5 %為惡性，即甲狀腺癌。其發(fā)病因?yàn)榈貐^(qū)及性別的不同，有較大的區(qū)別。 一般而言，高原缺碘地區(qū)，本病 的發(fā)病率高，并且女性發(fā)病較多。雖然甲狀腺癌從兒童到老年人均可發(fā)生，但和一般癌瘤好發(fā)于老年人的 特點(diǎn)不同，甲狀腺癌好發(fā)于青壯年。
甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤，分乳頭狀癌(約占60%,多見于年青女性，低度惡性)、濾泡 狀癌(約占20%,多見于中年人，中度惡性)、未分化癌(約占15%，多見于老年人，高度惡性)和髓樣 癌(少見，中度惡性)四種，多數(shù)發(fā)展較慢、轉(zhuǎn)移較晚、預(yù)后較好。甲狀腺癌的發(fā)病初期多無明顯自覺癥， 狀，只是在甲狀腺組織內(nèi)出現(xiàn)質(zhì)硬而高低不平的結(jié)節(jié)，晚期常壓迫喉返神經(jīng)、氣管、食管而產(chǎn)生聲音嘶啞， 呼吸困難或吞咽困難；如果壓迫頸交感神經(jīng)，可產(chǎn)生Homer綜合征(表現(xiàn)為同側(cè)瞳孔縮小、上眼瞼下垂、 眼球內(nèi)陷、同側(cè)頭面部無汗等)；頸叢淺支受損時(shí)，病人可有耳、枕、肩等部位疼痛。局部轉(zhuǎn)移常在頸部， 出現(xiàn)硬而固定的淋巴結(jié)。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移多見于扁骨(如顱骨、椎骨和骨盆)和肺。
人類X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因1 (XRCC1)是第一個(gè)分離到的能夠影響細(xì)胞對,電離輻射敏感性的哺乳 動(dòng)物基因，廣泛參與DNA損傷的修復(fù)。XRCC1蛋白自身不具有催化功能，它是作為腳手架蛋白，通過直 接與聚合酶e、 DNA連接酶ni和多聚ADP核糖聚合酶(PARP)形成復(fù)合物，共同參與堿基切除修復(fù)(BER) 和單鏈斷裂修復(fù)(Single strand break repair, SSBR)。 Arg399Gln位點(diǎn)是XRCC1基因第10號(hào)外顯子上的一 個(gè)G/A多態(tài)位點(diǎn)，引起XRCC1基因編碼蛋白的第399個(gè)氨基酸由Arg變?yōu)镚ln，該氨基酸處于BRCT I 區(qū)域。G、 A是該位點(diǎn)的兩個(gè)等位基因，兩兩組合形成三種基因型，分別為GG(Arg/Arg)、 GA(Arg/Gln)、 AA(Gln/Gln)，其中AA被確定為風(fēng)險(xiǎn)基因型，與甲狀腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。當(dāng)個(gè)體攜帶AA基因型時(shí)， XRCC1蛋白BRCT I功能域的空間構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致XRCC1蛋白不能正常結(jié)合于DNA受損處，而影 響PARP1發(fā)揮作用，最終使得堿基切除修復(fù)能力被削弱，DNA損傷增多，體細(xì)胞癌變增多，甲狀腺癌的 患病風(fēng)險(xiǎn)上升。
由于甲狀腺癌的一個(gè)重要誘發(fā)因素是強(qiáng)電離福射，因此當(dāng)XRCC3基因損傷時(shí)，機(jī)體對于由強(qiáng)電離輻 射產(chǎn)生的DNA雙鏈斷裂無法進(jìn)行有效修補(bǔ)，使得甲狀腺細(xì)胞易發(fā)生癌變，最終引起甲狀腺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn) 升高。A4541G位點(diǎn)是XRCC3基因第2號(hào)外顯子上的A/G多態(tài)，處在5'端非編碼區(qū)部分(5' UTR),因 此該突變可能會(huì)影響基因的表達(dá)調(diào)控。該位點(diǎn)的基因型有AA、 AG、 GG三種，其中AA為甲狀腺癌的風(fēng) 險(xiǎn)基因型。當(dāng)攜帶風(fēng)險(xiǎn)基因型(AA)時(shí)，XRCC3基因的表達(dá)受到影響，同源重組途徑受阻，DNA雙鏈斷裂 修復(fù)不能正常進(jìn)行，甲狀腺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高。
VEGFA是具有高度內(nèi)皮細(xì)胞特異性的有絲分裂原，在血管發(fā)生和形成過程中起著主要的調(diào)控作用。 VEGFA基因C-2578A位點(diǎn)是該基因靠近5'端的一個(gè)C/A多態(tài)位點(diǎn)。C、 A是該位點(diǎn)的兩個(gè)等位基因，兩 兩組合形成三種基因型，分別為CC、 CA和AA，其中CA、 AA被確定為風(fēng)險(xiǎn)基因型，與甲狀腺癌患病風(fēng) 險(xiǎn)增加有關(guān)。
C-2578A多態(tài)位點(diǎn)位于VEGFA基因的啟動(dòng)子區(qū)，因此具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平的作用。該位點(diǎn)突變對 VEGFA基因表達(dá)水平產(chǎn)生影響，C等位基因引起該基因高表達(dá)，A等位基因則為低表達(dá)。按照"Folkman 理論假說"，VEGFA的高表達(dá)應(yīng)該更容易導(dǎo)致癌癥的發(fā)展，然而更多的研究事實(shí)證明，低表達(dá)等位基因A 與癌癥的發(fā)生存在更密切的關(guān)系，其原因目前研究的還不夠透徹，可能是由于癌癥的發(fā)生和發(fā)展是兩個(gè)不. 同的過程。雖然癌細(xì)胞的快速生長需要新血管的生成，但是在癌癥發(fā)生的最初階段，由于血管生成障礙使 得機(jī)體的部分細(xì)胞長期處于缺氧狀態(tài)，從而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。因此，當(dāng)攜帶風(fēng)險(xiǎn)基因型(CA/AA)時(shí)，VEGFA基因的表達(dá)水平下降，對血管生成帶來影響，而機(jī)體細(xì)胞需要由紅細(xì)胞攜帶氧來進(jìn)行正常的生理活動(dòng)。在 血管不能正常生成的情況下，部分細(xì)胞得不到氧氣，處于缺氧狀態(tài)。缺氧在造成細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞過程中 發(fā)揮明顯的作用，甲狀腺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)反而升高了。
hMSH2基因是錯(cuò)配修復(fù)(MMR)基因中的一種，參與DNA復(fù)制過程中堿基錯(cuò)配修復(fù)通路，具有錯(cuò) 配識(shí)別的作用。hMSH2基因第12號(hào)內(nèi)含子第6位核苷酸上存在一個(gè)T/C多態(tài)， 一般表示為gIVS12-6T>C。 該多態(tài)位點(diǎn)有T和C兩種等位基因，兩兩組合成為3種基因型，分別是TT、 TC和CC基因型。其中，TC 和CC是甲狀腺癌的風(fēng)險(xiǎn)基因型。由于glVS12-6TX:位點(diǎn)位于內(nèi)含子與外顯子的交界處，鄰近剪接接受部 位，該位點(diǎn)的突變很可能影響mRNA前體加工過程中mRNA的剪接，從而改變hMSH2蛋白質(zhì)的功能。 因此，當(dāng)攜帶風(fēng)險(xiǎn)基因型(TC/CC)時(shí)，對轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的剪接過程產(chǎn)生影響，導(dǎo)致其蛋白功能變化，錯(cuò)配修 復(fù)通路不能正常進(jìn)行，甲狀腺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高。

發(fā)明內(nèi)容
基于X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因(XRCC1)、 X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因3 (XRCC3)、血管內(nèi)皮生長因子A 基因(VEGFA)、錯(cuò)配修復(fù)基因(hMSH2)上的4個(gè)SNP位點(diǎn)多態(tài)性可用來評(píng)估個(gè)體甲狀腺癌遺傳易感性的 基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種檢測個(gè)體甲狀腺癌遺傳易感性的試劑盒。
該試劑盒包括
檢測XRCC1基因上Arg399Gln SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對； 檢測XRCC3 S因上A4541G SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對； 檢測VEGFA基因上C-2578A SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對； 檢測hMSH2基因上glVS12-6T〉C SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對； 熒光定量PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反應(yīng)緩沖液、去離子水等)。 本試劑盒中所述的引物對是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成設(shè)計(jì)的，并可用常規(guī)的合成技術(shù)進(jìn)行合成。 本試劑盒中所述的特異性熒光探針對是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成設(shè)計(jì)的，:特異性熒光探針對可用 常規(guī)的探針合成技術(shù)進(jìn)行合成。
本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括
10 X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液4^1，
25mM dNTP混合液0.4^1,
25mM MgC12溶液2. 4nl，
5units/nl Taq DNA聚合酶0.01^1，
20MM特異性引物對每條引物各0.225^1,
IO剛特異性熒光探針對每條探針各0.25pl，
去離子水2L3nl。 '本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20'C。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī) 條件，或按照廠商所建議的條件。
實(shí)施例l.檢測試劑盒的使用 步驟l: DNA模板的抽取 用硅膠吸附法抽提口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA。
步驟2:熒光定量PCR反應(yīng)
使用檢測試劑盒中的熒光定量PCR套裝，分別進(jìn)行4次獨(dú)立的熒光定量PCR反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)的體系為 總體積10nl，包,濃度為20ng/nl的DNA模板2fxl、 1^1 10 X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、0.1^1 25mM dNTP 混合液、0.6jil 25mM MgCl2溶液、0.025^1 (5units/nl) Taq DNA聚合酶、20-的有義引物和反義引物
4各0.225^1、 10—的帶VIC熒光探針和帶FAM熒光探針各0.25^1，去離子水5. 325^1。
在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為50'C、 2分鐘，95'C、 IO分鐘，進(jìn)行60個(gè)循環(huán)的95°C 、 30秒， 60'C、 l分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。
步驟4:基因型分析
根據(jù)試劑盒使用說明書標(biāo)示的基因分型圖示對SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析。
熟悉熒光定量PCR技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識(shí)熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量，根 據(jù)不同序列探針VIC和FAM熒光信號(hào)的強(qiáng)弱即可確定所檢測的SNP位點(diǎn)的基因型。
實(shí)施例2.應(yīng)用檢測試劑盒進(jìn)行個(gè)體甲狀腺癌遺傳易感性檢測的服務(wù) 步驟l: DNA提取
由醫(yī)院檢驗(yàn)科醫(yī)師指導(dǎo)被檢者使用口腔采樣拭進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞取樣，釆用硅膠吸附法進(jìn)行口腔上皮 細(xì)胞的DNA抽提。
步驟2:基因分型檢測
使用本發(fā)明提供的試劑盒，對被檢測者基因組DNA的XRCC1基因上Arg399Gln SNP位點(diǎn)、XRCC3基因 上A4541G SNP位點(diǎn)、VEGFA基因上C-2578A SNP位點(diǎn)和hMSH2基因上glVS12-6T〉C SNP位點(diǎn)進(jìn)行熒光定量 PCR檢測，確定這4個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型。
步驟3:個(gè)體甲狀腺癌遺傳易感性的分析
通過對被檢測者SNP基因型的分析，出具個(gè)體甲狀腺癌遺傳易感性的分析報(bào)告單。報(bào)告中詳細(xì)說明了 被檢測者甲狀腺癌遺傳風(fēng)險(xiǎn)的高低，并由醫(yī)師向被檢者詳細(xì)說明和解讀個(gè)體甲狀腺癌遺傳易感性分析報(bào)告 單。
權(quán)利要求
1.一種檢測個(gè)體甲狀腺癌遺傳易感性的試劑盒，其特征在于包括同時(shí)檢測X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因(XRCC1)上Arg399Gln SNP位點(diǎn)、X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因3(XRCC3)上A4541G SNP位點(diǎn)、血管內(nèi)皮生長因子A基因(VEGFA)上C-2578A SNP位點(diǎn)、錯(cuò)配修復(fù)基因(hMSH2)上gIVS12-6T＞C SNP位點(diǎn)的特異性引物對及特異性熒光探針對、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括10 X熒光定量PCR反應(yīng) 緩沖液4W, 25mMdNTP混合液0.4W， 25mMMgC12溶液2.4W， 5units/W Taq DNA聚合酶20剛 特異性引物對每條引物各0.225W, IO幽特異性熒光探針對每條探針各0.25W,去離子水21.3W。 本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20°C 。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測甲狀腺癌遺傳風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒。該試劑盒包括檢測X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因(XRCC1)、X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因3(XRCC3)、血管內(nèi)皮生長因子A基因(VEGFA)、錯(cuò)配修復(fù)基因(hMSH2)上的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對、熒光定量PCR常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過同時(shí)檢測與甲狀腺癌遺傳風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)的基因上的多態(tài)性位點(diǎn)基因型來評(píng)估個(gè)體甲狀腺癌遺傳風(fēng)險(xiǎn)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101608227SQ200810039269
公開日2009年12月23日 申請日期2008年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月20日
發(fā)明者馮哲民, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司