專利名稱：對s-腺苷甲硫氨酸(sam)的改進分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的重組S-腺苷高半胱氨酸酶(SAHH)和其使用方法。本發(fā) 明還涉及應用SAHH監(jiān)測供試體的診斷方法，該供試體已給藥S-腺苷曱硫 氨酸(SAM)。本發(fā)明的改進方法可快速而又精確地評估SAM的濃度。
背景技術(shù)：
作為"nutraceutical"或處方藥給藥S-腺苷曱硫氨酸(SAM)最近顯示出 SAM是一種抗抑郁劑，是一種緩解肝病的預防或治療組分，提供一種緩解 關(guān)節(jié)炎癥狀的手段。SAM在此的作用機制尚未完全清楚，但是，已確信SAM 和其代謝產(chǎn)物高半胱氨酸的相對濃度影響曱基化水平，而甲基化水平會產(chǎn) 生更深的生理影響。由于該藥重要，因此期望找到一種可靠而又易實施的 方法來監(jiān)測所給藥的濃度。本發(fā)明提供一種改進的方法，該方法通過SAHH 來評估給藥SAM的供試體中該藥的治療性水平。本發(fā)明還涉及重組產(chǎn)生的 不同于以前報道的SAHH。
S-腺苷高半胱氨酸酶(S-腺苷高半胱氨酸水解酶；SAHH, EC. 3. 3. 1.1) 催化SAH到高半胱氨酸和腺苷的可逆性轉(zhuǎn)化(de la Haba和Cantoni， 1959)。 腺苷的各種結(jié)構(gòu)類似物使許多生物體的SAHH失活，從而導致細胞毒性的 產(chǎn)生(Ueland, 1982)。核苷類似物對SAHH活性的抑制取決于抑制物的結(jié)構(gòu) 和酶的來源。SAHH最初乂人陰道毛滴蟲(7h'c/zowcwas vag/"a/h)基因克隆并且 已鑒定特征(Bagnara等，1996)。
Minotto， L.， Ko, G,A.， Edwards, M. R.和Bagnara， A. S.[重組S-腺苷高半 胱氨酸酶的陰道毛滴蟲(7Wc/zomo"os vag/"a/z力表達和鑒定，ExperimentalParasitology 90, 175-180， 1998]進一步描述了陰道毛滴蟲(r vag/"afe)SAHH 的特征。編碼陰道毛滴蟲(7Hc/zowo"w vag/"a/^)中S-腺苷高半胱氨酸酶的基 因在大腸桿菌(&c/2en'c/n'a co//)pQE-30的表達有利于描述該酶的特征。6xHis N端標記表達系統(tǒng)(QIAGEN)可一步純化6毫克rSAHH,該rSAHH可通過 使用鎳-NTA基質(zhì)的親和層析于100ml細菌培養(yǎng)得到。測得重組酶的分子量 約為56， 000。 rSAHH的特性包括與腺苷有相似的表觀Km 20-25|liM和與腺 苷類似物例如阿糖腺苦(ara-A)有相似的抑制/失活模式。
Minotto等1998的研究結(jié)果不同于其他人所發(fā)現(xiàn)的水解酶根據(jù)酶的來 源以各種寡聚形式存在。原核生物SAHH的活性形式是六聚體(Shimizu等， 1984)或四聚體(Porcelli等，，勿a, 1164, 179-188， 1993)。 大鼠肝臟(Fujioka和Takata, J C/ze肌，256, 1631-1635， 1981)和小牛肝臟 (Richards等，253, 4476-4480, 1978)及其它動物源(Doskeland和Ueland， Biochem. et Biophys Acta 708, 185-193, 1982)的SAHH是四聚體，不過不能 確定亞基是否相同或相似。植物源的SAHH的功能形式是同型二聚體 (Gumnowski和Pawelkiewicz， Fur. J. Biochem. 80, 517-523， 1977)。 it文第一 次才艮道以單體形式起作用的SAHH活性(Minotto等，1998)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種分析樣品中SAM水平的改進新方法。 一方面，本發(fā)明 方法可用于分析供試體樣品中SAM的治療性水平，所述供試體例如但并不 限于給藥此化合物的患者。本方法還可用于分析生物液體中SAM的水平， 所述生物液體例如j旦并不限于供試體血液或其它生物液體。該方法可在體 內(nèi)例如血流或體外例如取自供試體的樣品里進行。所述方法可作為診斷方 案或治療方案的一部分。作為治療方案的一部分，該方法一定程度上可監(jiān) 測治療情況或進展。
在本發(fā)明的一實施方案中，該試驗方法可通過樣品與甘氨酸N-曱基轉(zhuǎn) 移酶(GMT),甘氨酸及活性形式SAHH的接觸而得以進行。測量樣品中一 種或更多種反應產(chǎn)物后就可得出樣品中SAM的水平，其中反應產(chǎn)物的量與 樣品中SAM水平成正比。在本發(fā)明一實施方案中，直接或間接地測量反應 產(chǎn)物高半胱氨酸(HC)?？捎萌魏畏椒▉黹g接測量HC,包括但并不限于用高 半胱氨酸酶處理并且測量一種或更多種反應產(chǎn)物(例如oc-酮戊二酸，HsS或 NH3)的水平。通過測量吸光度或熒光可直接或間接地測定反應產(chǎn)物H2S。 一種測熒光的方法是使用發(fā)焚光試劑。
本發(fā)明還提供一種新SAHH,編碼它的核酸，包含它的組合物及其制 備和使用方法。所述SAHH含有SEQ ID NO: 1編碼的氨基酸序列。
編碼本發(fā)明SAHH的核酸可置于任何合適核酸載體上以增殖，擴增或 表達。所述核酸還可與其它核苦酸操作性地連接以容許與一種或多種附加 氨基酸共價連接的SAHH表達。附加氨基酸導致產(chǎn)生包含SAHH的雜交或 嵌合蛋白。本發(fā)明的一優(yōu)選實施方案中，附加氨基酸是指那些改進本發(fā)明 中后面SAHH純化的組氨酸標記(His tag)。
本發(fā)明核酸可被導入任何合適的寄主細胞或生物體，例如但并不限于 細菌，真菌和高等真核細胞。這些細胞可用于重組表達本發(fā)明的核酸，任 選地，接著對表達蛋白進行分離和/或純化?；蛘?，所述核酸還可應用體外 表達系統(tǒng)來表達。
本發(fā)明的SAHH純化可由任何方便或合適的方法例如，但并不限于沉 淀和/或?qū)游龇▉硗瓿?。在本發(fā)明一優(yōu)選的實施方案中，所述純化全部或部 分是通過基于與組氨酸標記相互作用的親和層析來實現(xiàn)的。在本發(fā)明另一 優(yōu)選的實施方案中，這樣純化的SAHH， SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析顯 示為一條帶。
本發(fā)明SAHH還可被配制成組合物，例如包含藥劑或賦形劑(excipients) 的組合物。所迷SAHH還可用于本發(fā)明例如上述的試ar方法和其它方法中， 所述其它方法例如由分析樣品中高半胱氨酸向SAH轉(zhuǎn)化來測定高半胱氨酸 水平的方法。另一方面，本發(fā)明所述SAHH還可用于通過向SAH的轉(zhuǎn)化耗 竭體內(nèi)或體外樣品中過多高半胱氨酸的方法中。當然本發(fā)明所述樣品可以 是任何相關(guān)生物液體。
更具體地，本發(fā)明涉及
1. 評估生物液體樣品中S-腺苷曱硫氨酸(SAM)的治療性水平的方法， 包括將甘氨酸N-曱基轉(zhuǎn)移酶(GMT), S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)或 His SAHH,以及甘氨酸加入該樣品中；測量所述樣品中一種或多種反應 產(chǎn)物，其中所述一種或多種反應產(chǎn)物的水平與樣品中SAM水平成正比。
2. 項1的方法，其中被檢測的產(chǎn)物是高半胱氨酸(HC)。
3. 項2的方法，其中所述HC是由下述方法測得，該方法包括用高半 胱氨酸酶(HCYase)處理樣品，并測定所述高半胱氨酸與HCYase反應得到的 至少一種產(chǎn)物的濃度。4. 項3的方法，其中測得的產(chǎn)物是H2S。
5. 項4的方法，其中所述H2S通過熒光或吸光度而測定。
6. 項1的方法，其中所述SAHH包含SEQIDNO: 1編碼的氨基酸序列。
7. 分析含SAM的樣品的試劑盒，該試劑盒包括SAHH或His .SAHH, GMT,甘氨酸及使用說明。
8. —種試驗，包括含SAM的生物樣品；和GMT,甘氨酸，以及SAHH 或His . SAHH，其中SAHH或His . SAHH活性產(chǎn)生一種可測定的產(chǎn)物以 確定樣品中SAM的量。
9. 一種分離的包含SEQIDNO: 1的核酸分子。
10. 項9中定義的核酸分子，還包括編碼N端6xHis標記的序列。
11. 有效制備S-腺苷高半胱氨酸水解酶的方法，所述方法包括使含有 項9定義的核酸分子的盒進行表達。
12. 有效制備His S-腺苷高半胱氨酸水解酶的方法，所述方法包括使 含有項IO定義的核酸分子的盒進行表達。
13. 項11的方法，其中所述盒在大腸桿菌中表達。
14. 項12的方法，其中所述盒在大腸桿菌中表達。
15. 純化His S-腺苷高半胱氨酸水解酶的方法，包括用硫酸銨來沉 淀含His S-腺苦高半胱氨酸水解酶的懸浮液以產(chǎn)生上清和沉淀，所述His -S-腺苷高半胱氨酸水解酶由項12的方法生成；和對該上清進行組氨酸標記識 別型親和層析。
16. 用單個層析步驟純化His S-腺苦高半胱氨酸水解酶的方法，包括 使通過項12的方法生成的His 'S-腺香高半胱氨酸水解酶進行Ni-NAT親和層析。
17. 測定生物液體中高半胱氨酸的方法，包括將所述液體與His S-腺 苷高半胱氨酸水解酶接觸并且測定所述液體中高半胱氨酸向SAH的轉(zhuǎn)化， 所述His S-腺苷高半胱氨酸水解酶由項15的方法生成。
18. 包含His .S-腺芬高半胱氨酸水解酶的組合物，所述His.S-腺苷高 半胱氨酸水解酶經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析為一條帶，其中所述 His S-腺苷高半胱氨酸水解酶由項15的方法制成。
19. 耗竭體內(nèi)或來自體內(nèi)的生物液體中過量高半胱氨酸的方法，包括使 所述液體與項15的方法生成的SAHH接觸。
20. —種大腸桿菌宿主細胞，包括項9的核酸分子。21. —種大腸桿菌宿主細胞，包括項10的核酸分子。


圖1描述pTrcSAHH插入pTrc多克隆位點Ncol和BamHI。 圖2包含SAHH穩(wěn)定性研究的結(jié)果。 圖3顯示SAHH克隆的篩選。
圖4描述pTrcHis SAHH插入pTrc多克隆位點Ncol和BmaHT。
圖5包含His SAHH穩(wěn)定性研究的結(jié)果。
圖6a-c是本發(fā)明SAHH核香酸序列與野生型序列的對比。
實施本發(fā)明的方式 本發(fā)明提供一種分離和重組核酸，該編碼SAHH的核酸包括SEQ ID NO:l,還提供相應SAHH氨基酸序列。另一方面，修飾所述SAHH的基因 以編碼已修飾的His . SAHH, His , SAHH有6個額外組氨酸位于SAHH基 因N-末端。
另一方面，本發(fā)明提供增殖和維持核酸的方法及它們在SAHH蛋白表 達中的用途。本發(fā)明還提供通過一 步或兩步純化法純化SAHH的方法。
在一實施方案中，本發(fā)明涉及生物液體中SAM的測量。其中所述"生 物樣品，，指的是從個體中分離出的組織或液體樣品，包括但并不限于例如 血液，血成分，血漿，血清，腦脊液，淋巴液，尿液，皮膚外的部分，呼 吸道，腸道，生殖泌尿道，身體分泌物，眼淚，唾液，乳，淋巴以及從動 物，細胞(包括但不限于血細胞)，腫瘤，器官中提取出的其它成分，還包括 體外細胞培養(yǎng)的組分樣品。優(yōu)先選用的是在血漿或血清中測量。
其中所述"表達"包括轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
其中所述術(shù)語"包含"及其相關(guān)術(shù)語在此表示包含的意思。相當于術(shù) 語"包括"及其相關(guān)術(shù)語。
除非特別說明，否則所有本發(fā)明用到的科學技術(shù)術(shù)語與本領(lǐng)域普通人 員通常理解的意思相同。
SAHH是負責S-腺苷高半胱氨酸(SAH)向高半胱氨酸轉(zhuǎn)化的酶，最終降 低SAM水平。由于與SAH或高半胱氨酸(HC)內(nèi)源水平相比治療疾病所給 藥SAM水平非常高，下述方案可用來分析給藥SAM的供試體中該化合物 的水平。因此，所述試驗起到了藥物監(jiān)測裝置功能，可用于試劑盒形式中。下圖中顯示了該試驗的大概情況'
S-Ad
S-Ad
NH7CH COOH
;H,
tH，
:HNH2 SAM
甘氛拔f基
CH3NHCH2COOH &OOH SAH
SAH水解每
SH
高半胱^酸6^
(SAHH)
:HNH
2
ctkG
H2S + NH3
COOH HC
正如此處描述的，由于有效地生成了 SAHH或His SAHH,而且高半 胱氨酸酶對高半胱氨酸有高度專一的選擇性，從而使所述分析SAM的通常 方法得到了改進。盡管高半胱氨酸相對低于SAM的水平，由此確信所估 SAM的量沒有受到內(nèi)源SAH或HC顯著干擾，如果所用酶專一性較低，體 液中存在的半胱氨酸水平顯著高于高半胱氨酸的水平就會產(chǎn)生影響。存在 焚光試劑時，本發(fā)明方法中測得終產(chǎn)物為硫化氬。
SAHH還催化高半胱氨酸到S-腺苷高半胱氨酸轉(zhuǎn)化的逆反應，最終升 高SAM水平。該反應適用于另一類型試驗， 一種測量高半胱氨酸的高半胱 氨酸的酶-轉(zhuǎn)化免疫測定。具體地，本發(fā)明所述SAHH或His SAHH將高 半胱氨酸定量地轉(zhuǎn)化成SAH,并接著利用標準ELISA試驗測量終產(chǎn)物SAH。 通過提供充足的或較高的(甚至過量的)SAH使其得以實現(xiàn)。或者，針對SAH 的熒光抗體可用來定量生成的SAH。例如，該免疫測定可用于試劑盒并且 在約為1-lOOpM的范圍內(nèi)可用于血漿高半胱氨酸的測定。
本發(fā)明所述SAHH或His 'SAHH還可用作藥劑，特別是在篩選酶的抑 制物和失活物時用作藥劑并且可能用于例如癌癥，癡疾，關(guān)節(jié)炎和其它疾 病的治療。優(yōu)選試劑盒形式的SAHH藥物，該試劑盒包括一種試驗，由于 結(jié)合高半胱氨酸和利用二烷基苯二胺試劑例如DBPDA測量生成的辟"匕氫， 所以該試驗比較簡單。
重組SAHH的其它用途包括與SAH類似物結(jié)合的治療性癌基因，充當 激活有毒力前體藥物的酶，該前體藥物毒力由SAHH釋放的毒性腺苷類似 物來提供。所述腺苷類似物在和Hcy結(jié)合成SAH類似物時沒有毒性。也可 應用高半胱氨酸類似物，例如結(jié)合腺苷或腺苷類似物的硒代高半胱氨酸，其結(jié)合SAHH和rMETase基因治療在癌細胞中釋放由所述兩基因轉(zhuǎn)導的非 常毒的硒醇及有毒腺苷類似物。
優(yōu)選的實施方案包括分析樣品的試劑盒。優(yōu)選的是，試劑盒中含有試 驗操作說明，該說明可印在試劑盒中的包裝插頁(insert)上，包裝或標簽上。 要印的還可印在試劑盒中的容器及樣品標簽上，并且試劑體積要在試驗容 器上標明。精確說明隨所檢測物質(zhì)和/或所用檢測方法而定，但是可包括下 述說明的一項或多項如果必要，試劑盒組分和/或樣品稀釋說明，各試驗 所用酶體積或濃度說明，試驗中所加樣品體積說明，所加發(fā)焚光試劑說明， 產(chǎn)物測定說明，優(yōu)選的是溫度條件，組分添加和混合時間及校準試驗結(jié)果 用到的標準。
本發(fā)明可通過任何常規(guī)方法制備SAHH。通過實施例但并非對本發(fā)明 范圍的限制，用編碼本發(fā)明SAHH的合適載體首先轉(zhuǎn)化表達該酶的細菌。 接著，在液態(tài)培養(yǎng)基上培養(yǎng)(發(fā)酵)該轉(zhuǎn)化細菌許多小時，直至達到高密度。 如果SAHH編碼序列受誘導啟動子調(diào)控，則可加入合適誘導物。結(jié)束培養(yǎng) 后，接著就可離心收獲細胞，不用時冷凍儲存。
先解凍并融化冷凍細胞，然后添加組分沉淀細胞石卒片。離心收集碎片， 得到的上清中含有SAHH活性。在準備好的層析柱上上樣之前，先用合適 緩沖液稀釋上清。梯度洗脫出所述SAHH,或更優(yōu)選的是一步微體積洗脫。 然后制成儲存制劑以備用。
除了上述提供的一步純化方法外，可用親和層析法純化含組氨酸標記 的SAHH。通過實施例但并不限于本發(fā)明，按照上面所描述的來培養(yǎng)和收獲 表達帶組氨酸標記的SAHH的細菌細胞。接著如上所述解凍并破碎冷凍細 胞，制成細胞懸浮液，向懸浮液中加入固態(tài)硫酸氨，并將混合物置于水上， 然后離心。隨后收集含有SAHH活性的上清，并在預先準備好(已平衡)的 Ni-NAT層析柱上樣，沖洗該柱，實施一步洗脫法。在制成制劑冷凍儲存之 前，要先匯集活性成分并對其進行透析。
如下面實施例所述，根據(jù)下述步驟SAHH編碼序列從陰道毛滴蟲 (7Hc/zomowoy vag/加/^)克隆并在大腸桿菌中表達。在此提供編碼SAHH基 因的核苷酸序列，與野生型序列比較，如圖6a-c所示與Minotto等，1998 公開的序列相當。所述兩序列的比較顯示出11處點突變。在下面表1列出。
表l SAHH序列的比較
有11處點突變野生型A/C's氨基酸的變化
No. 19(G)CT(A)CTAla. —Thr.
No.201GC(G)GC(C)
No,207CT(T)CT(C)
No210AT(T)AT(C)
No.501GT(C)GT(T)
No.744GT(G)TG(C)
No.834GG(G)GG(C)
No,897CC(T)CC(A)
No.917G(T)CG(C)CVal. —Ala.
No.1314GA(T)GA(A)Asp. — Glu.
No.1346G(T)TG(C)TVal. — Ala.
本發(fā)明SAHH酶具有良好性質(zhì)。例如，SAHH有高度特異性活性至少 為1.5U/ml。此外，本發(fā)明SAHH克隆高度表達20%總細胞蛋白。而且， 附圖2和圖5顯示本發(fā)明方法制成的SAHH具備高度穩(wěn)定性。例如，附圖2 和圖5分別顯示SAHH和SAHH . His在45。C可保持三天穩(wěn)定而無活性喪失。
下面實施例用于說明但并不限制本發(fā)明。 實施例1 在pOE-30表達載體里克隆SAHH基因
使用寡核苷酸引物通過PCR擴增編碼陰道毛滴蟲(T. vaginalis)(Bagnara 等，1996)SAHH的基因組序列，該寡核苷酸引物分別包含在上游(有義)和下 游(反義)引物中改造的Bam/Z/和尸W/的限制酶切位點(兩種情況中以下劃線 標明限制位點)上游引物，5'TTTTGGATCCGCTTGCAAATCACCTGCTGG TGC3';下游引物，3'CTGCTATCGAGGGGGACGTCTTTT5'。將重組表達 載體pQE-30轉(zhuǎn)化入大腸桿菌C&c/zen'c/n'a co/Z)宿主菌抹M15[pREP4] (Villarejo和Zabin, 1974) (QIAGEN)。 實施例2 重組SAHH的表達，純化和分析
含pQE-30-SAHH構(gòu)建體的克隆在含氨千青霉素(100嗎/ml)和卡那霉素 (25昭/ml)大腸桿菌M15中過夜生長。O.lmM IPTG誘導表達，接著在39°C 伴隨用力振蕩生長14小時。于50mM磷酸鈉，pH8.0, 300mMNaCl中超聲 處理以破碎收獲的細胞。隨后12000g離心20分鐘。用50mM磷酸鈉，pH 6.0, 300mMNaCl，含各種濃度咪唑的10 %甘油從M-NTA柱上差異洗脫出該重組酶。純化重組酶級份不加甘油的于4'C儲藏。而其它級份與甘油混合后(終 濃度50。/。)儲存在-2(TC和-79。C以確定酶活性受到儲藏的影響。通過 Pharmacia Biotech SMART層析系統(tǒng)的尺寸排阻毛細管層析法(Superdex 200PC柱)在未變性情況下分析活性重組酶大小。 實施例3 SAHH在大腸桿菌里的表達
在大腸桿菌里已獲得SAHH基因表達，該宿主大腸桿菌提供一種 SAHH-陰性環(huán)境(Shimizu等，J所oc/zem， 141， 385-392, 1984)。在37。C用 l-2mM IPTG誘導時，含重組SAHH基因序列大腸桿菌克隆高度表達該酶， 但主要是不溶的"包涵體"。溫度降低到3(TC并且IPTG濃度降到O.lmM會 降低表達水平，導致較大比例地表達可溶性和有活性形式的酶。重組SAHH 包含約12%總可溶蛋白。 實施例4 重組蛋白的純化和特征
通過在Ni-NTA柱上親和層析來純化重組的SAHH。該酶分子量約為 55,000-56,000(圖1)。利用Superdex 200 PC毛細管柱所得尺寸排阻層析法的 結(jié)果顯示未變性條件下重組酶分子量約為55,000。在這些條件下該酶具有 活性，SDS-PAGE顯示亞基分子量約為55,000-56,000,這些數(shù)據(jù)顯示7: vag/"a&酶的功能形式是單體。該結(jié)果不同于其他人的發(fā)現(xiàn)，他們發(fā)現(xiàn)水解 酶以寡聚形式存在，酶的來源決定四級結(jié)構(gòu)。 實施例5 S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶的發(fā)酵與純化 發(fā)酵
1. 取肥大細胞庫10iul細菌接種到5mlL.B.上，37。C振蕩培養(yǎng)6小時。
2. 取步驟1中0.5ml細菌轉(zhuǎn)移到3個含400ml L. B.的瓶中，37。C振蕩 培養(yǎng)過夜。
3.4°C, 3000rpm離心收集細胞，將其懸浮于L.B.中并接種發(fā)酵。
4. 細胞在發(fā)酵器中28。C培養(yǎng)約6小時至其密度為OD600為7。
5. 加入O.lmMIPTG誘導細胞，28。C過夜培養(yǎng)。
6. 4°C， 4000rpm離心收獲細胞，-80°0儲存以備純化。 純化
1. 勻漿器中勻化3次以分解細胞。
2. 細胞分解液與2。/。PEL, 30%乙醇，8。/。PEG混合，在水浴鍋中加熱 到37°C。
3. 15000rpm離心30分鐘去除細胞;f片，收集上清。4. 加入20mM磷酸鉀緩沖液,pH 8.3,lmM DTT和EDTA稀釋上清兩倍。
5. 將上清加到預平衡的DEAE-瓊脂糖快速流柱上。
6. 該柱預先要用20mM磷酸鉀緩沖液，pH7.6， 40mMNaCl， lmMDTT 和lmMEDTA預沖洗至0D280低于0.2。
7. 用20mM磷酸鉀緩沖液，pH7.6， 100mM NaCl， lmM DTT和EDTA 洗脫SAHH。
8. 向SAHH洗脫液中加入30%甘油和lmMNAD制得終產(chǎn)物。 專一性
高度表達的克隆表達SAHH占總蛋白20%，純化后，SAHH特異活性 為1.64單位/毫克蛋白。純度超過90%。 穩(wěn)定性
如下所述配制該酶20mM磷酸鉀緩沖液，pH7.6, 100mMNaCl, 30 % 甘油，lmM DTT, lmM NAD和lmM EDTA。見圖2。 實施例6 SAHH活性的測量 試劑分析緩沖液
20mM磷酸鉀緩部液，pH 8.0, lmM DTT和lmM EDTA。
2mM S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)
rHCYase(5毫克/毫升)
L-高半胱氨酸(各種濃度)
40mMDBPDA,溶于6M鹽酸中。
40mM高4失氰化鉀
{式-驗方法
空白 標準曲線 試驗
分析緩沖液(pl) 940 970 920
rHCYase(pl) 10 10 10
L-高半胱氨酸(nl) — 20 …
SA稱1) 50 —- 50
樣品(fil) —- … 20
充分混勻，37。C培養(yǎng)5分鐘。
DBPDA(iil) 50 50 50
高鐵氰化鉀((il) 50 50 50
充分混勻，37。C培養(yǎng)10分鐘。讀取675nm吸光度或EX665nm/EM690nm熒光值。 一個單位定義為37。C在rHCYase過量存在下1分鐘水解S-腺苷高 半胱氨酸1jiM。
實施例7 rSAHH His標記的制備
為構(gòu)建表達載體，通過PCR修飾SAHH基因，5'引物為 CATCATCATCATCATCACGCTTGCAAATCACCTACTGG
6 x His . Tag
及3'引物為ATGCATGGATCCTTAATAACGGTAAGCATC。
BamHI
pTrc99A(Pharmacia Biotech)用作表達載體。修飾的His tSAHH在SAHH 基因N端有6個額外組氨酸密碼，在NcoI-鈍端和BamHI位點將其插入。 大腸桿菌JM109為His . SAHH表達的宿主菌抹。 實施例8 具有組氨酸標記的重組S-腺苷高半胱氨酸水解酶純化 細胞破碎
解凍500g表達SAHH的大腸桿菌冷凍細胞(-80。C)，將其懸浮于500ml 20mM磷酸鉀緩沖液，pH7.6,其中含有l(wèi)mM DTT和lmM EDTA。用勻漿 器(Hc-8000， Microfluidics International Corporation)于5000psi三次石皮碎細月包。 石克酸銨沉淀
向破碎細胞懸浮液中加入結(jié)晶硫酸銨(20 % W/V)，冰上混合20分鐘后， 在4。C, 12000rpm離心30分鐘，然后收集上清以備進一步純化。 Ni-NAT Superflow層析
將含有10mM咪唑的澄清上清加到用結(jié)合緩沖液(Binding Buffer)(50mM磷酸鉀緩沖液，pH 7.6， 0.5M NaCl, 10mM咪唑，lmM EDTA 和0.01 % a-巰基乙醇)平衡過的Ni-NAT Superflow柱中(2.0 x 20cm)。用3 倍柱體積結(jié)合緩沖液沖洗該柱使其280nm的吸光度值達到基線，然后用沖 洗緩沖液(50mM磷酸鉀緩沖液，pH 7.6, 0.5M NaCl, 50mM咪唑，lmM EDTA 和0.01 % a -巰基乙醇)沖洗使其280nrn的吸光度值達到基線。洗脫緩沖液 (50mM石岸酸鉀纟爰沖液，pH 7.6, 0.5M NaCl, 300mM咪唑，lmM EDTA和lmM DTT)洗脫酶。匯集活性級分并用含lmM DTT和lmM EDTA 50倍體積 20mM磷酸鉀緩沖液透析。終產(chǎn)物用30%甘油和lmMNAD儲存在-80。C。
用^5克酸銨和親和層析兩步程序來純化重組SAHase,該程序特別快而且 有效。該制品通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳產(chǎn)生一條帶。上述方法純化 rSAHase特異活性為1.79單位/毫克蛋白。序列表
〈110〉抗癌公司(Anticancer, Inc.) 徐明旭(Xu， Mingxu) 韓慶宏(Han， Qinghong)
〈120〉高特異活性重組S-腺苷高半胱氨酸酶(SAHH)的制備 與高度表達及對S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的改進分析
<130〉 31276、20026. 43
<140〉 PCT/US 01/01114 〈141〉 2001—0H2
<150〉 US 60/176,444 〈151〉 2000—01-14
<160〉 6
<170〉 FastSEQ for Windows Version 4.0
〈210〉 1
<211〉 1461
<212> DNA
<213〉陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)
<400〉 1
atggcttgcs
catgttctcg
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cctgcaacatcttctctacacaagatacagccgctgctgctatcgttgtc300
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<210〉 2
〈211〉 485
<212〉 PRT
<213>陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)<400> 2
AlaCysLysSerProThrGlyAlaProPheGluTyrArglieAlaAsp
151015
lieAsnLeuHisValLeuGlyArgLysGluLeuThrLeuAlaGluLys
202530
GluMetProGlyLeuMetValLeuArgGluArgTyrSerAlaSerLys
354045
ProLeuLysGlyValArglieSerGlySerLeuHisMetThrValGin
505560
ThrAlaValLeulieGluThrLeuThrAlaLeuGlyAlaAspValArg
65707580
TrpAlaSerCysAsnliePheSerThrGinAspThrAlaAlaAlaAla
859095
lieValValGlyProThrGlyThrProGluLysProAlaGlyliePro
100105110
ValPheAlaTrpLysGlyGluThrLeuProGluTyrTrpGluAsnThr
115120125
TyrArgAlaLeuThrTrpProAspGlyGinGlyProGinGinValVal
130135140
AspAspGlyGlyAspAlaThrLeuLeulieSerLysGlyPheGluPhe
145150155160
GluThrAlaGlyAlaValProGluProThrGluAlaAspAsnLeuGlu
165170175
TyrArgCysValLeuAlaThrLeuLysGinValPheAsnGinAspLys
180185190
AsnHisTrpHisThrValAlaAlaGlyMetAsnGlyValSerGluGlu
195200205
ThrThrThrGlyValHisArgLeuTyrGinLeuGluLysGluGlyLys
210215220
LeuLeuPheProAlalieAsnValAsnAspAlaValThrLysSerLys
225230235240
PheAspAsnlieTyrGlyCysArgHisSerLeulieAspGlylieAsn
245250255
ArgAlaSerAspValMetlieGlyGlyLysThrAlaLeuValMetGly
260265270
TyrGlyAspValGlyLysGlyCysAlaGinSerLeuArgGlyGinGly
275280285
AlaArgVallielieThrGluValAspProlieCysAlaLeuGinAla
290295300
AlaMetGluGlyTyrGinValArgArglieGluGluValValLysAsp
305310315320
ValAspliePheValThrCysThrGlyAsnCysAsplielieSerVal
325330335
AspMetMetAlaGinMetLysAspLysAlalieValGlyAsnlieGly
340345350
HisPheAspAsnGlulieAspThrAspGlyLeuMetLysTyrProGly
355360365
lieLysHislieProlieLysProGluTyrAspMetTrpGluPhePro
370375380
AspGlyHisAlalieLeuLeuLeuAlaGluGlyArgLeuLeuAsnLeu
385390395400
GlyCysAlaThrGlyHisProSerPheValMetSerMetSerPheThr
405410415
AsnGinThrLeuAlaGinLeuAspLeuTyrGluLysArgGlyAsnLeu
420425430
GluLysLysValTyrThrLeuProLysHisLeuAspGluGluValAla
435440445
ArgLeuHisLeuGlySerLeuAspValHisLeuThrLysLeuThrGin450 455 460
Lys Gin Ala Asp Tyr lie Asn Val Pro Val Glu Gly Pro Tyr Lys Ser 465 470 475 480
Asp Ala Tyr Arg Tyr 485
<210> 3 <211〉 33 <212〉 DNA <213〉人工序列
<220〉
<223>上游引物
<400〉 3
ttttggatcc gcttgcaaat cacctgctgg tgc
<210〉 4
<211〉 24
<212〉 DNA <213〉人工序列
33
<220〉
<223〉下游引物 <400〉 4
ttttctgcag ggggagctat cgtc 24
<210〉 5 〈211〉 38 〈212〉 DNA <213>人工序列
<220>
<223〉引物 〈400〉 5
catcatcatc atcatcacgc ttgcaaatca cctactgg 38
<210〉 6 <211〉 30 <212〉 DNA <213>人工序列
<220〉
<223〉引物 <400〉 6
ctacgaatgg caataattcc taggtacgta 30
權(quán)利要求
1.評估生物液體樣品中S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的治療性水平的方法，該方法包括將有效量的甘氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶(GMT)，有效量的S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)或His·SAHH，以及甘氨酸加入該樣品中；測量所述樣品中一種或多種反應產(chǎn)物，其中所述一種或多種反應產(chǎn)物的水平與樣品中SAM水平成正比。
2. 權(quán)利要求l的方法，其中被檢測的產(chǎn)物是高半胱氨酸(HC)。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中所述HC是由下述方法測得，該方法包括 用高半胱氨酸酶(HCYase)處理樣品，并測定所述高半胱氨酸與HCYase反應 得到的至少 一種產(chǎn)物的濃度。
4. 權(quán)利要求3的方法，其中測得的產(chǎn)物是H2S。
5. 權(quán)利要求4的方法，其中所述H2S通過熒光或吸光度而測定。
6. 權(quán)利要求1的方法，其中所述SAHH包含SEQIDNO: 1編碼的氨基 酸序列。
7. 分析含SAM的樣品的試劑盒，該試劑盒包括SAHH或His 'SAHH， GMT,甘氨酸及使用說明。
8. —種測定S-腺苷曱硫氨酸(SAM)濃度的方法，包括 含SAM的生物樣品；和有效量的甘氨酸N-曱基轉(zhuǎn)移酶(GMT)，甘氨酸，以及S-腺苷高半胱氨 酸水解酶(SAHH)或N-端組氨酸標記的SAHH(His . SAHH),其中SAHH或His . SAHH活性產(chǎn)生一種可測定的產(chǎn)物以確定樣品中 SAM的量。
全文摘要
本發(fā)明提供涉及SAM檢測和制備的新方法及新SAHH酶活性在該方法中的應用。還提供涉及新SAHH的其它方法，組合物及試劑盒。
文檔編號G01N33/68GK101298627SQ20081009000
公開日2008年11月5日 申請日期2001年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月14日
發(fā)明者徐明旭, 韓慶宏 申請人:抗癌公司