專利名稱：：人尿中三聚氰胺和三聚氰酸的液質(zhì)聯(lián)用定量檢測法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及人尿中三聚氰胺和三聚氰酸的液質(zhì)聯(lián)用(液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù))定量檢測方法。
背景技術(shù)：
：三聚氰胺(Melamine,2，4，6-三氨基-1,3,5-三嗪)，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，分子式C3N3(NH2h，分子量126.12。結(jié)構(gòu)式為H。NNNH三聚氰胺遇強(qiáng)酸或強(qiáng)堿水溶液水解，胺基逐步被羥基取代，先生成三聚氰酸-酰胺，進(jìn)一步水解生成三聚氰酸一酰胺，最后生成三聚氰酸HO由于蛋白質(zhì)主要由氨基酸組成，其含氮量一般不超過30%，而三聚氰胺的分子式(C3N6H6)含氮量為66.7%。現(xiàn)階段通用的蛋白質(zhì)測試方法"凱氏定氮法"，是通過測出含氮量來估算蛋白質(zhì)含量，因此，不法分子在食品中添加三聚氰胺使得食品的蛋白質(zhì)測試含量上升。1978年Newton和UUey發(fā)現(xiàn)三聚氰胺具有這種作用，近期曝光的三鹿嬰幼兒奶粉中含有大量三聚氰胺也是基于同樣的緣由。毒性學(xué)研究表明三聚氰胺在體內(nèi)的毒性非常微弱，大鼠口服的LD5Q(半數(shù)致死量)為3161mg/kg。1994年國際化學(xué)品安全規(guī)劃署和歐洲聯(lián)盟委員會合編的《國際化學(xué)品安全手冊》第三巻和國際化學(xué)品安全卡片指出長期或反復(fù)大量攝入三聚氰胺可能對腎與膀胱產(chǎn)生影響，導(dǎo)致產(chǎn)生結(jié)石。動物實(shí)驗(yàn)表明三聚氰胺在尿內(nèi)形成草酸鈣結(jié)晶，與泌尿系統(tǒng)結(jié)石有明顯的關(guān)聯(lián)性，并可引起腎功能衰竭，導(dǎo)致動物死；近期在我國所發(fā)生嬰兒死亡事件也支持這種觀點(diǎn)。據(jù)報道，三聚氰胺在不同物種中代謝存在差異。其在豬體內(nèi)的其半衰期大約為4.04土0.37h，是老鼠體內(nèi)(2.71h)的1.5倍，其原因?yàn)槔鲜蟮哪I臟清除率是豬的5倍。三聚氰胺在體內(nèi)的清除機(jī)制并不明確，但是根據(jù)其作為極性小分子的理化性質(zhì)，以及豬體內(nèi)的清除率(27ml/min)和腎小球?yàn)V過率(31-42ml/min),可以認(rèn)為主要經(jīng)腎臟清除。雄性Fischer大鼠的毒代研究表明，24h90%的口服劑量在尿中清除，28小時已經(jīng)超過99%，腎臟和膀胱中三聚氰胺的量髙于其他組織。體內(nèi)清除速度如此之快，說明三聚氰胺可能很少在體內(nèi)聚集。動物實(shí)驗(yàn)研究表明，在豬體內(nèi)三聚氰胺的表觀分部容積為0.61(±0.04)L/kg，接近體液的總量，故推測三聚氰胺在豬體內(nèi)主要分布于細(xì)胞外液，大部分器官組織中并不存在?，F(xiàn)有的文獻(xiàn)資料表明，三聚氰胺在不同的哺乳動物中的代謝特征有較大的差異；有關(guān)三聚氰胺在人體的代謝情況尚未見報道。目前常見的三聚氰胺檢測方法有髙效液相色譜法(HPLC法)、反相HPLC法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、升華法、離子交換色譜-紫外檢測法。樣品來源主要為動物食品、飼料、乳制品。樣品處理方法多需固相萃取、過濾、衍生化處理等步驟，測定方法中均未見同位素內(nèi)標(biāo)的使用。2008年9月媒體報道三鹿嬰幼兒奶粉中檢測出三聚氰胺，并導(dǎo)致食用該奶粉的嬰幼兒發(fā)生腎結(jié)石的重大食品安全事件，引起了全社會的關(guān)注。建立可靠靈敏的人尿中三聚氰胺和三聚氰酸的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)定量檢測方法，以便能及時了解人體內(nèi)三聚氰胺的殘留情況、臨床跟蹤觀察并采取有效的診療措施等，均具有十分重大的臨床意義。有關(guān)三聚氰胺和三聚氟酸在人尿中的檢測方法尚未見報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題，在于利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜和同位素稀釋質(zhì)譜原理，為臨床提供一種搡作簡便、專一靈敏的臨床人尿中三聚氰胺和三聚氰酸定量檢測方法，以滿足臨床的需求。本發(fā)明公開的定量檢測的方法包括釆用同位素稀釋技術(shù)，在尿樣的預(yù)處理時分別加入含13C3;15N3-三聚氰胺或氘代三聚氰胺和13C3;15N3-三聚氰酸的內(nèi)標(biāo)溶液；液-液萃取法分別提取尿中三聚氰胺和三聚氰酸；建立LC-MS/MS方法分別定量檢測人尿中三聚氰胺和三聚氰酸濃度，液相色譜以苯基、氟苯基、硅膠等填料柱為固定相，甲醇、乙腈、水、甲酸溶液或混合液為流動相，色譜分離進(jìn)行等度洗脫或梯度洗脫，質(zhì)譜檢測采用電噴霧電離源(ESI)檢測人尿中三聚氰胺和三聚氰酸含量。三聚氰胺和三聚氰酸的最低定量限可達(dá)IOng/ml。本發(fā)明方法包括以下步驟1、樣品預(yù)處理根據(jù)三聚氰胺和三聚氰酸的酸堿性質(zhì)，采用液-液萃取的樣品預(yù)處理方法分別處理三聚氰胺和三聚氰酸樣品。三聚氰胺用氫氧化鈉或氨水堿化，液-液萃取所用的提取溶劑為乙酸乙酯。三聚氟酸用甲酸酸化，液-液萃取所用的提取溶劑為異丙醇、乙酸乙酯或者二者的混合溶劑。2、液相分離三聚氰胺和三聚氰酸分別進(jìn)行液相色譜分離(1)流動相由A和B組成，流速為0.2-0.5ml，其中A為含0.0001~0.1%甲酸水溶液，B為含0.0001~0.1%甲酸的甲醇或乙腈或甲醇和乙腈的混合液。(2)色譜柱采用苯基、氟苯基、氰基、硅膠等填料柱，色譜柱內(nèi)徑為15rnrn，長度為50~250mm(3)洗脫方法采用等度或梯度洗脫方式。釆用等度洗脫時，流動相A為0.02y。甲酸水，流動相B為含O.02%甲酸的體積比為1:1的甲醇和乙腈溶液，A:B為體積比(20-50):(80~50)。采用梯度洗脫時，流動相A:甲醇(含0.001%甲酸)，流動相B:水，梯度比例A為10~100%，B為0~90%。使用色譜柱為XbridgeTMPhenyl(150x2.lmm，5jum，Waters),梯度程序可參考表1;流速0.35ml/min。表l流動相梯度程序表<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>3、質(zhì)譜檢測三聚氰胺釆用電噴霧電離源(ESI)，正離子多反應(yīng)監(jiān)測掃描(MRM)，離子選擇通道(Ql/Q3):三聚氰胺m/z127/68(定量)和127/85(定性)，內(nèi)標(biāo)通道為13C3;15N3-三聚氰胺m/z133/72。離子通道范圍可為土l.Oamu。三聚氰酸采用電噴霧電離源(ESI),負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測掃描(MRM)，離子選擇通道(Ql/Q3):ra/z128/42(定量)和128/85(定性)，內(nèi)標(biāo)13C3;15N3-三聚氰酸m/z134/44。離子通道范圍可為土l.Oamu。4、濃度計算方法和檢測限按內(nèi)標(biāo)法以峰面積或峰高法，分別計算尿中三聚氰胺和三聚氰酸含量。本發(fā)明三聚氰胺和三聚氰酸的檢測限為lng/ml，定量范圍為10-5000ng/ml，線性相關(guān)系數(shù)0.9990以上，批內(nèi)、批間精密度小于10°/。，準(zhǔn)確度85-115%之間。樣品穩(wěn)定性良好。本發(fā)明的有益結(jié)果是1.根據(jù)三聚氰胺和三聚氰酸不同的理化性質(zhì)，本發(fā)明分別對其進(jìn)行樣品處理、色譜分離和質(zhì)譜檢測。建立了相對經(jīng)濟(jì)簡便的人尿中三聚氰胺和三聚氰酸的預(yù)處理方法。本研究采用了液液萃取的樣品預(yù)處理方法，在滿足方法學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)的前提下，與已有的固相萃取方法相比，更為快速、簡便和經(jīng)濟(jì)。2.采用同位素稀釋法定量，在尿樣的預(yù)處理時就加入三聚氰胺和三聚氰酸穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)，實(shí)現(xiàn)了對測試的全過程的跟蹤校正，確保測定結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。3.本發(fā)明方法對樣品檢測的專一性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便，各項(xiàng)方法學(xué)指標(biāo)均能達(dá)到中國藥典的相關(guān)技術(shù)要求。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但不限制本發(fā)明。實(shí)施例中非特別聲明均為體積百分濃度。實(shí)施例1檢測條件和方法實(shí)例1.試劑配制(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線吸取三聚氰胺和三聚氰酸標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，加入雙重蒸餾水，分別制成含三聚氰胺和三聚氰酸濃度為10、50、100、500、1000、2500、5000ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)水溶液。含7個濃度點(diǎn)，每個濃度配制lml。(2)質(zhì)控品吸取三聚氰胺和三聚氰酸標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，加入雙重蒸餾水，分別制成含三聚氰胺和三聚氰酸濃度為10，20，2000，4000ng/ml的三聚氰胺和三聚氰酸作為質(zhì)控品，含4個濃度點(diǎn)，每個濃度配制2ml。(3)內(nèi)標(biāo)吸取250^1三聚氟胺內(nèi)標(biāo)(lOOjag/ml)溶液至10ml容量瓶，用50%甲醇水溶液定容，配制成2.5yg/ml工作溶液，4'C冷藏備用，得2.5ng/ml三聚氰胺內(nèi)標(biāo)溶液。同時，另外吸取250|Lil三聚氟酸內(nèi)標(biāo)U00ug/ml)溶液至10ml容量瓶，用50%甲醇水溶液定容，配制成2.5ug/ml工作溶液，4'C冷藏備用，得2.5yg/ml三聚氰酸內(nèi)標(biāo)溶液。(4)流動相(甲醇乙腈為1:1，含0.02%甲酸溶液)將500ml甲醇與500ml乙腈混合，取200pl甲酸溶液于混合液中，混勻，即得。(5)流動相(含O.02%甲酸水溶液)取200ul甲酸溶液于1000ml水中，混勻，即得。(6)流動相(含0.001%甲酸甲醇溶液)取IOm1甲酸溶液于1000ml甲醇中，混勻，即得。(7)1%甲酸水溶液取lml甲酸溶液于100ml水中，混勻，即得。U)0.1°/。甲酸水溶液取100pl甲酸溶液于100ml水中，混勾，即得。(9)1%氣氧化鈉溶液稱取lg氣氧化鈉，溶于100ral水中，混勻，即得。(10)提取溶劑取異丙醇和乙酸乙酯，按體積比5:95的比例混合。配制總體積1000ml。2.尿樣采集釆集臨床尿樣約2ml，然后在-8(TC保存。樣品測定時，取凍存樣品室溫下解凍，備用。3.樣品預(yù)處理3.1測定人尿樣中三聚氰胺處理步驟取尿樣，依次加入10W三聚氰胺同位素內(nèi)標(biāo)工作液(5Mg/ml)及20nUNNaOH溶液,渦旋10s,加入lral乙酸乙酯，旋渦振蕩10min，18000rpm離心3min;吸取上層有機(jī)相，加入100)4含0.1。/。甲酸的水溶液，旋渦振蕩10min,18000rpm離心3min;吸取下層水相轉(zhuǎn)移至300u1塑料管進(jìn)樣分析。3.2測定人尿樣中三聚氰酸處理步驟取尿樣，依次加入10W三聚氰酸同位素內(nèi)標(biāo)工作液(5yg/ml)及20n1含1°/。甲酸的水溶液，渦旋10s，加入lml含5%異丙醇的乙酸乙酯溶液，旋渦振蕩10min，18000rpm離心3min;吸取上層有機(jī)相，潔凈空氣37'C吹干，殘渣加入10(HxL含70%甲醇的水溶液，旋渦振蕩3rain,18000rpm離心3min，轉(zhuǎn)移至300|ul塑料管進(jìn)樣分析。4.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測定條件4.1色譜條件4.1.1測定三聚氰胺色譜條件柱AllurePFPPropyl(100x2.1mm,5",RESTEK)柱CI8(4.0x3.Omra，5jam,Phenomenex)相流動相A:雙蒸水(含O.02%甲酸)流動相比例流速柱溫進(jìn)樣量-.典型保留時間:流動相B:甲醇/乙腈(1:1,含O.02%甲酸)A:B=70:300.4ml/rain室溫三聚氰胺1.9min;內(nèi)標(biāo)1.9min4.1.2測定三聚氰酸色譜條件XbridgeTMPhenyl(150".1mm,5|jm,Waters)CI8(4.0x3.O線5nm，Phenomenex)甲醇(含O,001%甲酸)0.35ml/min室溫三聚氰酸1.3min;內(nèi)標(biāo)1.3min色譜柱保護(hù)柱流動相流速柱溫進(jìn)樣量典型保留時間4.2質(zhì)譜條件4.2.1測定三聚氰胺質(zhì)譜條件儀器API3000離子源電噴霧離子源掃描方式正離子MRM掃描離子源參數(shù)霧化氣60psi(10*);氣簾氣40psi(10*);碰撞氣42ps:(7*);輔助氣7L/min;電壓5500V;溫度450。C(注*為儀器設(shè)定值)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>4.2.2測定三聚氰酸質(zhì)譜條件儀器3200QTrap離子源電噴霧離子源掃描方式負(fù)離子MRM掃描離子源參數(shù)霧化氣50*;氣簾氣20*;碰撞氣High*;輔助氣50*;電壓-4500V;溫度500'C(注*為儀器設(shè)定值)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>5.濃度計算方法按內(nèi)標(biāo)法以峰面積或峰高法，計算尿中三聚氰胺和三聚氰酸的濃度。6.結(jié)果三聚氰胺和三聚氰酸測定的方法學(xué)包括線性關(guān)系、準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性等均符合中國藥典的規(guī)定。實(shí)施例2色譜條件試劑配制、樣品的采集及樣品處理的方法、檢測條件同實(shí)施例l。色譜條件中三聚氰胺改用ThermoHypersilSilica(150mmx2.1mmi.d.，5|um，Thermo)分析柱，等度洗脫，流動相(A)0.0001%甲酸水，(B)0.0001'/。甲酸乙腈，A:B為體積比15:85。在此條件下，三聚氰胺和內(nèi)標(biāo)的保留時間為2.6min。三聚氰酸采用RESTEKAllurePFPPropyl(100咖x2.1mmi.d.，5nm,RESTEK)分析柱，等度洗脫，流動相(A)0.1%甲酸水，(B)0.1%甲酸50%乙腈50%甲醇，A:B為體積比30:70。在此條件下，三聚氰酸和內(nèi)標(biāo)的保留時間為1.3min。三聚氰胺和三聚氰酸的色譜峰峰形良好，在相應(yīng)的色譜保留時間未見干擾存在。實(shí)施例3方法學(xué)驗(yàn)證釆用實(shí)施例1所列的檢測條件和方法，對測定方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。在10-5000ng/ml三聚氰胺和三聚氰酸的濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好(r>0.9990),最低檢測限可達(dá)lng/ml。批內(nèi)、批間精密度RSD分別《3.26%和《5.43%,準(zhǔn)確度為93.7-102.8%。提取回收率為78.0-83.3%，RSD<4.6°/。，介質(zhì)效應(yīng)為96.4~97.6%。方法學(xué)驗(yàn)證的結(jié)果說明LC-MS/MS可靈敏、準(zhǔn)確、快速地對大批量臨床樣品進(jìn)行檢測。1.標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量范圍按實(shí)施例1方法配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分三批處理和進(jìn)樣測定，共得3套標(biāo)準(zhǔn)曲線。以濃度為x軸，三聚氰胺和三聚氰酸與各自同位素內(nèi)標(biāo)峰面積之比為y軸，進(jìn)行線性回歸，建立回歸方程。結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.0304X+0.04036(三聚氰胺)，Y-0.00406X+0.01367(三聚氰酸)。3批次測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的r值分別為0.9994~0.9998。詳見表2。本法三聚氰胺和三聚氰酸的最低定量限為10ng/ml。表2標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果(3批次，每批11=2)理論濃度測定濃度(ng/ml)仏^準(zhǔn)確度批次1批次2批次3%RSD三聚氰胺1010.08.78.89.1509.42791.505051.151.354.652.334.550104.710098.4跳794.797.823.30297.82500500.4520.1515.4511.92.368102.410001005.21065.01081.010504.051105.025002426.52540.52454.524742.38098鄰50005068.04874.04951.049642.10299.29斜率0.03090.030.03030.03041.507/截距-0.006430.04260.08490.04036//相關(guān)系數(shù)r0.99970.99940.99940.9995//三聚氰酸109.09.38.48.9316.49289.315054.053.052.052.993.583106.0100103.8102.5105.7104.01.726104.0500510.4497.6522.0510.02.745102,01000968.4997.21040.010023.239100.225002426.52453.02458.524462.09397.8450005088.05047.54974.050372.108100.7斜率0.004130.004070.003990.004061,729/截距0.01070.01130.0190.01367//相關(guān)系數(shù)r0.99940.99980.99970.9996//2.準(zhǔn)確度與精密度按實(shí)施例1方法配制質(zhì)控品。每種濃度配制6份，在同一天內(nèi)按上述樣品處理方法及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜條件進(jìn)行處理和分析，計算批內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度。按上述方法，分3天配制3批樣品處理和分析，計算批間精密度和準(zhǔn)確度。結(jié)果見10表3，批內(nèi)、批間精密度CVy。《10%,準(zhǔn)確度88.91~111.6%之間。表3準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果(3批次，每批n-6)理論濃度(ng/ml)批內(nèi)批間精密度(°/)準(zhǔn)確度《)批次l批次2批次3批次1批次2批次3精密度(w準(zhǔn)確度(%)M105.8037.7977.054111.6100.192.7410.12100.9204.0147.42010.16104.5104.4100.47.321103,0M20003.9844.4792.96594.72104.8103.95.875101.140000.87570.67162.28392.97101.698.524.00297.69CA10202000400016.1110.192.3611.8467.4195.4493.4572.40215.1213.433.3052.638104.4102.796.91101.3100.298.0498.9697.7188.9195.59101.798.4114.379.9743.5562.69697.8198.5699.2099.13注MLM:三聚氱胺，CA:三聚氰酸3.提取回收率三聚氰胺、三聚氰酸及各自內(nèi)標(biāo)的提取回收率見表4，結(jié)果顯示低、中、髙濃度質(zhì)控樣品的三聚氰胺平均提取回收率分別為17.69%、20.23%和20.88%;三聚氰胺內(nèi)標(biāo)的提取回收率為19.68%;三聚氰酸平均提取回收率分別為70.88%、71.51%和64.32%;三聚氰酸內(nèi)標(biāo)的提取回收率為64.59°/。。表4三聚氰胺、三聚氰酸及內(nèi)標(biāo)的提取回收率提取回收率(％)重復(fù)次數(shù)三聚氰胺內(nèi)標(biāo)20ng/ml2000ng/ml4000ng/ml250ng/ml117,1819.8122,2118.2218.1821.12217.4418.5521.7619.4818.6020.90317.8921.3016.9018.2221.7916.08417.7220.2521.3520.1619.6920.30518.5620.4122.3120.4520.4420.96617.3321.0920.7519.0521.1619.46均值17朋20.2320.8819.68標(biāo)準(zhǔn)差SD0.49760.99102.0341.430%RSD2.8134.8989.7427.266提取回收率(％)重復(fù)次數(shù)三聚氰酸內(nèi)標(biāo)20ng/ml2000ng/ml4000ng/ml250ng/ml183.3269.5475.2183.9664朋59.16275,3575.0375.6680.5166.6862.41359.8068.7172.0272.9863.2357.744NA70.6456.3781.1266.6844.52577.1470.9135.5574.2067.0928.06658.8074.2171.1165.4667.2956.92均值70.8871.5164.3264.59標(biāo)準(zhǔn)差SD10.982.55115.7713.21%RSD15.503.56824.5220.454.穩(wěn)定性4.l樣品在自動進(jìn)樣器中(室溫)的穩(wěn)定性三個濃度質(zhì)控樣品，經(jīng)過樣品處理步驟搡作后，放入自動進(jìn)樣器中(室溫)，在不同時間測定，其結(jié)果見表5，表明提取后的樣品在自動進(jìn)樣器中6h內(nèi)穩(wěn)定。表5自動進(jìn)樣器穩(wěn)定性結(jié)果時間(h)二聚氰胺(ng/ml)三;艮氰酸(ng/ml)2020004000202000糊0022.012027401919.2719574006221.771986399020.2619753991420.231958382821.8920284003620.911936382622.7120024247均值21.231977391621.0319914062標(biāo)準(zhǔn)差SD0.817039.25103.21.55531.10123.7%RSD3.8481.9862.6357.3931.5623.045準(zhǔn)確度(％)106.298.8497.89105.299.53101.54.2樣品室溫放置的穩(wěn)定性質(zhì)控樣品室溫放置24h內(nèi)的濃度測定值結(jié)果見表6。結(jié)果表明樣品在室溫放置24h內(nèi)保持穩(wěn)定。表6樣品室溫放置的穩(wěn)定性結(jié)果時間(h)聚氰胺(ng/ml)三l!氰酸(ng/ml)20200040002020004000022.012027401920.8220264120228.47204844471.64559.60104.7621.53223639817.9022.9422.5412421.321684287104.1101.3103.0均值23.332120418420.8220264120標(biāo)準(zhǔn)差SD3.441199.32222.31.64559,60104.7%RSD14.754.6855.3137,9022.9422.541準(zhǔn)確度(％)116.6106,0104.6104.1101.3103,04.3多次凍融試驗(yàn)凍融后與不經(jīng)凍融的質(zhì)控樣品的濃度測定值結(jié)果見表7。結(jié)果表明三個濃度質(zhì)控樣品經(jīng)過3次凍融后的仍保持穩(wěn)定。表7凍融試驗(yàn)穩(wěn)定性結(jié)果凍融次數(shù)-三聚氰胺(ng/ml)三！《氰酸(ng/ml)20200040002020004000022.012027401919.2719574006119.822151420421.7620453986225.892021427422.920954073320.922268418920.4520634181均值22.162117417221.1020404062標(biāo)準(zhǔn)差SD2,643117.3108.21.57659.0787.93WSD11.925.5412.5947.4692.8962.165準(zhǔn)確度(％)110.8105.8104.3105.5102.0101.5實(shí)施例4臨床尿樣中的測定結(jié)果按實(shí)施例1的條件和方法，從2008年9月19日到2008年10月1日期間，收集到"奶粉門診"嬰幼兒尿樣86例，年齡0-8歲。收集成人健康體檢尿樣IIO例年齡25-57歲。尿樣中三聚氰胺和三聚氰酸測定結(jié)果見表8。表8"奶粉門診"嬰幼兒和健康體檢尿樣中三聚氰胺和三聚氰酸的濃度分布范圍及比例<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>從表8可見，110例健康體檢尿樣中96例(87.2%)檢測出三聚氰胺，109例(99.1%)檢測出三聚氰酸。說明采用同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法可靈敏、準(zhǔn)確的對尿樣中三聚氰胺和三聚氰酸進(jìn)行定量檢測。權(quán)利要求1.人尿中三聚氰胺和三聚氰酸的液質(zhì)聯(lián)用定量檢測法，其特征在于，以同位素稀釋法定量，在尿樣的預(yù)處理時加入含三聚氰胺和三聚氰酸穩(wěn)定同位素的內(nèi)標(biāo)溶液；液-液萃取法分別提取尿中三聚氰胺和三聚氰酸；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測人尿中三聚氰胺和三聚氰酸含量；按內(nèi)標(biāo)法以峰面積或峰高法，計算尿中三聚氰胺和三聚氰酸的濃度。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述定量檢測方法，其特征在于，在尿樣預(yù)處理時添加的穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)分別是13C3;15N3-三聚氰胺或氘代三聚氰胺，13C3;15N3-三聚氰酸。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述定量檢測方法，其特征在于，所述液-液萃取是樣品用氫氧化鈉或氨水堿化，然后用提取溶劑乙酸乙酯提取三聚氰胺；樣品用甲酸酸化，再用提取溶劑異丙醇或乙酸乙酯，或異丙醇和乙酸乙酯的混合溶劑提取三聚氰酸。4.根據(jù)權(quán)利要求l所述定量檢測方法，其特征在于，色譜分離時以苯基、氟苯基、硅膠等填料柱為固定相，甲醇、乙腈、水、甲酸溶液或混合液為流動相，色譜分離，等度洗脫或梯度洗脫。5.根據(jù)權(quán)利要求i所述定量檢測方法，其特征在于，質(zhì)譜檢測用電噴霧電離源；(1)三聚氰胺用正離子多反應(yīng)監(jiān)測掃描(MRM)模式，離子選擇通道(Q1/Q3):定量通道m(xù)/z127/68和定性通道m(xù)/z127/85，內(nèi)標(biāo)通道為13C3,15N3-三聚氰胺ra/z133/72;(2)三聚氰酸用負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測掃描(MRM)模式，離子選擇通道(Q1/Q3):定量通道m(xù)/z128/42和定性通道m(xù)/z128/85,內(nèi)標(biāo)通道13C3,15N3-三聚氰酸m/z134/44。全文摘要本發(fā)明公開的人尿中三聚氰胺和三聚氰酸的液質(zhì)聯(lián)用定量檢測法，其特征在于包括采用同位素稀釋技術(shù)，在尿樣的預(yù)處理時分別加入含13C3；15N3-三聚氰胺或氘代三聚氰胺和13C3；15N3-三聚氰酸的內(nèi)標(biāo)溶液；液-液萃取法分別提取尿中三聚氰胺和三聚氰酸；建立LC-MS/MS方法分別定量檢測人尿中三聚氰胺和三聚氰酸濃度，液相色譜以苯基、氟苯基、硅膠等填料柱為固定相，甲醇、乙腈、水、甲酸溶液或混合液為流動相，色譜分離進(jìn)行等度洗脫或梯度洗脫，質(zhì)譜檢測采用電噴霧電離源(ESI)檢測人尿中三聚氰胺和三聚氰酸含量。三聚氰胺和三聚氰酸的最低定量限可達(dá)10ng/ml。本方法的樣品處理經(jīng)濟(jì)、簡便，檢測專一性強(qiáng)、靈敏度高，各項(xiàng)方法學(xué)指標(biāo)均能達(dá)到中國藥典的相關(guān)技術(shù)要求。文檔編號G01N30/00GK101446574SQ200810200988公開日2009年6月3日申請日期2008年10月10日優(yōu)先權(quán)日2008年10月10日發(fā)明者健何,琛余,昀劉,劉罡一,劉艷梅,紅周,周菊珍,宋曉濤,張夢琪,方戴,朱建民,李水軍,賈晶瑩,川陸,高淳新申請人:上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院