專利名稱：腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)及腺苷脫氨酶活性濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定腺苷脫氨酶
活性濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
醫(yī)學(xué)研究表明，腺苷脫氨酶是一種與機(jī)體細(xì)胞免疫活性有重要關(guān)系的核酸代謝酶。因此，腺苷脫氨酶活性的測(cè)定被作為良惡性胸腹水，腦脊液鑒別診斷，重癥聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)，急、慢性肝炎，肝硬化，肝癌等疾病鑒別的重要診斷標(biāo)志。 腺苷脫氨酶的活性測(cè)定方法主要有放射核素法、物理方法和生化法。據(jù)申請(qǐng)人了解，目前國(guó)際上普遍采用紫外光法，其測(cè)定原理是腺苷(白色結(jié)晶粉末)+水(H20)腺苷脫氨酶肌苷(Inosine) +氨離子(NH4+)，此反映過(guò)程生成的肌苷會(huì)在波長(zhǎng)為265nm處顯現(xiàn)，因此可以通過(guò)測(cè)定此波長(zhǎng)處吸光度的大小直接反映腺苷脫氨酶活性的大小。然而，此方法無(wú)法用一般醫(yī)院的可見(jiàn)光分析儀測(cè)定，而需要使用專門的紫外光分析儀，因此難以切實(shí)推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetricMethod)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，連續(xù)監(jiān)測(cè)還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè)定腺苷脫氨酶活性濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，采用該試劑(盒)不僅可以在紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行腺苷脫氨酶活性濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明腺苷脫氨酶活性濃度測(cè)定方法如下
腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨 氨+2水+6高鐵細(xì)胞色素c亞硝酸還原酶/Ca2+亞硝酸+
6亞鐵細(xì)胞色素c 亞硝酸+水+輔酶硝酸還原酶硝酸+還原型輔酶 這種方法應(yīng)用腺苷脫氨酶(Adenosine Deaminase ;EC 3.5.4.4)酶(偶)聯(lián)亞石肖酸還原醇(nitrite reductase ;EC 1. 7. 2. 2)、石肖酸還原醇(nitrate reductase;EC1. 7. 1. 1 ;EC 1. 7. 1. 2 ;EC 1. 7. 99. 4)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)法。腺苷脫氨酶酶解腺苷反應(yīng)產(chǎn)生氨，再通過(guò)(偶)聯(lián)合亞硝酸還原酶、硝酸還原酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒(méi)有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度，通過(guò)測(cè)量340nm處吸光度上升的速度，可以測(cè)算腺苷脫氨酶的活性濃度大小。 實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明腺苷脫氨酶診斷試劑較為理想
100,1/L500,1/L3mmol/L 亞硝酸還原酶 6000U/L
硝酸還原酶 8000U/L
腺苷 4mmol/L
高鐵細(xì)胞色素C 6mmol/L
氯化鈣 3mmol/L 鈣離子是亞硝酸還原酶的激活劑，因此氯化鈣可用其它鈣鹽取代。
本發(fā)明的腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、腺苷、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣。
試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶。 輔酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、腺苷、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑l 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、硝酸還原酶。
試劑3 緩沖液、穩(wěn)定齊U、亞硝酸還原酶。 輔酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、腺苷、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定腺苷脫氨酶活性濃度的方法，其輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例一 本實(shí)施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為單試劑，包括
液劑
沖定酶
緩穩(wěn)輔
o o o
o o o[OO42]三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500mmol/L
輔酶 3mmol/L
亞硝酸還原酶 6000U/L
硝酸還原酶 8000U/L
腺苷 4mmol/L
高鐵細(xì)胞色素C 6,1/L
氯化f丐 3mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0. 1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)腺苷脫氨酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右，理論K值4180。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性濃度大小。
實(shí)施例二 本實(shí)施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為雙試劑，包括
試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L
穩(wěn)定劑 50mmol/L
輔酶 3mmol/L
腺苷 4mmol/L
高鐵細(xì)胞色素C 6,1/L
氯化鈣 3mmol/L
試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 亞硝酸還原酶 6000U/L 硝酸還原酶 8000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37°C ，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0. 1，測(cè)
試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)腺苷脫氨酶樣品與試劑1、試劑2的體積比例為
2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右，
理論K值2170。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性濃度大小。
實(shí)施例三 本實(shí)施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為三試劑，包括
試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50mmol/L
輔酶 3,1/L
腺苷 4mmol/L
高鐵細(xì)胞色素C 6mmol/L
氯化f丐 3mmol/L
試劑2 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L
穩(wěn)定劑 500mmol/L
硝酸還原酶 8000U/L
試劑3三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 亞硝酸還原酶 6000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測(cè)定腺苷脫氨酶活性濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間
10分鐘，起始吸光度《0. l，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)腺苷脫氨酶樣品與
試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間
大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右，理論K值2170。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性濃度大小。
申請(qǐng)人:經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測(cè)定方法均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。 總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)一般生化分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0. 0006 ;吸光度時(shí)間反應(yīng)曲線應(yīng)呈直線下降；試劑可測(cè)有效(R > 0. 99)線形范圍可達(dá)700U/L ;試劑測(cè)試的不準(zhǔn)確度，其相對(duì)偏差不超過(guò)±4% ;試劑測(cè)試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2% ;試劑的靈敏度可達(dá)0. 00046±0. 00023 AA/min/U/L ;試劑在2-8。C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長(zhǎng)，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的腺苷脫氨酶活性濃度測(cè)定方法，其方法如下腺苷+水 腺苷脫氨酶 肌苷+氨氨+2水+6高鐵細(xì)胞色素c 亞硝酸還原酶/Ca2+ 亞硝酸+ 6亞鐵細(xì)胞色素c亞硝酸+水+輔酶 硝酸還原酶 硝酸+還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，主要成分包括試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會(huì)反應(yīng)作用。氯化鈣可用其它鈣鹽取代。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、腺苷、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、腺苷、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶組成。輔酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、腺苷、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、腺苷、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、硝酸還原酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、亞硝酸還原酶組成。輔酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、腺苷、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑l-4000mmol/L或0. 1 % _100%體積比。所述穩(wěn)定劑為甘油(Glycerol)、丙二醇(PropyleneGlycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。6亞鐵細(xì)胞色素c緩沖液穩(wěn)定劑輔酶亞硝酸還原酶硝酸還原酶腺苷高鐵細(xì)胞色素C氯化鈣
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定腺苷脫氨酶活性濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、輔酶、腺苷、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶及穩(wěn)定劑；通過(guò)將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度上升的速度，從而測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性濃度大小。
文檔編號(hào)G01N33/48GK101750381SQ20081024427
公開(kāi)日2010年6月23日 申請(qǐng)日期2008年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司