專利名稱：呼出的粒子的采集和測量的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及在動物，特別是哺乳動物，優(yōu)選人類呼吸的過程中呼出的粒子。粒子的 性質和數量能夠指示某種醫(yī)學狀態(tài)。因此，這些粒子能夠被采集，按照大小或質量被分類并 且它們可被用于一種或多種醫(yī)學狀態(tài)的診斷中。
背景技術：
人類呼吸道每天面對至少7-8立方米的空氣，并且有一個先進的生物系統(tǒng)用來解 除吸入粒子和氣體的毒性。第一道抵御吸入物質的防線是覆蓋在整個呼吸道上的呼吸道內 襯粘液(RTLF)，其中含有幾個重要的抗氧化系統(tǒng)。RTLF中另外一個重要成分是表面活性 劑，其含有用于減小表面張力的化合物，但也參與天然的免疫。已經顯示在呼吸道炎癥條件下RTLF的成分會發(fā)生改變。當RTLF中的抗氧化劑和 吸入的氧化劑之間的平衡被打亂時，氧化應激將啟動炎癥過程。這種炎癥過程，雖然形式非 常多樣，但是是在從哮喘到肺癌的大多數呼吸道疾病發(fā)展過程中的共有的主要早期事件。導致所有呼吸道疾病的病理生理過程目前還不完全清楚。其背后的一個原因是人 體內的那些過程難以監(jiān)測。為了評估例如不同接觸劑量的作用，現行的方法僅限于測量肺 功能、呼出的一氧化氮、誘導的痰或者對支氣管肺泡灌洗(BAL)或支氣管鏡活檢進行分析。現有的這些方法要么是過分侵入的，例如支氣管鏡檢，因此不適用于較大規(guī)模研 究，而應確保較大規(guī)模研究對不同接觸劑量的易感性是高度可變的。另外，支氣管鏡檢和誘 導的痰還都與一定的風險相關聯，特別是在敏感人群中，例如在具有先前已經存在的心肺 系統(tǒng)疾病或哮喘的人群中。呼出的氣體中的一氧化氮似乎在很大程度上只是反映過敏性炎 癥，因此當研究其他呼吸道疾病時價值有限。另一方面，寧愿肺功能對患者是無害的，但是 無法提供有關疾病的根本機制方面的信息。其他所用的方法包括體外研究，它們只能對人類呼吸道復雜的環(huán)境進行有限的概 括。同樣的情況在很大程度上對動物研究也適用，其中雖然與人類基因高度一致，但是各種 基因的表達在實質上不同。最近，引入了一種新的方法，叫做呼出的呼吸氣冷凝液(EBC)采集，也就是呼出的 水蒸氣通過低溫被冷凝，其中可以鑒別揮發(fā)性和非揮發(fā)性化合物。相信在EBC中發(fā)現的非 揮發(fā)性物質源于在呼吸道內形成的粒子。這些粒子是在呼吸、說話或咳嗽時在呼吸系統(tǒng)中 產生的，并且已經被人們所觀察到，直到目前為止，這些粒子被研究了主要是因為它們可以 充當運輸傳染性物質的載體。目前還不清楚這些粒子是如何形成的，但一種似是而非的機 制可能是由于中心呼吸道中支氣管的橫截面積急劇減小，從而其中呼出的氣體形成湍流。 第二種假設是當肺周邊中的呼吸道打開時，由RTLF形成了粒子。在疾病狀態(tài)下，粒子的形 成可能會因為湍流的增強和/或RTLF物理特性的改變而得到提高。在WO 02/082977中給 出了一個這樣的例子。采集呼出的呼吸氣冷凝液(EBC)與許多嚴重的方法學上的困難相關聯，這些困難 例如是用水稀釋會使得感興趣物質的濃度非常低、被來自口腔中的物質高度污染、個體內的高變化系數以及存在于EBC中的揮發(fā)性物質的采樣效率非常低。因此需要一種更好的非侵入性方法來檢測和監(jiān)控對呼吸系統(tǒng)的有害健康的效果。用來克服與EBC分析相關的方法學上的一些困難的一種到目前為止尚未驗證的方法是直 接對呼出的粒子進行采樣和分析。確定采集的粒子的數量和大小的能力也將給出有關呼吸 道狀態(tài)的特定信息。不同大小的粒子級分分布的測量目前只有幾篇公開發(fā)表的核查呼出的液滴(即粒子)的研究。Papineni 禾口 Rosenthal[J Aerosol Med 10 (2) 105—16]禾口 Edwards 等人[Proc NatlAcad Sci USA 101 (50) :17383_8]測量了若干濃度的人類呼出粒子，并描述了主體間 的差異很大，但是其濃度普遍遠低于在典型的室內空氣中測得的。也有一些關于呼出的粒 子的大小分布的資料。必須假設液滴的主要成分是水，這樣粒子大小將隨周圍空氣的相對 濕度(RH)的變化而快速變化。Papineni和Rosenthal采用的研究RH的影響的方法并不能 讓人信服，因為他們用紅外燈加熱空氣來改變RH。Edwards等人并沒有在他們的研究中認 真考慮RH。粒子大小可以用間接手段，如鏡檢干燥的液滴或采用低尺寸分辨率的光散射方 法。因此，在這種情況下有必要對呼出氣溶膠的濃度變化和大小分布作更多的研究。最近對于人類氣溶膠形成的興趣與日俱增，主要在用來檢測它們的感染的可能性 的可能性范圍。US 2005/0073683 和 Anal. Chem. 2005，77，4734-4741 描述了一種用于鑒別 預先形成的氣溶膠粒子的實時檢測方法和系統(tǒng)。該方法的目的在于通過將正和負質譜與也 將被開發(fā)的參考質譜比較來即時檢測含有傳染性物質或“威脅劑”的氣溶膠。該方法并不 是為了診斷或監(jiān)測人類呼吸道狀態(tài)而被開發(fā)的，而且其顯著低的敏感性也阻礙了對非常低 濃度的物質，例如一些呼出粒子中的物質的檢測。目前還缺乏容易監(jiān)測呼吸道的方法。諸如支氣管肺泡灌洗和痰誘導這樣的侵入性 方法對患者是有害的，并且不允許頻繁采樣。發(fā)明概述由于對呼出的空氣中的生物標記物進行測量是非侵入性的并能夠實現重復采樣， 其可用于對疾病的早期檢測并對疾病發(fā)展和治療反應進行監(jiān)控。這項技術已經成功地用于 揮發(fā)性物質，尤其重要地用于作為過敏性哮喘標記物的呼出的NO。非揮發(fā)性化合物是由氣溶膠粒子運輸的，氣溶膠粒子被認為源于呼吸道上皮粘 液。這已經被我們的初步數據證實了。這些化合物可以提供有關在呼吸道中病理生理學過 程的基本的原理和特定的信息。很少有關于在呼出的呼吸氣中的內源性粒子的研究。在呼 吸道中粒子形成的機制和準確位置是不清楚的，而且還沒有關于粒子的化學組成的具體分 析。發(fā)展了一種對呼出的呼吸氣中的粒子進行采樣和分析的新技術。用于確定主體的 醫(yī)學狀態(tài)的方法包括下列步驟a.采集由所述主體呼出的粒子；b.依據所述的粒子質量或大小對所述的粒子進行分類，和g.分析所述粒子的化學成分，這樣允許確定該主體的醫(yī)學狀態(tài)。此外，在該方法中還可包括如下步驟c.依據所述粒子的質量或大小對所述粒子進行分類來獲得所述粒子的粒子分布譜；d.比較由所述主體呼出的粒子的粒子分布譜和參考粒子分布譜；e.記錄所述主體的粒子分布譜和所述參考粒子分布譜之間的相似性和/或偏差； 并且f.將主體的和參考粒子分布譜之間的相似性和/或偏差歸因于所述主體中的一 個或多個醫(yī)學狀態(tài)；并且任選地，
g.分析所述粒子的化學成分。所述醫(yī)學狀態(tài)可以選自支氣管哮喘、囊性纖維化、慢性阻塞性肺疾病(COPD)J^ 質性肺疾病、結節(jié)病、在系統(tǒng)性疾病例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)中的肺部負擔、肺部感染例 如肺炎、細菌定居或病毒感染。所述參考粒子分布譜可從不具有給定醫(yī)學狀態(tài)的主體獲得，并且步驟e.涉及記 錄所述主體的粒子分布譜和參考粒子分布譜之間的偏差。備選地，該參考粒子分布譜來自 具有給定醫(yī)學狀態(tài)的病人，并且步驟e.涉及記錄所述主體和所述病人的粒子分布譜之間 的相似性，導致對該主體的所述給定醫(yī)學狀態(tài)的診斷。本發(fā)明同樣提供了一種用于提供呼出的呼吸氣粒子的粒子分布譜的方法，該方法 包括下列步驟a.采集由主體呼出的粒子；和b.依據粒子的大小或質量對所述粒子進行分類以獲得所述粒子的粒子分布譜。在另一種方法中，可以使用慣性沖擊器(inertial impactor)依據粒子的質量對 所述粒子進行分類，或使用粒子計數器依據粒子的大小對所述粒子進行分類。該沖擊器應當具有進口和出口，并且包括多個平臺，安排這些平臺使得包括粒子 (P)的氣流(A)通過入口進入沖擊器并在通過所述出口離開之前依次通過每個平臺；其中通過具有孔的隔離物使每個平臺與相鄰平臺相分隔，該孔引導氣流(A)朝向 采集盤，安排每個采集盤的主面使其基本上垂直于該氣流(A)的流動方向；從而，呼出的粒子以氣流㈧形式穿過所述慣性沖擊器；使得引導主要的氣流(A) 依次朝向在每個平臺中的每個采集盤；使得至少位于第一平臺中的第一采集盤采集第一質 量粒子，而至少位于第二平臺中的第二采集盤采集第二質量粒子。在依據粒子質量或大小進行分類后，對粒子進行分析。在從采集盤上首先沖洗 或不從采集盤上首先沖洗的情況下，通過至少一種分析技術對粒子進行分析，所述分析技 術選自飛行時間二次離子質譜(T0F-SIMS)、基質輔助的激光解吸電離質譜(MALDI-MS)、 基于標記抗體的生化檢測或方案、定量的PCR分析、電子掃描顯微鏡(SEM)、氣相色譜質譜 (GC-MS)、液相色譜質譜(LC-MS)、表面等離子體共振(SPR)、熒光光譜、TOC(總有機物含量) 分析、元素分析以及電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)。本發(fā)明同樣涉及一種用于對呼出的粒子進行采集和分類的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括a.具有第一和第二開口的容器；b.與容器的第一開口相連接的雙向接口 ；c.具有進口和出口的慣性沖擊器，該沖擊器包括多個平臺，安排該平臺使得包括 粒子(P)的氣流(A)通過入口進入沖擊器，并在通過所述出口離開沖擊器之前依次穿過每 個平臺；
其中通過具有孔的隔離物使每個平臺與相鄰平臺相分隔，該孔引起主要氣流(A) 朝向采集盤，安排每個采集盤的主面使其基本上垂直于氣流(A)的流動方向；該慣性沖擊器的入口被連接到所述容器的第一開口。對呼出粒子的測量和分析應滿足如下要求·非侵入性·能夠在人體中重復測量·遵循肺部的各種病理生理過程，包括抗氧化系統(tǒng)、蛋白表達、脂質模式的變化以 及粒子大小和濃度的差異的動力學?！び糜诜乔秩胄缘罔b別用于診斷或監(jiān)控疾病的新生物標記物的平臺，所述疾病包 括a)呼吸道疾病例如ο 哮喘ο慢性阻塞性肺疾病ο間質性肺疾病ο 肺癌ο呼吸道感染ο系統(tǒng)性疾病例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡SLE、硬皮病和風濕性關節(jié)炎中的肺部負擔。b)系統(tǒng)性疾病例如ο心脈管疾病ο糖尿病ο新陳代謝綜合癥ο高膽固醇血癥 監(jiān)測插管病人·監(jiān)測接觸·鑒別藥理學治療的新靶標·鑒別對于某種接觸或疾病具有增加的遺傳易感性的個體附圖的簡要說明

圖1舉例說明依據本發(fā)明的慣性沖擊器；圖2舉例說明用于采集呼出的粒子的系統(tǒng)；圖3顯示來自一個對照主體的粒子斑的正(圖3A)和負(圖3B) TOF-SIMS光譜；圖4是具有來自一個對照主體的呼出粒子的一個斑點的TOF-SIMS圖；圖5顯示呼出粒子(0. 5-2. Oym)的濃度和時間的關系圖；圖6顯示在對健康主體和患有哮喘或囊性纖維化主體的先導研究中的比值 (CN+CNO)/POf ；優(yōu)選實施方案的詳細描述在第一實施方案中，本發(fā)明涉及一種確定主體的醫(yī)學狀態(tài)的方法。詞“確定”以其最廣的范圍來理解；也就是對醫(yī)學狀態(tài)的存在(定性)和/或程度(定量)進行評估。此 外，“確定”也指通過對主體可能具有的任何易感性的確定以獲得給定醫(yī)學狀態(tài)。術語“醫(yī)學狀態(tài)”不應當局限地僅僅理解為疾病或障礙。它同樣涉及以非診斷方式對健康主體的醫(yī)學狀態(tài)的研究，例如下列情形-處于藥物治療或藥品影響下(例如麻醉測試)，亦如接觸化學物質(例如污染 物、職業(yè)危險物)的主體；-參與鍛煉或健康項目的主體(例如確定主體的體質或健康)；-健康主體，其具有發(fā)展為某種疾病或障礙的易感性；-健康主體，其可能發(fā)展成某種疾病或障礙，或者對特定接觸具有更少耐受力的遺 傳易感性?？梢员粦帽景l(fā)明方法的主體為動物，特別是哺乳動物，尤其是人類。主要參考人 類描述本發(fā)明。在第二實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于提供呼出的呼吸氣粒子的粒子分布譜 的方法。在本發(fā)明的兩種方法中的第一步驟均涉及采集由主體呼出的粒子。單次呼氣就可 提供足夠數量粒子，但通常需要從多次重復呼氣中采集粒子。比如，在對人類醫(yī)學狀態(tài)進行 診斷時，可從持續(xù)一段時間的連續(xù)的吸氣/呼氣中采集粒子，這段時間包括至多數十分鐘， 例如，1秒到100分鐘，如1秒到50分鐘，5秒到20分鐘或10秒到5分鐘的單次呼氣。通過改變呼氣方式，也可能從呼吸道的不同部位采集代表性的粒子。與其中假設 通過從呼吸道的最遠端打開的呼吸道中形成了更多粒子的正常呼吸相對照，在某些較為中 心的呼吸道中，當呼吸道狹窄時受迫的呼氣增加了湍流，并因此增加了粒子的產出。在采集后，根據粒子的大小或質量對粒子進行分類?？梢允褂昧Ｗ佑嫈灯饔脕韺?個別粒子進行計數，并因而提供了粒子的數量-大小分布?？梢酝ㄟ^假定球形粒子和密度 來計算質量分布。隨之而來的是對采集到的非揮發(fā)性物質的高等化學分析(如下詳細描 述)O依據粒子的質量或大小對粒子進行分類可以提供所述粒子的粒子分布譜。粒子分 布譜是在呼出的空氣中某一特定質量或數量(或質量或大小范圍)的粒子怎樣存在的量 度，其同樣可以用來確定主體的醫(yī)學狀態(tài)。本文中出現的粒子是指經常懸浮在氣體中，通常 懸浮在但不必要懸浮在空氣中的固體、液體和液體包裹的固體物體。物體大小通常但不必 要大于0. 005微米并通常但不必要小于15微米。而大小應當是指空氣動力學直徑或電遷 移直徑，合適地為空氣動力學直徑。圖1顯示了用于采集呼出的粒子(在圖1中顯示為P)的慣性沖擊器10。沖擊器 10是具有入口 12和出口 14的容器，氣體和呼出的粒子通過該入口進入該沖擊器10，并且 氣體和呼出的粒子通過該出口離開沖擊器10。舉例說明的圖1中的該沖擊器10為圓柱形， 具有在圓柱形的相對圓形表面上的入口 12和出口 14 ；盡管如此，入口和出口 12、14也有可 能為其他的幾何形狀或設計。沖擊器10包括多個平臺20、30、40、50。圖1舉例說明了 4個平臺20、30、40、50，
而已知具有從2到15個平臺的沖擊器。具有粒子(P)的主要氣流(A)通過入口 12進入沖擊器10并在通過出口 14離開沖擊器10之前依次穿過平臺20、30、40、50。該主要氣流(A) 包括由主體呼出的空氣和粒子。流動是由連接到沖擊器出口的泵產生的。依據本發(fā)明，通 常呼出氣體和粒子在離開主體和進入沖擊器之間沒有被改變過。由隔離物21、31、41、51將每個平臺20、30、40、50與相鄰平臺分隔開。每個隔離物具有至少一個孔22、32、42、52(實踐中，在每個隔離物中存在多個孔)，該孔引導所述氣流(A)朝向采集盤33、43、53。安排每個采集盤33、43、53的主面使其基本上垂直于所述氣流 (A)的流動方向。使用的采集盤33、43、53具有大約Imm的厚度并且是具有10_12mm邊長的正方形。 通過雙面帶將所述盤固定在位于通過管嘴的氣流出口處的基質固定器上。該盤由天然硅制 成，因為這對于此后的分析是有利的。所述盤必須非常的干凈，因為微量雜質會干擾后面的 粒子分析?？梢酝ㄟ^多種方式清潔硅盤，優(yōu)選地在有機溶劑中通過超聲清洗，然后通過紫外 線臭氧處理，或通過浸入1-10%的硝酸或過氧化氫中進行。在清潔后，可針對采集和此后的化學分析進一步優(yōu)化采集盤表面的準備。通過變 化采集盤的親水性或其他表面化學性質，以友好的方式控制了粒子和表面之間的相互作 用。優(yōu)選地，該采集盤的整個表面被修飾。疏水性的采集表面，相比較于親水性表面，將會 更強烈地結合疏水性部分例如脂質分子的烴鏈。正常的親水性硅表面可通過表面覆蓋一薄 層疏水性物質例如甲基硅烷或在硅基底上覆蓋一層金，然后在金上施加一單層甲基封端的 硫醇衍生物而實現疏水化。相似地，可使采集表面特異性地結合某種分子。通過在采集盤 表面覆蓋一層針對上述相關蛋白的抗體，可使特異性的蛋白與采集板表面結合。通過采用 適合的試劑，該被分析物質的結合可引起顏色變化或發(fā)出熒光，而這些能夠在原位實時地 探測。通過電測量由被分析物結合到采集盤表面而引起的電流或電容的變化也能夠實現原 位檢測。在該情況下，采集盤還要具有必要的能實現這種測量的電連接。所述沖擊器可包 括必要的電連接，該電連接與采集盤表面上適宜的連接器接觸。粒子具有慣性，因此當在第一采集盤33處偏轉后不再跟隨空氣流，將會沖撞采集 盤33，而具有更小慣性的粒子將會繼續(xù)到下個平臺40。粒子的慣性依賴于它的質量，而質 量反過來取決于它的大小。通過這種方式，得以實現粒子質量或大小的分離。這樣通過在每個階段選擇每個平臺中孔的數量、孔的直徑和從孔到采集盤的距 離，可能實現氣溶膠中粒子的大小或尺寸的分離。具有高慣性即大質量/尺寸的粒子被分 離在前部平臺上，而具有小慣性即小質量/尺寸的粒子將撞擊在后面的平臺上。通過選擇 孔的形狀，可能以適合于此后化學分析的形式濃縮采集的物質。與呼出的空氣或呼吸氣濃 縮物相比，采集盤上物質濃度的增加是可觀的。在本案中，使用修飾的3平臺Dekati PM10。修飾由下列組成以系數2減小第三 平臺管嘴的數量，以系數1. 5增大沖擊器的設計流速。原始沖擊器是每分鐘10公升的形式的，其是在15公升每分鐘的流動速下運行的。 最后一個平臺的20個孔被減少為10個，由此以系數2增大了每個管嘴中的氣流速度。對 于這3個平臺50%截止的尺寸[即，該尺寸的粒子數的一半被采集而另一半仍繼續(xù)。這不 會顯示出階梯形采集特征，而是“S-樣”特征]分別為7、1. 5和0. 5 μ m。如上文中描述的采集盤的表面功能塊，可被小型化，以實現在每個管嘴處不同的 功能化，從而方便地優(yōu)化平行采集不同的被分析物。相似地，通過其中給在管嘴出口處的采 集盤提供了恰當的表面功能塊和/或電連接的采集盤芯片，實現了對特定物質的平行的原 位光或電探測。沖擊器被設計以盡可能高效的方式采集呼出的粒子。這意味著實質上所有在給定 質量/大小區(qū)間內的呼出的空氣中的粒子，都被采集用于分析。這些粒子以適于高等化學分析的濃縮的形式被回收。本發(fā)明同樣提供了一種對呼出的粒子進行采集和分類的系統(tǒng)100，該系統(tǒng)包括a.具有第一開口 112和第二開口 113的容器114 ；b.連接到容器114的第一開口 112的雙向接口 110 ；c.具有進口 12和出口 14的慣性沖擊器10，所述沖擊器10包括多個平臺20、30、 40,50...，這些平臺被布置為使得包括粒子(P)的氣流(A)通過入口 12進入沖擊器10，并 在從該出口 14離開沖擊器10之前依次穿過每個平臺20、30、40、50...；其中通過具有孔22、32、42、52...的隔離物21、31、41、51...使每個平臺20、30、 40,50. · ·與相鄰平臺相分隔，該孔引導主要的氣流(A)朝向每個采集盤33、43、53...，安排 每個采集盤33、43、53...的主面使其基本上垂直于氣流(A)的流動方向；該慣性沖擊器的 入口 12被連接到上述容器114的第一開口 112?？梢匀鐖D2中舉例說明的那樣設立采集系統(tǒng)。系統(tǒng)的較大部分位于恒溫室120中。 需要呼出粒子的個體通過雙向接口(110)吸入室內空氣。吸氣后，吸入的空氣(A)穿過位 于所述接口之前的高效粒子過濾器(125)。將接口(110)保持在一定溫度，使得呼出的氣溶膠的大小分布不會因為水蒸汽的 蒸發(fā)或冷凝而改變。呼出的空氣㈧通過接口(Iio)進入位于恒溫室(120)中的系統(tǒng)，這同 樣也是為了保持氣溶膠的大小分布的目的。在室內放置了用于呼出氣體的容器(114)。此 夕卜，將粒子計數器(116)連接到容器(114)的第一開口(112)以計算和測量粒子大小。用 于采集粒子(P)的慣性沖擊器(10)也被連到容器的第一開口(112)。穿過沖擊器(10)的流動典型地是通過泵(115)保持的，所述泵位于恒溫室的外 面。圖2同樣顯示了氣體排放(130)并且加入了潮濕的不含粒子的氣體(135)。能夠測量數量-大小分布的粒子計數器(116)提供了額外的重要信息。這里 使用的粒子計數器是Gri_ 1.108光學粒子計數器(Gri_ AerosolTechnik, Ainring, Germany)，能夠計數以及對從0. 3到20微米之間的15個尺寸區(qū)間的粒子的大小進行測量。 該儀器可提供所測量的氣溶膠的數量大小分布或從所測量的數量大小分布計算所得的質 量分布。在該儀器中，充滿粒子的空氣以一種方式從小的、精確限定的、高強度照射的體積 中穿過，使得每次只有一個粒子被照射。被照射的粒子產生散射光脈沖，其強度被測量。由 于散射光的強度取決于粒子大小，因此可以在氣流中來對粒子計數并測量其大小。當呼出氣流穿過相連的沖擊器(10)和粒子計數器(116)而流動時，所述容器 (114)作為緩沖器，呼出的空氣體被存儲在其中。當沒有呼氣發(fā)生時，該容器(114)給沖擊 器(10)和粒子計數器(116)提供空氣。潮濕的不具有粒子的空氣從容器(114)的第二開口 (113)加入，使得總是存在正排放流動。該流動通過位于容器(114)排放端的流量計(119) 來測量。通過以圖像方式呈現實時流動，主體可以根據指示控制自己的呼吸頻率和強度。通過下述方式進行采樣。假定沖擊器裝有干凈采集盤，而系統(tǒng)，尤其是沖擊器已經 達到了所需要的溫度。首先流量計被歸零以允許正確測量流動，然后潮濕的干凈空氣流量 被設定在一定值，使得在測量期間保持正的來自系統(tǒng)的流量。然后該沖擊器流量被設定在 低于該干凈空氣流量的值，在該過程期間，在盤上將不會收集到沉淀，因為給該系統(tǒng)供給了 干凈的不含粒子的空氣。然后，啟用光學粒子計數器并檢查沒有假的粒子存在，例如，指示 泄漏進入系統(tǒng)中。然后開始呼氣到該系統(tǒng)中，粒子計數器連續(xù)不斷地每6秒就抽取樣本并產生大小分布，同時沖擊器采集樣本以用于之后的分析。當已經獲得了所需數量的樣本時，就終止采集，記錄采樣時間和呼出的體積。關閉通過沖擊器的流體，將沖擊器從測量系統(tǒng)上 移開，并回收裝載的盤。在系統(tǒng)的兩個組件是“相連的”的表述中，應當將其理解為空氣和呼出的粒子可在 兩個組件之間流動。連接通常是采用管和合適的接頭、閥或密封件形成的，以引導氣體/粒 子流。該系統(tǒng)能夠實現的一種可能性是在不同的呼出速率下對不同級分中的粒子形成 進行量化。這是一種非常簡單的用來探測湍流，例如哮喘中的湍流的方法，而且可被用作疾 病的標記物。分析所述采集盤23、33、43、53以及它們相關的粒子P可以被從沖擊器10中取出，并且 可以分析上述粒子的化學成分。粒子P的化學成分提供對主體的醫(yī)學狀態(tài)的洞察(如下文 中醫(yī)學狀態(tài)部分描述的)。在一種分析策略中，對仍然位于采集盤上的粒子進行分析。這種方法是通過如下 的化學分析技術完成的，這種技術提供了有關在粒子中出現的特定物質的互補信息。飛行 時間二次離子質譜儀(T0F-SIMS)對于分析質量至多在IOOOu的物質尤其有用，尤其是各種 不同類型的脂質，其譜可隨各種醫(yī)學狀態(tài)而改變?；|輔助激光解吸電離質譜(MALDE-MS) 對于分析與炎癥反應相關的肽和更大的大分子(各種蛋白)是合適的方法。通過應用將 會把蛋白質解離為能夠被測定的片段的蛋白水解酶、優(yōu)選胰蛋白酶，可進一步方便對蛋白 進行MALDI-MS鑒定，并且通過與公開的可用數據庫進行比較，其可用于結論性的蛋白質鑒 定。對特定蛋白或其他生物分子(例如DNA)的分析可同樣通過將基于標記抗體的不同生 物化學分析或實驗方案直接應用在采集盤上來完成。掃描電鏡(SEM)可以被用于對采集的 粒子聚集物的形態(tài)進行分析。這樣的分析能夠揭示非生物來源的粒子，例如由于主體接觸 而產生的粒子。在另一分析策略中，將采集的物質從采集盤上除去(沖洗)?？蛇M一步加工包括采 集粒子的沖洗溶液以用于不同的化學或生物化學分析技術。在最簡單的分析中，可以采用 TOC (總有機成分)分析器來分析采集的粒子中有機物質的總量。使用不同元素分析器以獲 得采集物質中碳、氮、氧和硫的含量，其本身又反映了不同類生物分子(脂質、碳水化合物、 蛋白)的相對量。通過電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)可以測定痕量的無機元素，尤其 是金屬的量。這樣的分析將不僅提供關于非生物來源的物質的信息，而且也可用來檢測在 特定疾病狀態(tài)下重要的含有金屬的生物分子(蛋白)例如鐵-反應蛋白(IRP)。已經顯示 在肺腫瘤組織中Cu和Zn增加了，并均在氣路中顯示出調控炎癥反應的重要性。對于更多 生物分子的特異性分析，三種技術氣相色譜質譜(GC-MS)、液相色譜質譜(LC-MS)和直接的 MALDI-MS將會提供互補的信息。GC-MS將會提供關于在至多約500u的質量范圍內的半揮 發(fā)性物質的信息。LC-MS將會提供有關不同生物分子，例如脂質、肽和蛋白以及其修飾的定 量和定性信息。最后，直接的MALDI-MS可以被用于至多為幾個IOOOOu的生物分子的模式 檢測，允許你對脂質和蛋白譜兩者進行檢測和鑒定。也可對采集和沖洗的物質進行生物化 學分析，特別是對于特定感興趣蛋白的標記抗體，或者進行定量PCR分析，用于分析遺傳物 質。
有幾種技術用來方便樣本處理并提高方法的靈敏性。在該方法中已經呈現出的一個優(yōu)勢是使用表面解吸質譜技術來直接分析取自沖擊器的采集盤的可能性。另一優(yōu)點是直 接在采集盤上凈化并修飾樣本，例如上述提到的酶，這被稱為盤上消解。也可在采集盤上創(chuàng) 造不同類型的表面，為了直接結合或修飾粒子樣本中的特定被分析物，所述采集盤已經被 受體分子或酶共價修飾。這些方法是公知的并能夠被容易地使用在有機實驗室中。這將可 觀地加速分析過程，并使得對大的病人組的研究變得切實可行。在通過質譜方法鑒定新的生物標記物后，可以引入新的分析儀器，例如表面等離 子體共振(SPR)和熒光光譜以便更容易地將所述分析放大到更大的群體組。這兩種方法更 容易被非專業(yè)人員使用，其使得在醫(yī)院或健康看護中心實施粒子采集方法變得更加可行， 并使得對大的病人組的研究更有時間效率。能夠使用直接來自沖擊器的采集盤是非常有利 的。上述提到的不同的質譜(MS)技術具有不同的優(yōu)點，它們提供了有關采集的粒子 的組成的總括的信息。這意味著通過組合不同的MS技術，以非預定的方式可以檢測絕大部 分的生物分子。這與那些只能檢測預先選擇的或標記的物質的許多其它生化分析技術形成 對照。因此本發(fā)明的方法和MS技術的相容性是鑒別不同疾病的新的特異性生物標記物的 一個重要優(yōu)點。將粒子的分析與對照化學分析進行比較，可以鑒別與對照化學分析的偏差和/或 相似性。這可以被用于確定主體的一個或多個醫(yī)學狀態(tài)。對照化學分析可以來自具有某種 醫(yī)學狀態(tài)(在這種情況下尋找化學分析中的相似點)或不具有某種醫(yī)學狀態(tài)(在這種情況 下尋找化學分析中的偏差)的主體，或者來自主體本身，不定期在不同的環(huán)境下取得(例 如，在另一時間點，或在某個治療或練習過程后)。通過在每個采集盤上對粒子分類來確定粒子分布譜。獲得的粒子分布譜可以被用 來確定主體中的一個或多個醫(yī)學狀態(tài)。如果將要作出診斷，則將由該主體呼出的粒子的粒 子分布譜與參考粒子分布譜進行對比。記錄主體的粒子分布譜與參考粒子分布譜的相似性 和/或偏差，并將主體的粒子分布譜和參考粒子分布譜之間的相似性和/或偏差歸因于主 體的一個或多個醫(yī)學狀態(tài)。該參考粒子分布譜可以是來自不具有給定醫(yī)學狀態(tài)的主體的粒子分布譜。在該案 例中，可以記錄主體的粒子分布譜與參考粒子分布譜之間的偏差，提供了有關某種醫(yī)學狀 態(tài)的指征。該參考粒子分布譜備選地來自具有給定醫(yī)學狀態(tài)的主體。可以記錄主體與病人的 粒子分布譜之間的相似性，導致對在主體中所述給定醫(yī)學狀態(tài)的診斷。該參考粒子分布譜同樣可來自主體本身，但在不同情形下獲取(例如，在另一時 間點，或在某個治療或練習過程后)。這將允許通過本發(fā)明的方法監(jiān)測醫(yī)學狀態(tài)。醫(yī)學狀態(tài)可 以通過本發(fā)明確定或監(jiān)測的醫(yī)學狀態(tài)包括-支氣管哮喘-囊性纖維化-慢性阻塞性肺疾病(COPD)-肺癌_間質性肺疾病
_結節(jié)病_在系統(tǒng)性疾病例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)中的肺部負擔。-肺部感染ο 肺炎ο細菌定居ο病毒感染似乎其他系統(tǒng)性醫(yī)學狀態(tài)也可以被監(jiān)控例如-心力衰竭(例如內皮素-1)
_高膽固醇血癥(在呼出粒子中發(fā)現膽固醇)_糖尿病(在粒子中發(fā)現胰島素)-新陳代謝綜合癥-對疾病或接觸增加的遺傳易感性所述粒子可以包括或由指示特定醫(yī)學狀態(tài)的生物標記物組成。依據本發(fā)明的方法 允許檢測這樣的生物標記物。人們認為呼出的粒子源自于覆蓋整個呼吸道上皮細胞的呼吸道上皮粘液(RTLF) [Pediatr Allergy Immunol 15(1) :4_19]，其含有大量的抗氧化劑和表面活性劑。人們也 應當謹記從氣管的近端到末端RTLF的組分發(fā)生變化。豐富地存在于RTLF中的一種物質是克拉拉細胞蛋白16(CC16)，也作為一種由克 拉拉細胞產生的抗炎癥蛋白而發(fā)揮作用。到現在為止，已經只在BAL和血液中測量了 CC16。 迄今為止贏得關注的其他物質是表面活性蛋白A-D，其同樣僅在支氣管肺泡灌洗BAL中被 檢測。受到特別關注的是探測和監(jiān)測粒子中的抗氧化劑的濃度。一種可能的生物標記物 是在呼吸道中以高豐度存在的谷胱甘肽。其他在呼出液滴中作為可能的生物標記物的抗氧 化劑是結合金屬的蛋白血漿銅藍蛋白和鐵傳遞蛋白，這些有可能采用基質輔助激光解吸電 離質譜(MALDI MS)測量。其他具有低分子量的潛在的抗氧化劑，例如抗壞血酸鹽、α-生 育酚、尿酸鹽以及L-半胱氨酸，同樣有可能采用質譜方法來檢測，這些分子同樣是氧化應 激的生物標記物。作為抗氧化劑直接參與氧化應激的潛在的生物標記物是谷胱甘肽、血漿銅藍蛋 白、鐵傳遞蛋白、抗壞血酸鹽、α-生育酚、尿酸鹽以及L-半胱氨酸。谷胱甘肽尤其令人關 注，因為，其在呼吸道中高度豐富地存在。用于探測這些抗氧化劑的分析方法是質譜。a.脂質RTLF中的磷脂譜可作為疾病的生物標記物。已經在大多數呼吸道疾病中看到了 磷脂成分(PC)的改變，例如在急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、肺炎、囊性纖維化以及哮喘中。 在哮喘中，在BAL中PC減少了，并且已經顯示在過敏原刺激后PC/磷脂酰甘油(PG)之間的 關系發(fā)生改變。在呼吸道疾病中新的正在形成的研究領域還有脂質的硝化和氧化，這可以改變它 們的功能。RTLF中的表面活性劑，包括磷脂和蛋白，被認為在天然免疫系統(tǒng)中起重要作用。磷 脂是在天然免疫中活性的多種細胞因子例如前列腺素、凝血氧烷、嗜酸細胞活化趨化因子(extaxins)、脂氧素、溶解素(resolvins)等的前體。同樣也顯示表面活性蛋白在天然免疫、以及其他作為抗原呈遞細胞發(fā)揮作用的事情中和控制細胞死亡中扮演重要角色。關于 表面活性劑的新陳代謝的知識到現在為止都非常有限，但對于理解呼吸道疾病的發(fā)病機理
非常重要。使用TOF-SIMS對硅采集盤的表面分析已經揭示了在呼出粒子中廣泛的磷脂。在 粒子中檢測到的磷脂與在BAL研究中在RTLF中發(fā)現的磷脂一致。磷脂的相對量同樣和BAL 一致。磷脂的相對量同樣和BAL—致。在患有哮喘和囊性纖維化的病人中CN-+CN0-(假定 主要來自蛋白和肽的片段)與P03-的比值升高了。該比值可以反映由于呼吸道疾病，血漿 蛋白滲漏到氣室中。b.蛋白質和肽對支氣管灌洗樣本的蛋白質組學分析發(fā)現了在樣本中存在多種蛋白質。這項分析 是使用二維凝膠和質譜進行的。蛋白參與了其中的免疫應激過程、細胞生長、氧化劑-抗氧 化劑以及蛋白酶-抗蛋白酶系統(tǒng)以及具有未知功能的蛋白質。例如，已經針對過敏性哮喘 病人進行了 BAL的蛋白質組學研究。在該項研究中，在病人中鑒別出1592種蛋白，其中有 160種蛋白的表達與對照組有差異。最豐富的蛋白是血漿蛋白，其可能源于來自氣血屏障的 擴散。血漿蛋白的增多可能由于滲出或損傷。很可能的是在BAL中檢測出的幾種肽和蛋白 也存在于呼出的粒子中。在呼吸道中作為疾病的生物標記物的肽和蛋白包括內皮素-1、白細胞介素_4、干 擾素-g、表面活性蛋白A-D和克拉拉細胞蛋白16等。能夠采用電噴霧質譜ESI-MS和電離 質譜方法MALDI-MS或通過免疫檢驗檢測這些分子。在本發(fā)明中有很高的概率將會檢測出 更多類型的生物標記物，因為收集粒子比使用呼出的呼吸氣冷凝液效率更高，在后者中收 集了較小數量的粒子。使用諸如胰島素這樣的蛋白水解酶對采集的樣本進行處理，將產生 幾個肽片段，這些片段將形成一個模式，其對于某個特定的蛋白組是獨特的。對蛋白的翻譯后修飾例如磷酸化和糖基化的研究也可是生物標記物的潛在目標。 已知錯誤的磷酸化模式是幾種疾病的一部分。在呼吸道中的另一類重要生物標記物是粘蛋白糖蛋白，其有助于粘膜纖毛保護呼 吸道免受病原體和環(huán)境毒素侵害的防御。對于患有哮喘、慢性阻塞性肺病COPD和囊性纖維 化的患者，存在著粘蛋白糖蛋白的過表達。盡管由于糖蛋白的多樣化的糖基化模式，對糖蛋 白的分析有一些困難，但是追蹤這組化合物還是很有價值的，因為它們與不同的呼吸道疾 病有關。在分析糖蛋白時的一個優(yōu)點是它們很容易用親和色譜法進行提純。而且可能在觀 測的蛋白糖基化模式中的變化將和疾病有關，因此應考慮將其作為潛在的生物標記物。c.細胞物質和基因表達很可能呼出的粒子含有細胞或者細胞結構，這些細胞或細胞結構含有攜帶遺傳信 息的物質，特別是DNA和RNA。這些細胞物質可能來自細菌、病毒或呼吸道的細胞。對該物 質的遺傳表達的分析可以提供有關診斷特定疾病的病理學的新信息，或者被用作為診斷某 些疾病的高度特異性的并且高敏感的工具。因此該方法能夠被用于鑒別在諸如肺炎和慢性 阻塞性肺病COPD的惡化等疾病中的病原體，還能被用于對例如在經常是臨床問題的囊性 纖維化的定居的銅綠假單胞菌早期檢測中。d.金屬
在EBC中跟蹤對金屬例如鐵、鎘、鉛、鋁、銅的接觸也已經是可能的。金屬最有可能被運輸到與呼出的粒子結合的EBC上。這暗示這種方法同樣具有監(jiān)測接觸空氣污染的各種 成分，例如鐵、鋅、鎘或鋁的可能性。與周圍納米粒子中的金屬接觸也已經被與呼吸道疾病 的發(fā)展相關聯。
實施例將來自四個健康主體的呼出的粒子采集在硅晶片上。利用光學粒子計數器(Grimm 1. 108)記錄了粒子的濃度。為了獲得高粒子產量，進行了受迫的呼氣(使用鼻夾)。訓練 主體以進行重復的不間斷呼氣，其對應于在1秒內主體個體最大受迫呼氣容量(FEVl)的 80%。可以接受距離目標流量10%的偏差。在第1天早晨在15分鐘內進行采樣，并在第2 天以相似的方式重復采樣。通過飛行時間二次離子質譜(TOF-SIMS IV IONTOF GmbH)分析在硅晶片上呼出的 粒子的化學組成。使25keV Bi3+ —次離子在圍繞粒子的斑為中心的面積為500 X 500 μ m2的 區(qū)域上進行光柵化。采用針對最大分辨率優(yōu)化的儀器來記錄正負二次離子的質譜。來自全 部的分析區(qū)域或來自選定感興趣區(qū)域的光譜以及所選離子的圖像都是采用儀器軟件從記 錄的原始數據文件中提取的。通過與來自純物質和來自其他質譜方法的公開數據的對照光 譜相比較來確定光譜中峰的歸屬，也可通過與理論同位素模式相比較來控制該歸屬。確定 的峰的相對強度是通過在各自的光譜上對總粒子強度進行歸一化來計算出。圖3顯示來自一個對照主體的粒子斑的正(圖3A)和負(圖3B) TOF-SIMS光譜。圖4是來自一個對照主體的呼出粒子的一個斑的TOF-SIMS圖。圖5顯示呼出的粒子(0. 5-2. Oym)的濃度和時間的關系圖。圖6顯示在對健康主體和患有哮喘或囊性纖維化病人的先導研究中的比值 (CN+CNO)/PO3^表1.呼出的粒子的TOF-SIMS光譜峰的m/z比例值的歸屬。磷脂分子種類被稱為 x:a，其中χ代表碳原子數，a代表雙鍵的數目。正離子負離子歸屬m/z 歸屬 m/z磷酸膽堿離子 184 C16:l 253膽固醇-OH369 C16:0 255PC 片段476 C18:l 281PC 片段478 C18:0 283PC 片段494 PA32 1 645PC 片段522 PA32 0 647PC 片段524 PG 28:1 663PC 片段650 PG 28:0 665PC 28 0+H 678 PG34:2 671PC 片段680 PA34:1 673PC 30:0+H 706 PG32:0 721PC 32:1+H 732 PG34:1 747
PC 32:0+H 734 PG36:2 773PC 34:1+H 760 PG36:1 775PC 34:0+H 762 PI34:2 833PI34:1 835PI36:2 861PI36:1 863表2. 15分鐘采樣期內的總呼出體積和平均呼出粒子(0. 5-2. Oym)濃度主體1主體2主體3主體4FEV14. 1 FEV12.8 FEV13. 2 FEV13. 2第1天第2天第1天第2天第1天第2天第1天第2天體積(公升)153128 176 181 142 144 201 166粒子/ 公升 210 123 149 55 956 343 239 180所有的粒子樣本均給出來自磷脂的強烈信號(圖2和4以及表1)。以正離子模式 的不同種的磷脂酰膽堿(PC) 了呈質子化或堿金屬陽離子化的分子離子形式的不同種的磷 脂酰擔堿(PC)，而以陰離子模式檢測了呈去質子化離子形式的磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌 醇(PI)和磷脂酸(PA)，表1。磷脂的組成與先前在支氣管肺泡灌洗(BAL)液中發(fā)現的相一 致，這指示呼出的粒子最有可能源自于下呼吸道。實施例2.培訓主體使其進行重復的連續(xù)呼吸，該呼吸對應于在1秒內主體個體最 大受迫呼出容量(FEVl)的80%。讓四名健康的志愿者、四名哮喘病人和四名患有囊性纖維 化的病人分別進行10次受迫呼氣。將大小在0.5-2. Oym的呼出粒子采集在硅晶片上。光 學計數器實時地測量粒子的濃度。在取樣前施加3分鐘的不含粒子氣體的呼吸氣的沖洗階 段。使用飛行時間二次離子質譜(T0F-SIMS)來分析硅晶片。在粒子中檢測到幾個類別的 磷脂磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酸(PA)。在組之間觀察 到一些差別。與對照組相比，在哮喘病人以及患有囊性纖維化的病人中PC信號總量和PG 信號總量的比例傾向于升高了。同樣，與對照組相比，與哮喘病人和患有囊性纖維化的病人 樣品中的磷脂相比，已知特征性的蛋白和肽(CN0_)的信號升高了(圖6)。實施例3.主體在20分鐘內進行受迫呼氣。將大小在0.5-2. Ομπι的呼出粒子收集在硅晶片上。使用熒光試劑DAPI (4，6- 二脒基2-苯基吲哚對硅晶片染色)，該試劑強烈 地結合到DNA和RNA上。在粒子斑中獲得了強烈的信號，指示呼出的粒子含有核酸。實施例4.兩個主體呼出150L空氣兩次；一次用于采集粒子，另一次用于呼吸氣冷 凝液采集。從硅晶片上解收呼出的粒子，并且將呼吸氣冷凝液濃縮，然后通過ELIZA分析表 面活性蛋白Α。在呼出的粒子中表面活性蛋白A(SpA)的總量比在呼出的呼吸氣冷凝液中測 得的要高6倍，并且比在100 μ L血清中的要高4倍。在檢測(對兩個主體在三種不同情況 下測試CV 5.4)時，對Sp A的分析顯示了高的個體內的重復再現性。開發(fā)的采樣方法對于在呼出的氣體中檢測新的生物標志物以及監(jiān)測呼吸道疾病 具有高的潛力。
權利要求
一種用于確定主體的醫(yī)學狀態(tài)的方法，所述方法包括下列步驟a.采集由所述主體呼出的粒子；b.依據所述粒子的質量或大小對所述粒子進行分類，g.分析所述粒子的化學成分，這樣允許確定該主體的醫(yī)學狀態(tài)。
2.根據權利要求1的方法，進一步包括下列步驟a.依據所述粒子的質量或大小對所述粒子進行分類來獲得所述粒子的粒子分布譜；b.比較由所述主體呼出的粒子的粒子分布譜和參考粒子分布譜；c.記錄所述主體的粒子分布譜和所述參考粒子分布譜之間的相似性和/或偏差；d.將主體的粒子分布譜和參考粒子分布譜之間的相似性和/或偏差歸因于所述主體 中的一個或多個醫(yī)學狀態(tài)；并任選地，e.分析所述粒子的化學成分。
3.根據權利要求1的方法，其中所述的醫(yī)學狀態(tài)選自支氣管哮喘、囊性纖維化、慢性阻 塞性肺疾病(C0PD)、間質性肺疾病、結節(jié)病、在系統(tǒng)性疾病例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)中的 肺部負擔、肺部感染例如肺炎、細菌定居或病毒感染、心力衰竭(例如內皮素-1)、高膽固醇 血癥(在呼出粒子中發(fā)現膽固醇)、糖尿病(在粒子中發(fā)現胰島素)、新陳代謝綜合癥、對疾 病或接觸增加的遺傳易感性。
4.根據權利要求2的方法，其中所述的醫(yī)學狀態(tài)選自支氣管哮喘、囊性纖維化、慢性阻 塞性肺疾病(C0PD)、間質性肺疾病、結節(jié)病、在系統(tǒng)性疾病例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)中的 肺部負擔、肺部感染例如肺炎、細菌定居或病毒感染。
5.根據權利要求2或4中任一項的方法，其中所述參考粒子分布譜是從不具有給定的 醫(yī)學狀態(tài)的主體獲得的，并且步驟e.涉及記錄主體的粒子分布譜和參考粒子分布譜之間 的偏差。
6.根據權利要求2或4-5中任一項的方法，其中所述參考粒子分布譜來自具有給定醫(yī) 學狀態(tài)的病人，并且步驟e.涉及記錄所述主體和所述病人的粒子分布之間的相似性，導致 確定所述主體中的所述給定的醫(yī)學狀態(tài)。
7.一種用于提供呼出的呼吸氣粒子的粒子分布譜的方法，該方法包括下列步驟a.采集由主體呼出的粒子；并且b.依據所述粒子質量或大小對所述粒子進行分類以獲得所述粒子的粒子分布譜。
8.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中使用慣性沖擊器(10)根據粒子的質量 對粒子進行分類。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述沖擊器(10)具有入口(12)和出口(14)，該 沖擊器(10)包括多個平臺(20、30、40、50…)，安排所述平臺使得包括粒子(P)的氣流(A) 通過入口(12)進入沖擊器(10)并在通過所述出口(14)離開沖擊器(10)之前依次穿過每 個平臺(20、30、40、50…)；其中通過隔離物(21、31、41、51…)使每個平臺(20、30、40、50…)與相鄰平臺相分隔， 該隔離物具有孔(22、32、42、52…)，所述孔引導所述氣流(A)朝向采集盤(33、43、53…)，安 排每個采集盤(33、43、53"0的主面使其基本上垂直于所述氣流(A)的流動方向；從而，呼出的粒子以氣流(A)形式穿過所述慣性沖擊器(10)；使得引導主要的氣流(A)依次朝向每個平臺(20、30、40、50…)中的每個采集盤(23、33、43、53…)；使得至少位于第 一平臺(30)中的第一采集盤(33)采集第一質量的粒子，而至少位于第二平臺(40)中的第 二采集盤(43)采集第二質量的粒子。
10.根據權利要求1-9中任一項所述的方法，其中使用粒子計數器(116)根據粒子大小 對粒子進行分類。
11.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中，在依據粒子質量或大小進行分類后， 在從采集盤上首先沖洗或不從采集盤上首先沖洗的情況下，通過至少一種分析技術對粒子 進行分析，所述分析技術選自飛行時間二次離子質譜(TOF-SIMS)、基質輔助的激光解吸 電離質譜(MALDI-MS)、基于標記抗體的生化檢測或方案、定量的PCR分析、掃描電子顯微鏡 (SEM)、氣相色譜質譜(GC-MS)、液相色譜質譜(LC-MS)、表面等離子體共振(SPR)、熒光光 譜、TOC(總有機物含量)分析、元素分析以及電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)。
12.一種用于對呼出的粒子進行采集和分類的系統(tǒng)(100)，該系統(tǒng)包括a.具有第一開口(112)和第二開口 (113)的容器(114)；b.連接到所述容器(114)的第一開口(112)的雙向接口(110)；c.具有進口(12)和出口 (14)的慣性沖擊器(10)，該沖擊器(10)包括多個平臺(20、 30、40、50…)，安排所述平臺使得包括粒子⑵的氣流㈧通過入口(12)進入沖擊器(10)， 并在通過所述出口(14)離開沖擊器(10)之前依次穿過每個平臺(20、30、40、50…)；其中通過具有孔(22、32、42、52…)的隔離物(21、31、41、51…)使每個平臺(20、30、 40,50···)與相鄰平臺相分隔，該孔引導主要氣流(A)朝向采集盤(33、43、53…)，安排每個 采集盤(33、43、53···)的主面使其基本上垂直于氣流(A)的流動方向；該慣性沖擊器的入口 (12)被連接到所述容器(114)的第一開口(112)。
13.根據權利要求12所述的系統(tǒng)(100)，其中每個平臺(20、30、40、50…)包括適用于 探測被分析物的采集盤(33、43、53…)，其與其它平臺(20、30、40、50…)中的采集盤(33、 43、53…)不同。
14.一種適用于權利要求12或13的系統(tǒng)(100)中的采集盤(33、43、53…)。
15.根據權利要求14所述的采集盤(33、43、53…)，其中通過涂覆一種物質例如疏水性 物質或抗體對其至少一個表面進行修飾。
16.根據權利要求14或15所述的采集盤(33、43、53…)，其包括電連接，該電連接使得 能夠探測到響應于粒子結合到該采集盤而發(fā)生的采集盤(33、43、53···)的電流或電容的改 變。
全文摘要
動物體在呼吸時呼出粒子。粒子的性質和數量能夠指示某種醫(yī)學狀態(tài)。因此可以采集粒子，依據大小或質量對其進行分類并它們可被用于對一種或多種醫(yī)學狀態(tài)的診斷中。本發(fā)明提供了一種用于對呼出的粒子進行采集和分類的方法和系統(tǒng)以及使用所述呼出粒子進行診斷的方法。
文檔編號G01N33/497GK101827558SQ200880110004
公開日2010年9月8日 申請日期2008年10月1日 優(yōu)先權日2007年10月2日
發(fā)明者埃弗特·揚斯特羅姆, 安娜-卡林·奧林, 安娜-夏洛特·阿爾姆斯特蘭德, 朱卡·勞斯馬 申請人:安娜-卡林·奧林;安娜-夏洛特·阿爾姆斯特蘭德;朱卡·勞斯馬;埃弗特·揚斯特羅姆