專利名稱：微芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開涉及一種包含由低溫共燒陶瓷(LTCC)制成的多層的微PCR(聚合酶鏈反 應(yīng))芯片。本公開還提供具有用后可丟棄的LTCC微PCR芯片的便攜式實時PCR裝置。
背景技術(shù)：
由于快速且高效的分析技術(shù)的發(fā)展，在分子和細胞生物學(xué)中已經(jīng)獲得了最新的進 步。由于微型化和倍增，像基因芯片或生物芯片這樣的技術(shù)能夠在單個實驗布置中實現(xiàn)全 部基因組的特征化。PCR是用于核酸分子體內(nèi)擴增的分子生物方法。PCR技術(shù)正快速代替 用于識別法醫(yī)、環(huán)境、臨床和工業(yè)樣品中的生物種和病原體的其他耗時和較不敏感的技術(shù)。 在生物技術(shù)中，對于大量分子和臨床診斷，PCR已經(jīng)成為生命科學(xué)實驗室中最重要的分析步 驟。像實時PCR這樣的PCR技術(shù)的重大發(fā)展已經(jīng)導(dǎo)致相比于常規(guī)方法更快速的反應(yīng)過程。 在過去的幾年里，微制造技術(shù)已經(jīng)擴展到諸如PCR分析之類的反應(yīng)和分析系統(tǒng)的微型化， 旨在進一步減小分析時間和試劑消耗。若干研究小組已經(jīng)研究了“芯片上實驗室”裝置，且 已經(jīng)促進了微型化分離和反應(yīng)系統(tǒng)領(lǐng)域中的很多進步。在當前可用的大多數(shù)PCR中，因為樣品、容器和循環(huán)器熱容量以及2至6小時的延 長擴增時間，瞬時溫度變化是不可能的。在樣品溫度從一個溫度過渡到另一溫度的過程中， 會發(fā)生消耗重要試劑且產(chǎn)生多余干擾化合物的不期望的額外反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種允許更快PCR性能的微芯片。本發(fā)明的另一目的是提供一種改善的微芯片。本發(fā)明的主要目的之一在于發(fā)展一種包含多個LTCC層的微芯片。本發(fā)明的又一目的在于發(fā)展一種制造微芯片的方法。本發(fā)明的另一目的在于發(fā)展一種包含微芯片的微PCR裝置。本發(fā)明的再一目的在于發(fā)展一種使用微PCR裝置診斷疾病狀態(tài)的方法。因此，本發(fā)明提供一種微芯片，包含由低溫共燒陶瓷(LTCC)制成的多個層，其中 反應(yīng)室在多個反應(yīng)室層中形成用以裝載樣品，導(dǎo)體嵌入在位于該反應(yīng)室之下的至少一個導(dǎo) 體層中，且加熱器嵌入在位于(一個或多個)導(dǎo)體層之下的至少一個加熱器層中；一種制造 微芯片的方法，該方法包含以下步驟(a)布置由低溫共燒陶瓷(LTCC)制成的多個層且具 有阱以形成反應(yīng)室，(b)將包含加熱器的至少一個LTCC層放置在該室下，(c)將一個或若干 導(dǎo)體層放置在加熱器和反應(yīng)室之間，以及(d)互連這些層以形成微芯片；一種微PCR裝置， 包含(a)包含多個LTCC層的微芯片，其中反應(yīng)室在多個層中形成用以裝載樣品，導(dǎo)體嵌入 在位于反應(yīng)室之下的至少一個層中且加熱器嵌入在位于(一個或多個)導(dǎo)體層之下的至少 一個層中；(b)溫度傳感器，嵌入在微芯片中或放置在芯片外用以測量芯片溫度，(c)控制 電路，基于溫度傳感器輸入控制加熱器；以及(d)光學(xué)系統(tǒng)，檢測來自樣品的熒光信號；以 及一種使用微PCR裝置檢測樣品中的分析物或者診斷疾病狀態(tài)的方法，該方法包含以下步驟(a)將包含核酸的樣品裝載到包含多個LTCC層的微芯片中，(b)通過運行微PCR裝置擴 增核酸；以及(c)基于擴增的核酸的熒光讀數(shù)確定分析物的存在與否，或者基于擴增的核 酸的熒光讀數(shù)確定病原體的存在與否以診斷疾病狀態(tài)。


現(xiàn)在將參考附圖描述本發(fā)明圖1示出LTCC微PCR芯片的實施例的正投影圖。圖2示出LTCC微PCR芯片的實施例的橫截面圖。圖3示出LTCC微PCR芯片的實施例的逐層設(shè)計。圖4示出控制加熱器和熱敏電阻器的電路的一個實施例的框圖。圖5示出制造的芯片反應(yīng)室設(shè)計的模型。圖6示出使用由手持單元控制的集成加熱器/熱敏電阻器的芯片上的\ -636DNA 片段的熔解。圖7示出芯片上X-311DNA片段的PCR擴增。(a)來自芯片的實時熒光信號；(b) 確認擴增產(chǎn)物的凝膠的圖像。圖8示出用于16S核醣體單位的沙門氏菌的經(jīng)處理血液和血漿PCR的凝膠的圖像。圖9示出用于16S核醣體單位的沙門氏菌的直接血液PCR的凝膠的圖像。圖10示出用于16S核醣體單位的沙門氏菌的直接血漿PCR的凝膠的圖像。圖11示出使用微芯片的沙門氏菌的基因的PCR擴增。(a)來自芯片的實時熒光信 號；(b)確認擴增產(chǎn)物的凝膠的圖像。圖12示出使用LTCC芯片擴增乙型肝炎病毒DNA花費的時間。圖13示出用于熔解X -311DNA的熒光信號的微分的LTCC芯片的熔解曲線。
具體實施例方式本發(fā)明涉及一種包含由低溫共燒陶瓷(LTCC)制成的多個層的微芯片，其中反應(yīng) 室在多個反應(yīng)室層中形成以用于裝載樣品，導(dǎo)體嵌入在位于反應(yīng)室之下的至少一個導(dǎo)體層 中，且加熱器嵌入在位于(一個或多個)導(dǎo)體層之下的至少一個加熱器層中。在本發(fā)明的一個實施例中，該反應(yīng)室覆蓋有透明密封帽。在本發(fā)明的一個實施例中，芯片包含溫度傳感器。在本發(fā)明的一個實施例中，溫度傳感器嵌入在該芯片的至少一個傳感器層中。在本發(fā)明的一個實施例中，溫度傳感器是熱敏電阻器。在本發(fā)明的一個實施例中，芯片提供接觸焊盤以將外部控制電路連接到溫度傳感 器和加熱器。 在本發(fā)明的一個實施例中，溫度傳感器布置在芯片外部以測量芯片溫度。在本發(fā)明的一個實施例中，反應(yīng)室由導(dǎo)體環(huán)圍繞。在本發(fā)明的一個實施例中，導(dǎo)體環(huán)由柱連接到(一個或多個)導(dǎo)體層。在本發(fā)明的一個實施例中，導(dǎo)體由從包括金、銀、鉬和鈀或其合金的組中選出的材 料制成。
在本發(fā)明的一個實施例中，在反應(yīng)室底部與該加熱器之間存在間隙，且所述間隙 的范圍約為0. 2mm至0. 7mm。在本發(fā)明的一個實施例中，樣品是食品或從包括血液、血清、血漿、組織、唾液、痰 和尿的組中選出的生物樣品。在本發(fā)明的一個實施例中，反應(yīng)室具有1 ill至25 ill的體積。本發(fā)明還涉及一種制造微芯片的方法，該方法包含以下步驟(a)布置由低溫共燒陶瓷(LTCC)制成的多個層且具有阱以形成反應(yīng)室，(b)將包含加熱器的至少一個LTCC層放置在反應(yīng)室下，(c)將一個或若干導(dǎo)體層放置在加熱器和反應(yīng)室之間，以及(d)互連各層以形成該微芯片。在本發(fā)明的一個實施例中，其中在加熱器和反應(yīng)室之間或在加熱器之下布置包含 溫度傳感器的至少一個LTCC層。在本發(fā)明的一個實施例中，反應(yīng)室由導(dǎo)電環(huán)圍繞。本發(fā)明的一個實施例提供柱子來連接該導(dǎo)電環(huán)和(多個)導(dǎo)體層。本發(fā)明還涉及一種微PCR裝置，該裝置包含a)包含多個LTCC層的微芯片，其中反應(yīng)室在多個層中形成以用于裝載樣品，導(dǎo)體 嵌入在位于反應(yīng)室之下的至少一個層中且加熱器嵌入在位于(一個或多個)導(dǎo)體層之下的 至少一個層中；(b)溫度傳感器，嵌入在微芯片中或放置在芯片之外用以測量芯片溫度，(c)控制電路，基于溫度傳感器輸入控制加熱器；以及(d)光學(xué)系統(tǒng)，檢測來自該樣品的熒光信號。
在本發(fā)明的一個實施例中，裝置是手持裝置。在本發(fā)明的一個實施例中，裝置由便攜式計算平臺控制。在本發(fā)明的一個實施例中，裝置布置成陣列以實現(xiàn)多個PCR。在本發(fā)明的一個實施例中，微芯片可從裝置釋放。本發(fā)明還涉及一種使用微PCR裝置檢測樣品中的分析物或者診斷疾病狀態(tài)的方 法，該方法包含以下步驟(a)將包含核酸的樣品裝載到包含多個LTCC層的微芯片上，(b)通過運行該微PCR裝置擴增核酸；以及(c)基于擴增的核酸的熒光讀數(shù)確定分析物的存在與否，或者基于擴增的核酸的 熒光讀數(shù)確定病原體的存在與否，從而診斷疾病狀態(tài)。在本發(fā)明的一個實施例中，核酸是DNA或RNA。在本發(fā)明的一個實施例中，方法提供擴增產(chǎn)物的定性和定量分析。
在本發(fā)明的一個實施例中，樣品是食品或生物樣品。在本發(fā)明的一個實施例中，生物樣品從包括血液、血清、血漿、組織、唾液、痰和尿 的組中選出。在本發(fā)明的一個實施例中，病原體從包括病毒、細菌、真菌、酵母菌和原生動物的 組中選出。本公開中的術(shù)語“反應(yīng)室層”指參與形成反應(yīng)室并且與樣品接觸的微芯片的任何層。本公開中的術(shù)語“導(dǎo)體層”指其中嵌有導(dǎo)體的微芯片的任何層。本公開中的術(shù)語“加熱器層”指其中嵌有加熱器的微芯片的任何層。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是發(fā)現(xiàn)的一種用于從模板合成DNA的特異性片段的多個副本 的技術(shù)。原始PCR工藝基于來自水生棲熱菌(Taq)的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，該DNA聚合酶 可以在包含4個DNA堿基和兩個與目標序列相鄰的引物DNA片段的混合物中合成給定DNA 鏈的互補鏈。加熱混合物以分離包含目標序列的雙螺旋DNA鏈，隨后冷卻該混合物以允許 引物在分離鏈上發(fā)現(xiàn)并結(jié)合它們的互補序列，且Taq聚合酶將引物延伸為新互補鏈。因為 每個新的雙鏈分離為用于進一步合成的兩個模板，所以重復(fù)的加熱和冷卻循環(huán)指數(shù)地倍增 目標DNA。用于聚合酶鏈反應(yīng)的典型溫度范圍如下1.在 93°C 變性 15 至 30 秒2.在 55°C 退火 15 至 30 秒3.在72 °C延伸引物30至60秒。作為示例，在第一步驟，溶液被加熱到90_95°C，使得雙鏈模板熔解(“變性”)以 形成兩個單鏈。在下一步驟中，溶液被冷卻到50-55°C，使得尤其短的合成DNA片段(“引 物”)結(jié)合到模板的合適的互補部分(“退火”)。最后，當特異性酶(“DNA聚合酶”)通過 結(jié)合來自溶液的互補堿基延伸引物時，溶液被加熱到72°C。因而從單個雙鏈合成了兩個相 等同的雙鏈。引物延伸步驟必須以約60秒/千堿基(sec/kbase)的速率增加以產(chǎn)生比幾百個 堿基更長的產(chǎn)物。上面是典型的儀器時間；實際上，變性和退火步驟幾乎瞬時發(fā)生，但是當 金屬塊或水用于熱平衡且樣品被包含在塑料微量離心管中時，商業(yè)儀器中的溫度速率通常 小于rc/秒。通過熱絕緣的顯微機械加工小質(zhì)量PCR室；可以大規(guī)模產(chǎn)生更快、更能量有效且 更加特異性的PCR儀器。而且，從一個溫度到另一溫度的快速轉(zhuǎn)變確保樣品在不希望的中 間溫度花費很少的時間，使得擴增的DNA具有最佳保真度和純度。低溫共燒陶瓷(LTCC)是在用于汽車、防御、宇航和通信產(chǎn)業(yè)的電子組件封裝中使 用的厚膜技術(shù)的現(xiàn)代版本。它是化學(xué)惰性、生物兼容、熱穩(wěn)定(> 600°C)的氧化鋁基玻璃 狀陶瓷材料，具有低導(dǎo)熱性(< 3W/mK)、良好的機械強度并且提供良好的厄米矩陣性。它通 常用在封裝芯片級電子器件中，其中這些電子器件用于結(jié)構(gòu)和電學(xué)功能兩者。本發(fā)明的發(fā) 明人意識到LTCC用于微PCR芯片應(yīng)用的適用性，且據(jù)發(fā)明人盡力了解，LTCC至今尚未用于 此類目的。LTCC技術(shù)中的基板優(yōu)選地是具有聚合結(jié)合物的玻璃狀陶瓷材料的非燒結(jié)(生) 層。結(jié)構(gòu)特征通過切割/沖壓/鉆孔這些層且層疊多個層來形成。逐層處理使得能夠形成 對于MEMS (微機電系統(tǒng))而言十分關(guān)鍵的三維特征。小于50微米的特征可容易地在LTCC 上制造。電學(xué)電路可通過在每一層上絲網(wǎng)印刷導(dǎo)電和電阻漿料制造。多個層通過沖壓通孔 且使用導(dǎo)電漿料填充這些通孔而互連。這些層被堆疊、壓縮和燒結(jié)。在文獻1中已經(jīng)報告 了高達80層的堆疊處理。燒結(jié)材料是致密的且具有良好的機械強度。典型地，使用凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。在該技術(shù)中，PCR之后的DNA片段在電場中 分離且通過使用熒光染料著色觀察。更合適的方案是使用特異性結(jié)合到雙鏈DNA的熒光染料來監(jiān)視連續(xù)的反應(yīng)(實時PCR)。這種染料的示例是SYBR GREEN，其由490nm藍光激勵且 當結(jié)合到DNA時發(fā)射520nm的綠光。熒光強度正比于在PCR過程中形成的雙鏈產(chǎn)物DNA的 量并且因此隨著循環(huán)數(shù)增加。圖1示出了指示反應(yīng)室(11)或阱的微PCR芯片的一個實施例的正投影圖。該圖 指示了 LTCC微PCR芯片內(nèi)部的加熱器(12)和溫度傳感器熱敏電阻器(13)的組合件。還 指示了加熱器導(dǎo)線(15)和熱敏電阻器導(dǎo)線(14)。這些導(dǎo)線將幫助提供外部電路與嵌入在 芯片內(nèi)部的加熱器和熱敏電阻器的連接。參考圖2，示出了 LTCC微PCR芯片的一個實施例的橫截面圖，其中(16a&16b)指示 用于加熱器(12)的接觸焊盤且(17&17b)指示用于熱敏電阻器(13)的接觸焊盤。參考圖3，示出了 LTCC微PCR芯片的一個實施例的逐層設(shè)計，其中芯片由12個 LTCC帶層組成。存在兩個基層(31)，包括加熱器層(32)、導(dǎo)體層(33)以及具有熱敏電阻器 的層(34)的三個中間層，其中該具有熱敏電阻器的層(34)又形成對反應(yīng)室(11)的界面層 (35)。如圖所示，反應(yīng)室層(36)由6個層組成。在加熱器和熱敏電阻器層之間還設(shè)置導(dǎo)體 層(33)。還指示了加熱器導(dǎo)線(33)和熱敏電阻器導(dǎo)線(32)。在該圖中，示出了導(dǎo)線(32) 布置在熱敏電阻器層(34)的任一側(cè)。加熱器設(shè)計可以具有“階梯”、“蜿蜒”、“線”、“板”等 任意形狀，大小在0. 2mmX 3mm至2mmX 2mm間變化。加熱器的大小和形狀可以基于具體要 求來選擇。這些要求會依賴于反應(yīng)室的大小或待測樣品或用作導(dǎo)體層的材料。圖3示出了制造的封裝芯片的一個實施例的層式設(shè)計和圖像。LTCC芯片具有1至 25 u 1的阱體積以及約50%的電阻變化率(加熱器和熱敏電阻器)。加熱器的電阻值( 40Q)和熱敏電阻器的電阻值( 1050Q)與估算值一致。加熱器基于在常規(guī)LTCC封裝中 采用的厚膜電阻元件。使用氧化鋁的熱敏電阻器系統(tǒng)用于制造嵌入式溫度傳感器。測得的 芯片TCR在1至2Q/°C之間。芯片在DuPont 951生系統(tǒng)上制造。熱敏電阻器層可以布置 在芯片中的任何位置，或者溫度傳感器可以布置在芯片外部，取代芯片內(nèi)部的熱敏電阻器。參考圖4，示出了控制加熱器和熱敏電阻的電路的一個實施例的框圖，其中LTCC 微PCR芯片(10)中的熱敏電阻器充當橋(46)中的一個臂。給出來自橋式放大器(41)的 橋的放大輸出作為PID控制器(43)的輸入，其中該輸入被數(shù)字化且PID算法提供受控的數(shù) 字輸出。該輸出被重新轉(zhuǎn)換回模擬電壓，并且該電壓使用加熱器驅(qū)動器(46)中存在的功率 晶體管驅(qū)動加熱器。另外，處理LTCC與硅工藝相比更為便宜。本發(fā)明還提供常規(guī)PCR系統(tǒng)在分析時間、便攜性、樣品體積以及執(zhí)行吞吐量分析 和量化能力方面的改善。這使用便攜式微PCR裝置實現(xiàn)，該便攜式微PCR裝置實時原位檢 測/量化PCR產(chǎn)物，并且包括■用后可丟棄的PCR芯片，由帶有透明密封帽的(一個或多個)反應(yīng)室、嵌入式加 熱器和溫度傳感器組成?！鍪殖蛛娮訂卧?，包含如下單元 用于加熱器和溫度傳感器的控制電路。 熒光光學(xué)檢測系統(tǒng)?！鲋悄苁謾C或PDA(個人數(shù)字助理)，運行程序以控制所述手持單元。用后可丟棄的PCR芯片包括被嵌入式加熱器加熱且被嵌入式熱敏電阻器監(jiān)視的 反應(yīng)室。該芯片在低溫共燒陶瓷(LTCC)系統(tǒng)上制備且用帶有與加熱器和溫度傳感器的接觸的連接器適當封裝。嵌入式加熱器由電阻器漿料制成，比如與LTCC兼容的來自Dupont的CF系列。可 以使用任意生陶瓷帶系統(tǒng)，諸如DuPont 95、ESL (41XXX系列)、Ferro (A6系統(tǒng))或Haraeus。 所述嵌入式溫度傳感器是針對氧化鋁基板使用PTC(正溫度系數(shù))電阻熱敏電阻器漿料 (例如409X D是來自ESL Electroscience的ESL 2612)制造的熱敏電阻器。也可以使用 NTC 負溫度系數(shù)電阻漿料，比如來自EMCARemex的NTC 4993。透明(300至lOOOnm波長)密封帽用于防止樣品從所述反應(yīng)室蒸發(fā)并且由聚合物 材料制成?？刂齐娐窇?yīng)包含開/關(guān)或PID(比例積分微分)控制電路，后者會基于嵌入式熱敏 電阻形成其一部分的橋式電路的輸出來控制加熱器。此處公開的控制加熱器和讀取熱敏電 阻器的值的方法僅是示例。這一示例不應(yīng)被視為控制器的唯一方法或限制?？刂萍訜崞骱?讀取熱敏電阻器的值的其他途徑和方法也可應(yīng)用于本公開。熒光光學(xué)檢測系統(tǒng)應(yīng)包含LED(發(fā)光二極管)的激勵源和由光電二極管檢測的熒 光。系統(tǒng)將容納光纖，該光纖將用于把光投射到樣品上。光纖還可用于把光引導(dǎo)到光電二 極管上。LED和光電二極管通過合適的帶通濾波器耦合到光纖。來自光電檢測器的輸出信 號的精確測量需要具有極好信噪比的電路。此處公開的熒光檢測系統(tǒng)僅是示例。這一示例 不應(yīng)被視為檢測的唯一方法或限制。任意熒光檢測器都將是可行的，除非它不能將其自身 投射到樣品上。本發(fā)明提供用于特異性診斷應(yīng)用的適于銷售的手持PCR系統(tǒng)。PDA具有運行的控 制軟件，用以為完整的手持PCR系統(tǒng)提供實時檢測和軟件控制。通過使用該裝置減小熱量和改善加熱/冷卻速率，即使對于5-25 u 1的中等樣品 體積，完成30至40次循環(huán)反應(yīng)所花費時間從2至3小時縮短到小于30分鐘。圖12示出 了使用本發(fā)明的LTCC芯片擴增乙型肝炎病毒DNA所花費的時間。PCR運行45次循環(huán)且能 夠在45分鐘內(nèi)實現(xiàn)擴增。而且，當PCR在20分鐘內(nèi)運行45次循環(huán)時能夠觀察到擴增，在 15分鐘內(nèi)也是如此。用于HBV的常規(guī)PCR持續(xù)時間(45次循環(huán))將花費2個小時。微型化允許使用較小的樣品尺寸且消耗較少體積的昂貴試劑來獲得精確的讀數(shù)。 微系統(tǒng)的小熱量和小樣品尺寸允許快速低功耗熱循環(huán)，由此增加多種處理(諸如通過微 PCR的DAN復(fù)制)的速度。另外，通過增加微尺度上可用的表面積體積比，依賴于表面化學(xué) 性的化學(xué)過程極大地增強。微應(yīng)用流體學(xué)的優(yōu)點能夠促進用于化學(xué)分析的集成微系統(tǒng)的發(fā) 展。轉(zhuǎn)變成手持裝置的微芯片由此將PCR機器從復(fù)雜的實驗室中移出，因而增加了這 種極強大技術(shù)的推進，使得它用于臨床診斷、食品測試、血庫的血液篩查或者其他應(yīng)用領(lǐng) 域。使用多個反應(yīng)室的現(xiàn)有PCR儀器提供全都運行相同的熱協(xié)議的多個DNA實驗點， 因此并不是時間有效的。存在縮短反應(yīng)時間和引入樣品體積的需要。今后設(shè)計的即用型PCR將具有裝置陣列，該裝置陣列具有極快熱響應(yīng)并且與相鄰 PCR芯片高度隔離，從而能夠使用不同的熱協(xié)議以最小的串擾來有效獨立地運行多個反應(yīng)。PCR產(chǎn)物的分析或量化通過實時熒光檢測系統(tǒng)的實際集成實現(xiàn)。該系統(tǒng)也可以與 量化和感測系統(tǒng)集成以檢測像乙肝(圖12)、AIDS、肺結(jié)核之類的疾病。其他市場包括食品監(jiān)控、DNA分析、法醫(yī)科學(xué)和環(huán)境監(jiān)控。在確定芯片中的溫度配置的均勻性之后，在這些芯片上實施PCR反應(yīng)。已成功地使用這些芯片擴增了 λ DNA片段和沙門氏菌DNA。圖5以3維視圖形式示出了微芯片，圖中 示出了微芯片與加熱器、導(dǎo)體環(huán)、熱敏電阻器和導(dǎo)電環(huán)(52)的各種連接。圖中還示出連接 導(dǎo)體環(huán)(52)和導(dǎo)體板(33)的柱(51)。圖6示出了使用集成加熱器和熱敏電阻器的芯片上的X-636DNA片段的熔解的比 較圖。圖7示出了與λ -3IlDNA的擴增相關(guān)聯(lián)的熒光信號的增加。熱配置由手持單元控 制并且在芯片(3 μ 1反應(yīng)混合物和6 μ 1油)上執(zhí)行反應(yīng)。使用常規(guī)鎖定放大器監(jiān)視熒光。本發(fā)明還提供診斷系統(tǒng)。發(fā)展診斷系統(tǒng)所采用的過程必須首先標準化用于幾個問 題的熱協(xié)議，隨后在芯片上功能化所述熱協(xié)議。為擴增16S核醣體DNA約300 400bp片 段而設(shè)計的引物來自大腸桿菌和沙門氏菌，而為擴增stn基因約200bp片段而設(shè)計的引物 來自傷寒沙門氏菌。獲得的產(chǎn)物通過SYBR綠熒光檢測以及瓊脂糖凝膠電泳確認。圖7和 圖11示出了使用微芯片擴增的λ-31Π)ΝΑ和沙門氏菌基因的凝膠照片。用于擴增λ -311 DNA的熱配置變性94°C(90s)94°C (30s)-50°C (30s)_72°C (45s)延伸:72°C(120s)用于擴增沙門氏菌基因的熱配置變性94°C(90s)94°C (30s)-55°C (30s)-72°C (30s)延伸72°C(300s)使用經(jīng)處理的血液和血漿的PCR使用沉淀試劑處理血液或血漿，該沉淀試劑可以從這些樣品沉淀主要PCR抑制 物。清液用作模板。使用該協(xié)議，獲得來自傷寒沙門氏菌(圖8)的約200bp片段的擴增。 在圖8中，凝膠電泳圖像顯示1.控制反應(yīng)，2. PCR產(chǎn)物-未處理的血液，3. PCR產(chǎn)物-經(jīng)處理的血液，4. PCR產(chǎn)物-經(jīng)處理的血漿。血液直接PCR緩沖器提出了唯一緩沖劑以用于使用血液或血漿樣品的直接PCR。使用該唯一緩沖劑系 統(tǒng)，已經(jīng)實現(xiàn)了使用血液和血漿的直接PCR擴增。使用本發(fā)明的LTCC芯片，通過這種緩沖 劑系統(tǒng)可以獲得針對血液高達50%的擴增，以及針對血漿達40%的擴增(見圖9和10)。在圖9中，凝膠電泳圖像顯示1. PCR 產(chǎn)物-20% 血液，2. PCR 產(chǎn)物-30% 血液，3. PCR 產(chǎn)物-40%血液，4. PCR產(chǎn)物-50%血液；并且
在圖10中，凝膠電泳圖像顯示1. PCR 產(chǎn)物-20% 血菜，
2. PCR 產(chǎn)物-30% 血菜，3. PCR 產(chǎn)物-40%血菜，4. PCR 產(chǎn)物-50%血菜，5.控制反應(yīng)。唯一緩沖物包括緩沖鹽、包含二價離子的氯化物或硫化物、非離子清潔劑、穩(wěn)定劑 和醇。圖13示出了用于熔解λ-311DNA的熒光信號的微分的LTCC芯片的熔解曲線。該 圖還提供了本發(fā)明(131)和常規(guī)PCR裝置(132)之間的比較。較陡的峰峰值/寬度(χ軸)@半峰值=1. 2/43較淺的峰峰值/寬度(χ軸)@半峰值=0. 7/63較高的比例指示較陡的峰。而且，在該圖中，y軸是微分(熔解曲線的斜率)，較高 的斜率表示較陡的熔解。
權(quán)利要求
一種包含由低溫共燒陶瓷(LTCC)制成的多個層的微芯片，其中反應(yīng)室在多個反應(yīng)室層中形成以用于裝載樣品，導(dǎo)體嵌入在位于所述反應(yīng)室之下的至少一個導(dǎo)體層中，并且加熱器嵌入在位于一個或多個導(dǎo)體層之下的至少一個加熱器層中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微芯片，其中所述反應(yīng)室覆蓋有透明密封帽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微芯片，其中所述芯片包含溫度傳感器。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微芯片，其中所述溫度傳感器嵌入在所述芯片的至少一個傳 感器層中。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微芯片，其中所述溫度傳感器是熱敏電阻器。
6.根據(jù)權(quán)利要求1和4所述的微芯片，其中所述芯片提供將外部控制電路連接到溫度 傳感器和加熱器的接觸焊盤。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微芯片，其中所述溫度傳感器放置在所述芯片外部以測量芯 片溫度。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微芯片，其中所述反應(yīng)室由導(dǎo)體環(huán)圍繞。
9.根據(jù)權(quán)利要求1和8所述的微芯片，其中所述導(dǎo)體環(huán)由柱連接到一個或多個導(dǎo)體層。
10.根據(jù)權(quán)利要求1、8和9所述的微芯片，其中所述導(dǎo)體由從包括金、銀、鉬和鈀或其合 金的組中選出的材料制成。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微芯片，其中在反應(yīng)室底部與加熱器之間存在間隙，并且所 述間隙的范圍在約0. 2mm至約0. 7mm之間。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微芯片，其中該樣品是食品或從包括血液、血清、血漿、組 織、唾液、痰和尿的組中選出的生物樣品。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微芯片，其中是反應(yīng)室具有約1μ 1至約25 μ 1的體積。
14.一種制造微芯片的方法，包含以下步驟(a)布置由低溫共燒陶瓷(LTCC)制成的多個層并且制備阱以形成反應(yīng)室，(b)將包含加熱器的至少一個LTCC層放置在該室下，(c)將一個或若干導(dǎo)體層放置在加熱器和反應(yīng)室之間，以及(d)互連這些層以形成微芯片。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中在加熱器和反應(yīng)室之間或在加熱器之下布置包 含溫度傳感器的至少一個LTCC層。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中該室由導(dǎo)電環(huán)圍繞。
17.根據(jù)權(quán)利要求14和16所述的方法，其中提供柱來連接導(dǎo)電環(huán)和一個或多個導(dǎo)體層。
18.一種微PCR裝置，包含(a)包含多個LTCC層的微芯片，其中反應(yīng)室在多個層中形成以用于裝載樣品，導(dǎo)體嵌 入在位于反應(yīng)室之下的至少一個層中且加熱器嵌入在位于一個或多個導(dǎo)體層之下的至少 一個層中；(b)溫度傳感器，嵌入在微芯片中或放置在該芯片之外，用于測量芯片溫度，(c)控制電路，基于溫度傳感器輸入控制加熱器；以及(d)光學(xué)系統(tǒng)，從樣品檢測熒光信號。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的微PCR裝置，其中所述裝置是手持裝置。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的微PCR裝置，其中所述裝置使用便攜式計算平臺進行控制。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的微PCR裝置，其中所述裝置布置為陣列以實現(xiàn)多個PCR。
22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的微PCR裝置，其中所述微芯片可從所述裝置釋放。
23.一種使用微PCR裝置檢測樣品中的分析物或者診斷疾病狀態(tài)的方法，所述方法包 含以下步驟(a)將包含核酸的樣品裝載到包含多個LTCC層的微芯片上，通過運行該微PCR裝置擴 增核酸；以及(b)基于擴增的核酸的熒光讀數(shù)確定分析物的存在與否，或者基于擴增的核酸的熒光 讀數(shù)確定病原體的存在與否以診斷疾病狀態(tài)。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述核酸是DNA或RNA。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述方法提供擴增產(chǎn)物的定性和定量分析兩者o
26.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述樣品是食品或生物樣品。
27.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述生物樣品從包括血液、血清、血漿、組織、唾 液、痰和尿的組中選出。
28.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述病原體從包括病毒、細菌、真菌、酵母菌和 原生動物的組中選出。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種包含多個LTCC層的微芯片，其中反應(yīng)室在多個頂層中形成以裝載樣品。加熱器嵌入在位于反應(yīng)室之下的至少一層中且溫度傳感器嵌入在加熱器和反應(yīng)室之間的至少一層中以用于分析樣品。溫度傳感器可以放置在芯片外部以測量芯片溫度。
文檔編號G01N33/48GK101868722SQ200880116740
公開日2010年10月20日 申請日期2008年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月12日
發(fā)明者C·B·納伊爾, K·庫馬爾, M·賈甘納斯, P·V·蘇巴拉奧, R·M·拉德哈克里什南, R·賈亞拉曼, S·K·納拉希姆哈, S·維斯瓦納桑, S·錢納克里什納埃赫 申請人:比格科技私人有限公司