專利名稱：檢測對象的檢測方法和定量方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一直以來，作為檢測被檢體中的檢測對象的方法，采用膠乳凝集法。所謂膠乳凝集 法，是指在檢測生物體樣品等流體中的抗原時，通過將擔(dān)載有與抗原特異性結(jié)合的抗體或 其片段的膠乳和流體混合，測定膠乳的凝集程度，來檢測或定量抗原的方法(例如參照專 利文獻(xiàn)1)。根據(jù)該膠乳凝集法，作為檢驗(yàn)體添加的抗原使多個膠乳結(jié)合抗體交聯(lián)，促進(jìn)膠乳 的凝集。這樣，由于程序簡單，因此能夠簡便且快速地檢測抗原。但是，當(dāng)抗原為微量時，不 易發(fā)生交聯(lián)，因此膠乳不能充分凝集。因此，難以檢測微量的抗原。在手動測定中，還存在 測定結(jié)果偏差大等問題。于是，人們還廣泛采用ELISA法或CLEIA法這樣的利用酶底物反應(yīng)的方法。這些 方法中，例如使與抗原特異性結(jié)合的一次抗體與抗原結(jié)合，并使具有酶的二次抗體與該一 次抗體結(jié)合。其中，通過添加酶底物，測定酶催化反應(yīng)的程度，來檢測或定量抗原。根據(jù)這些方法，例如使用發(fā)光試劑作為底物時，底物添加后的發(fā)光檢測靈敏度高， 因此也可以檢測微量的抗原。專利文獻(xiàn)1 特公昭58-11575號公報

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題但是，在利用酶底物反應(yīng)的方法中，必須使用二次抗體、發(fā)光試劑、發(fā)光檢測裝置 等特殊的試劑、儀器，作業(yè)成本高。此外，如圖8所示，該方法包括培育試樣和各試劑的步驟(ST110、ST130)、清洗系 統(tǒng)的步驟(ST120)、測定發(fā)光的步驟(ST140)等多個階段，操作繁雜。而且，各階段所需的時 間非常長，不適合大規(guī)模處理。本發(fā)明鑒于上述情況而設(shè)，其課題在于提供能夠快速、廉價且簡便地檢測、定量 檢測對象的檢測、定量用試劑盒、以及可以高精度地進(jìn)行檢測、定量的方法。解決課題的方法本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)若使親水性化合物接近，則會阻礙刺激響應(yīng)性聚合物的凝集，從 而完成了本發(fā)明。具體而言，本發(fā)明提供以下內(nèi)容。[1]試劑盒，該試劑盒用于檢測和/或定量檢測對象，其中含有第1結(jié)合物和第2 結(jié)合物，第1結(jié)合物含有刺激響應(yīng)性聚合物的第1物質(zhì)與對上述檢測對象親和的第1親 和性物質(zhì)結(jié)合的結(jié)合物；第2結(jié)合物親水性的第2物質(zhì)與對上述檢測對象親和的第2親和性物質(zhì)結(jié)合的 結(jié)合物，第1親和性物質(zhì)和第2親和性物質(zhì)可以在上述檢測對象的不同部位同時與上述檢 測對象結(jié)合。
[2] [1]所述的試劑盒，其中第1物質(zhì)含有微粒狀磁性物質(zhì)。[3] [1]或[2]所述的試劑盒，其中第2物質(zhì)為親水性聚合物。[4] [1] [3]中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中第2物質(zhì)為多元醇。[5] [1] [3]中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中第2物質(zhì)為含有聚氧化亞烷基作為構(gòu) 成單元的聚合物。[6]檢測檢驗(yàn)體中的檢測對象的方法，該方法包括以下步驟將第1結(jié)合物、第2結(jié)合物和上述檢驗(yàn)體混合，并將該混合物置于刺激響應(yīng)性聚合 物凝集的條件下，判定上述刺激響應(yīng)性聚合物是否分散，所述第1結(jié)合物為含有刺激響應(yīng) 性聚合物的第1物質(zhì)與對上述檢測對象親和的第1親和性物質(zhì)結(jié)合的結(jié)合物；所述第2結(jié) 合物為親水性的第2物質(zhì)與對上述檢測對象親和的第2親和性物質(zhì)結(jié)合的結(jié)合物；第1親和性物質(zhì)和第2親和性物質(zhì)可以在上述檢測對象的不同部位同時與上述檢 測對象結(jié)合。[7] [6]所述的方法，其中第1物質(zhì)含有微粒狀磁性物質(zhì)，上述方法還包括通過施加磁力來分離凝集的磁性物質(zhì)的步驟。[8]定量檢驗(yàn)體中的檢測對象的方法，該方法包括以下步驟將第1結(jié)合物、第2結(jié)合物和上述檢驗(yàn)體混合，并將該混合物置于刺激響應(yīng)性聚合 物凝集的條件下，所述第1結(jié)合物為含有刺激響應(yīng)性聚合物的第1物質(zhì)與對上述檢測對象 親和的第1親和性物質(zhì)結(jié)合的結(jié)合物；所述第2結(jié)合物為親水性的第2物質(zhì)與對上述檢測 對象親和的第2親和性物質(zhì)結(jié)合的結(jié)合物；測定上述混合物的濁度，根據(jù)上述檢測對象的量與濁度在上述預(yù)定條件下的關(guān)系 式，算出上述檢驗(yàn)體中檢測對象的量。[9] [8]所述的方法，其中，第1物質(zhì)含有微粒狀磁性物質(zhì)，上述方法還包括通過施加磁力來分離凝集的磁性物質(zhì)的步驟。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，若存在檢測對象，則第1親和性物質(zhì)和第2親和性物質(zhì)與該檢測對象 結(jié)合，因此與第1親和性物質(zhì)結(jié)合的刺激響應(yīng)性聚合物和與第2親和性物質(zhì)結(jié)合的第2物 質(zhì)接近。由此，由于親水性部分配置在刺激響應(yīng)性聚合物的附近，所以會阻礙對刺激作出響 應(yīng)的刺激響應(yīng)性聚合物的凝集。因此，通過觀察有無該凝集阻礙，即可檢測是否存在檢測對 象。此外，通過測定凝集阻礙的程度，即可定量檢測對象。以上程序均無需特別使用特殊試劑、儀器即可進(jìn)行，廉價且簡便。此外，由于只測 定凝集阻礙的程度，而不是利用被酶催化的反應(yīng)的系統(tǒng)，所以可以快速進(jìn)行。另外，第2物 質(zhì)所具有的親水性部分高度阻礙刺激響應(yīng)性聚合物的凝集，因此可以以高靈敏度檢測、定 量檢測對象。


圖1是本發(fā)明一實(shí)施方式的方法中使用的結(jié)合物的概略構(gòu)成圖。圖2是顯示上述實(shí)施方式所涉及的結(jié)合物的使用狀態(tài)的模式圖。圖3是顯示在本發(fā)明一實(shí)施例的方法中磁力的施加方式的圖。圖4是本發(fā)明一實(shí)施例的方法的流程圖。
圖5是顯示在本發(fā)明一實(shí)施例的方法中測定時間與濁度的關(guān)系的圖。圖6是顯示在本發(fā)明另一實(shí)施例的方法中測定時間與濁度的關(guān)系的圖。圖7是顯示在圖6的實(shí)施例的方法中檢測對象的量與濁度的關(guān)系式的圖。圖8是以往例的方法的流程圖。符號說明10第1結(jié)合物
11刺激響應(yīng)性聚合物
13第1抗體(第1親和性物質(zhì))
15抗生物素蛋白
17生物素
19磁性物質(zhì)
20第2結(jié)合物
21第2物質(zhì)
23第2抗體(第2親和性物質(zhì))
50檢測對象
71比色皿
73永久磁石
具體實(shí)施例方式以下，參照附圖對本發(fā)明一實(shí)施方式進(jìn)行說明。<試劑盒>本發(fā)明的試劑盒是用于檢測或定量檢測對象的試劑盒，含有第1結(jié)合物和第2結(jié) 合物。以下對各構(gòu)成進(jìn)行詳細(xì)說明。[第1結(jié)合物]第1結(jié)合物是含有刺激響應(yīng)性聚合物的第1物質(zhì)與對檢測對象親和的第1親和性 物質(zhì)結(jié)合的結(jié)合物。(第1物質(zhì))本發(fā)明所使用的第1物質(zhì)是含有刺激響應(yīng)性聚合物的物質(zhì)，該刺激響應(yīng)性聚合物 是對外部刺激作出響應(yīng)而發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，從而可以調(diào)整凝集和分散的聚合物。對刺激沒有 特別限定，可以是溫度變化、光照射、酸或堿的添加(PH的變化)、電場變化等。在本發(fā)明中，刺激響應(yīng)性聚合物特別優(yōu)選為根據(jù)溫度變化能夠凝集和分散的溫度 響應(yīng)性聚合物。需要說明的是，作為溫度響應(yīng)性聚合物，可以是具有下限臨界溶液溫度(以 下也稱作LCST)的聚合物或具有上限臨界溶液溫度的聚合物(以下也稱作UCST)。作為本發(fā)明所使用的具有下限臨界溶液溫度的聚合物，可以列舉包含N-正丙基 丙烯酰胺、N-異丙基丙烯酰胺、N-乙基丙烯酰胺、N, N- 二甲基丙烯酰胺、N-丙烯酰基吡咯 烷、N-丙烯?；哙ぁ-丙烯?；鶈徇?、N-正丙基甲基丙烯酰胺、N-異丙基甲基丙烯酰胺、 N-乙基甲基丙烯酰胺、N，N-二甲基甲基丙烯酰胺、N-甲基丙烯?；量┩?、N-甲基丙烯酰 基哌啶、N-甲基丙烯酰基嗎啉等N取代(甲基)丙烯酰胺衍生物的聚合物；羥丙基纖維素、 聚乙烯醇部分乙?；?、聚乙烯基甲基醚、(聚氧乙烯-聚氧丙烯)嵌段共聚物、聚氧乙烯月
5桂基胺等聚氧乙烯烷基胺衍生物；聚氧乙烯脫水山梨糖醇月桂酸酯等聚氧乙烯脫水山梨糖 醇酯衍生物；(聚氧乙烯壬基苯基醚)丙烯酸酯、(聚氧乙烯辛基苯基醚)甲基丙烯酸酯等 (聚氧乙烯烷基苯基醚)(甲基)丙烯酸酯類；以及(聚氧乙烯月桂基醚)丙烯酸酯、(聚氧 乙烯油烯基醚)甲基丙烯酸酯等(聚氧乙烯烷基醚)(甲基)丙烯酸酯類等聚氧乙烯(甲 基)丙烯酸酯衍生物等。并且，還可以利用包含這些聚合物和它們中的至少2種單體的共聚 物。此外，還可以使用N-異丙基丙烯酰胺與N-叔丁基丙烯酰胺的共聚物。使用含有(甲 基)丙烯酰胺衍生物的聚合物時，可以在該聚合物中以具有下限臨界溶液溫度的范圍共聚 其他可共聚的單體。在本發(fā)明中，其中可以優(yōu)選使用包含選自N-正丙基丙烯酰胺、N-異丙 基丙烯酰胺、N-乙基丙烯酰胺、N, N- 二甲基丙烯酰胺、N-丙烯?；量┩椤-丙烯?；?啶、N-丙烯?；鶈徇-正丙基甲基丙烯酰胺、N-異丙基甲基丙烯酰胺、N-乙基甲基丙烯 酰胺、N, N- 二甲基甲基丙烯酰胺、N-甲基丙烯?；量┩?、N-甲基丙烯酰基哌啶、N-甲基 丙烯酰基嗎啉的至少1種單體的聚合物或N-異丙基丙烯酰胺與N-叔丁基丙烯酰胺的共聚 物。作為本發(fā)明所使用的具有上限臨界溶液溫度的聚合物，可以使用包含選自丙烯酰 基甘氨酰胺、丙烯?；哙ぜ柞０?、丙烯酰基天冬酰胺(Τ"々口 O 7 7 A，O 7 S κ )和丙烯?；劝滨０返鹊闹辽?種單體的聚合物。另外，可以是包含它們中的至少2
種單體的共聚物。這些聚合物中，可以以具有上限臨界溶液溫度的范圍共聚丙烯酰胺、乙酰 基丙烯酰胺、生物素醇丙烯酸酯(biotinol acrylate)、N_生物素基-N’ -甲基丙烯?；?亞甲基酰胺、丙烯?；“滨０?、甲基丙烯基肌氨酰胺、丙烯?；谆蜞奏さ?、其他可共 聚的單體。另外，在本發(fā)明中，作為刺激響應(yīng)性聚合物，可以使用根據(jù)PH變化能夠凝集和分 散的pH響應(yīng)性聚合物。對pH響應(yīng)性聚合物發(fā)生結(jié)構(gòu)變化的pH沒有特別限定，但從給予刺 激時可以抑制由第1結(jié)合物、第2結(jié)合物和檢驗(yàn)體的變性等引起的檢測、定量精度的降低的 角度考慮，優(yōu)選PH4 10，進(jìn)一步優(yōu)選為pH5 9。作為這樣的pH響應(yīng)性聚合物，可以例示含有羧基、磷酸、磺?；?、氨基等基團(tuán)作 為官能團(tuán)的聚合物。更具體而言，可以是(甲基)丙烯酸、馬來酸、苯乙烯磺酸、2-丙烯酰 胺-2-甲基丙磺酸、(甲基)丙烯酸磷?；阴?、甲基丙烯酸氨基乙酯、氨基丙基(甲基)丙 烯酰胺、二甲基氨基丙基(甲基)丙烯酰胺等具有解離基團(tuán)的單體聚合的聚合物，還可以是 這些具有解離基團(tuán)的單體以不損及PH響應(yīng)能力的程度與其他乙烯基單體、例如(甲基)丙 烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丁酯等(甲基)丙烯酸酯類、乙酸乙烯酯、 丙酸乙烯酯等乙烯基酯類、苯乙烯、氯乙烯、N-乙烯吡咯烷酮等乙烯基化合物、(甲基)丙烯 酰胺類等共聚的共聚物。(微粒狀磁性物質(zhì))在此使用的微粒狀磁性物質(zhì)可以由多元醇和磁鐵礦構(gòu)成。該多元醇只要是構(gòu)成單 元中具有至少2個羥基且可與鐵離子結(jié)合的醇結(jié)構(gòu)體即可，沒有特別限定，例如有葡聚糖、 聚乙烯醇、甘露醇、山梨醇、環(huán)糊精。例如，在日本特開2005-82538公報中公開了使用葡聚 糖的微粒狀磁性物質(zhì)的制造方法。此外，還可以使用如甲基丙烯酸縮水甘油酯聚合物那樣 具有環(huán)氧基、且開環(huán)后形成多元醇結(jié)構(gòu)體的化合物。使用這樣的多元醇制備的微粒狀磁性 物質(zhì)(磁性微粒)，優(yōu)選其平均粒徑為0. 9nm以上且不足lOOOnm，以具有良好的分散性。為了提高目標(biāo)檢測對象的檢測靈敏度，平均粒徑特別優(yōu)選為2. 9nm以上且不足200nm。[第2結(jié)合物]第2結(jié)合物是親水性的第2物質(zhì)與對檢測對象親和的第2親和性物質(zhì)結(jié)合的結(jié)合 物。(第2物質(zhì))親水性的第2物質(zhì)例如為水溶性聚合物，可以列舉聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化 乙烯、聚氧化丙烯等含有聚氧化亞烷基作為構(gòu)成單元的聚合物；聚乙烯醇等含醇性羥基的 聚合物；葡聚糖、環(huán)糊精、瓊脂糖、羥丙基纖維素等水溶性多糖類等多元醇。這些親水性物質(zhì) 在聚合物鏈中或末端可以具有用于結(jié)合第2親和性物質(zhì)的官能團(tuán)等。(第1親和性物質(zhì)、第2親和性物質(zhì))第1結(jié)合物的第1親和性物質(zhì)和第2結(jié)合物的第2親和性物質(zhì)在檢測對象的不同 部位可以同時與檢測對象結(jié)合。第1親和性物質(zhì)和第2親和性物質(zhì)例如可以是識別檢測對 象的不同抗原決定簇的單克隆抗體。在此使用的抗體可以是任意類型的免疫球蛋白分子，也可以是Fab等具有抗原結(jié) 合位點(diǎn)的免疫球蛋白分子片段。此外，抗體可以是單克隆抗體也可以是多克隆抗體，優(yōu)選為 具有不同的抗原識別位點(diǎn)的2種單克隆抗體。[制作方法]對上述試劑盒的制作方法進(jìn)行說明。[第1結(jié)合物的制作]第1結(jié)合物通過將第1物質(zhì)和第1親和性物質(zhì)結(jié)合來制作。對該結(jié)合方法沒有特 別限定，例如在第1物質(zhì)側(cè)(例如刺激響應(yīng)性聚合物部分)和第1親和性物質(zhì)(例如第1 抗體)側(cè)這兩側(cè)結(jié)合相互具有親和性的物質(zhì)(例如抗生物素蛋白和生物素、谷胱甘肽和谷 胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶)，經(jīng)由這些物質(zhì)使第1物質(zhì)和第1親和性物質(zhì)結(jié)合。具體而言，如國際公開W001/09141號小冊子所述，生物素與刺激響應(yīng)性聚合物的 結(jié)合，可以通過使生物素等與甲基丙烯基或丙烯基等聚合性官能團(tuán)結(jié)合形成加成聚合性單 體，再與其他單體共聚來進(jìn)行。另外，抗生物素蛋白等與第1親和性物質(zhì)的結(jié)合可以按照常 規(guī)方法來進(jìn)行。接下來，將生物素結(jié)合刺激響應(yīng)性聚合物和抗生物素蛋白結(jié)合第1親和性 物質(zhì)混合，則經(jīng)由抗生物素蛋白與生物素的結(jié)合，第1親和性物質(zhì)和刺激響應(yīng)性聚合物結(jié)
I=I O作為另外的方法，可以采用在聚合物聚合時使具有羧基、氨基或環(huán)氧基等官能團(tuán) 的單體與其他單體共聚，經(jīng)由該官能團(tuán)，按照本技術(shù)領(lǐng)域周知的方法使抗體親和性物質(zhì) (例如Melongel ( > 口 > 7 > )、蛋白A、蛋白G)與聚合物結(jié)合的方法。通過使第1抗體與 如此操作得到的抗體親和性物質(zhì)結(jié)合，制作刺激響應(yīng)性聚合物與抗檢測對象抗原的第1抗 體的第1結(jié)合物?；蛘?，可以在聚合物聚合時使具有羧基、氨基或環(huán)氧基等官能團(tuán)的單體與其他單 體共聚，按照常規(guī)方法使抗檢測對象抗原的第1抗體與這些官能團(tuán)直接結(jié)合?；蛘?，可以使第1親和性物質(zhì)和刺激響應(yīng)性聚合物與微粒狀磁性物質(zhì)結(jié)合。也可以將第1物質(zhì)置于刺激響應(yīng)性聚合物凝集的條件下，之后通過離心進(jìn)行分 離，從而純化第1結(jié)合物。第1結(jié)合物的純化還可以通過以下方法來進(jìn)行使微粒狀磁性物質(zhì)與刺激響應(yīng)性聚合物結(jié)合，再使其與第1親和性物質(zhì)結(jié)合，之后施加磁力來回收磁性物 質(zhì)。微粒狀磁性物質(zhì)與刺激響應(yīng)性聚合物的結(jié)合，可以通過經(jīng)由反應(yīng)性官能團(tuán)進(jìn)行結(jié) 合的方法、或向磁性物質(zhì)中的多元醇上的活性氫或多元醇中導(dǎo)入聚合性不飽和鍵進(jìn)行接枝 聚合的方法等本技術(shù)領(lǐng)域周知的方法來進(jìn)行(例如參照ADV. Polym. Sci.、第4卷、第111 頁、1965 和 J. Polymer Sci.、Part_A、3、第 1031 頁、1965)。接下來，對使親水性的第2物質(zhì)與抗檢測對象抗原的第2抗體結(jié)合來制作第2結(jié) 合物的方法進(jìn)行闡述。[第2結(jié)合物的制作]第2結(jié)合物通過使第2物質(zhì)與第2親和性物質(zhì)直接或間接結(jié)合來制作。沒有特別 限定，例如在第2物質(zhì)側(cè)和第2親和性物質(zhì)(例如第2抗體)側(cè)這兩側(cè)結(jié)合相互具有親和 性的物質(zhì)(例如抗生物素蛋白和生物素、谷胱甘肽和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶)，經(jīng)由這些物質(zhì)使 第2物質(zhì)和第2親和性物質(zhì)間接結(jié)合。使第2物質(zhì)和第2親和性物質(zhì)直接結(jié)合時，可以經(jīng)由官能團(tuán)使之結(jié)合，例如在使用 官能團(tuán)時，可以按照Ghosh等人的方法(Ghosh等人.=Bioconjugate Chem.、1、71_76、1990) 的馬來酰亞胺_硫醇偶聯(lián)進(jìn)行結(jié)合。如此操作制造的試劑盒，例如可以通過以下方法用于檢測或定量檢測對象。<檢測方法>本發(fā)明的檢測方法包括以下步驟首先，將第1結(jié)合物、第2結(jié)合物和檢驗(yàn)體混合， 并將該混合物置于刺激響應(yīng)性聚合物凝集的條件下，判定刺激響應(yīng)性聚合物是否分散。程 序的細(xì)節(jié)說明如下。(混合、凝集)首先，將第1結(jié)合物和第2結(jié)合物在容器內(nèi)混合，再添加檢驗(yàn)體，得到混合物。接 著，將該混合物置于刺激響應(yīng)性聚合物凝集的條件下。這樣，當(dāng)存在檢測對象時，刺激響應(yīng) 性聚合物被第2結(jié)合物中的親水性部分阻礙凝集而分散。另一方面，當(dāng)不存在檢測對象時， 刺激響應(yīng)性聚合物的凝集沒有被阻礙而發(fā)生凝集。參照圖1 圖2來說明該現(xiàn)象。如圖1所示，第1結(jié)合物10含有刺激響應(yīng)性聚合物11，該刺激響應(yīng)性聚合物11經(jīng) 由抗生物素蛋白15和生物素17與抗檢測對象50的第1抗體13結(jié)合。另外，第1結(jié)合物 10含有微粒狀磁性物質(zhì)19，在該磁性物質(zhì)19的表面結(jié)合有刺激響應(yīng)性聚合物11。另一方 面，第2結(jié)合物20含有親水性的第2物質(zhì)21，該第2物質(zhì)21與抗檢測對象50的第2抗體 23結(jié)合。而且，第1抗體13和第2抗體23可以在檢測對象50的不同部位同時與檢測對象 50結(jié)合。如圖2所示，若將第1結(jié)合物10、第2結(jié)合物20和檢驗(yàn)體的混合物置于預(yù)定條件 下，則當(dāng)存在檢測對象50時，刺激響應(yīng)性聚合物11被第2結(jié)合物20中的親水性部分阻礙 凝集而分散(圖2(A))。另一方面，當(dāng)不存在檢測對象50時，刺激響應(yīng)性聚合物11的凝集 沒有被阻礙而發(fā)生凝集(圖2(B))。為了使刺激響應(yīng)性聚合物11凝集，例如在使用溫度響應(yīng)性聚合物時，將裝有混合 液的容器移入溫度響應(yīng)性聚合物凝集的溫度的恒溫槽內(nèi)即可。溫度響應(yīng)性聚合物中存在具
8有上限臨界溶液溫度(以下有時簡稱為“UCST”)的聚合物和具有下限臨界溶液溫度(以下 有時簡稱為“LCST”)的聚合物這兩種。例如，使用具有LCST為37°C的下限臨界溶液溫度 的聚合物時，通過將裝有混合液的容器移入37°C以上的恒溫槽內(nèi)，可以使溫度響應(yīng)性聚合 物凝集。當(dāng)使用具有UCST為5°C的上限臨界溶液溫度的聚合物時，通過將裝有混合液的容 器移入低于5°C的恒溫槽內(nèi)，可以使溫度響應(yīng)性聚合物凝集。使用pH響應(yīng)性聚合物時，向裝有混合液的容器中加入酸溶液或堿溶液即可。具體 而言，向裝有處于PH響應(yīng)性聚合物發(fā)生結(jié)構(gòu)變化的pH范圍外的分散混合液的容器中加入 酸溶液或堿溶液，使容器內(nèi)變?yōu)镻H響應(yīng)性聚合物發(fā)生結(jié)構(gòu)變化的pH范圍即可。例如，使用 在pH5以下凝集、超過pH5則分散的pH響應(yīng)性聚合物時，向裝有超過pH5則分散的混合液 的容器中加入酸溶液使PH達(dá)到5以下即可。此外，使用在pHIO以上凝集、不足pHIO則分 散的PH響應(yīng)性聚合物時，向裝有低于pHIO則分散的混合液的容器中加入堿溶液使pH達(dá)到 10以上即可。對pH響應(yīng)性聚合物發(fā)生結(jié)構(gòu)變化的PH沒有特別限定，但優(yōu)選PH4 10，進(jìn) 一步優(yōu)選為pH5 9。使用光響應(yīng)性聚合物時，對裝有混合液的容器照射能夠凝集聚合物的波長的光即 可。用于使聚合物凝集的優(yōu)選的光根據(jù)光響應(yīng)性聚合物所含的光響應(yīng)性官能團(tuán)的種類和結(jié) 構(gòu)而不同，但通常可以優(yōu)選使用波長為190 SOOnm的紫外光或可見光。此時，光強(qiáng)度優(yōu)選 0. 1 lOOOmW/cm2。需要說明的是，從可以提高測定精度的角度考慮，光響應(yīng)性聚合物優(yōu)選 為照射用于測定濁度的光時不易發(fā)生分散、換言之發(fā)生凝集的光響應(yīng)性聚合物。作為光響 應(yīng)性聚合物，當(dāng)使用照射用于測定濁度的光時發(fā)生分散的光響應(yīng)性聚合物時，通過縮短照 射時間，可以提高測定精度。需要說明的是，溫度響應(yīng)性聚合物的凝集可以在第1結(jié)合物和第2結(jié)合物與檢測 對象結(jié)合后進(jìn)行，也可以同時并列進(jìn)行，但從可以縮短處理時間的角度考慮，優(yōu)選后者。但 是，當(dāng)溫度響應(yīng)性聚合物凝集的條件、與第1結(jié)合物和第2結(jié)合物與檢測對象結(jié)合的條件差 別甚大時，優(yōu)選前者。其中，下限臨界溶液溫度如下確定。首先，將試樣裝入吸光光度計的比色皿中，以 1°C/分鐘的速度將試樣升溫。其間，記錄550nm處的透過率變化。其中，將聚合物溶解至 透明時的透過率作為100%、將完全凝集時的透過率作為0%時，求出透過率達(dá)到50%時的 溫度，作為LCST。另外，上限臨界溶液溫度的情形如下確定。以1°C /分鐘的速度將試樣冷卻，同樣 記錄550nm處的透過率變化。其中，將聚合物溶解至透明時的透過率作為100%、將完全凝 集時的透過率作為0%時，求出透過率達(dá)到50%時的溫度，作為UCST。(判定)判定是否分散例如可以通過目視或濁度測定來進(jìn)行。濁度可以由光散射裝置測得 的光透過率算出，若濁度低，則刺激響應(yīng)性聚合物的凝集被阻礙，暗示檢測物質(zhì)的存在。其 中，使用的光的波長可以根據(jù)磁性物質(zhì)的粒徑等適當(dāng)設(shè)定，以得到所期望的檢測靈敏度。從 可以利用以往通用的裝置的角度考慮，光的波長優(yōu)選為可見光范圍內(nèi)(例如550nm)。目視或濁度測定可以在一定時刻斷續(xù)地進(jìn)行，也可以隨時間連續(xù)進(jìn)行。還可以根 據(jù)某時刻的濁度測定值與其他時刻的濁度測定值之差進(jìn)行判定?！炊糠椒ā?br> 根據(jù)本發(fā)明的定量方法，首先，將第1結(jié)合物、第2結(jié)合物和檢驗(yàn)體混合，并將該混 合物置于刺激響應(yīng)性聚合物凝集的預(yù)定條件下，接下來測定混合物的濁度，根據(jù)檢測對象 的量與濁度在預(yù)定條件下的關(guān)系式，算出檢驗(yàn)體中檢測對象的量。前半部分的程序與前述 的檢測方法類似，因此省略說明。(關(guān)系式)制作與上述預(yù)定條件相同條件下的、檢測對象的量與濁度的關(guān)系式。構(gòu)成該關(guān)系 式的檢測對象的量與濁度的測定，其數(shù)據(jù)越多則得到可靠性越高的關(guān)系式。因此，數(shù)據(jù)只要 涉及2個以上檢測對象的量即可，優(yōu)選涉及3個以上檢測對象的量。其中，檢測對象的量與濁度的關(guān)系式，不僅是顯示檢測對象的量與濁度的直接相 關(guān)的關(guān)系式，而且還可以是檢測對象的量與反映濁度的參數(shù)之間的關(guān)系式。(計算)將混合物的濁度測定值代入制作好的關(guān)系式中，由此可以算出檢驗(yàn)體中檢測對象的量。(分離)第1物質(zhì)含有微粒狀磁性物質(zhì)時，本發(fā)明的檢測方法或定量方法優(yōu)選進(jìn)一步包 括通過施加磁力來分離凝集的磁性物質(zhì)的步驟。由此，凝集的磁性物質(zhì)從含有非凝集狀態(tài) 的磁性物質(zhì)的夾雜物中分離出來。因此，分離的磁性物質(zhì)的量、分散于溶劑時的光透過率等 測定值排除了夾雜物的影響，更忠實(shí)地反映了檢測物質(zhì)的存在。磁力的施加可以通過使磁石接近磁性物質(zhì)來進(jìn)行。該磁石的磁力根據(jù)使用的磁性 物質(zhì)所具有的磁力大小而不同。作為磁石，例如有MAGNA社制釹(才、力”)磁石。此外，磁力的施加可以在判定前或與判定同時并列進(jìn)行，從可以縮短步驟所耗費(fèi) 的時間的角度考慮，優(yōu)選同時并列進(jìn)行。需要說明的是，若施加磁力，則凝集的磁性物質(zhì)以 卷入夾雜物的形式被分離，因此推測分離后的混合物的濁度在夾雜物存在時反而變小。需要說明的是，檢測方法或定量方法中的“濁度測定”，不僅包括直接測定濁度，還 包括測定反映濁度的參數(shù)。作為所述參數(shù)，可以列舉在多個時刻的濁度測定值的差異、所 分離的凝集物量、分離后的非凝集物的濁度等。其中，多個時刻中的1點(diǎn)，例如在對不存在 檢測對象的陰性對照施加磁力時，優(yōu)選為濁度達(dá)到最大值的時刻附近。由此，與在其他時刻 的濁度測定值的差異變大，可以更正確地定量檢測對象的量。(檢測對象)作為檢驗(yàn)體中的檢測對象，可以列舉用于臨床診斷的物質(zhì)，具體可以列舉體液、 尿、咳痰、糞便中等所含的人免疫球蛋白G、人免疫球蛋白M、人免疫球蛋白A、人免疫球蛋白 E、人白蛋白、人纖維蛋白原(纖維蛋白及其分解產(chǎn)物)、α-甲胎蛋白(AFP)、C反應(yīng)性蛋白 (CRP)、肌紅蛋白、癌胎兒性抗原、肝炎病毒抗原、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、人胎盤性催乳 素(HPL)、HIV病毒抗原、變態(tài)反應(yīng)原、細(xì)菌毒素、細(xì)菌抗原、酶、激素(例如人甲狀腺刺激激 素(TSH)、胰島素等)、藥物等。[試劑盒的構(gòu)成及其使用方法的例子]以下，針對檢測對象為抗原的情形，說明用于利用本發(fā)明的方法的試劑盒的構(gòu)成 及其使用方法的例子。試藥試劑盒例如由下述試劑構(gòu)成。
抗原檢測用試藥試劑盒試劑A 與檢測對象抗原特異性結(jié)合的第1抗體和溫度響應(yīng)性聚合物所結(jié)合的微 粒狀磁性物質(zhì)試劑B 識別不同于第1抗體的部位、且能夠同時與檢測對象抗原結(jié)合的第2抗體 所結(jié)合的親水性物質(zhì)試劑C 被測物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品(具體例子有純化抗原)試劑D 稀釋用緩沖液(用于稀釋上述試劑、并可用于稀釋被測試樣的緩沖液，可 以列舉Tris鹽酸緩沖液、磷酸緩沖液等)作為測定濁度的裝置，可以使用能夠?qū)⑷萜鲀?nèi)保溫在聚合物凝集的溫度、能夠照 射200nm 900nm的透過光的以往周知的裝置。包含上述試劑的試劑盒，例如可以按以下方法使用。首先，將5 1000征試劑A和5 1000 μ L試劑B混合。準(zhǔn)備在裝有試劑A和試 劑B的溶液中(1)添加被測物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品的陽性對照、(2)不添加任何物質(zhì)的陰性對照、 (3)添加5 1000 μ L被檢液的樣品，使之在聚合物分散的溫度(例如約0 30°C )下反 應(yīng)一定時間。使用溫度響應(yīng)性聚合物時，反應(yīng)后將反應(yīng)液加入保溫在該聚合物的凝集溫度 (例如42°C )的容器中，照射550nm的透過光，測定濁度，進(jìn)行是否存在抗原的判定或抗原 的定量。作為與上述不同的使用方法，可以使試劑A與上述(1)、⑵和(3)在聚合物分散 的溫度下反應(yīng)一定時間后添加試劑B、或者使試劑B與上述(1)、(2)和(3)反應(yīng)后在聚合 物分散的溫度下添加試劑A，反應(yīng)一定時間后，向保溫在凝集溫度的容器中加入反應(yīng)液，照 射550nm的透過光，測定濁度，進(jìn)行是否存在抗原的判定或抗原的定量。[實(shí)施例]本發(fā)明的實(shí)施例中使用的代表性的試劑如下。PBS緩沖液用純凈水將 10倍濃度的市售PBS(8. ImM Na2HPO4,1. 5mM KH2PO4,2. 7mM KClU37mM NaCl、pHL 4、二 ？求 > 夕一 > (株)制)稀釋至 1/10 (V/V)后使用。硼酸緩沖液水。丨J寸4工> 7社制硼酸鹽緩沖液、IOOmM硼酸、pH8. 5。純凈水經(jīng)MILLIP0RE社制“Direct-Q” (商品名)純化的水?！磳?shí)施例1>本實(shí)施例中，使用生物素結(jié)合_溫度響應(yīng)性聚合物表面修飾磁性顆粒作為第1結(jié) 合物，使用生物素結(jié)合聚乙烯醇作為第2結(jié)合物，給出檢測、定量鏈霉抗生物素蛋白的例 子。(第1結(jié)合物的制備)作為生物素結(jié)合-溫度響應(yīng)性聚合物表面修飾磁性顆粒，使用Magnabeat (社)制 的 Therma-Max LB 生物素(0. 4% (質(zhì)量))。取 500 μ LTherma-Max LB 生物素到 1. 5mL 微 管中，將該微管加熱至42°C JiTherma-Max LB生物素凝集，用磁石回收后除去上清。向除 去后的微管中加入500 μ L含有0.5% (w/v)BSA( *義"^社制)、0.5% (w/v) Tween (注冊商 標(biāo))20、IOmM EDTA的PBS緩沖液(pH7. 4)，通過冷卻使之分散，制成第1結(jié)合物的分散溶液。(第2結(jié)合物的制備)[制造例1]生物素結(jié)合聚乙烯醇的制備方法
將ImL 1% (w/v)聚乙烯醇(” 7 ^社制、M205、單側(cè)末端含有巰基)水溶液和 10 μ L 1% (w/v)生物素-PEAC5-馬來酰亞胺(同仁化學(xué)研究所社制)水溶液混合，在37°C 下靜置1小時。使用2根旋轉(zhuǎn)柱(MILLIP0RE社制、Microcon YM-10)純化該反應(yīng)液，用純凈 水調(diào)節(jié)總量為lmL。將其中的100 μ 1與900 μ 1含有0. 5% (w/v) BSA ( ν ^、社制)、0. 5% (w/v) Tween (注冊商標(biāo))20、IOmM EDTA的PBS緩沖液(pH7. 4)混合，由此制成第2結(jié)合物的 分散溶液。(使用生物素結(jié)合_溫度響應(yīng)性聚合物表面修飾磁性顆粒和生物素結(jié)合聚乙烯醇 的鏈霉抗生物素蛋白的定量)[試樣的制備]用純凈水溶解鏈霉抗生物素蛋白(和光純藥工業(yè)社制)使達(dá)到10mg/mL。將該溶 液用含有 0.5% (w/v) BSA ( * 夕社制)、0.5% (w/v) Tween (注冊商標(biāo))20、IOmM EDTA 的 PBS緩沖液(pH7. 4)分別稀釋成13. 3 μ g/mL、6. 7 μ g/mL和O μ g/mL,作為試樣。[定量]如圖3所示，在通用的分光光度計用SEMIMICROCELL 71的光路外安裝尺寸為 5mmX9mmX2mm的釹(才、才夕Λ )永久磁石73 (西興產(chǎn)業(yè)社制)。將該比色皿71設(shè)置在設(shè) 有比色皿溫度控制儀的紫外可見分光光度計V-660DS(日本分光社制)內(nèi)，在37°C下保持 10分鐘以上。圖4是顯示實(shí)施例的定量方法的程序的流程圖。定量方法包括將上述第1結(jié)合 物、第2結(jié)合物和試樣混合的步驟(STlO)；以及測定混合物濁度的步驟(ST20)。(混合)將150 μ L第1結(jié)合物的分散溶液、120 μ L第2結(jié)合物的分散溶液和750 μ L各試 樣注入微管內(nèi)，用移液法(C《7 f 4 > ^ )混合，之后用渦旋混合器攪拌5分鐘。(濁度的測定)將該攪拌液分別注入比色皿71內(nèi)，按照附帶的使用說明書對分光光度計進(jìn)行零 校正，使用波長420nm的光，直接以譜帶(band)寬2. Onm連續(xù)測定1000秒。其結(jié)果見圖5。如圖5所示，直至測定開始約260秒后，鏈霉抗生物素蛋白的量越多，則濁度越低。 這是由于溫度響應(yīng)性聚合物經(jīng)由鏈霉抗生物素蛋白而靠近親水性聚乙烯醇，受到凝集阻礙 而分散的緣故。另一方面，自測定開始約260秒后附近起，鏈霉抗生物素蛋白的量與濁度的 關(guān)系開始逆轉(zhuǎn)，隨著時間的流逝濁度比初期值還低。推測這是由于凝集的磁性物質(zhì)被吸附 在磁石上而分離的緣故。接下來，顯示各試樣在測定開始260秒后和1000秒后這2點(diǎn)的測定值的差異。其 結(jié)果見表1。[表1]
鏈霉抗生物素蛋白濃度(μ g/mL)Δ 260-100013. 31. 32 如表1所示，測定開始260秒后和1000秒后這2點(diǎn)間的測定值之差依賴于鏈霉抗 生物素蛋白的量。即，隨著鏈霉抗生物素蛋白濃度的增加，測定開始260秒后和1000秒后 這2點(diǎn)間的測定值之差變小。由此可知通過測定測定開始260秒后和1000秒后這2點(diǎn)間 的測定值之差，可以檢測或定量檢測物質(zhì)。并且，與包括培育時間在內(nèi)耗時約90分鐘的現(xiàn)有技術(shù)(參照圖8)相比，1000秒以 內(nèi)的檢測時間格外短。此外，對實(shí)際檢驗(yàn)體只需進(jìn)行STlO和ST20的操作(參照圖4)，即可 檢測或定量檢測物質(zhì)，故程序簡便。以上結(jié)果表明濁度根據(jù)鏈霉抗生物素蛋白的濃度而變化，換言之，通過測定濁 度，即可定量鏈霉抗生物素蛋白的濃度。即，本發(fā)明的方法被確認(rèn)是無需使用二次抗體、發(fā) 光試劑、發(fā)光檢測裝置等特殊的試劑、儀器，即可快速、廉價且簡便地檢測、定量檢測對象的 新方法?！磳?shí)施例2>本實(shí)施例中，使用具有保護(hù)巰基的溫度響應(yīng)性聚合物表面修飾磁性顆粒(以后也 稱作TM-LPDP)作為第1結(jié)合物，使用結(jié)合有N-羥基琥珀酰亞胺的聚乙二醇(以后也稱作 NHS-PEG) "SUN BRIGHTME_400CS”(日油社制、重均分子量為40000)作為第2結(jié)合物，給出 檢測、定量谷胱甘肽(GSH)的例子。(第1結(jié)合物的制備)作為氨基結(jié)合-溫度響應(yīng)性聚合物表面修飾磁性顆粒，使用0.4% (質(zhì)量) Magnabeat (社)芾[J 的 Therma-Max LAm Amine (以后稱作 TM-LAm)。取 2mL TM-LAm 至Ij 2mL 微管中，將該微管加熱至42V，從而使TM-LAm凝集，用磁石回收后除去上清。向除去后的微 管中加入2mL硼酸緩沖液以置換溶劑，使TM-LAm充分分散，由此得到含磁性微粒的硼酸緩 沖液。接著，將2mg N-琥珀酰亞氨基_3-(2_吡啶基二硫代)丙酸酯(同仁化學(xué)研究所 社制、SPDP)溶于IOOyL 二甲基亞砜中，將所得溶液與上述含磁性微粒的硼酸緩沖液混合， 在20°C下攪拌一夜。將攪拌的溶液加熱至42°C，用磁石回收凝集體，之后除去上清。之后， 向凝集體中加入2mL PBS緩沖液，使其充分分散。上述清洗進(jìn)行2次，除去未反應(yīng)的SPDP。 將分散液再次加熱至42°C，用磁石回收凝集體，并除去上清，之后將含保護(hù)巰基的溫度響應(yīng) 性聚合物表面修飾磁性顆粒分散于PBS緩沖液中，由此制成第1結(jié)合物(顆粒含量為0. 3% (質(zhì)量))。(使用含保護(hù)巰基的溫度響應(yīng)性聚合物表面修飾磁性顆粒和N-羥基琥珀酰亞胺 結(jié)合聚乙二醇的谷胱甘肽的定量)[試樣的制備]制作以下試樣將還原型谷胱甘肽(和光純藥工業(yè)社制)溶于ImL含IOmM EDTA 的PBS緩沖液中，用含有IOmM EDTA的PBS緩沖液分別稀釋成12 μ g/mL、6 μ g/mL和3 μ g/ mL ；以及制備不含谷胱甘肽的試樣。 [定量](混合)取500 μ L上述第1結(jié)合物的PBS緩沖液分散液到1.5mL管中，添加IOyL 0. 5M 的EDTA溶液(pH8、二 , > ”一 >社制)并混合，由此制成溶液。向該溶液中加入200 μ L 上述試樣，在4°C下攪拌6小時。之后，向管中加入7001^(20(^11)朋5^^6，在41下攪拌 12小時。向400 μ L該攪拌物中加入800 μ L PBS,得到混合物。(關(guān)系式的制作)將該混合物分別注入實(shí)施例1中使用的比色皿71內(nèi)，按照與實(shí)施例1相同的條件 測定濁度。其結(jié)果見圖6。如圖6所示，測定開始約50秒后起各試樣的濁度的差異已經(jīng)變大。由此可知可 以非?？焖俚剡M(jìn)行檢驗(yàn)體中檢測對象的檢測和定量。另外，各試樣的濁度之差在測定開始 約450秒后達(dá)到最大值，由此確認(rèn)優(yōu)選選擇自測定開始時起450秒后作為測定時間點(diǎn)。將上述第1結(jié)合物、第2結(jié)合物和試樣保存在4°C的暗室內(nèi)，1日1次連續(xù)3天按 照相同程序進(jìn)行濁度測定。其結(jié)果見表2。需要說明的是，表2中的數(shù)值是指從測定開始時 的各試樣的濁度中扣除自測定開始時起450秒后各試樣的濁度而得到的值(△ 0-450)的平 均值。[表2]
Δ0-450GSH (wg/mL)平均CV (%)STDEVA0-0.512.80.0143-0.333.30.01160.142.20.003120.570.20.001如表2所示，在3天中的任一時點(diǎn)間，CV(變動系數(shù))均為3. 3以下的低值。由此 確認(rèn)只要是本實(shí)施例的系統(tǒng)即可獲得高重現(xiàn)性。其中，cn%)根據(jù)算式cv =標(biāo)準(zhǔn)偏差 (STDEVA) /平均值X 100來計算。此外，顯示從0 μ g/ml谷胱甘肽測定開始時的各試樣的濁度中扣除測定開始時 起450秒后各試樣的濁度而得到的值(GSH 0 μ g/ml、Δ 0-450)的平均值、以及從各試樣測 定開始時的濁度中扣除測定開始時起450秒后各試樣的濁度而得到的值(GSH 3 μ g/ml, 6μ g/ml、12 μ g/ml、Δ 0-450)的平均值與谷胱甘肽的量的關(guān)系式的圖見圖7。如圖7所示，求得的關(guān)系式為y = 0. 0937x-0. 0133(式中，χ為谷胱甘肽的量、y 為濁度)。另外，可知相關(guān)系數(shù)R2高達(dá)0. 97，通過使用該關(guān)系式，可以高精度地定量谷胱 甘肽量。由此可知如本實(shí)施例所示，通過使用如聚乙二醇那樣通過接近顆粒表面而顯示出 立體排斥、且不易與機(jī)體成分發(fā)生非特異性吸附的聚氧化亞烷基作為第2物質(zhì)，可以以極 高的精度定量檢驗(yàn)體中的檢測對象的量。關(guān)于多元醇，也可考慮同樣的作用。本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式，可達(dá)到本發(fā)明目的的范圍內(nèi)的變形、改良等也包 含在本發(fā)明中。另外，在本發(fā)明中雖然必須使用刺激響應(yīng)性聚合物，但并不限于聚合物，也 可使用刺激響應(yīng)性的低分子。作為所述的低分子，例如有專利第3693979號公報、專利第
143916330號公報、日本特開2002-85957號公報、專利第4071738號公報、專利第2869684號 公報、專利第2927601號公報、專利第3845249號公報、日本特開2006-242597號公報等中 公開的低分子。
權(quán)利要求
試劑盒，該試劑盒用于檢測和/或定量檢測對象，其中含有第1結(jié)合物和第2結(jié)合物，第1結(jié)合物含有刺激響應(yīng)性聚合物的第1物質(zhì)與對上述檢測對象親和的第1親和性物質(zhì)結(jié)合的結(jié)合物；第2結(jié)合物親水性的第2物質(zhì)與對上述檢測對象親和的第2親和性物質(zhì)結(jié)合的結(jié)合物，第1親和性物質(zhì)和第2親和性物質(zhì)可以在上述檢測對象的不同部位同時與上述檢測對象結(jié)合。
2.權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中第1物質(zhì)含有微粒狀磁性物質(zhì)。
3.權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其中第2物質(zhì)為親水性聚合物。
4.權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中第2物質(zhì)為多元醇。
5.權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中第2物質(zhì)為含有聚氧化亞烷基作為構(gòu) 成單元的聚合物。
6.檢測檢驗(yàn)體中的檢測對象的方法，該方法包括以下步驟將第1結(jié)合物、第2結(jié)合物和上述檢驗(yàn)體混合，并將該混合物置于刺激響應(yīng)性聚合物凝 集的條件下，判定上述刺激響應(yīng)性聚合物是否分散，所述第1結(jié)合物為含有刺激響應(yīng)性聚 合物的第1物質(zhì)與對上述檢測對象親和的第1親和性物質(zhì)結(jié)合的結(jié)合物；所述第2結(jié)合物 為親水性的第2物質(zhì)與對上述檢測對象親和的第2親和性物質(zhì)結(jié)合的結(jié)合物；第1親和性物質(zhì)和第2親和性物質(zhì)可以在上述檢測對象的不同部位同時與上述檢測對 象結(jié)合。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中第1物質(zhì)含有微粒狀磁性物質(zhì)， 上述方法還包括通過施加磁力來分離凝集的磁性物質(zhì)。
8.定量檢驗(yàn)體中的檢測對象的方法，該方法包括以下步驟將第1結(jié)合物、第2結(jié)合物和上述檢驗(yàn)體混合，并將該混合物置于刺激響應(yīng)性聚合物凝 集的條件下，所述第1結(jié)合物為含有刺激響應(yīng)性聚合物的第1物質(zhì)與對上述檢測對象親和 的第1親和性物質(zhì)結(jié)合的結(jié)合物；所述第2結(jié)合物為親水性的第2物質(zhì)與對上述檢測對象 親和的第2親和性物質(zhì)結(jié)合的結(jié)合物；測定上述混合物的濁度，根據(jù)上述檢測對象的量與濁度在上述預(yù)定條件下的關(guān)系式， 算出上述檢驗(yàn)體中檢測對象的量。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中第1物質(zhì)含有微粒狀磁性物質(zhì)， 上述方法還包括通過施加磁力來分離凝集的磁性物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明的課題在于提供可快速、廉價且簡便地檢測、定量檢測對象的檢測、定量用試劑盒以及檢測、定量方法。檢測檢驗(yàn)體中的檢測對象50的試劑盒含有第1結(jié)合物10和第2結(jié)合物20，所述第1結(jié)合物10是含有刺激響應(yīng)性聚合物11的第1物質(zhì)與抗檢測對象50的第1抗體13結(jié)合的結(jié)合物，所述第2結(jié)合物20是親水性的第2物質(zhì)21與抗檢測對象50的第2抗體23結(jié)合的結(jié)合物。第1抗體13和第2抗體23可以在檢測對象50的不同部位同時與檢測對象結(jié)合。
文檔編號G01N33/543GK101918840SQ200880123629
公開日2010年12月15日 申請日期2008年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月28日
發(fā)明者佐藤保信, 大輪田惠利, 杉田悟, 澤井俊哉, 長岡宏一 申請人:奧索臨床診斷股份有限公司;智索股份有限公司