專利名稱：檢測艾滋病病毒的熒光微球免疫層析檢測卡及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，具體地說是涉及一種利用熒光微球免疫層析技術(shù)定量檢測 艾滋病病毒的檢測卡及其制備方法。
背景技術(shù)：
艾滋病是獲得性免疫缺陷綜合癥(acquired immunodeficiency syndrome,簡稱AIDS) 的英文音譯。它是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,簡稱HIV，俗稱 艾滋病病毒)引起的一種病死率極高的惡性傳染病。HIV屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒，目前已發(fā)現(xiàn) HIV-l、 HIV-2二型。AIDS主要傳播途徑為血液傳播、異性和同性間的性行為傳播和母嬰 間垂直傳播。
自1981年在美國洛杉磯首次發(fā)現(xiàn)艾滋病病例后，艾滋病正在全世界迅速流行。至今， 全球已有六千多萬人感染了 HIV，已造成2500萬人死亡。我國在1985年發(fā)現(xiàn)第一例AIDS 患者，歷經(jīng)了傳入期、擴(kuò)散期，在上世紀(jì)90年代進(jìn)入了快速增長期。截止到2007年10 月，我國累計(jì)報(bào)告HIV感染者223501例，其中AIDS患者62838例，已死亡22205例。 專家估計(jì)，我國現(xiàn)已有約70萬HIV感染者，如不及時(shí)采取嚴(yán)格的控制措施，到2010年有 可能迅速達(dá)到1000萬例。艾滋病的流行已引起各國政府的重視，但迄今為止，仍無特效 的治療藥物及安全有效的抗HIV疫苗，因而早期診斷并及時(shí)發(fā)現(xiàn)感染病人，控制其進(jìn)一步 傳播仍是艾滋病防治的重要手段之一。
近年來，分子生物學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，HIV抗體檢測方法也隨之不斷更新。酶聯(lián)免疫吸 附法(ELISA)和免疫印跡法(Western-Blotting)相結(jié)合是HIV抗體檢測的"金標(biāo)準(zhǔn)"方 法。但這兩種方法需要借助昂貴而復(fù)雜的儀器設(shè)備，成本高，需由專業(yè)人員進(jìn)行操作，操 作復(fù)雜，耗時(shí)長，不利于在基層推廣和在現(xiàn)場進(jìn)行快速篩査。近幾年，HIV抗體快速檢測 方法發(fā)展迅速，常用的快速檢測方法有免疫斑點(diǎn)、免疫層析以及凝集試驗(yàn)，其中利用膠體 金免疫層析技術(shù)檢測HIV抗體已有很多文獻(xiàn)和專利報(bào)道，但膠體金法一般情況下對艾滋病 病毒只能進(jìn)行定性分析。目前國內(nèi)使用的快速檢測試劑，其靈敏性和特異性都不是很理想， 導(dǎo)致實(shí)際樣品檢測過程中會(huì)產(chǎn)生漏檢現(xiàn)象。
HIV感染后抗體的出現(xiàn)需要2-8周的時(shí)間，這一階段為不能檢出抗體的"窗口期"，是 可能發(fā)生傳播的危險(xiǎn)期。而患者血液中只要有HIV病毒，即存在p24抗原，其通常在感染2-3周后可以檢出，通過檢測HIVp24抗原可以發(fā)現(xiàn)早期的HIV感染，縮短了HIV抗體檢 測的窗口期。HIVp24抗原的變化情況幾乎與HIV感染后的臨床急性表現(xiàn)同步，在血液中 的濃度不斷變化著，p24抗原的檢測可以作為HIV抗體檢測窗口期的輔助診斷。目前，研 制出的第四代HIV抗體酶免檢測試劑可以同時(shí)檢測HIV 1/2抗體和HIVp24抗原，使窗口 期縮短了一周多，但由于把抗原和抗體同時(shí)包被在酶標(biāo)板上，存在著相互干擾，影響了免 疫反應(yīng)的特異性，另外，該試劑是采用ELISA方法，檢測時(shí)操作復(fù)雜，比較耗時(shí)。
AIDS之所以被稱為"超級癌癥"和"世紀(jì)殺手"，主要是因?yàn)镠IV病毒復(fù)制具有失保 真性，病毒很容易發(fā)生變異而產(chǎn)生耐藥性，使原本有效的藥物活性變低甚至失去作用。因 此如何有效預(yù)防與控制AIDS的傳播是一項(xiàng)刻不容緩、復(fù)雜而長期的艱巨任務(wù)。目前，國 內(nèi)外已研制出很多種HIV檢測試劑，但能同時(shí)兼顧敏感性、特異性和操作簡便快速的試劑 很少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種靈敏度高、操作簡便 檢測快速、價(jià)格低廉的檢測艾滋病病毒的熒光微球免疫層析檢測卡。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述檢測卡的制備方法。 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的一個(gè)技術(shù)方案是
提供一種能同時(shí)檢測HIV抗體與HIV p24抗原的熒光微球免疫層析檢測卡，該檢 測卡為雙卡型，由兩張免疫層析試紙條、底卡以及面卡構(gòu)成， 一張?jiān)嚰垪lA檢測HIV 抗體，另一張?jiān)嚰垪lB檢測HIVp24抗原；免疫層析試紙條是在底板上依次搭接地粘貼 濾紙、樣本墊、玻璃纖維膜、NC膜和吸水紙而制成的，所述的玻璃纖維膜上噴涂有熒光 微球墊，所述的硝酸纖維素膜上固定有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)；所述試紙條A的玻璃纖維膜上 噴涂的熒光微球墊為熒光微球標(biāo)記gp41， gp36重組抗原和熒光微球標(biāo)記的兔多抗，硝 酸纖維素膜上檢測區(qū)噴涂gp41， gp36重組抗原；所述試紙條B的玻璃纖維膜上噴涂的 熒光微球墊為熒光微球標(biāo)記的抗HIVp24抗體和熒光微球標(biāo)記的兔多抗，硝酸纖維素膜 上的檢測區(qū)噴涂有配對的抗HIV p24抗體；所述試紙條A和試紙條B的質(zhì)控區(qū)都固定 有抗兔抗體。
所述熒光微球是通過采用一種有機(jī)硅摻雜，無機(jī)硅包覆相結(jié)合的方法而制備的二氧 化硅與熒光物質(zhì)復(fù)合的核殼雙結(jié)構(gòu)發(fā)光納米粒子，直徑為30-150nm，其表面有修飾的 活性基團(tuán)。
所述活性基團(tuán)為一CHO、 -COOH、 -OH、 -NH2或-SH;所述的熒光物質(zhì)為菲咯啉
6聯(lián)釕有機(jī)染料、異硫氰根熒光素、異硫氰根羅丹明、6-羧基熒光素酰胺酯、1,8-萘二酰 亞胺、7-羥基香豆素有機(jī)熒光染料或其摻雜物以及量子點(diǎn)。
本發(fā)明采取的另一個(gè)技術(shù)方案是提供一種上述檢測艾滋病病毒的熒光微球免疫層 析檢測卡的制備方法，具體包括以下步驟
1.免疫層析試紙條的制備
(1) 熒光微球墊的制備
熒光微球的制備將60 ml無水乙醇、2~15 ml氨水、1 6 ml正硅酸乙酯、1~4 ml 超純水、0. 1 5mg熒光物質(zhì)混合在一起，恒溫水浴反應(yīng)6 24小時(shí)后，加入化^03封閉微 球，Na2Si03的終濃度為2% 10%，通過加入鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH值來控制微球大小，最后用活 性基團(tuán)修飾微球表面。
用制備的熒光微球標(biāo)記抗原或抗體，并將其噴涂在玻璃纖維膜上 取微球在1000Xg離心10 15min，收集沉淀，用0.01 MpH 4.8的硼酸鹽緩沖液調(diào)節(jié) 微球濃度為OD450=0.2，然后分別加入20 100 mg/ml對乙基-N,N-二甲基丙基碳二亞胺 (EDC) 100 pi, 2 20 mg/mL氮羥基琥珀酰亞胺(NHS) 100 nl,再加入0.01 M pH 4.8 的硼酸鹽緩沖液，振蕩混勻，室溫孵育10 30min后，1000Xg離心5 15 min，沉淀用 0.01 M pH 7 8的硼酸鹽緩沖液混勻，并調(diào)節(jié)微球濃度為OD45o為0.2 1.0。在0.1 ml熒 光微球中加入1 10昭的gp41 ， gp36重組抗原和兔多抗或抗HIV p24抗體和兔多抗，充 分混勻后，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)l 4h，超純水離心洗滌2 5次，用0.01 M pH 7.2 PBS (磷酸 鹽緩沖液，其中包含5%蔗糖和0.05% Tween-20)復(fù)溶沉淀至起始體積后，用BIODOT Dispensing System (BIODOT操作平臺(tái))噴涂至玻璃纖維膜上，25。C真空干燥1 2 h，放 于干燥環(huán)境備用。
(2) 檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的制備
分別將gp41， gp36重組抗原，配對的抗HIV p24抗體和抗兔抗體噴涂到硝酸纖維 素膜上，制成檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)。
用0.01M pH 7.4 PBS (磷酸鹽緩沖液，其中包含5%蔗糖和0.05%吐溫-20)分別調(diào)節(jié) 包被物的濃度為0.5~8.0 mg/mL，噴膜量為0.74 ^L/cm，檢測區(qū)噴涂gp41， gp36重組抗 原或配對的抗HIV p24抗體，質(zhì)控區(qū)噴涂抗兔抗體，兩區(qū)相隔5mm，質(zhì)控區(qū)距離NC 膜一端2mm， 37'C烘干過夜后，于室溫干燥環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?br> (3) 組裝和剪切
在粘性底板上依次搭接地粘貼濾紙、樣本墊、熒光微球墊、硝酸纖維素膜以及吸水紙，并剪切成適當(dāng)寬度即成為免疫層析試紙條。按照上述步驟分別制得試紙條A和試 紙條B。
2.免疫層析試紙條的組裝
將按上述方法制備的檢測HIV抗體的試紙條A和檢測HIV p24抗原的試紙條B并 排固定在底卡上，然后在試紙條表面用面卡壓緊，即成為免疫層析檢測卡。底卡和面卡 一般都為塑料卡，底卡能使試紙條上的樣本墊、熒光微球墊、硝酸纖維素膜和吸水紙緊 密結(jié)合，面卡可保護(hù)試紙條，使其不受損壞。面卡上預(yù)留加樣孔和觀察窗各兩個(gè)，加樣 孔的位置與每張?jiān)嚰垪l的樣本墊對應(yīng)，觀察窗的位置與每張?jiān)嚰垪l的NC膜對應(yīng)。
用上述的熒光微球免疫層析檢測卡定量檢測艾滋病病毒，包括以下步驟
(1) 免疫層析檢測卡的兩個(gè)加樣孔中分別加入待檢樣本，反應(yīng)3 20min后，將檢 測卡放入檢測窗口；樣本包括全血、血清、血漿、體液等；
(2) 截留在檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的熒光微球在最佳激發(fā)燈源下，發(fā)出強(qiáng)烈的熒光條帶；
(3) 發(fā)射的熒光經(jīng)濾除雜光后，通過聚焦系統(tǒng)將采集的光學(xué)信號，送入光電倍增 管，光信號得到增強(qiáng)，再經(jīng)過信號轉(zhuǎn)換元件，獲得檢測線與質(zhì)控線的熒光強(qiáng)度；
(4) 通過熒光分析儀中內(nèi)置分析軟件對檢測線的熒光數(shù)值進(jìn)行校正，并把校正值 代入內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線，自動(dòng)計(jì)算出待檢樣本中HIV抗體與HIVp24抗原的濃度。
本發(fā)明中所述的免疫層析試紙條上的免疫反應(yīng)方式為夾心模式，其中檢測HIV抗 體的試紙條上為雙抗原夾心模式，檢測HIVp24抗原的試紙條上為雙抗體夾心模式。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下
1. 熒光物質(zhì)被入射光激發(fā)后，返回基態(tài)時(shí)發(fā)射出熒光，可以在與激發(fā)光源垂直的方向 進(jìn)行檢測，因此熒光不受來自激發(fā)光本底的干擾，靈敏度大大提高，其靈敏度是用傳統(tǒng)染 料和有色標(biāo)記物質(zhì)檢測方法的10 1000倍。另外，熒光標(biāo)記檢測方法還具有操作簡便， 檢測快速，定量準(zhǔn)確，價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)；
2. 熒光微球是核殼雙結(jié)構(gòu)，克服了常規(guī)熒光微球的染料泄露，抗溶液干擾能力差等 缺點(diǎn)，增加了熒光微球的穩(wěn)定性和熒光壽命；
3. 熒光微球表面修飾活性基團(tuán)，采用化學(xué)偶聯(lián)方法來標(biāo)記抗體和抗原，形成抗體和抗 原與微球的穩(wěn)定結(jié)合；
4. 通過CCD掃描技術(shù)或光纖技術(shù)把過濾后的發(fā)射光譜收集后，再發(fā)送到熒光分析檢 測儀以及經(jīng)過軟件處理，把熒光信號數(shù)值化，從而實(shí)現(xiàn)定量檢測；
5. 采用雙卡型免疫層析檢測卡，實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測HIV抗體與HIV p24抗原，縮短了窗
8口期，與現(xiàn)有的第四代HIV抗體診斷試劑相比，避免了HIV抗體與HIV p24抗原之間的 相互干擾。
用上述方法制備的熒光微球免疫層析檢測卡來分別測試20例AIDS患者和20例正常 人血清，準(zhǔn)確率均達(dá)到100%。用第四代HIV抗體酶免檢測試劑對這40個(gè)樣品進(jìn)行檢測， 所得數(shù)據(jù)與本發(fā)明提供的熒光微球免疫層析法相比，相關(guān)系數(shù)為r=0.9578，表明這兩種方 法的檢測結(jié)果顯著相關(guān)。本發(fā)明提供的熒光微球免疫層析法定量準(zhǔn)確，檢測快速，操作簡 便，靈敏度高。


圖1是免疫層析試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖2是免疫層析檢測卡的結(jié)構(gòu)示意圖3是熒光微球免疫層析檢測卡檢測原理圖4是一種簡易熒光檢測儀的檢測原理及其結(jié)構(gòu)示意圖。
如圖1所示，該免疫層析試紙條的構(gòu)成為在粘性底板18上，依次搭接地粘貼濾紙 11、樣本墊12、噴涂有熒光微球標(biāo)記的兔多抗和gp41， gp36重組抗原或熒光微球標(biāo)記的 兔多抗抗HIVp24抗體的玻璃纖維膜13、包被有g(shù)p41， gp36重組抗原或配對的抗HIVp24 抗體的檢測區(qū)15和包被有抗兔抗體的質(zhì)控區(qū)16的硝酸纖維素膜14和吸水紙17。如圖2 所示，該免疫層析檢測卡是雙卡型的，由分別檢測HIV抗體和HIVp24抗原的兩張免疫層 析試紙條固定在底卡上而形成，具體構(gòu)造包括底卡21、面卡22、加樣孔23、觀察窗24、 NC膜25、質(zhì)控區(qū)26、檢測區(qū)27。
如圖l、 2和3所示，檢測原理如下在檢測卡的兩個(gè)加樣孔23中加入待檢樣本，樣 本溶解玻璃纖維膜13上噴涂的熒光微球標(biāo)記的兔多抗和gp41， gp36重組抗原以及熒光微 球標(biāo)記的抗HIV p24抗體，通過毛細(xì)作用在纖維膜上向前泳動(dòng)，同時(shí)樣本中HIV抗體、 HIVp24抗原與相應(yīng)的熒光微球標(biāo)記物反應(yīng)；反應(yīng)液經(jīng)過檢測區(qū)15時(shí)，與檢測區(qū)的包被物 反應(yīng)，并富集在檢測區(qū)；而兔多抗則繼續(xù)向前泳動(dòng)，在質(zhì)控區(qū)16被抗兔抗體截留。將檢 測卡放入檢測窗口31，熒光微球33在光源32激發(fā)下，發(fā)射的熒光34通過單色濾光片35 過濾后，通過觀察窗口 36在檢測區(qū)15能夠觀察到一條清晰的熒光條帶，質(zhì)控區(qū)不管樣本 是陰性還是陽性都會(huì)出現(xiàn)熒光條帶。檢測區(qū)15無熒光條帶，樣本是陽性，檢測區(qū)15有熒 光條帶，樣本是陰性。
如圖4所示，熒光微球免疫層析定量檢測艾滋病病毒的檢測步驟如下 (1)在檢測卡的兩個(gè)加樣孔中滴加待檢樣本，反應(yīng)3 20min后，將其放入檢測窗口41;
(2) 檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)被截留的熒光微球43在最佳激發(fā)光源42激發(fā)下，發(fā)出強(qiáng)烈的 熒光條帶；
(3) 發(fā)射的熒光44經(jīng)CCD掃描系統(tǒng)或光纖系統(tǒng)45匯聚后，經(jīng)過光電聚集管46，送 入光電倍增管47，光信號得到增強(qiáng)，再經(jīng)過信號轉(zhuǎn)換元件48以及軟件分析49后，樣本中 HIV抗體與HIVp24抗原的濃度在數(shù)據(jù)輸出410的顯示器上顯示出來。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一
1、異硫氰酸熒光素-二氧化硅殼核雙結(jié)構(gòu)熒光微球的制備
將lmg FITC與APS按摩爾比1:10加入4ml無水乙醇，避光常溫200rpm攪拌8小時(shí) 后加入60ml無水乙醇，2ml氨水，3ml正硅酸乙酯和lml超純水混合攪拌8小時(shí)，再加入 Na2Si03封閉微球，Na2Si03的終濃度為3%，封閉8小時(shí)，離心洗滌微球三遍，然后用10ml 無水乙醇將微球超聲分散。在三口燒瓶中加入60ml無水乙醇、lml氨水、lml超純水，50ul MPS，加入超聲處理后的微球，25°C， 300rpm攪拌8小時(shí)。將0. 07g SDBS， 0. 05g NaHC03， 溶解于100ral超純水中，加入微球，通氮，7(TC， 300rpm攪拌，然后向三口燒瓶中加500uL 苯乙烯和100uL丙烯酸，0. 03g過硫酸鉀，lml超純水，300rpm攪拌7小時(shí)，即為制備好 的表面修飾活性基團(tuán)(-COOH)的異硫氰酸熒光素-二氧化硅殼核雙結(jié)構(gòu)熒光微球。
2、熒光微球標(biāo)記物的制備(EDC法)
熒光微球標(biāo)記的市售的gp36， gp41重組抗原的制備取lmg包裹異硫氰酸熒光素的 熒光微球在1000Xg離心10min，收集沉淀，用0.01M pH4.8的硼酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)微球濃 度為OD45o=0.2，然后加入卯50 mg/mL對乙基-N,N-二甲基丙基碳二亞胺(EDC)， 150 tiL5mg/mL氮羥基琥珀酰亞胺(NHS)，振蕩混勻，室溫孵育20min后，1000Xg離心5 min， 沉淀用0.01MpH4.8的硼酸鹽緩沖液溶解，并調(diào)節(jié)微球濃度為OD45o為0.5。在O.lmL熒光 微球中加入l嗎gp36， gp41重組抗原，充分混勻后，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3h，用超純水洗滌離 心3次后，沉淀用0.01M pH 7.2的PBS (其中包含5%蔗糖和0.05% Tween-20)復(fù)溶至起 始體積后，即為制備好的熒光微球標(biāo)記的gp36， gp41重組抗原。
熒光微球標(biāo)記的抗HIV p24抗體的制備取lmg包裹異硫氰酸熒光素的熒光微球在 1000Xg離心10min，收集沉淀，用0.01MpH4.8的硼酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)微球濃度為OD45G=0.2， 然后加入80 pl 50 mg/ml對乙基-N,N-二甲基丙基碳二亞胺(EDC)， 100 )xl 10 mg/ml氮輕基 琥珀酰亞胺(NHS)，振蕩混勻，室溫孵育30min后，1000Xg離心5 min，沉淀用0.01M
10pH4.8的硼酸鹽緩沖液溶解，并調(diào)節(jié)微球濃度為OD45o為0.8。在0.1ml熒光微球中加入2嗎 抗HIVp24抗體，充分混勻后，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3h，用超純水洗滌離心3次后，沉淀用0.01M pH 7.2的PBS (其中包含5%蔗糖和0.05% Tween-20)復(fù)溶至起始體積后，即為制備好的 熒光微球標(biāo)記的抗HIV p24抗體。
熒光微球標(biāo)記的兔多抗的制備取lmg包裹異硫氰酸熒光素的熒光微球在1000Xg離 心10min，收集沉淀，用0.01MpH4.8的硼酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)微球濃度為OD45Q=0.2，然后加 入80 pl 50 mg/ml對乙基-N,N-二甲基丙基碳二亞胺(EDC)， 100 pl 10 mg/mL氮羥基琥珀 酰亞胺(NHS)，振蕩混勻，室溫孵育30min后，1000Xg離心5 min，沉淀用0.01MpH4.8 的硼酸鹽緩沖液溶解，并調(diào)節(jié)微球濃度為OD45o為0.8。在0.1ml熒光微球中加入2嗎兔多 抗，充分混勻后，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3h，用超純水洗滌離心3次后，沉淀用0.01M pH 7.2的 PBS (其中包含5M蔗糖和0.05。/。Tween-20)復(fù)溶至起始體積后，即為制備好的熒光微球標(biāo) 記的兔多抗。
3、 熒光微球墊的制備
用BIODOT Dispensing System,將熒光微球標(biāo)記的gp36， gp41重組抗原和兔多抗噴涂 至玻璃纖維膜(A)上，將熒光微球標(biāo)記的抗HIVp24抗體和兔多抗噴涂至玻璃纖維膜(B) 上，噴膜量均為4 pl/cm，玻璃纖維膜大小為30X0.8 cm， 25。C真空干燥l~2h，放于干燥 環(huán)境備用。
4、 檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的制備
gp36， gp41重組抗原和抗兔抗體包被到硝酸纖維素膜A上用O.OIM pH 7.4 PBS (磷 酸鹽緩沖液，其中包含5%蔗糖和0.05%吐溫-20)調(diào)節(jié)gp36， gp41重組抗原的濃度為 lmg/ml，將所得溶液噴涂在NC膜A上形成檢測區(qū)；用O.OIM pH 7.2 PBS (磷酸鹽緩沖液， 其中包含5%蔗糖和0.05%吐溫-20)調(diào)節(jié)抗兔抗體的濃度為lmg/ml，將所得溶液噴涂在 NC膜(A)上形成質(zhì)控區(qū)。兩區(qū)的噴膜量均為0.74 pl/cm，兩區(qū)相隔5mm，質(zhì)控區(qū)距離 NC膜一端2mm， 37'C烘干過夜后，于室溫干燥環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?br> 抗HIV p24抗體和抗兔抗體包被到硝酸纖維素膜(B)上用O.OIM pH 7.4 PBS (磷 酸鹽緩沖液，其中包含5%蔗糖和0.05%吐溫-20)調(diào)節(jié)抗HIVp24抗體的濃度為0.5mg/ml， 將所得溶液噴涂在NC膜(B)上形成檢測區(qū)；用O.OIM pH 7.2 PBS (磷酸鹽緩沖液，其中 包含5%蔗糖和0.05%吐溫-20)調(diào)節(jié)抗兔抗體的濃度為0.5mg/ml，將所得溶液噴涂在NC 膜(B)上形成質(zhì)控區(qū)。兩區(qū)的噴膜量均為0.74pl/cm，兩區(qū)相隔5mm，質(zhì)控區(qū)距離NC膜 一端2mm， 37"烘干過夜后，于室溫干燥環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?、熒光微球免疫層析檢測卡的制備
組裝試紙條A:在PVC底板上依次搭接地粘貼(l)濾紙和樣本墊，樣本墊為一種經(jīng)
過5% Tween-20浸泡1小時(shí)的玻璃纖維膜；(2)噴涂有熒光微球標(biāo)記的兔多抗和gp36， gp41 重組抗原的玻璃纖維膜A; G)包被有g(shù)p36， gp41重組抗原作為檢測區(qū)和抗兔抗體作為質(zhì) 控區(qū)的硝酸纖維素膜A; (4)吸水紙，組裝完成后剪切成4mm的寬度，即成為免疫層析 試紙條A。
組裝試紙條B:在PVC底板上一次搭接地粘貼(l)濾紙和樣本墊，樣本墊為一種經(jīng)
過5% Tween-20處理的玻璃纖維膜；(2)噴涂有熒光微球標(biāo)記的兔多抗和抗HIV p24抗體 的玻璃纖維膜B; (3)包被有配對的抗HIVp24抗體作為檢測區(qū)和抗兔抗體作為質(zhì)控區(qū)的 硝酸纖維素膜B; (4)吸水紙，組裝完成后剪切成4mm的寬度，即成為免疫層析試紙條B。 把免疫層析試紙條A和免疫層析試紙條B并排固定在塑料底卡上，試紙條表面用面卡 壓緊，面卡在對應(yīng)每張?jiān)嚰垪l的樣本墊和NC膜的部位分別預(yù)留加樣孔和觀察窗，制成的 免疫層析檢測卡可用來同時(shí)檢測HIV抗體與HIVp24抗原。該檢測卡組裝好后裝入鋁箔袋 中，加入干燥劑后封口保存，于室溫干燥環(huán)境下至少可以保存一年。
用上述熒光微球免疫層析檢測卡定量檢測艾滋病病毒包括以下步驟
(1) 平放檢測卡，待測樣品血樣平衡至室溫后，兩個(gè)加樣孔中各加入血樣50^L，于 室溫下反應(yīng)10min，將檢測卡放入檢測窗口 ；
(2) 截留在檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的熒光微球在最佳激發(fā)光源的激發(fā)下，發(fā)出強(qiáng)烈的熒光；
(3) 發(fā)射的熒光經(jīng)濾除雜光后，通過聚集系統(tǒng)將采集的光學(xué)信號，送入光電倍增 管，光信號得到增強(qiáng)，再經(jīng)過信號轉(zhuǎn)換元件，自動(dòng)獲得HIV抗體和HIVp24抗原檢測卡 的檢測線與質(zhì)控線的熒光數(shù)值；
(4) 熒光分析儀中的內(nèi)置分析軟件通過對檢測線的熒光值進(jìn)行校正，并把校正值 代入內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線，自動(dòng)計(jì)算出待測樣品中HIV抗體為82U/ml， HIV p24抗原濃度為 235pg/ml。
實(shí)施例二
本實(shí)施例的制備方法與實(shí)施例一基本相同，不同點(diǎn)在于
步驟1中制備的熒光微球?yàn)槎热?1，10-鄰二氮雜菲)釕熒光素-二氧化硅殼核雙結(jié)構(gòu) 微球，其制備方法如下
將3mg 二氯三(1, lO-鄰二氮雜菲)釕熒光素，60ral無水乙醇，4ml氨水，2ml正硅 酸乙酯和3ml超純水混合攪拌8小時(shí)，再加入Na2Si03封閉微球，Na2Si03的終濃度為3%，封閉8小時(shí)，離心洗滌微球三遍，然后用10ml無水乙醇將微球超聲分散。在三口燒瓶中 加入60ml無水乙醇、lml氨水、lml超純水，50ul MPS以及超聲處理后的微球，25°C， 300rpm 攪拌8小時(shí)。將0. 07g SDBS，溶解于100ml pH7. 0的PB中，加入微球，通氮，70°C， 300rpm 攪拌，然后向三口燒瓶中加500uL苯乙烯和50uL APS， 0. 03g過硫酸鉀，lml超純水，300rpm 攪拌8小時(shí)，即為制備好的表面修飾活性基團(tuán)(-NH3)的二氯三(1,10-鄰二氮雜菲)釕熒光 素-二氧化硅殼核雙結(jié)構(gòu)熒光微球。
用上述熒光微球免疫層析檢測卡定量檢測艾滋病病毒包括以下步驟
(1) 平放檢測卡，待測樣品血樣平衡至室溫后，兩個(gè)加樣孔中各加入血樣50pL，于 室溫下反應(yīng)10min，將檢測卡放入檢測窗口；
(2) 截留在檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的熒光微球在最佳激發(fā)光源的激發(fā)下，發(fā)出強(qiáng)烈的熒光；
(3) 發(fā)射的熒光經(jīng)濾除雜光后，通過聚集系統(tǒng)將采集的光學(xué)信號，送入光電倍增 管，光信號得到增強(qiáng)，再經(jīng)過信號轉(zhuǎn)換元件，獲得檢測線與質(zhì)控線的熒光數(shù)值；
(4) 熒光分析儀中的內(nèi)置分析軟件對檢測線熒光強(qiáng)度進(jìn)行校正，并把校正值代入 內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線，自動(dòng)計(jì)算出待測樣品中HIV抗體為53U/ml， HIVp24抗原為125pg/ml。
權(quán)利要求
1.一種檢測艾滋病病毒的熒光微球免疫層析檢測卡，其特征在于包括用于檢測HIV抗體的試紙條A和用于檢測HIV p24抗原的試紙條B；所述試紙條A和試紙條B均包括在底板上依次搭接地粘貼的濾紙、樣本墊、玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜和吸水紙，所述的玻璃纖維膜上噴涂有熒光微球墊，所述的硝酸纖維素膜上固定有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)；所述試紙條A的玻璃纖維膜上噴涂的熒光微球墊為熒光微球標(biāo)記gp41，gp36重組抗原和熒光微球標(biāo)記的兔多抗，硝酸纖維素膜上檢測區(qū)噴涂gp41，gp36重組抗原；所述試紙條B的玻璃纖維膜上噴涂的熒光微球墊為熒光微球標(biāo)記的抗HIV p24抗體和熒光微球標(biāo)記的兔多抗，硝酸纖維素膜上的檢測區(qū)噴涂有配對的抗HIV p24抗體；所述試紙條A和試紙條B的質(zhì)控區(qū)都固定有抗兔抗體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測艾滋病病毒的熒光微球免疫層析檢測卡，其特征在于-所述的熒光微球是采用有機(jī)硅摻雜，無機(jī)硅包覆相結(jié)合的方法制備的雙結(jié)構(gòu)二氧化硅復(fù) 合熒光物質(zhì)的發(fā)光納米粒子，其直徑為30-150 nm。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測艾滋病病毒的熒光微球免疫層析檢測卡，其特征在于 所述的熒光微球的制備方法為將60 ml無水乙醇、2~15 ml氨水、1~6 ml正硅酸乙酯、 l-4ml超純水、0. 1~5 mg熒光物質(zhì)混合在一起，恒溫水浴反應(yīng)6~24小時(shí)后，加入^&03 封閉微球，Na2Si03的終濃度為2%~10%，最后用活性基團(tuán)修飾微球表面。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測艾滋病病毒的熒光微球免疫層析檢測卡，其特征在于 所述的活性基團(tuán)為—CHO、 -COOH、 -OH、 -NH2或-SH;所述的熒光物質(zhì)為菲咯啉聯(lián) 釕有機(jī)染料、異硫氰根熒光素、異硫氰根羅丹明、6-羧基熒光素酰胺酯、1,8-萘二酰亞 胺、7-羥基香豆素有機(jī)熒光染料或其摻雜物以及量子點(diǎn)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測艾滋病病毒的熒光微球免疫層析檢測卡的制備方法， 其特征在于，免疫層析試紙條制備步驟包括(1) 熒光微球墊的制備首先制備熒光微球，用熒光微球來標(biāo)記gp41， gp36重組 抗原或抗HIVp24抗體，并將其噴涂在玻璃纖維膜上；將熒光微球標(biāo)記在兔多抗上并同 時(shí)噴涂在玻璃纖維膜上；(2) 檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的制備將gp41， gp36重組抗原或抗HIV p24配對抗體噴涂 到硝酸纖維素膜上制成檢測區(qū)，將抗兔抗體噴涂到硝酸纖維素膜上制成質(zhì)控區(qū)；(3) 組裝和剪切在粘性底板上依次搭接地粘貼濾紙、樣本墊、熒光微球墊、硝酸纖維素膜以及吸水紙，并剪切成所需寬度即成為免疫層析試紙條；按照上述步驟分別制得試紙條A和試紙條B。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的定量檢測艾滋病病毒的熒光微球免疫層析檢測卡的制備 方法，其特征在于，所述熒光微球墊的制備方法如下；取熒光微球在1000Xg離心10 15 min，收集沉淀，用0.01 M pH 4.8的硼酸鹽緩沖 液調(diào)節(jié)微球濃度為OD45()=0.2，然后分別加入20 100mg/ml對乙基-N,N-二甲基丙基碳二 亞胺100 pl， 2 20 mg/ml氮羥基琥珀酰亞胺100 pl，再加入0.01 M pH 4.8的硼酸鹽緩沖 液，振蕩混勻，室溫孵育10 30min后，1000Xg離心5 15 min，沉淀用0.01MpH7 8的硼酸鹽緩沖液混勻，并調(diào)節(jié)微球濃度為OD45o在0.2 1.0,在0.1 ml熒光微球中加入1 10嗎gp41， gp36重組抗原、兔多抗或抗HIVp24抗體，充分混勻后，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1 4 h，超純水離心洗滌2 5次，沉淀用0.01 M pH 7.2磷酸鹽緩沖液復(fù)溶沉淀至起始體積后， 用BIODOT Dispensing System噴涂至玻璃纖維膜上，25。C真空干燥1 2 h，放于干燥環(huán) 境備用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的定量檢測艾滋病病毒的熒光微球免疫層析檢測卡的制備方法，其特征在于，所述硝酸纖維素膜的制備方法如下用0.01M pH 7.4磷酸鹽緩沖液分別調(diào)節(jié)包被物的濃度為0.5~8.0 mg/mL，噴膜量為0.74 pL/cm，檢測區(qū)噴涂gp41， gp36重組抗原或配對的抗HIVp24抗體，質(zhì)控區(qū)噴涂抗兔抗 體，兩區(qū)相隔5mm，質(zhì)控區(qū)距離硝酸纖維素膜一端2mm， 37"C烘干過夜后，于室溫干 燥環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?br> 8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的定量檢測艾滋病病毒的熒光微球免疫層析檢測卡的制備 方法，其特征在于，免疫層析檢測卡的制備方法如下將試紙條A和試紙條B兩張免疫層析試紙條并排固定在底卡上，試紙條表面用面卡 壓緊，所述面卡上預(yù)留加樣孔和觀察窗，加樣孔的位置與試紙條的樣本墊對應(yīng)，觀察窗 的位置與試紙條的硝酸纖維素膜對應(yīng)，所述底卡和面卡為塑料卡。
9. 用權(quán)利要求l、 2 、 3或4所述的檢測卡定性檢測艾滋病病毒的方法，其特征在 于，包括以下步驟-(1) 在免疫層析檢測卡的兩個(gè)加樣孔中分別加入待檢樣本，反應(yīng)3 20min后，將 檢測卡放入簡易熒光分析儀窗口檢測；(2) 熒光微球在激發(fā)燈源下，發(fā)出強(qiáng)烈的熒光條帶；(3) 發(fā)射的熒光經(jīng)濾除雜光后，用肉眼觀察是否有熒光信號；當(dāng)樣本中不含有被 檢測物質(zhì)時(shí)，檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)均出現(xiàn)一條熒光條帶，即檢測樣本為陰性；當(dāng)樣本中含有過量被檢測物質(zhì)時(shí)，檢測區(qū)無熒光條帶，質(zhì)控區(qū)有一條熒光條帶，檢測樣本即為陽性。
10.用權(quán)利要求1、 2 、 3或4所述的檢測卡定量檢測艾滋病病毒的方法，其特征 在于，定量檢測艾滋病病毒時(shí)，包括以下步驟(1) 免疫層析檢測卡的兩個(gè)加樣孔中分別加入待檢樣本，反應(yīng)3 20min后，將檢 測卡放入熒光分析儀檢測窗口 ；(2) 截留在檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的熒光微球在激發(fā)燈源下，發(fā)出強(qiáng)烈的熒光條帶；(3) 發(fā)射的熒光經(jīng)濾除雜光后，通過聚焦系統(tǒng)將采集的光學(xué)信號，送入光電倍增 管，光信號得到增強(qiáng)，再經(jīng)過信號轉(zhuǎn)換元件，獲得檢測區(qū)與質(zhì)控區(qū)的熒光強(qiáng)度；(4) 通過熒光分析儀中內(nèi)置分析軟件對檢測區(qū)的熒光數(shù)值進(jìn)行校正，并把校正值 代入內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線，自動(dòng)計(jì)算出待檢樣本中HIV抗體與HIVp24抗原的濃度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種定量檢測艾滋病病毒的熒光微球免疫層析檢測卡及其制備方法。該檢測卡構(gòu)成包括A、B兩張?jiān)嚰垪l、樣本墊、玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜和吸水紙，其中硝酸纖維素膜上固定有檢測線和質(zhì)控線，實(shí)現(xiàn)對HIV抗體與HIV p24抗原的同時(shí)檢測，本發(fā)明以二氧化硅與熒光物質(zhì)復(fù)合的核殼雙結(jié)構(gòu)發(fā)光納米粒子為標(biāo)記，采用免疫層析技術(shù)實(shí)現(xiàn)艾滋病病毒定量的免疫分析。檢測過程中，采用熒光微球激發(fā)光源進(jìn)行激發(fā)，發(fā)射出的熒光經(jīng)過濾光片裝置后，用CCD掃描技術(shù)或光纖技術(shù)，把所有的發(fā)射光譜收集、聚集和倍增后，轉(zhuǎn)換成數(shù)值信號，利用熒光分析儀中的內(nèi)置分析軟件，自動(dòng)計(jì)算出待測物的濃度。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、定量準(zhǔn)確、檢測快速、操作方便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用。
文檔編號G01N33/558GK101576562SQ200910142348
公開日2009年11月11日 申請日期2009年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月1日
發(fā)明者史愛武, 波 徐, 熊勇華, 賴衛(wèi)華, 陳雪嵐, 華 魏 申請人:無錫中德伯爾生物技術(shù)有限公司