專利名稱：一種檢測人血清中透明質(zhì)酸含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用放射免疫分析方法檢測人血清、體液或組織勻漿中的透明質(zhì)酸 (Hyaluronic Acid，簡稱 HA)的方法。
背景技術(shù)：
如文獻CN 1047391A中所公開的，該文獻公開了一種檢測血清、體液或組織勻漿 中透明質(zhì)酸(HA)含量的靈敏、準(zhǔn)確、快速的方法。它將未知量標(biāo)本中加入定量透明質(zhì)酸結(jié) 合蛋白(HABP)，再加入碘標(biāo)記透明質(zhì)酸使之與標(biāo)本反應(yīng)所剩的HABP結(jié)合，再用第一抗體、 第二抗體將HABP沉淀下來，測其放射性后定標(biāo)其濃渡。血清HA的檢測有助于肝病的診斷 和鑒別診斷、病情判斷和預(yù)后估價。該方法及其試劑盒也為HA與疾病關(guān)系的科研和臨床應(yīng) 用提供了必要的方法和物質(zhì)基礎(chǔ)。HABP所結(jié)合的125I-HA與標(biāo)本中HA含量呈負相關(guān)。但是上述方法的存在如下不足一、使用試劑過多，加樣步驟繁瑣，反應(yīng)時間長；二、 使用1251作為標(biāo)記物，靈敏度低，試劑的貨架期短，對環(huán)境產(chǎn)生放射性污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明使用固相包被以及銪標(biāo)記透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白(HABP-EU3+)的方法，不需要 第一抗體、第二抗體等試劑，加樣簡單，反應(yīng)快速，試劑貨架期長，對環(huán)境無污染。本發(fā)明預(yù)先在固相載體(例如96孔微孔板)上包被有HA，反應(yīng)體系中與樣本中的 HA共同與限量的HABP-Eu3+在適宜的條件下進行競爭性結(jié)合反應(yīng)，形成一種HA-HABP_Eu3+ 結(jié)合物。校準(zhǔn)品或樣本中的HA含量越高，在包被板上形成的HA-HABP-EU3+結(jié)合物就越少。 加樣時只需向微孔中連續(xù)加入樣本及HABP-EU3+，反應(yīng)1小時即可完成。測定時，先洗去包 被板中的液體，再加入增強液，使結(jié)合在包被板上的Eu3+解離下來，并與增強液中的一些 成分螯合形成新的螯合物。Eu3+的熒光強度隨樣本中HA濃度的增加而減少。銪與HABP結(jié) 合穩(wěn)定，存放時間可大于12個月，無放射性污染。


附圖1為本發(fā)明檢測方法的流程圖
具體實施例方式實施例一1)包被板的制作與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)的HA(HA-BSA)用0. OlM磷酸鹽緩 沖液(PB，pH7. 4)按一定比例稀釋制成包被液，等體積加入微孔板的各孔中，4°C放置過夜。 棄去包被液，加入等體積的封閉液(0. OlM PB，5-10%蔗糖，0. 5-l%BSA,pH7. 4)，4°C放置過 夜。棄去封閉液，自然干燥后，用鋁箔袋真空密封后可長期保存。2)檢測操作過程a.向微孔板各孔中加入等體積HA校準(zhǔn)品或待測樣本。
b.向微孔板各孔中加入等體積HABP-EU3+。c.將微孔板放入振蕩器上，室溫振蕩反應(yīng)60分鐘。d.吸出或倒出反應(yīng)液，加入洗滌液洗6次，末次洗板后將板拍干。e.各孔中加入等體積增強液。f.將微孔板放入振蕩器上，室溫振蕩反應(yīng)5-10分鐘。g.將微孔板放入時間分辨儀上檢測各孔熒光值。 3)數(shù)據(jù)處理a.聯(lián)機處理由電腦自動處理得出結(jié)果。建議使用Iog-Iogit或四參數(shù)數(shù)據(jù)處理 模式。b.手工作圖或計算器處理i.百分結(jié)合率計算設(shè)0校準(zhǔn)管計數(shù)為B0，各校準(zhǔn)品管或樣本管計數(shù)為B，則百分 結(jié)合率計算公式如下Β/Β0 = B/B0X100%ii. Iogit計算各校準(zhǔn)品管或樣本管的Iogit值計算公式如下Iogit = (B/B0)/(1-B/B0)iii.手工作圖以校準(zhǔn)品濃度取Ig值為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的Iogit值為縱坐標(biāo)在普通 坐標(biāo)紙上，或以校準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)對應(yīng)的B/B0為縱坐標(biāo)在Iog-Iogit坐標(biāo)紙上畫出校準(zhǔn) 曲線(理想化時是一條直線)。根據(jù)待測樣品的B/B0可以從坐標(biāo)紙上查出樣品的濃度值。iv.計算器處理使用有線性擬合功能的計算器可以比較方便地計算出樣品濃度 值，具體操作方法請查閱計算器的使用說明書。上述實施例中的與HA偶聯(lián)的BSA可以被其它蛋白或多肽替代；微孔板可以被其它 適宜包被的材料，如塑料試管、塑料珠等替代；用于HABP標(biāo)記的銪(Eu)可以被其它鑭系元 素的三價金屬離子釤(Sm)、鏑(Dv)、锝(Te)等替代，也可以被酶或其它熒光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光 標(biāo)記物替代，并用相應(yīng)的儀器進行檢測。
權(quán)利要求
1.一種檢測人血清中透明質(zhì)酸含量的方法 步驟如下1)制作包被板與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)的HA(HA-BSA)用0.OlM磷酸鹽緩沖液，pH 值7. 4，按一定比例稀釋制成包被液，等體積加入微孔板的各孔中，4°C放置過夜，棄去包被 液，加入等體積的封閉液:0. OlM磷酸鹽緩沖液、5-10%蔗糖、0. 5-1% BSA pH值7. 4，4°C放 置過夜，棄去封閉液，自然干燥后，用鋁箔袋真空密封；2)檢測操作步驟a.向微孔板各孔中加入等體積HA校準(zhǔn)品或待測樣本；b.向微孔板各孔中加入等體積HABP-Eu3+；c.將微孔板放入振蕩器上，室溫振蕩反應(yīng)60分鐘；d.吸出或倒出反應(yīng)液，加入洗滌液洗6次，末次洗板后將板拍干；e.各孔中加入等體積增強液；f.將微孔板放入振蕩器上，室溫振蕩反應(yīng)5-10分鐘；g.將微孔板放入時間分辨儀上檢測各孔熒光值；
2.如權(quán)利要求1所述的一種檢測人血清中透明質(zhì)酸含量的方法 與HA偶聯(lián)的BSA用其它蛋白或者多肽替代。
3.如權(quán)利要求1所述的一種檢測人血清中透明質(zhì)酸含量的方法 上述微孔板用塑料試管或塑料珠適宜包被的材料替代。
4.如權(quán)利要求1所述的一種檢測人血清中透明質(zhì)酸含量的方法用于HABP標(biāo)記的銪(Eu)用其它鑭系元素的三價金屬離子釤(Sm)、鏑(Dv)或锝(Te) 替代，或者被酶或其它熒光物質(zhì)或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物替代，并用相應(yīng)的儀器進行檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用放射免疫分析方法檢測人血清、體液或組織勻漿中的透明質(zhì)酸的方法。本發(fā)明使用固相包被以及銪標(biāo)記透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白(HABP-Eu3+)的方法，不需要第一抗體、第二抗體等試劑，加樣簡單，反應(yīng)快速，試劑貨架期長，對環(huán)境無污染，銪與HABP結(jié)合穩(wěn)定，存放時間可大于12個月，無放射性污染。
文檔編號G01N33/545GK102095847SQ20091025047
公開日2011年6月15日 申請日期2009年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月10日
發(fā)明者呂東川 申請人:北京北方生物技術(shù)研究所