專利名稱：用于測(cè)定角化結(jié)構(gòu)中分析物的非蛋白水解方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于測(cè)定對(duì)象的角化結(jié)構(gòu)中一種或多種感興趣分析物的存在和含量 的材料和方法，更具體涉及用于上述目的但不需要對(duì)所述角化結(jié)構(gòu)進(jìn)行蛋白水解加工的材 料和方法。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的分析方法，它允許較快地釋放和直接分析毛發(fā)和其它角化 結(jié)構(gòu)如指甲和趾甲中存在的分析物，包括有機(jī)分析物，如某些濫用藥物或其代謝物。該方法 能夠靈敏地檢測(cè)這類分析物，而不影響該分析物的結(jié)構(gòu)，不會(huì)對(duì)可用于檢測(cè)該分析物的分 析物探針如抗體、RNA/DNA和生物受體探針產(chǎn)生不利影響。例如，在一些實(shí)施方式中，分析 物探針可直接加入懷疑含有一種或多種分析物且經(jīng)過本文所述處理的角化結(jié)構(gòu)中?？梢源?方式評(píng)價(jià)所述一種或多種分析物的種類以及對(duì)象消耗所述一種或多種分析物的程度和持 續(xù)時(shí)間。在感興趣分析物的檢測(cè)中，與尿液、血液或口腔液體的分析技術(shù)相比，分析毛發(fā)和 其它角化結(jié)構(gòu)有某些優(yōu)勢(shì)。這些優(yōu)勢(shì)包括容易處理和儲(chǔ)存、檢測(cè)窗寬以及藥物的存在和含 量與使用時(shí)間和攝入劑量相關(guān)聯(lián)。尿液、血液和口腔液體技術(shù)的已知缺點(diǎn)包括無法確定使 用或接觸的持續(xù)時(shí)間和強(qiáng)度。這些技術(shù)至多提供有關(guān)攝入分析物的短期信息。此外，解釋 這些結(jié)果時(shí)也有問題。例如，在尿液中檢測(cè)到低水平的攝入藥物或藥物代謝物可能表明對(duì) 象最近攝入少量這種藥物或幾天前攝入較大量的這種藥物。因此，在不重復(fù)檢測(cè)的情況下， 使用這些方法無法測(cè)定長(zhǎng)期藥物使用。在對(duì)建立用于測(cè)定感興趣分析物的持續(xù)時(shí)間和強(qiáng)度的精確可靠方法的問題的 回應(yīng)中，Werner A. Baumgartner博士進(jìn)行的工作(參見“用于測(cè)定阿片類濫用歷史的毛 發(fā)的放身寸性免疫試驗(yàn)，，(Radioimmunoassay of Hair for Determining Opiate Abuse Histories), J. Nucl Med 20 :749-752 (1979))確定可通過分析哺乳動(dòng)物體毛獲得接觸濫用 藥物的長(zhǎng)期歷史，因?yàn)樵诶w維合成期間這些物質(zhì)被“嵌入”個(gè)體毛發(fā)纖維中。在這個(gè)方面， 毛發(fā)能夠像錄音帶那樣工作，即可通過對(duì)毛發(fā)樣品進(jìn)行區(qū)塊分析評(píng)價(jià)過往接觸史。例如，曾 發(fā)現(xiàn)一旦血流中出現(xiàn)嗎啡，則會(huì)發(fā)現(xiàn)其隨著毛發(fā)的合成進(jìn)入毛發(fā)中。經(jīng)測(cè)定，各種化學(xué)物質(zhì)，包括濫用藥物均能夠在毛發(fā)合成過程中俘獲在毛發(fā)中；這 些物質(zhì)主要在軀體上存在毛發(fā)的時(shí)間“鎖定”在毛發(fā)中。在頭發(fā)和體毛，以及其它角化結(jié)構(gòu) 如指甲中發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象；參見 Suzuki 等，F(xiàn)orensic Sci. International, 24 :9_16，1984。這 些俘獲的物質(zhì)無法從毛發(fā)中洗出，曾認(rèn)為只有在完全或接近完全破壞毛發(fā)纖維時(shí)才能完全 釋放這些物質(zhì)。
以前從毛發(fā)中提取分析物的方法包括將毛發(fā)加入熱的甲醇溶液中，或者在堿性或 酸性介質(zhì)中孵育毛發(fā)數(shù)小時(shí)(通常過夜)；Yegles，等，刊于《在毛發(fā)中進(jìn)行藥物測(cè)試的分 析禾口實(shí)踐方法》(Analytical and Practical Aspects of Drug Testing in Hair), CRC 出 版社，2007，第73-94頁；JUrado，C.刊于《在毛發(fā)中進(jìn)行藥物測(cè)試的分析和實(shí)踐方法》，CRC 出版社，2007，第95-125頁；Cheze，Μ.等，刊于《在毛發(fā)中進(jìn)行藥物測(cè)試的分析和實(shí)踐方 法》，CRC出版社，2007，第163-185頁)?，F(xiàn)有方法也包括使用超聲波或杵白和溶劑溶劑輔 助提取。在精確測(cè)定攝入分析物的存在和含量時(shí)，溶劑提取方法可能存在以下幾個(gè)問題。 這些問題之一是溶劑提取方法常常只去除毛發(fā)樣品所含全部分析物中未知和可變的一小 部分。另一缺點(diǎn)是不同分析物可能需要不同溶劑或不同時(shí)間和溫度進(jìn)行提取。此外，在免 疫試驗(yàn)分析中，需要蒸發(fā)溶劑，許多溶劑是有毒有害的。其它現(xiàn)有方法采用蛋白水解和還原性處理的組合來完全消化和降低角化結(jié)構(gòu)， 以便釋放一種或多種分析物。參見例如，美國專利5，466，579 ；5, 324, 642 ；6，022，693 ； 6，582，924 ；和6，949，344，通過引用將其全文納入本文，這些文獻(xiàn)提供了用于篩選和驗(yàn)證 感興趣分析物的實(shí)驗(yàn)的示范性檢測(cè)方法，包括免疫試驗(yàn)方法，例如放射性免疫試驗(yàn)和酶促 免疫試驗(yàn)方法的示范性檢測(cè)方法。這類合并的蛋白水解和還原性處理方法雖然有效，但由 于使用蛋白水解酶使得成本相當(dāng)高，這也會(huì)干擾通過蛋白水解切割分析物檢測(cè)探針如抗體 進(jìn)行的后續(xù)分析物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，從而阻止某些高度靈敏的分析技術(shù)的應(yīng)用或者需要在中間使 用蛋白酶中和、分離或純化步驟。因此，需要能夠快速和完全地釋放身體角化結(jié)構(gòu)，例如毛發(fā)、指甲和趾甲中的分析 物，能夠允許直接測(cè)定分析物的種類和對(duì)象使用它們的時(shí)間，但不會(huì)破壞或干擾感興趣分 析物和/或分析物檢測(cè)探針的有效和相對(duì)廉價(jià)的分析物檢測(cè)方法，例如免疫試驗(yàn)方法。發(fā)明概述角化結(jié)構(gòu)如毛發(fā)是在分子內(nèi)和分子間由許多二硫鍵交聯(lián)，以提供最終結(jié)構(gòu)的剛度 和強(qiáng)度的角蛋白多肽鏈的復(fù)雜的大組裝體。例如，毛發(fā)由卷曲螺旋角蛋白多肽鏈構(gòu)成，這些 多肽鏈組裝形成“初原纖維”;然后，許多初原纖維在兩個(gè)或多個(gè)初原纖維周圍捆扎成圓形， 形成稱為“微原纖維”的多鏈纜索；幾百個(gè)這種微原纖維聚在一起形成稱為“大原纖維”的 纖維束。大原纖維形成毛發(fā)纖維的皮層(或主體層)。隨著這些結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)，對(duì)象的角化結(jié)構(gòu)中可能俘獲感興趣的分析物。以前用于檢 測(cè)嵌入這類結(jié)構(gòu)的分析物的方法中，使用蛋白水解和還原型方法完全消化和破壞該角化結(jié) 構(gòu)，切割角蛋白的蛋白主鏈(例如，打斷角蛋白中的酰胺(肽鍵)連接)和將分子內(nèi)和分子 間二硫鍵還原成巰基，導(dǎo)致這些復(fù)雜蛋白質(zhì)的宏觀結(jié)構(gòu)發(fā)生伸直、解旋和肽斷裂。本發(fā)明人 驚訝地發(fā)現(xiàn)，就釋放嵌入分析物而言不必對(duì)角化結(jié)構(gòu)進(jìn)行這種蛋白水解切割，與以前的方 法相比在不存在蛋白水解酶的情況下用還原劑如二硫蘇糖醇(“DTT”)處理角化結(jié)構(gòu)就足 以定量地釋放分析物。因此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)前述還原劑如DTT和蛋白水解酶之間的協(xié)同作 用(其中各試劑能促進(jìn)其它試劑進(jìn)一步穿透毛發(fā)結(jié)構(gòu)并發(fā)揮作用)雖然有用，但對(duì)釋放感 興趣分析物而言并不必要。與現(xiàn)有方法相比，所得方法在成本和時(shí)間上有效，同時(shí)仍然能夠 靈敏地檢測(cè)感興趣的一種或多種分析物。而且，所得方法可用于篩選驗(yàn)證感興趣的分析物， 例如，也是與免疫試驗(yàn)相容的。
因此，本文提供了一種測(cè)定對(duì)象的角化結(jié)構(gòu)樣品中是否存在分析物的方法，所述 方法包括(a)提供任選洗滌的角化結(jié)構(gòu)樣品；(b)將所述角化樣品與還原劑水溶液相接觸以產(chǎn)生測(cè)試溶液，其中所述接觸不會(huì) 蛋白水解切割所述角化結(jié)構(gòu)；和(c)測(cè)定步驟(b)的測(cè)試溶液中是否存在所述分析物。該方法還可包括在存在所 述分析物的前提下測(cè)定測(cè)試溶液中所述分析物的含量。在一些實(shí)施方式中，該方法還可包 括在步驟(C)之前使步驟(b)的測(cè)試溶液中殘留的還原劑失活以得到失活的測(cè)試溶液，并 測(cè)定所述失活的測(cè)試溶液中是否存在所述分析物，其中所述失活過程不會(huì)蛋白水解切割所 述角化結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方式中，該方法還可包括純化步驟(b)的測(cè)試溶液以分離測(cè)試溶 液中殘留的角化樣品，得到純化的測(cè)試溶液，并測(cè)定所述純化的測(cè)試溶液中是否存在所述 分析物；其中所述純化過程不會(huì)蛋白水解切割所述角化結(jié)構(gòu)。還提供了一種測(cè)定對(duì)象的角化結(jié)構(gòu)樣品中是否存在分析物的方法，所述方法主要 由以下步驟構(gòu)成(a)提供任選洗滌的角化結(jié)構(gòu)樣品；(b)使所述角化樣品與還原劑水溶液相接觸，得到測(cè)試溶液；(c)使步驟(b)的測(cè)試溶液中殘留的還原劑失活以得到失活的測(cè)試溶液；(d)純化步驟(C)的失活測(cè)試溶液以去除殘留的角化樣品，得到純化、失活的測(cè)試 溶液；和(e)測(cè)定步驟(d)的純化、失活的測(cè)試溶液中是否存在所述分析物。在一些實(shí)施方 式中，該方法還可包括在存在所述分析物的前提下測(cè)定所述純化、失活的測(cè)試溶液中所述 分析物的含量。還提供了一種測(cè)定對(duì)象的角化結(jié)構(gòu)樣品中是否存在分析物的方法，所述方法包括(a)提供任選洗滌的角化結(jié)構(gòu)樣品；(b)使所述角化樣品與還原劑水溶液相接觸，得到測(cè)試溶液；和(c)測(cè)定所述測(cè)試溶液中是否存在所述分析物。其中所述方法不包括使所述角化結(jié)構(gòu)樣品與蛋白水解酶相接觸。所述方法還可包 括在存在所述分析物的前提下測(cè)定測(cè)試樣品中所述分析物的含量，和/或使測(cè)試溶液中殘 留的還原劑失活，和/或純化所述測(cè)試溶液以去除殘留的角化樣品。還提供了一種測(cè)定對(duì)象的角化結(jié)構(gòu)樣品中是否存在分析物的方法，所述方法包括(a)提供任選洗滌的角化結(jié)構(gòu)樣品；(b)使所述角化樣品與還原劑水溶液相接觸，得到測(cè)試溶液；和(c)測(cè)定所述測(cè)試溶液中是否存在所述分析物。其中所述方法不包括蛋白水解切割所述角化結(jié)構(gòu)樣品。所述方法還可包括在存在 所述分析物的前提下測(cè)定測(cè)試樣品中所述分析物的含量，和/或使測(cè)試溶液中殘留的還原 劑失活，和/或純化所述測(cè)試溶液以去除殘留的角化樣品。還提供了一種測(cè)定對(duì)象的角化結(jié)構(gòu)樣品中是否存在分析物的方法，所述方法包括(a)提供任選洗滌的角化結(jié)構(gòu)樣品；(b)處理所述角化結(jié)構(gòu)樣品，以便減少所述角化結(jié)構(gòu)樣品中存在的二硫鍵，但不切割所述樣品中的肽鍵，從而得到測(cè)試溶液；和(c)測(cè)定所述測(cè)試溶液中是否存在所述分析物。所述方法還可包括在存在所述 分析物的前提下測(cè)定測(cè)試樣品中所述分析物的含量，和/或使測(cè)試溶液中殘留的還原劑失 活，和/或純化所述測(cè)試溶液以去除殘留的角化樣品。在任何上述方法中，還原劑可包含DTT或DTE。在任何上述方法中，失活步驟可包括使所述測(cè)試溶液與金屬鹽的水溶液相接觸， 其中所述鹽的金屬陽離子選自下組Cu++、Zn+\ Mn++、Fe++\ Fe+\ Pb++、Cd++、Hg++、Ag++、As+++ 和 Co++。在任何上述方法中，純化步驟可包括分離、過濾或離心所述測(cè)試溶液。在任何上述方法中，可以用所述分析物的特異性免疫試驗(yàn)測(cè)定是否存在分析物； 并且在任何上述方法中，所述分析物的特異性免疫試驗(yàn)可包括使用所述分析物的特異性抗 體。在一些實(shí)施方式中，所述免疫試驗(yàn)是放射性免疫試驗(yàn)。在一些實(shí)施方式中，所述免疫試 驗(yàn)是酶促免疫試驗(yàn)。在所述方法的一些實(shí)施方式中，使用質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定是否存在分析物。在一些實(shí)施方式中，用色譜技術(shù)測(cè)定是否存在分析物。在所述方法的一些實(shí)施方式中，進(jìn)行接觸步驟或處理步驟的pH約為5. 0至10. 5， 例如，進(jìn)行接觸步驟或處理步驟的PH約為5至8. 8，或者約為8. 8至10. 5。在所述方法的一些實(shí)施方式中，進(jìn)行接觸步驟或處理步驟的溫度約為20°C至 40 "C。在所述方法的一些實(shí)施方式中，所述接觸或處理步驟進(jìn)行約0. 5小時(shí)至12小時(shí)， 例如約1至5小時(shí)，或者約2小時(shí)。在一些實(shí)施方式中，所述分析物是濫用藥物或其代謝物、處方藥或其代謝物、止痛 藥或其代謝物、營養(yǎng)劑、或內(nèi)源性分析物，或任何上述物質(zhì)的鹽形式。濫用藥物或其代謝物可選自下組可卡因、苯甲酰芽子堿、古柯乙烯、去甲可卡因、 PCP、苯丙胺、去氧麻黃堿、大麻素、THC、羧基-THC、海洛因、可待因、嗎啡、6-單乙酰基嗎啡 (MAM)、羥考酮、3，4-亞甲基二氧苯丙胺(MDA)；和3，4-亞甲基二氧去氧麻黃堿(MDMA)。角化結(jié)構(gòu)樣品可包括毛發(fā)、指甲或趾甲。在一些實(shí)施方式中，洗滌所述角化結(jié)構(gòu)樣品，如毛發(fā)樣品。在一些實(shí)施方式中，濫用藥物或其代謝物、處方藥或其代謝物、或止痛藥或其代謝 物是阿片類藥物、大麻素、NSAID、類固醇、苯丙胺、苯并二氮革、巴比妥類藥物、三環(huán)藥物或 麻黃堿，或其代謝物。除非另外定義，否則，本文中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有本發(fā)明所屬領(lǐng) 域普通技術(shù)人員通常所理解的同樣含義。雖然在本發(fā)明所述方法的實(shí)施或測(cè)試中可以采用 類似于或等同于本文所述的那些方法和材料，但是，下面描述了合適的方法和材料。本文中 述及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其他文獻(xiàn)都全文參考結(jié)合于本文。在抵觸的情況，以 本說明書包括定義在內(nèi)為準(zhǔn)。此外，材料、方法和例子都只是說明性的，并不構(gòu)成限制。從以下詳述和所附權(quán)利要求不難了解其它特征和優(yōu)點(diǎn)。附圖簡(jiǎn)要說明

圖1和2顯示毛發(fā)截面圖，說明毛發(fā)的復(fù)雜宏觀結(jié)構(gòu)是如何由多個(gè)較小結(jié)構(gòu)(角蛋白α-螺旋；卷曲螺旋的初原纖維、微原纖維和大原纖維)組裝形成的，所有這些結(jié)構(gòu)由 二硫鍵廣泛交聯(lián)。詳述本發(fā)明提供一種方法，其能夠從個(gè)體(其曾攝入過一種或多種分析物)的頭發(fā)或 體毛或其它角化結(jié)構(gòu)中快速釋放一種或多種分析物，然后通過已知的分析方法，包括例如， 高度靈敏的受體試驗(yàn)、免疫試驗(yàn)或儀器技術(shù)如質(zhì)譜或原子吸收光譜來鑒定所述一種或多種 分析物。在不損害分析物且不對(duì)隨后使用的分析物檢測(cè)探針(如抗體)產(chǎn)生有害影響的條 件下，使所述一種或多種分析物從所述角化結(jié)構(gòu)內(nèi)釋放到還原溶液中。所述方法也允許檢 測(cè)對(duì)象在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的既往使用模式，而不用進(jìn)行測(cè)定血液、尿液或口腔液體樣品中分析 物含量的常規(guī)測(cè)試方法中必需的重復(fù)測(cè)試。眾所周知，同一個(gè)體的毛發(fā)中俘獲的分析物含 量與分析物的攝入量成正比，毛發(fā)樣品的區(qū)塊分析可提供有關(guān)歷史使用的信息。在所述方法中，首先，由對(duì)象，例如可能攝入某種具體分析物或懷疑攝入該種分析 物的對(duì)象收集角化結(jié)構(gòu)樣品，如毛發(fā)。本文所用術(shù)語“分析物”指對(duì)象內(nèi)源性產(chǎn)生或外源性 引入的任何化合物。因此，在一些實(shí)施方式中，感興趣分析物可能從外部引入對(duì)象，即通常情況下對(duì)象 中不存在這種分析物，但通過外源性方法，例如吸入、胃腸道外給藥(例如IV、透皮、皮下或 IM途徑)或攝取(例如口服、口頰或跨粘膜途徑)引入這種分析物。本文所用的外源性 引入的分析物的代謝物或降解產(chǎn)物是感興趣的外源性分析物，因?yàn)楸M管它是對(duì)象體內(nèi)產(chǎn)生 的，但它驗(yàn)證自外源性引入的分析物。在一些實(shí)施方式中，感興趣分析物可以是外源性引入的濫用藥物、處方藥、止痛 藥、有機(jī)化合物、營養(yǎng)劑、金屬、毒性化合物、殺蟲劑或它們的代謝物或降解產(chǎn)物。濫用藥物、 止痛藥、處方藥或其代謝物的例子包括阿片類藥物、大麻素、NSAID、類固醇、苯丙胺、苯并二 氮革、巴比妥類藥物、三環(huán)藥物或麻黃堿、或其代謝物。具體的例子包括可卡因(和代謝物苯甲酰芽子堿、古柯乙烯和去甲可卡因)、 阿片類藥物和其代謝物(嗎啡、海洛因、6-單乙?；鶈岱?、二乙?；鶈岱?、可待因、羥考酮、 氫可酮、氫嗎啡酮、羥嗎啡酮和美沙酮)、大麻素類、苯環(huán)利定(PCP)、苯丙胺、去氧麻黃堿、 MDMA(搖頭丸、亞甲基二氧去氧麻黃堿)、MDA(亞甲基二氧苯丙胺)、大麻(和THC和羧 基-THC代謝物)、丙氧芬、哌替啶、苯并二氮、卡立普多、曲螞多、芬太尼、丁丙諾啡、納曲酮、 三環(huán)藥物、煙堿(和其代謝物可替寧)、伊文(eve)(亞甲基二氧-乙基苯丙胺)、氟硝西泮、 麥角酸(LSD)、地高辛、哌甲酯、對(duì)乙酰氨基酚、水楊酸鹽、氟西汀、舍曲林、右美沙芬、麻黃 堿、苯乙胺、偽麻黃堿和昔奈福林。殺蟲劑包括但不限于對(duì)硫磷、馬拉硫磷、氯螨硫磷、二嗪 磷、敵敵畏和殺蟲畏。在其它實(shí)施方式中，感興趣分析物是內(nèi)源性產(chǎn)生的，例如其產(chǎn)量與對(duì)象是否存在 某種疾病狀態(tài)或代謝狀態(tài)相關(guān)。內(nèi)源性分析物的例子包括脂肪酸酯(例如，作為飲酒標(biāo)記 物)；鉻(例如，作為葡萄糖耐受和2型糖尿病的衡量)；葡萄糖(例如，作為葡萄糖耐受和 2型糖尿病的衡量)；和糖基(例如，作為慢性高血糖的衡量)。角化樣品的大小范圍可以是約4_16mg/mL還原劑溶液，例如，約5_iaiig、約 6-10mg、約7-15mg、約5-lOmg、或者約8_Hmg/mL還原劑溶液。首先，可以用已知方法洗滌 樣品以去除可能通過外部接觸而非實(shí)際使用沉積在表面上的分析物或污染物。
然后處理角化結(jié)構(gòu)樣品，以釋放俘獲的分析物。重要的是，角化結(jié)構(gòu)的處理方法不 包括使角化結(jié)構(gòu)與一種或多種蛋白水解酶，如木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶和蛋白酶K相 接觸。因此，所述處理方法不會(huì)蛋白水解切割所述結(jié)構(gòu)中的肽(酰胺)鍵，例如基本不切割 它們。在一些實(shí)施方式中，所述方法能減少，例如顯著減少角化結(jié)構(gòu)樣品中存在的二硫鍵， 但不切割樣品中的肽鍵(例如，基本不切割它們)。通常，所述處理方法包括還原步驟、任選 的失活步驟和任選的純化步驟(例如，分離、過濾或離心)。在還原步驟中，使所述樣品與還原劑溶液(還原溶液)，如二硫蘇糖醇(“DTT”) 相接觸，以便還原角蛋白宏觀結(jié)構(gòu)中的分子間和分子內(nèi)二硫鍵，從而釋放俘獲的分析物。在 一些實(shí)施方式中，可將所述角化結(jié)構(gòu)樣品與主要由還原劑組成的還原溶液相接觸，或者與 不含蛋白水解酶的還原溶液相接觸。在一些實(shí)施方式中，所述接觸步驟不會(huì)導(dǎo)致角蛋白多 肽鏈中的肽主鏈鍵(即酰胺鍵)發(fā)生大量斷裂。與還原溶液接觸后，可任選處理還原的角化結(jié)構(gòu)樣品，以便使殘留的還原劑失活。 如同接觸步驟那樣，失活步驟在不存在蛋白水解酶的情況下進(jìn)行(例如，在主要由失活劑 組成的溶液中，或者在不含蛋白水解酶的溶液中)。為了確定一種或多種分析物是否存在和(任選地)濃度，在與還原溶液接觸的步 驟之后或者是任選失活步驟之后，可由經(jīng)處理的角化樣品獲得樣品。該樣品可直接取出、在 任選的失活步驟后取出或者在任選的用于去除殘留的還原角化樣品的純化步驟(例如，分 離、離心或過濾)后取出。包含在還原溶液中的還原劑可以是能夠還原角化結(jié)構(gòu)中二硫鍵的任何還原劑。典 型例子包括DTT (2，3 二羥基丁 -1，4- 二硫醇)或其異構(gòu)體DTE (2，3 二羥基丁 _1，4_ 二硫 醇)、巰基乙酸酯、半胱氨酸、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、硫化物、二硫化物或TCEP (三(2-羧基 乙基)膦)，或任何上述物質(zhì)的鹽形式。具體地，TCEP可用于在較低pH范圍，例如5. 5-約 8下進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。通常，在接觸步驟中水溶液中還原劑的濃度約為l_20g/L，例如，約1-15、約2_14、 約5-15、約10-18、約3-12、約4_8g/L。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，還原劑含量可根據(jù)反 應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)短和所用的檢測(cè)方法而改變。在一些實(shí)施方式中，所述方法可以在室溫或接近室溫的溫度下，并在中性pH下進(jìn) 行。例如，所述方法可以在約20°C _60°C的溫度(例如約20、25、沘、30、32、34、36、38、40、 42、44、46、48、50、52、54、56或60°C )和約pH 5-10. 5的條件下進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，所 述方法的 PH 約為 8. 8-9. 7 (例如，8. 9,9. 0,9. 1,9. 2,9. 3,9. 4,9. 45,9. 5,9. 55,9. 6,9. 65)， 所述方法在大約37°C的溫度下進(jìn)行。例如，在其它實(shí)施方式中，當(dāng)感興趣分析物或者其代謝 物或降解產(chǎn)物對(duì)堿性PH敏感時(shí)，可使用較低的pH，例如，約5-8. 7 (例如，約5. 2,5. 4,5. 6、 5. 8,6. 0,6. 2,6. 4,6. 6,7. 0,7. 2,7. 4,7. 6,7. 8,8. 0,8. 2,8. 4、8. 6 或 8. 7)。本領(lǐng)域普通技術(shù) 人員不難確定合適的反應(yīng)條件，包括反應(yīng)溫度、時(shí)間和PH。其它信息參見例如，美國專利號(hào) 5，466，579 ；5，324，642 ；6，022，693 ；6，582，924 ；和 6，949，344，通過引用將其全文納入本 文，這些專利討論了通過在較低PH下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)保持感興趣分析物(如海洛因代謝物、可卡 因)的化學(xué)結(jié)構(gòu)的方法。DTT和DTE是特別有用的還原劑。已發(fā)現(xiàn)，在所述方法中使用DTT或DTE導(dǎo)致在 較短時(shí)間內(nèi)(取決于角化樣品的量和類型)，例如約0. 5-4小時(shí)、約1-3小時(shí)或約1. 5-2. 5小時(shí)內(nèi)釋放俘獲的分析物。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于(例如)約5_15mg角化樣品如毛發(fā)而 言，處理約2小時(shí)是足夠的。一旦所述一種或多種分析物釋放到溶液混合物中，任選可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人 員了解的方法使殘留的活性還原劑失活，包括簡(jiǎn)單的等待足夠時(shí)間使其自然失活。通常， 這一時(shí)間約為還原劑與角化樣品初次接觸后2-14小時(shí)，這取決于所用還原劑的濃度和量、 PH、溫度、樣品大小等因素。或者，如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的那樣，可通過向還原溶液中加入某些金屬離 子，通常是金屬鹽形式，使殘留的還原劑失活。在與樣品接觸后，在還原溶液中加入少量，例 如在最終樣品溶液中達(dá)到約0. 1-1. Og/L的這種金屬鹽可顯著減少對(duì)還原樣品進(jìn)行所述分 析物檢測(cè)方法所需的時(shí)間，因?yàn)椴恍枰却€原劑自身失活。大部分有效的金屬鹽是在化 學(xué)連接后不會(huì)從溶液中析出、并且能使所述還原劑如DTT或DTE失活的某些金屬鹽。避免 在還原溶液中析出可能有用，因?yàn)檫@種析出可能導(dǎo)致分析物吸附在沉淀上或者俘獲在沉淀 中而產(chǎn)生損失，或者可引起顆粒阻礙對(duì)光學(xué)讀出方法的干擾。在某些實(shí)施方式中，也通過將還原溶液的pH保持在約6-8，最優(yōu)選約7來防止析 出。實(shí)現(xiàn)這種目的的一種方式是加入一摩爾BIS-TRIS堿，以便將pH保持在約7。就某些分 析物檢測(cè)方法，例如放射性免疫試驗(yàn)(RIA)或酶促免疫試驗(yàn)的性能而言，pH約7也是有用 的pH。除如美國專利5，466，579和5，324，642所述的Cu++鹽(如硫酸銅)外，Si++鹽(如 硫酸鋅和硝酸鋅)；Mn++鹽(如硫酸錳)；Fe+++鹽(如硫酸鐵和氯化鐵)；和Fe++鹽(如硫酸 亞鐵)是有效的。有效的還有1 ++鹽(如乙酸鉛和硝酸鉛)；Cd++鹽(如氯化鎘)；Hg++鹽 (如氯化汞)；Ag++鹽(如硝酸銀)；和Co++鹽(如氯化鈷)。參見美國專利6，022，693和 6，350, 582。在某些實(shí)施方式中，可使用亞砷酸鹽，如亞砷酸鈉(NaAsO2),通過形成可沉淀化合 物去除殘留的還原劑(如DTT或DTE)。通常，將100微升lOOmg/mL的亞砷酸鈉溶液加入 ImL毛發(fā)消化溶液(終濃度約為10g/L)，以使還原劑失活。然而，不優(yōu)選亞砷酸鹽，因?yàn)榭?能因產(chǎn)生沉淀而吸附或俘獲分析物。通常，在所述樣品與所述還原溶液接觸后約1-5小時(shí) (例如，約 1、1· 5、2、2· 5、3、3· 5、4、4· 5 或5 小時(shí))，可將約 0. 1-lmg(例如，約 0. 1,0. 2,0. 3、
0.4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9 或 Img)溶液中的金屬鹽加入約 0. 8-1. 6mL(例如，約 0. 8,0. 9、
1.0,1. 1、1. 2,1. 3,1. 4、1· 5或1. 6mL)還原溶液中。通常，失活過程快速完成，例如在約30 分鐘內(nèi)，例如約20分鐘內(nèi)，約10分鐘內(nèi)、約5分鐘內(nèi)或約2分鐘內(nèi)完成。一旦樣品處理完成后，可通過本領(lǐng)域認(rèn)可的分析物檢測(cè)方法，包括受體試驗(yàn)、基于 蛋白質(zhì)的分析方法如免疫試驗(yàn)，包括放射性免疫試驗(yàn)(RIA)或酶促免疫試驗(yàn)(EIA)和/或 儀器方法如質(zhì)譜、色譜技術(shù)或原子吸收，對(duì)還原的角化樣品溶液進(jìn)行直接分析。因此，驚訝 地發(fā)現(xiàn)，所述還原劑可破壞角蛋白的二硫鍵連接但不破壞免疫試驗(yàn)中所用的IgG蛋白(抗 體)。在具體實(shí)施方式
中，可使用儀器方法驗(yàn)證免疫試驗(yàn)方法中獲得的陽性結(jié)果。由于 這些方法不是基于蛋白質(zhì)的方法，所以不需要使還原劑失活的步驟。處理方法的速度和溫 和性以及通過包含“峰”，即包含含量已知的氘化分析物定量測(cè)定效率的能力，使得本發(fā)明 所述的處理方法也成為儀器分析方法如氣相色譜、液相色譜和質(zhì)譜中選擇的方法。
可使用該方法，檢測(cè)如前所述任何感興趣分析物的使用或早先使用，這些分析物 包括濫用藥物如可卡因、嗎啡/海洛因和其它阿片類藥物、大麻素類、大麻、苯環(huán)利定或 “PCP”、安眠酮和苯丙胺。而且，所述方法能夠有效確定處方藥如地高辛、美沙酮和苯并二氮 罩的早先使用?？紤]到，個(gè)體血流中存在的、在毛發(fā)合成期間轉(zhuǎn)移到毛發(fā)中的任何分析物， 特別是任何有機(jī)分析物可利用本文所述方法提取和分析。在某些實(shí)施方式中，可使用去污劑輔助釋放感興趣的一種或多種分析物?？捎糜?溶解生物膜組分的某些生物去污劑化合物有助于在較低PH下釋放分析物，而不干擾還原 或后續(xù)的分析物檢測(cè)。這些生物去污劑可能有助于在PH范圍約為5-10. 5的條件下處理角 化樣品。合適的去污劑包括膽汁酸去污劑，如甘膽酸、膽酸、?；悄懰帷⒚撗跄懰?、甘氨脫氧 膽酸、?；敲撗跄懰峒捌潲}，包括鈉鹽。用于所述方法的其他去污劑是磺基甜菜堿，如兩性 去污劑(Zwittergents) 和甜菜堿，如Empigen BB (N-十二烷基-N，N-二甲基甘氨酸)(均 購自加利福尼亞州拉霍亞的卡巴開公司(Calbiochem Corp. ,La Jolla,CA))0其他去污劑 包括烷基葡糖苷，包括己基-β -D-吡喃葡糖苷、庚基-β -D-吡喃葡糖苷、辛基-β -D-吡喃 葡糖苷、壬基-β -D-吡喃葡糖苷、癸基-β -D-吡喃葡糖苷、十二烷基-β -D-麥芽糖苷和辛 基- β -D-硫代吡喃葡糖苷(OSGP)。烷基葡糖苷混合物如ELUGENT 產(chǎn)品(卡巴開公司) 也是有效的。特別優(yōu)選的是膽汁酸、膽酸和甘膽酸，它們有助于在ρΗ范圍約6. 3-8的條件下消 化毛發(fā)。脫氧膽酸類如脫氧膽酸和甘氨脫氧膽酸能在PH高于約7的條件下有效輔助消化毛發(fā)。這些去污劑可用于工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的五種藥物篩選(美國最常見的濫用藥物，即大麻、 可卡因、苯環(huán)利定、去氧麻黃堿和阿片類)，用本文所述方法進(jìn)行測(cè)定。因此，它們不影響 五種藥物篩選中涉及的任何分析物或抗體，不會(huì)導(dǎo)致假陰性或假陽性。物種藥物篩選中最 有效的具體去污劑是膽酸鹽、脫氧膽酸鹽、膽酸、脫氧膽酸、辛基-β-D-吡喃葡糖苷和辛 基-β-D-硫代吡喃葡糖苷。當(dāng)進(jìn)行包括可卡因、阿片類、苯環(huán)利定、苯丙胺和擬交感神經(jīng) 胺在內(nèi)的篩選時(shí)，優(yōu)選膽汁酸去污劑、烷基葡糖苷、磺基甜菜堿和甜菜堿。在單獨(dú)用于可卡 因的篩選中，優(yōu)選去污劑是膽酸、兩性去污劑(Zwittergents) 、烷基葡糖苷和N-十二烷 基-N，N 二甲基甘氨酸。實(shí)踐中，將生物去污劑與還原性水溶液混合，然后將在大約30-40°C的溫度范圍內(nèi) 將該溶液與角化樣品相接觸。通常，將約1-ang生物去污劑加入約Iml還原溶液中。有關(guān)本文所述方法的額外信息，包括使用生物去污劑、離子交換樹脂(例如，去除 干擾物質(zhì))和改變用于消化的PH范圍，可參見通過引用納入本文的美國專利6，022，693和 6，350, 582。通過本發(fā)明所述方法獲得的益處頗多，包括能夠迅速、準(zhǔn)確和廉價(jià)地確定早先接 觸特定的分析物。該方法可提供長(zhǎng)時(shí)間上的消耗記錄或未消耗記錄。通過剔除所有蛋白 水解處理步驟，蛋白水解方法的花費(fèi)和對(duì)生物分析物檢測(cè)的某些干擾都被降低。令人驚訝 的是，用于使各物質(zhì)擴(kuò)散到毛發(fā)結(jié)構(gòu)中的蛋白水解酶和還原劑的協(xié)同作用對(duì)于有效釋放感 興趣分析物而言不是必需的。而且，毛發(fā)收集侵入性和身體排斥性均低于血液或尿液的收 集，樣品無法改變或替換，也無法通過在預(yù)定測(cè)試，例如雇傭前檢查或年度體檢前短期戒除 或“沖淡”(攝取過量液體)來規(guī)避檢測(cè)。樣品可無限期的保存而無需冷藏。最后，所述方法有利于用于檢測(cè)感興趣分析物的篩選和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。下述實(shí)施例旨在說明而不是限制權(quán)利要求書。
實(shí)施例實(shí)施例I 毛發(fā)樣品的非蛋白水解消化物的放射性免疫試驗(yàn)向試管中的8mg毛發(fā)樣品中加入1. 6mL 6%二硫蘇糖醇(pH 9. 5)，該樣品在37°C 孵育2小時(shí)。然后，用140uL含有6%五水硫酸銅的1.0M Bis Tris (pH 7)中和該樣品，混 合并離心。采集上清液，測(cè)定可卡因、阿片類、PCP、苯丙胺和大麻素類。通過將樣品等份與I125-標(biāo)記的藥物和針對(duì)該藥物的第一抗體混合進(jìn)行放射性免 疫試驗(yàn)。樣品中標(biāo)記和未標(biāo)記的藥物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合第一抗體上的位點(diǎn)。孵育后，加入針對(duì)第一 抗體的第二抗體，以沉淀抗體結(jié)合的藥物。離心和傾析上清液后，用Y計(jì)數(shù)器對(duì)沉淀的結(jié) 合組分進(jìn)行計(jì)數(shù)?？煽ㄒ虻氖痉缎越Y(jié)果
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定對(duì)象的角化結(jié)構(gòu)樣品中是否存在分析物的方法，所述方法包括(a)提供任選洗滌的角化結(jié)構(gòu)樣品；(b)將所述角化樣品與還原劑水溶液相接觸以產(chǎn)生測(cè)試溶液，其中所述接觸不會(huì)蛋白 水解切割所述角化結(jié)構(gòu)；和(c)測(cè)定步驟(b)的測(cè)試溶液中是否存在所述分析物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括在存在所述分析物的前提下測(cè)定所述測(cè)試溶液中 所述分析物的含量。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括在步驟(c)之前使步驟(b)的測(cè)試溶 液中殘留的還原劑失活以得到失活的測(cè)試溶液，并測(cè)定所述失活的測(cè)試溶液中是否存在所 述分析物，其中所述失活過程不會(huì)蛋白水解切割所述角化結(jié)構(gòu)。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括純化步驟(b)的測(cè)試溶液以分離測(cè)試 溶液中殘留的角化樣品，得到純化的測(cè)試溶液，并測(cè)定所述純化的測(cè)試溶液中是否存在所 述分析物；其中所述純化過程不會(huì)蛋白水解切割所述角化結(jié)構(gòu)。
5.一種測(cè)定對(duì)象的角化結(jié)構(gòu)樣品中是否存在分析物的方法，所述方法主要由以下步驟 構(gòu)成(a)提供任選洗滌的角化結(jié)構(gòu)樣品；(b)使所述角化樣品與還原劑水溶液相接觸，得到測(cè)試溶液；(c)使步驟(b)的測(cè)試溶液中殘留的還原劑失活以得到失活的測(cè)試溶液；(d)純化步驟(c)的失活測(cè)試溶液以去除殘留的角化樣品，得到純化、失活的測(cè)試溶 液；禾口(e)測(cè)定步驟(d)的純化、失活的測(cè)試溶液中是否存在所述分析物。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，還包括在存在所述分析物的前提下測(cè)定所述純化、失活 的測(cè)試溶液中所述分析物的含量。
7.一種測(cè)定對(duì)象的角化結(jié)構(gòu)樣品中是否存在分析物的方法，所述方法包括(a)提供任選洗滌的角化結(jié)構(gòu)樣品；(b)使所述角化樣品與還原劑水溶液相接觸，得到測(cè)試溶液；和(c)測(cè)定所述測(cè)試溶液中是否存在所述分析物。其中所述方法不包括使所述角化結(jié)構(gòu)樣品與蛋白水解酶相接觸。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，還包括在存在所述分析物的前提下測(cè)定所述測(cè)試樣品中 所述分析物的含量。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，還包括使所述測(cè)試溶液中殘留的還原劑失活。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，還包括純化所述測(cè)試溶液以去除殘留的角化樣品。
11.一種測(cè)定對(duì)象的角化結(jié)構(gòu)樣品中是否存在分析物的方法，所述方法包括(a)提供任選洗滌的角化結(jié)構(gòu)樣品；(b)使所述角化樣品與還原劑水溶液相接觸，得到測(cè)試溶液；和(c)測(cè)定所述測(cè)試溶液中是否存在所述分析物。其中所述方法不包括蛋白水解切割所述角化結(jié)構(gòu)樣品。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，還包括在存在所述分析物的前提下測(cè)定所述測(cè)試樣品 中所述分析物的含量。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，還包括使所述測(cè)試溶液中殘留的還原劑失活。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，還包括純化所述測(cè)試溶液以去除殘留的角化樣品。
15.一種測(cè)定對(duì)象的角化結(jié)構(gòu)樣品中是否存在分析物的方法，所述方法包括(a)提供任選洗滌的角化結(jié)構(gòu)樣品；(b)處理所述角化結(jié)構(gòu)樣品，以便減少所述角化結(jié)構(gòu)樣品中存在的二硫鍵，但不切割所 述樣品中的肽鍵，從而得到測(cè)試溶液；和(c)測(cè)定所述測(cè)試溶液中是否存在所述分析物。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，還包括在存在所述分析物的前提下測(cè)定所述測(cè)試樣品 中所述分析物的含量。
17.如權(quán)利要求1、5、7、11或15所述的方法，其特征在于，所述還原劑包含DTT或DTE。
18.如權(quán)利要求3、5、9或13所述的方法，其特征在于，所述失活步驟包括使所述測(cè)試 溶液與金屬鹽的水溶液相接觸，其中所述鹽的金屬陽離子選自下組Cu++、Zn+\ Mn++、Fe++\ Fe++、Pb++、Cd++、Hg++、Ag++、As+++ 和 Co++。
19.如權(quán)利要求4、5、10或14所述的方法，其特征在于，所述純化步驟包括分離、過濾或 離心所述測(cè)試溶液。
20.如權(quán)利要求1、5、7、11或15所述的方法，其特征在于，用特異于所述分析物的免疫 試驗(yàn)測(cè)定是否存在所述分析物。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述分析物的特異性免疫試驗(yàn)包括使用 所述分析物的特異性抗體。
22.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述免疫試驗(yàn)是放射性免疫試驗(yàn)。
23.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述免疫試驗(yàn)是酶促免疫試驗(yàn)。
24.如權(quán)利要求1、5、7、11或15所述的方法，其特征在于，用質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定是否存在所 述分析物。
25.如權(quán)利要求1、5、7、11或15所述的方法，其特征在于，用色譜技術(shù)測(cè)定是否存在所 述分析物。
26.如權(quán)利要求1、5、7、11或15所述的方法，其特征在于，進(jìn)行所述接觸步驟或處理步 驟的PH約為5.0至10. 5。
27.如權(quán)利要求1、5、7、11或15所述的方法，其特征在于，進(jìn)行所述接觸步驟或處理步 驟的PH約為5至8. 8。
28.如權(quán)利要求1、5、7、11或15所述的方法，其特征在于，進(jìn)行所述接觸步驟或處理步 驟的PH約為8. 8至10. 5。
29.如權(quán)利要求1、5、7、11或15所述的方法，其特征在于，進(jìn)行所述接觸步驟或處理步 驟的溫度約為20°C至40°C。
30.如權(quán)利要求1、5、7、11或15所述的方法，其特征在于，所述接觸步驟或處理步驟進(jìn) 行約0. 5至12小時(shí)。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述接觸步驟或處理步驟進(jìn)行約1至5小時(shí)。
32.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述接觸步驟或處理步驟進(jìn)行約2小時(shí)。
33.如權(quán)利要求1、5、7、11或15所述的方法，其特征在于，所述分析物是濫用藥物或其 3代謝物、處方藥或其代謝物、止痛藥或其代謝物、營養(yǎng)劑、或內(nèi)源性分析物，或任何上述物質(zhì) 的鹽形式。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述濫用藥物或其代謝物選自下組可 卡因、苯甲酰芽子堿、古柯乙烯、去甲可卡因、PCP、苯丙胺、去氧麻黃堿、大麻素、THC、羧 基-THC、海洛因、可待因、嗎啡、6-單乙?；鶈岱?MAM)、羥考酮、3，4_亞甲基二氧苯丙胺 (MDA)；和3，4-亞甲基二氧去氧麻黃堿(MDMA)。
35.如權(quán)利要求1、5、7、11或15所述的方法，其特征在于，所述角化結(jié)構(gòu)樣品包括毛發(fā)、 指甲或趾甲。
36.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述角化結(jié)構(gòu)樣品包括毛發(fā)。
37.如權(quán)利要求1、5、7、11或15所述的方法，其特征在于，洗滌所述毛發(fā)樣品。
38.如權(quán)利要求15所述的方法，還包括使所述測(cè)試溶液中殘留的還原劑失活。
39.如權(quán)利要求15所述的方法，還包括純化所述測(cè)試溶液以去除殘留的角化樣品。
40.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述濫用藥物或其代謝物、處方藥或其代 謝物、或止痛藥或其代謝物是阿片類藥物、大麻素、NSAID、類固醇、苯丙胺、苯并二氮萆、巴 比妥類藥物、三環(huán)藥物或麻黃堿，或其代謝物。
全文摘要
本發(fā)明提供從個(gè)體(其曾攝入過一種或多種分析物)的頭發(fā)或體毛或其它角化結(jié)構(gòu)中快速釋放一種或多種分析物的方法。所述方法可包括使角化結(jié)構(gòu)與還原劑相接觸，但不與蛋白水解劑相接觸。所述方法還可包括通過已知的分析技術(shù)，例如免疫試驗(yàn)鑒定和定量測(cè)定一種或多種分析物。所述方法不會(huì)損害分析物，也不會(huì)對(duì)隨后使用的分析物檢測(cè)探針(如抗體)產(chǎn)生有害影響。
文檔編號(hào)G01N33/94GK102077093SQ200980125850
公開日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2009年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月29日
發(fā)明者M·I·謝弗, M·阿特菲, V·希爾 申請(qǐng)人:賽凱米迪克斯股份有限公司