專利名稱：納米金結(jié)合聚噻吩衍生物比色檢測目標(biāo)靶dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種納米金結(jié)合聚噻吩衍生物比色檢測目標(biāo)靶DNA的方法。更確切地 說，特別是涉及一種復(fù)合納米金和聚噻吩靈敏快速檢測目標(biāo)靶DNA的方法。屬靶基因檢測 領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人類、病毒以及細菌的特異性核酸序列檢測在疾病診斷中正變得越來越重要。尤 其近年來一些病原體引起的爆發(fā)性疫情給人類的健康以及社會經(jīng)濟帶來嚴重損失。因此， 對病原體進行快速、準確的診斷不僅對傳染性疾病的預(yù)防和控制有著非常重要的意義，對 臨床疾病的指導(dǎo)也起著積極的指導(dǎo)意義。至今為止許多技術(shù)，包括電化學(xué)、熒光、電泳、電化 學(xué)發(fā)光、酶、表面等離子共振(SPR)以及原子力顯微鏡等方法被用于人類和病原體基因的 檢測。這些技術(shù)方法盡管有其各自的優(yōu)勢以及較高的靈敏度，但大多需要基因的擴增以及 昂貴的檢測儀器等，最近幾年來許多研究都在努力提高目標(biāo)靶基因檢測的敏感度而不需要 靶序列的擴增和富集的過程。然而，大多數(shù)這些方法仍需要復(fù)繁瑣的步驟。因此建立簡單、 特異、快速的基因檢測方法對疾病的早期診斷具有重要的意義。近年來，金納米顆粒和水溶性熒光共軛聚合物作為高靈敏的生化傳感元件的獨特 性質(zhì)在生物大分子(如核酸、蛋白質(zhì))特異性識別、檢測方面的研究越來越受到人們的關(guān) 注。納米金顆粒具有很好的生物相容性，顆粒直徑小，比表面積大，在可見區(qū)內(nèi)具有較高的 消光系數(shù)和特殊的光學(xué)性質(zhì)，因此可作為一個信號分子識別的理想顏色顯示劑，用于DNA 雜交的比色分析檢測。但是通常需要在納米金顆粒表面修飾寡核苷酸探針，才能達到特異 性識別靶生物分子的目的，因此成本較昂貴。研究表明，ssDNA和dsDNA對未標(biāo)記的納米金 顆粒有不同的靜電作用，因而對納米金顆粒的穩(wěn)定性有所不同，根據(jù)此特性可以鑒別ssDNA 和dsDNA。另一方面，攜帶著離子功能的共軛聚合物也一直是高性能和快速反應(yīng)的化學(xué)和生 物傳感器運用的候選者。例如聚噻吩衍生物為帶正電離子、有熒光色團的水溶性多聚物，在 能量轉(zhuǎn)換、機械壓力以及離子結(jié)合的情況下可顯示出明顯的顏色變化。因此，用聚噻吩作為 傳感材料的傳感器已引起研究者的廣泛注意。聚噻吩可以與帶負電離子的寡聚核苷酸結(jié)合 形成化學(xué)計量的聚合電解質(zhì)復(fù)合物(二聚體)，而使聚噻吩衍生物本身的熒光淬滅而呈現(xiàn) 紅光；當(dāng)未標(biāo)記的互補的寡核苷酸探針增加到多聚物中，聚合電解質(zhì)復(fù)合物進一步與完全 互補的寡聚核苷酸結(jié)合形成三聚體，此時聚噻吩衍生物骨架緊密地纏繞在雙鏈互補核苷酸 骨架的帶負離子的磷酸上形成了一個螺旋結(jié)構(gòu)，從而限制了鏈內(nèi)和鏈間的熒光淬滅導(dǎo)致熒 光信號增強發(fā)出黃色的光譜，并且從顏色上也可辨別出明顯的改變，最關(guān)鍵的是聚噻吩衍 生物本身能夠產(chǎn)生信號級聯(lián)放大，這為低濃度基因的檢測提供了一種新方法。鑒于以上對納米金和聚噻吩衍生物作為高靈敏度的生化傳感元件的獨特特性，本 發(fā)明試圖將兩者結(jié)合起來用生物比色方法檢測目標(biāo)靶DNA，本發(fā)明是基于納米金結(jié)合聚噻 吩衍生物為傳感材料的非標(biāo)記DNA檢測方法，為了增加這個傳感器的選擇性和敏感性，未 修飾的聚噻吩衍生物被用于做顏色變化和擴增指示劑。該發(fā)明基于聚噻吩衍生物與ssDNA/dDNA結(jié)合時使得DNA-納米金溶液的穩(wěn)定性發(fā)生變化而引起顏色改變產(chǎn)生信號級聯(lián)放大的 原理，通過顏色轉(zhuǎn)變顯示劑以及擴增標(biāo)簽的雙重作用實現(xiàn)DNA的高靈敏快速檢測，從而建 立利用納米金結(jié)合聚噻吩衍生物進行基因直接檢測的分析平臺。該復(fù)合納米金和聚噻吩作 為傳感材料用于DNA的檢測比納米金和聚噻吩單獨作為傳感材料用于DNA的檢測靈敏度大 大提高，并且操作簡單，不需要特殊的儀器設(shè)備，可望應(yīng)用于臨床檢驗醫(yī)學(xué)及環(huán)境中靶目標(biāo) DNA的快速診斷和檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種納米金結(jié)合聚噻吩衍生物快速檢測目標(biāo)靶DNA的方 法，以彌補現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷。本發(fā)明提供一種納米金結(jié)合聚噻吩選擇性靈敏檢測目標(biāo)靶DNA的方法，包括(一 )檢測試劑及探針的準備(1)納米金溶液的制備配置濃度為ImM HAuC14溶液及濃度為38. 8mM的檸檬酸三鈉溶液。將HAuC14溶 液加熱至130°C，保證加熱過程中攪拌充分，約20分鐘時迅速加入新配好的檸檬酸三鈉溶 液(此過程中注意保溫，不要讓HAuC14溶液降溫)25ml，持續(xù)攪拌至溶液冷卻至室溫、即形 成為酒紅色溶液。以0. 22 μ m硝酸纖維尼龍膜過濾溶液，即可得到顆粒均勻的13nm納米金 溶液，4°C保存?zhèn)溆谩?2) HlNl DNA檢測探針的設(shè)計及合成甲型Hmi流感原名豬流感，現(xiàn)已成為全球流行病。發(fā)展快速簡便的檢測方法對 流感的預(yù)防和早期診斷都具有重要的意義。本發(fā)明以HlNl (GenBank :CY048965. 1)序列為 靶目標(biāo)基因模板，建立利用未修飾的納米金結(jié)合聚噻吩衍生物進行基因直接檢測的分析方 法。DNA探針序列(探針的合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成)為H1N1DNA 探針5，-ACGGAAGGAGTGCCAA-3，；互補的靴H1N1DNA 5，-TTGGCACTCCTTCCGT-3，；非互補DNA (HCV DNA 對照)5，-A GTAGTGTTGGGTCGC-3，；(3)聚噻吩衍生物(PMNT)的制備在檢測DNA雜交中，本發(fā)明選擇陽離子共軛聚[3_ (3，-N, N, N-triethylamino-l，-propyloxy)-4-methyl-2,5-thiophene hydrochloride] (PMNT)作為顏色指示劑，選擇性靈敏地檢測單雙鏈DNA。按照Hoang-Anh等 人的方法(HO Hoang-Anh ；B0ISSIN0T Maurice ；BERGERON Michel G.，etal. Colorimetric and fluorometric detection of nucleic acids using cationicpolythiophene derivatives. Angew. Chem. 2002,41 :1548-1551)合成 PMNT。(二)目標(biāo)靶序列的檢測1，單鏈或雙鏈DNA雜交溶液制備取去離子水 4. 5μ L，力口入 5μ L 0. 2Μ NaCl/0. IM phosphate buffer(pH7. 4) > 0. 25 μ L (100 μ Μ) HmiDNA探針以及0. 25 μ L(IOOyM)非互補的寡核苷酸DNA，充分混勻，制 備單鏈DNA溶液；另取去離子水4μ L，加入5μ L的0.2M NaCl/0. IM phosphate buffer (pH 7),0. 5 μ L(IOOyM)HlNl DNA 探針以及 0. 5 μ L (100 μ Μ)完全互補的靶 Hmi DNA，充分混勻，互補的的兩個單鏈DNA經(jīng)過雜交形成雙鏈的DNA，制備為雙鏈DNA溶液。2.基于納米金結(jié)合聚噻吩用于互補靶DNA的檢測取兩管納米金溶液(濃度12nM) 100 μ L，分別加入單鏈DNA溶液(非互補的探針)、雙鏈DNA溶液(序列完全互補)各lyL，混勻，觀察納米金溶液的顏色。再分別加入Iul聚 噻吩(0. 05mg/ml).充分混勻，觀察納米金溶液的變化(見圖)。上述納米金-DNA-聚噻吩混合液各取100 μ L，分別加100 μ L去離子水混勻。用紫 外-可見分光光度計(型號為JASCO V-670)檢測200nm 800nm區(qū)間紫外吸收強度。吸 收/發(fā)射狹縫寬度為lnm，工作電壓為700伏，所有實驗在室溫下進行。所述步驟(二)/⑴中的制備單、雙鏈DNA雜交溶液的雜交緩沖液為0.2M NaCl (含 IOnM phosphate buffer)，PH7.4 ；所述步驟(二 )/(1)中寡核苷酸探針與雜交緩沖液的濃度比為 100 μ M 1Μ(1 10)；所述步驟(二)/ (2)中的納米金顆粒大小為13nm，納米金溶液濃度為12nM，聚噻 吩衍生物溶液的濃度為0. 05mg/ml.所述步驟(二)/(2)中的DNA探針與聚噻吩衍生物的濃度比為接近1 1所述步驟(二)/(2)中的目標(biāo)靶序列的檢測是指以靶Hmi DNA作為雜交模板，未 修飾的納米金復(fù)合聚噻吩超敏性、選擇性和快速DNA檢測流程見附圖1。本發(fā)明根據(jù)納米金和水溶性陽離子共軛聚合物的結(jié)構(gòu)特征，將納米金顆粒結(jié)合陽 離子共軛聚合物_聚噻吩用于靶DNA的檢測。在一定條件的情況下，單鏈和雙鏈DNA具有 穩(wěn)定納米金的作用。未經(jīng)修飾的納米金溶液加入DNA探針與待檢測的目標(biāo)靶序列，納米金 溶液無明顯變化(未加入NaCl溶液情況下)。在聚噻吩存在的條件下，因為陽離子共軛聚 合物聚噻吩與包圍著納米金的單鏈DNA結(jié)合，促使納米金顆粒進一步的團聚，而使得納米 金溶液發(fā)生明顯的顏色變化；而聚合物與雙鏈DNA形成三聚體的結(jié)構(gòu)在溶液中能夠較為穩(wěn) 定納米金溶液，納米金沒有明顯的聚集。因此通過肉眼觀察聚噻吩在單、雙鏈DNA納米金溶 液中的不同顏色變化，或檢測紫外吸光度可達到檢測目標(biāo)靶DNA的目的(見圖1)。綜上所述，本發(fā)明利用未修飾的納米金結(jié)合水溶性共軛聚合物聚噻吩對單、雙鏈 DNA具有不同的顏色反應(yīng)，可方便地選擇性地檢測目標(biāo)靶DNA。該方法操作簡單、快速，可通 過裸眼進行觀察，不需要特殊的儀器設(shè)備，使得檢測方便易行。該檢測方法可檢測與已知探 針互補的靶DNA序列，具有特異、快速、高靈敏度的特點，可應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)和環(huán)境監(jiān)測中 人類及微生物基因的檢測。


圖1為互補的靶DNA的檢測流程。圖2為單獨的納米金溶液、包含單鏈DNA的納米金溶液、包含雙鏈DNA的納米金溶 液分別加入聚噻吩后肉眼可觀察到的顏色變化成像。圖中，A :ssDNA和dsDNA分別加入納米金溶液中(未加NaCl)并無顏色變化；Al 納米金溶液；A2 :ssDNA+納米金溶液；A3 dsDNA+納米金溶液B 將聚噻吩衍生物分別加入ssDNA+納米金溶液以及dsDNA+納米金溶液后，單、雙 鏈DNA溶液發(fā)生明顯的顏色變化；Bl 納米金溶液；B2 ssDNA+納米金+聚噻吩衍生物溶液；B3 :dsDNA 2+納米金+聚噻吩衍生物溶液。圖3為單獨的納米金溶液、包含單鏈DNA的納米金溶液以及包含雙鏈DNA的納米金溶液加入聚噻吩后的紫外吸收光譜區(qū)別示意圖。圖4基于未修飾納米金比色檢測DNA單鏈或雙鏈流程示意圖。圖5基于未修飾的納米金溶液比色反應(yīng)檢測單鏈、雙鏈DNA ；A 納米金溶液；B ssDNA+納米金溶液+NaCl ；C :dsDNA+納米金溶液+NaCl ；D 納米金溶液+NaCl。圖6基于納米金溶液檢測單鏈、雙鏈DNA紫外吸收光譜；圖中，1單獨的納米金溶 液；2為包含單鏈DNA的納米金溶液以及3為包含雙鏈DNA的納米金溶液加入NaCl溶液 (0. 2M)后的紫外吸收光譜圖。圖7基于聚噻吩衍生物比色反應(yīng)檢測單鏈、雙鏈DNA成像；A單獨聚噻吩溶液；B包 含單鏈DNA的聚噻吩溶液；C包含雙鏈DNA的聚噻吩溶液顏色變化成像。圖8基于聚噻吩衍生物比色反應(yīng)檢測單鏈、雙鏈DNA紫外吸收光譜區(qū)別示意圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明所述的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。實施例1(一 )檢測試劑及探針的準備(1)納米金溶液的制備配置濃度為ImM HAuC14溶液及濃度為38. 8mM的，檸檬酸三鈉溶液。將HAuC14溶 液加熱至130°C，保證加熱過程中攪拌充分，約20分鐘時迅速加入新配好的檸檬酸三鈉溶 液(此過程中注意保溫，不要讓HAuC14溶液降溫)25ml，持續(xù)攪拌至溶液冷卻至室溫、即形 成為酒紅色溶液。以0. 22 μ m硝酸纖維尼龍膜過濾溶液，即可得到顆粒均勻的13nm納米金 溶液，4°C保存?zhèn)溆谩?2) HmiDNA檢測探針的設(shè)計及合成本發(fā)明以Hmi (GenBank :CY048965. 1)序列為靶目標(biāo)基因模板，建立利用未修飾 的納米金復(fù)合聚噻吩衍生物進行基因直接檢測的分析方法。DNA探針序列如下，探針的合成 由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。H1N1DNA 探針5，-ACGGAAGGAGTGCCAA-3，；互補的靴H1N1DNA :5，-TTGGCACTCCTTCCGT-3，；非互補DNA (HCV DNA 對照)5，-AGTAGTGTTGGGTCGC-3，；(3)聚噻吩衍生物的制備在檢測DNA雜交中，本發(fā)明選擇陽離子共軛聚合物[3-(3，-N, N, N-triethylamino-Γ -propyloxy) -4-methyl-2, 5-thiophene hydrochloride] (PMNT)作顏色指示劑，選擇性靈敏地檢測單雙鏈DNA。按照Hoang-Anh等 人的方法(HO Hoang-Anh ；B0ISSIN0T Maurice ；BERGERON Michel G.，et al. Colorimetric and fluorometric detection of nucleic acids using cationicpolythiophenederivatives. Angew. Chem. 2002,41 :1548-1551)合成 PMNT。(二)目標(biāo)靶序列的檢測1，單鏈和雙鏈DNA雜交溶液制備取去離子水 4· 5μ L，力口入 5μ L 0. 2Μ NaCl/0. IM phosphate buffer(pH7. 4) > 0. 25 μ L (100 μ Μ) HmiDNA探針以及0. 25 μ L(IOOyM)非互補的寡核苷酸DNA，充分混勻，制 備單鏈DNA溶液；另取去離子水4 μ L，加入5μ L的0.2M NaCl/0. IM phosphate buffer (pH 7),0. 5 μ L(IOOyM)HlNl DNA 探針以及 0. 5 μ L (100 μ Μ)完全互補的靶 Hmi DNA，充分混 勻，互補的的兩個單鏈DNA經(jīng)過雜交形成雙鏈的DNA，制備成雙鏈DNA溶液。(見圖1)聚噻吩加入單鏈或雙鏈DNA納米金溶液中可引起不同的顏色反應(yīng)，含有單鏈DNA 的納米金溶液加入陽離子的聚噻吩后，因為和納米金周圍的DNA探針結(jié)合，發(fā)生明顯的聚 集反應(yīng)，而包含雙鏈DNA的納米金溶液沒有明顯的聚集反應(yīng)。2.基于納米金結(jié)合聚噻吩衍生物用于互補靶DNA的檢測取兩管納米金溶液(濃度12nM) 100 μ L，分別加入單鏈DNA溶液(非互補的探針)、 雙鏈DNA溶液(序列完全互補)各lyL，混勻，觀察納米金溶液的顏色。再分別加入Iul聚 噻吩(0.05mg/ml).充分混勻，觀察納米金溶液的變化(見圖2和圖3)。檢測DNA的靈敏度 為 49nM。上述納米金-DNA-聚噻吩混合液各取100 μ L，分別加100 μ L去離子水混勻。用紫 外-可見分光光度計(型號為JASCO V-670)檢測200nm 800nm區(qū)間紫外吸收強度。吸 收/發(fā)射狹縫寬度為lnm，工作電壓為700伏，所有試驗均在室溫下進行。實施例2本發(fā)明提供的納米金結(jié)合聚噻吩衍生物檢測與納米金、聚噻吩衍生物單獨檢測目 標(biāo)靶DNA的方法的比較1.基于納米金溶液比色檢測單鏈、雙鏈DNA1. 1制備單鏈、雙鏈和單堿基突變DNA溶液取一 Ependoff管加入去離子水3 μ L，HlNl DNA探針1 μ L,非互補DNA (HCV DNA對 照)1 μ L以及0. 2Μ NaCl/lOmM PB溶液5 μ L，充分混勻，配制非雙鏈DNA溶液(單鏈DNA) 的濃度為20 μ M ；另取一個管子加入去離子水1 μ L，Him DNA探針2 μ L、互補的靶Hmi DNA 2 μ L、0. 2M NaCl/lOmMPB溶液5 μ L，配制雙鏈DNA溶液的濃度為20 μ Μ。1. 2.互補靶DNA的檢測室溫下，取單鏈DNA溶液、雙鏈DNA溶液各5 μ L分別加入100 μ L的納米金溶液。 再分別加入NaCl溶液(濃度0. 2Μ) 5 μ L/次，加四次；觀察納米金溶液顏色的變化(見圖 3。另外，上述納米金-DNA-NaCl混合液各取100 μ L，分別加100 μ L去離子水混勻。用紫 外_可見分光光度計(型號為JASCO V-670)檢測400nm 800nm區(qū)間紫外吸收強度。吸 收/發(fā)射狹縫寬度為lnm，工作電壓為700伏。圖4-6為基于未修飾納米金比色反應(yīng)檢測單鏈或雙鏈DNA流程示意圖，比色反應(yīng) 檢測單鏈、雙鏈DNA以及基于納米金溶液檢測單鏈或雙鏈的紫外吸收光譜。檢測單鏈或雙 鏈DNA的靈敏度為0. 8 μ M。2.基于單一聚噻吩衍生物比色法檢測目標(biāo)靶DNA2. 1制備單鏈、雙鏈和單堿基突變DNA溶液
取一 Ependoff管加入去離子水3 μ L，HlNl DNA探針1 μ L,非互補DNA (HCV DNA對 照)1 μ L以及0. 2Μ NaCl/lOmM PB溶液5 μ L，充分混勻，配制非雙鏈DNA溶液(單鏈DNA) 的濃度為20 μ M ；另取一個管子加入去離子水1 μ L，H1N1DNA探針2 μ L、互補的靶H1N1DNA 2 μ L、0. 2M NaCl/lOmMPB溶液5 μ L，配制雙鏈DNA溶液的濃度為20 μ Μ。2. 2基于聚噻吩衍生物的靶DNA檢測室溫下，取單鏈DNA溶液、雙鏈DNA溶液各2 μ L力卩入20 μ 1聚噻吩衍生物溶液中(濃度為0. 05mg/mL)，充分混勻，肉眼觀察顏色變化。其中C管為聚噻吩衍生物溶液對照管 (見圖7和8)。檢測靈敏度為1. 8 μ M。3.本發(fā)明提供的納米金結(jié)合聚噻吩檢測目標(biāo)靶DNA方法如實施例1所述。通過對納米金結(jié)合聚噻吩衍生物檢測目標(biāo)靶DNA與納米金、聚噻吩衍生物單獨分 別檢測目標(biāo)靶DNA的方法的進行比較，三種方法檢測單雙鏈DNA的靈敏度分別為納米金溶 液(加入0. 2Μ NaCl)檢測DNA靈敏度為0. 8 μ Μ，聚噻吩檢測DNA靈敏度為1. 8 μ Μ，納米金 結(jié)合聚噻吩衍生物檢測DNA靈敏度為49ηΜ.可以發(fā)現(xiàn)納米金結(jié)合聚噻吩衍生物檢測方法檢 測DNA單雙鏈DNA的方法靈敏度最高。
權(quán)利要求
一種納米金結(jié)合聚噻吩衍生物比色檢測目標(biāo)靶DNA的方法，包括(一)檢測試劑及探針的準備(1)納米金溶液的制備首先，配置濃度為1mM HAuCl4溶液及濃度為38.8mM的檸檬酸三鈉溶液，并將HAuCl4溶液加熱至130℃，在加熱過程中攪拌充分，20分鐘時迅速加入檸檬酸三鈉溶液25ml，在加入過程中不使HAuCl4溶液降溫，持續(xù)攪拌至溶液冷卻至室溫、形成酒紅色溶液，最后用硝酸纖維尼龍膜過濾溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?2)H1N1DNA檢測探針的設(shè)計及合成以流感病毒H1N1序列為靶目標(biāo)基因模板，建立利用未修飾的納米金復(fù)合聚噻吩衍生物進行基因直接檢測的分析方法，DNA探針序列為H1N1 DNA探針5’-ACGGAAGGAGTGCCAA-3’；互補的靶H1N1 DNA5’-TTGGCACTCCTTCCGT-3’；非互補DNA5’-AGTAGTGTTGGGTCGC-3’；(3)聚噻吩衍生物的制備在檢測DNA雜交中，選擇陽離子共軛聚合物[3-(3’-N，N，N-triethylamino-1’-propyloxy)-4-methyl-2，5-thiophene hydrochloride]作顏色指示劑，選擇性靈敏地檢測單鏈或雙鏈DNA；(二)目標(biāo)靶序列的檢測1.單鏈或雙鏈DNA雜交溶液制備取去離子水4.5μL，加入5μL 0.2M NaCl/0.1M pH＝7.4的phosphate buffer、0.25μL 100μM H1N1 DNA探針或0.25μL 100μM非互補的寡核苷酸DNA，充分混勻，制備單鏈DNA溶液；或另取去離子水4μL，加入5μL的0.2MNaCl/0.1M pH＝7的phosphate buffer、0.5μL 100μM H1N1 DNA探針以及0.5μL100μM完全互補的靶H1N1 DNA，充分混勻，互補的的兩個單鏈DNA經(jīng)過雜交形成雙鏈的DNA，制備為雙鏈DNA溶液；2.基于納米金結(jié)合聚噻吩用于互補靶DNA的檢測取兩管濃度為12nM納米金溶液100μL，分別加入非互補的探針單鏈DNA溶液和序列完全互補雙鏈DNA溶液各1μL，混勻，觀察納米金溶液的顏色；再分別加入濃度為0.05mg/ml 1μl聚噻吩，充分混勻，觀察納米金溶液的變化。
2.按權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述步驟(二)/(1)中寡核苷酸探針與 雜交緩沖液的濃度比為1 10。
3.按權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述步驟(二)/(2)中的納米金顆粒為 13nm、納米金溶液濃度為12nM。
4.按權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述步驟(二)/(2)中的DNA探針與聚 噻吩衍生物的濃度比為1:1。
5.按權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述步驟(一)/(1)中使用的硝酸纖維 尼龍膜的孔徑為0. 22 μ m。
6.按權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述步驟(二)/(2)中的目標(biāo)靶序列的 檢測是指以靶Hmi DNA作為雜交模板。
7.按權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于納米金結(jié)合聚噻吩衍生物檢測靈敏度為49nM 。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種納米金結(jié)合聚噻吩衍生物比色檢測目標(biāo)靶DNA的方法，包括檢測試劑(納米金和聚噻吩衍生物)及探針的準備；目標(biāo)靶序列的檢測等。該發(fā)明基于聚噻吩衍生物與ssDNA/dDNA結(jié)合時使得DNA-納米金溶液的穩(wěn)定性發(fā)生變化而引起顏色改變產(chǎn)生信號級聯(lián)放大的原理，通過顏色轉(zhuǎn)變顯示劑以及擴增標(biāo)簽的雙重作用實現(xiàn)DNA的高靈敏快速檢測，從而建立利用納米金結(jié)合聚噻吩衍生物進行基因直接檢測的分析平臺。該方法操作簡單，不需要特殊的儀器設(shè)備，具有特異、快速和高靈敏的特點，可望應(yīng)用于臨床檢驗醫(yī)學(xué)及環(huán)境中靶目標(biāo)DNA的診斷和檢測。
文檔編號G01N21/33GK101818198SQ20101011818
公開日2010年9月1日 申請日期2010年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月5日
發(fā)明者婁新徽, 張宏蓮, 毛紅菊, 王樹, 趙建龍, 郭青川, 金慶輝 申請人:中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所