專利名稱：一種快速定量線蟲存活率的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速定量線蟲存活率的方法及試劑盒，該方法及試劑盒可在藥物篩選、農(nóng)藥篩選、環(huán)境評(píng)價(jià)、水質(zhì)評(píng)價(jià)等方面應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
秀麗隱桿線蟲(C We^ms)是一種生長(zhǎng)在土壤中的線蟲，以細(xì)菌為食，很容易在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。成蟲體長(zhǎng)1mm，且通體透明，在顯微鏡下易于觀察。L3 L4期對(duì)外界敏感。從一個(gè)受精卵發(fā)育成可以產(chǎn)卵的成蟲，它只需要3天。在自然狀態(tài)下，秀麗隱桿線蟲絕大部分個(gè)體為雌雄同體，其一生能產(chǎn)生約300個(gè)受精卵，如果在一個(gè)培養(yǎng)皿上放幾只線蟲，幾天之后就可得到大量的后代(龐林海等，2007)。上述這些特點(diǎn)使得秀麗隱桿線蟲在很多方面都有應(yīng)用(秦峰松和楊崇林，2006)。廈門大學(xué)柯翎等人(2004)以秀麗隱桿線蟲作為重金屬污染的指示生物，研究了 Cu2+，Cd2+，Pb2+, Si2+等4種重金屬離子對(duì)秀麗隱桿線蟲的毒性，發(fā)現(xiàn)重金屬離子濃度越高， 毒性越強(qiáng)，線蟲死亡率越高。在高濃度組中線蟲的中毒反應(yīng)較迅速，短期內(nèi)就出現(xiàn)死亡；而在低濃度組，中毒反應(yīng)較慢，經(jīng)較長(zhǎng)時(shí)間才出現(xiàn)死亡，對(duì)照組相對(duì)其他各組，存活時(shí)間最長(zhǎng)。 北京師范大學(xué)的鄢雯等(2005)人將秀麗隱桿線蟲用于環(huán)境水質(zhì)的監(jiān)測(cè)，同樣發(fā)現(xiàn)秀麗隱桿線蟲存活率與水樣毒性之間存在緊密的關(guān)系，水樣毒性越大，線蟲死亡率越高，因此可用秀麗隱桿線蟲的存活率評(píng)價(jià)飲用水源水和水廠工藝水水樣毒性。王曉等人(2007)也將秀麗隱桿線蟲用于對(duì)造紙廠廢水中酸堿類毒物的追蹤。實(shí)驗(yàn)顯示，用秀麗隱桿線蟲指示重金屬危害、水樣毒性大小等既降低了實(shí)驗(yàn)成本，又提高了檢測(cè)效率。萬樹青(1993)等人用秀麗隱桿線蟲的死亡率來評(píng)價(jià)棉酚，克線磷，甲基異柳磷，氧樂果，滅多威，硫酸銅等多種農(nóng)藥的殺蟲效果。國(guó)外將秀麗隱桿線蟲用于體內(nèi)驅(qū)蟲藥物藥效篩選的研究已有相關(guān)的文章發(fā)表 (tooula等，2007)，為驅(qū)蟲藥的體外研究提供了可行方法，并且呈現(xiàn)良好的選擇性、準(zhǔn)確度及重復(fù)性，而且成本低廉。這些研究表明，線蟲死亡率的大小反應(yīng)了供試藥物的藥效和毒性的大小。王擺(2006)以自由海洋線蟲aroaai/ori/^ sp.為模型動(dòng)物，選擇水溶性的重金屬鎘離子和不溶于水的環(huán)境雌激素雙酚A，以線蟲的死亡率為指標(biāo)，測(cè)試了兩種化學(xué)物質(zhì)對(duì) Chromadorina sp.的急性毒性。由此可見，線蟲可在藥物篩選、農(nóng)藥篩選、環(huán)境評(píng)價(jià)、水質(zhì)評(píng)價(jià)等方面應(yīng)用。在以上諸多方面的應(yīng)用中對(duì)線蟲死活的判斷是關(guān)鍵技術(shù)。在涉及線蟲死亡或存活進(jìn)行判斷的現(xiàn)有技術(shù)中，萬樹青等(1993)人試圖通過染色方法來區(qū)分死活線蟲從而測(cè)定被測(cè)物殺線劑的活性，他們比較了中性紅，甲基藍(lán)，番紅花紅，曙紅等4種染料的染色效果，發(fā)現(xiàn)這4種染料都能使死線蟲著色，而活線蟲不著色，番紅花紅效果最好。但是這種方法仍然需要在顯微鏡下一一計(jì)數(shù)，工作量很大。國(guó)外學(xué)者用MTT法檢測(cè)了驅(qū)蟲藥物左旋咪唑?qū)ψ杂缮畹挠左w線蟲存活率的影響(Catherine等，2007 ；Smith等2009)，但此方法用MTT對(duì)線蟲染色的時(shí)間為3至對(duì)小時(shí)，且用DMSO溶出甲臢需要1小時(shí)，比較費(fèi)時(shí)。而且，MTT價(jià)格昂貴，sigma公司產(chǎn)品Ig參考價(jià)格為1413. 36元，而同為sigma公司產(chǎn)品的TTC 5g參考價(jià)格為243元。美國(guó)專利(專利號(hào)為20060191023)公開了一種應(yīng)用熒光染色劑法來鑒別死活線蟲的染色方法。這種方法已用于驅(qū)蟲藥物的篩選研究，由于染色后活的線蟲無熒光，而死亡的線蟲有熒光，利用測(cè)試熒光強(qiáng)度的大小來確定線蟲的死亡率，這樣為高通量篩選提供了保證，但此法需要熒光酶標(biāo)儀，對(duì)設(shè)備要求很高，難以在普通實(shí)驗(yàn)室和基層得以推廣和應(yīng)用。中國(guó)專利(專利號(hào)為200710202068. 8)公開了一種應(yīng)用中性紅染料來鑒別死活線蟲的染色方法。該方法可以使死線蟲著色，活線蟲不著色，但染色后需要裂解線蟲釋放染料后再測(cè)定染料的吸光值，步驟繁瑣，比較費(fèi)時(shí)。通過對(duì)上述涉及線蟲死亡或存活進(jìn)行判斷的現(xiàn)有技術(shù)分析可以看出，現(xiàn)有技術(shù)費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、而且成本較高或需要昂貴的儀器設(shè)備，市場(chǎng)急需一種簡(jiǎn)單易行、成本低廉、不需昂貴的儀器設(shè)備就能進(jìn)行快速定量線蟲存活率的新方法，可以廣泛應(yīng)用于新藥篩選、農(nóng)藥篩選、環(huán)境評(píng)價(jià)及水質(zhì)評(píng)價(jià)等領(lǐng)域。參考文獻(xiàn)
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發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單易行、成本低廉的快速定量線蟲存活率的新方法及試劑盒，可以廣泛應(yīng)用于新藥篩選、農(nóng)藥篩選、環(huán)境評(píng)價(jià)及水質(zhì)評(píng)價(jià)等領(lǐng)域。具體內(nèi)容如下一種快速定量線蟲存活率的方法，采用染料對(duì)線蟲進(jìn)行染色，由于活線蟲著色，死線蟲不著色，且光吸收值與活線蟲的數(shù)量成正比，從而直接可反映線蟲的存活率，該方法應(yīng)用的染料是紅四氮唑或稱四氮紅唑(全稱為2，3，5_三苯基氯化四氮唑；英文名稱為 2, 3, 5-Triphenyl tetrazolium chloride,簡(jiǎn)寫為 TTC 或 TZ),分子式為 C19H15ClN40
TTC原理存活狀態(tài)的線蟲存在呼吸作用，在呼吸過程中產(chǎn)生還原態(tài)脫氫輔酶I或 II (NADH2或NADPH2)。當(dāng)TTC的無色溶液滲入活線蟲的活細(xì)胞內(nèi)并作為氫受體被脫氫輔酶上的氫還原時(shí)，生成一種紅色、穩(wěn)定、不會(huì)擴(kuò)散和不溶于水的三苯基甲臢(TTF)?；瘜W(xué)方程式如下
權(quán)利要求
1.一種快速定量線蟲存活率的方法，采用染料對(duì)線蟲進(jìn)行染色，由于活線蟲著色，死線蟲不著色，且光吸收值與活線蟲的數(shù)量成正比，從而直接可反映線蟲的存活率，其特征在于該方法應(yīng)用的染料是紅四氮唑(2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride, TTC)，分子式為C19H15ClN40
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速定量線蟲存活率的方法，其特征在于該方法中的線蟲是自由生活的種類，或者是寄生生活的種類，優(yōu)選秀麗隱桿線蟲(femorA^i/iiis elegans)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1至2中任意一項(xiàng)所述的一種快速定量線蟲存活率的方法，其特征在于該方法中的線蟲是處于任一發(fā)育階段的線蟲，自由生活的線蟲是選自一期幼體線蟲至成蟲的任一發(fā)育階段線蟲，寄生生活的是自由生活時(shí)期的幼體線蟲。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的一種快速定量線蟲存活率的方法，其特征在于染色溫度為4°C 35°C、染料濃度為0. 1% 20%、染色時(shí)間為5min 45min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)所述的一種快速定量線蟲存活率的方法，其特征在于應(yīng)用的線蟲數(shù)量為15 1500條。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任意一項(xiàng)所述的一種快速定量線蟲存活率的方法，其特征在于該方法采用二甲基亞砜(DMSO)或甲醇將在線蟲體內(nèi)顯色的染料溶出。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至5任意一項(xiàng)所述的一種快速定量線蟲存活率的方法，其特征在于染色后還可以采用甘油作為透明劑，然后采用酶標(biāo)儀直接測(cè)定吸光值。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7任意一項(xiàng)所述的一種快速定量線蟲存活率的方法，其特征在于該方法在新藥篩選、農(nóng)藥篩選、環(huán)境評(píng)價(jià)及水質(zhì)評(píng)價(jià)領(lǐng)域應(yīng)用。
9.一種快速定量線蟲存活率的試劑盒，其特征在于該試劑盒含有染料紅四氮唑 (2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC)，分子式為 C19H15ClN40
10.一種快速定量線蟲存活率的試劑盒，其特征在于該試劑盒可以含有線蟲，其中的線蟲是自由生活的種類，或者是寄生生活的種類，優(yōu)選秀麗隱桿線蟲(femorA^i/iiis elegans)。
11.根據(jù)權(quán)利要求9至10中任意一項(xiàng)所述的一種快速定量線蟲存活率的試劑盒，其特征在于該試劑盒中的線蟲是處于任一發(fā)育階段的線蟲，自由生活的線蟲是選自一期幼體線蟲至成蟲的任一發(fā)育階段線蟲，寄生生活的是自由生活時(shí)期的幼體線蟲。
12.根據(jù)權(quán)利要求9至11中任意一項(xiàng)所述的一種快速定量線蟲存活率的試劑盒，其特征在于染色溫度為4°C 35°C、染料濃度為0. 1% 20%、染色時(shí)間為5min 45min。
13.根據(jù)權(quán)利要求9至12中任意一項(xiàng)所述的一種快速定量線蟲存活率的試劑盒，其特征在于應(yīng)用的線蟲數(shù)量為15 1500條。
14.根據(jù)權(quán)利要求9至13任意一項(xiàng)所述的一種快速定量線蟲存活率的試劑盒，其特征在于該試劑盒含有二甲基亞砜(DMSO)或甲醇。
15.根據(jù)權(quán)利要求9至14任意一項(xiàng)所述的一種快速定量線蟲存活率的試劑盒，其特征在于該試劑盒含有甘油。
16.根據(jù)權(quán)利要求9至15任意一項(xiàng)所述的一種快速定量線蟲存活率的試劑盒，其特征在于該試劑盒在新藥篩選、農(nóng)藥篩選、環(huán)境評(píng)價(jià)及水質(zhì)評(píng)價(jià)領(lǐng)域應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速定量線蟲存活率的方法及試劑盒，具體是首先采用染料TTC對(duì)線蟲進(jìn)行染色，由于活線蟲著色，死線蟲不著色，且光吸收值與活線蟲的數(shù)量成正比，從而直接可反映線蟲的存活率，并據(jù)此制備試劑盒。這種方法及試劑盒可以在以線蟲存活率為指標(biāo)的藥物篩選、農(nóng)藥篩選、環(huán)境評(píng)價(jià)、水質(zhì)評(píng)價(jià)等方面應(yīng)用。本發(fā)明在操作上快速、簡(jiǎn)單易行，對(duì)設(shè)備要求不高，成本低廉，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)G01N1/30GK102213672SQ20101013862
公開日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2010年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月3日
發(fā)明者周婷, 支德娟, 李紅玉 申請(qǐng)人:李紅玉