專利名稱：用于檢測干燥綜合癥α-胞襯蛋白抗體的膠體金檢測卡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種干燥綜合癥α-胞襯蛋白(α-fordin)蛋白抗體的快速檢測產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
原發(fā)性干燥綜合征(Primary sjogren's syndrome，pSS)是一種在遺傳、病毒感染和性激素異常等多種因素作用下，引起機(jī)體細(xì)胞免疫及體液免疫反應(yīng)異常的自身免疫病。 國外及國內(nèi)何菁等的研究證實(shí)α-胞襯蛋白與原發(fā)性干燥綜合征的發(fā)病有密切關(guān)系，對本病的診斷具有重要參考意義。陳巧林等進(jìn)一步利用生物信息學(xué)方法對α -胞襯蛋白抗原表位進(jìn)行預(yù)測分析，并以融合蛋白的方式體外重組表達(dá)含重疊序列的α-胞襯蛋白片段，對其抗原表位進(jìn)行了篩選和鑒定，發(fā)現(xiàn)其序列中1 59位氨基酸為主要抗原表位所在區(qū)域(陳巧林，樸海燕，何菁等.干燥綜合征特異性α-胞襯蛋白的抗原表位篩選及鑒定[J].中國免疫學(xué)雜志，2005; 21(11) :864-872.),其自身抗體在原發(fā)性干燥綜合征中的陽性率為63. 75% (陳巧林，李晶，張翠華等.重組α-胞襯蛋白的表達(dá)及其在原發(fā)性干燥綜合征臨床研究中的意義[J]. 中國免疫學(xué)雜志，2006 ；22 (12) 1146-1149.)，在SSA抗體陰性、SSB抗體陰性和ANA陰性的原發(fā)性SS受測者中該表位多肽抗體的陽性率分別為37. 5%、42. 7%和48.2%，因此該表位多肽抗體的檢測對于SSA抗體、SSB抗體及ANA陰性的原發(fā)性SS受測者的診斷具有重要意義，是臨床原發(fā)SS受測者現(xiàn)有診斷抗體的有效補(bǔ)充(陳巧林，李想，何文智等.α-胞襯蛋白抗原多肽的篩選及其在干燥綜合征臨床診斷中的意義[J].臨床免疫學(xué)，2007 ;23 (11) 1022-1025.)。近年來常用的抗體檢測方法多為ELISA法，但檢測需要特殊的儀器設(shè)備，且需要長時(shí)間的預(yù)雜交、雜交洗滌過程，并且要求專業(yè)技術(shù)人員進(jìn)行，操作復(fù)雜，不適宜做現(xiàn)場快速檢測。因此，人們?nèi)匀恍枰獙ふ铱焖佟㈧`敏、低成本、操作簡易的檢測工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種方便、快捷的檢測干燥綜合癥自身抗體的檢測卡。本發(fā)明所述的一種用于檢測干燥綜合癥α -胞襯蛋白自身抗體的膠體金檢測卡， 包括從左到右依次固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙；所述玻璃纖維上涂有納米膠體金標(biāo)記的重組蛋白G ；所述硝酸纖維素膜上固定有大分子蛋白偶聯(lián) α-胞襯蛋白表位多肽，該α-胞襯蛋白表位多肽序列如SEQ ID NO :1所示；以及抗重組蛋白G抗體；其中，固定于靠近吸水紙一端的抗重組蛋白G抗體形成質(zhì)控線，固定于靠近玻璃纖維一端的大分子蛋白偶聯(lián)α-胞襯蛋白的表位多肽形成檢測線。重組蛋白G (Recombinant Protein G)是從Mi^ptococci細(xì)菌中分離出來的胞壁蛋白，可與多數(shù)哺乳動物IgG的Fc段結(jié)合，重組蛋白G已經(jīng)除去了其與白蛋白及細(xì)胞表面結(jié)合位點(diǎn)，減少了交叉反應(yīng)和非特異性結(jié)合。因此，與天然蛋白G相比，重組蛋白G與蛋白A具有更大的親和力與穩(wěn)定性。本發(fā)明所述檢測卡中α-fordin蛋白的表位多肽為大分子偶聯(lián)，其多肽序列為 FQFFQRDAEELEKff (SEQ ID NO 1)，是發(fā)明人經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定的α-fordin蛋白的優(yōu)選抗原表位多肽。根據(jù)本發(fā)明所述的膠體金檢測卡的進(jìn)一步特征，所述質(zhì)控線與檢測線相距 3-10mmo根據(jù)本發(fā)明所述的膠體金檢測卡的進(jìn)一步特征，所述固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙的相鄰部分彼此重疊l-5mm。根據(jù)本發(fā)明所述的膠體金檢測卡的進(jìn)一步特征，所述納米膠體金的粒徑為 8-100nm。根據(jù)本發(fā)明所述的膠體金檢測卡的進(jìn)一步特征，所述偶聯(lián)α-胞襯蛋白表位多肽的大分子蛋白選自牛血清白蛋白、卵清蛋白或鑰孔蟲戚血藍(lán)蛋白；反應(yīng)支持物優(yōu)選PVC板， 金標(biāo)重組蛋白膜優(yōu)選聚酯膜、玻璃纖維膜。本發(fā)明所述檢測卡檢測的抗體為針對人α -胞襯蛋白N端46-59氨基酸位點(diǎn)的自身IgG、IgA抗體；所檢測的樣本為受測者的血清、血漿或全血。本發(fā)明的技術(shù)原理是以免疫色譜層析為基礎(chǔ)，當(dāng)在樣品墊上滴加樣品(含待測自身抗體)時(shí)，由于毛細(xì)作用，抗體隨樣品液一起向前運(yùn)動，當(dāng)?shù)竭_(dá)金標(biāo)墊時(shí)，納米金顆粒上包被的重組蛋白G與樣品中的抗體結(jié)合，結(jié)合抗體的金顆粒繼續(xù)向前移動，當(dāng)?shù)竭_(dá)檢測區(qū)域時(shí)重組蛋白G結(jié)合的自身抗體與大分子偶聯(lián)的表位多肽特異性結(jié)合而固定在檢測線上形成紅色條帶，未結(jié)合的金顆粒繼續(xù)向前移動，與質(zhì)控線上的抗重組蛋白G抗體結(jié)合而固定在質(zhì)控線上形成紅色條帶。如果樣品中沒有相應(yīng)的自身抗體時(shí)，檢測區(qū)域不出現(xiàn)紅線， 而質(zhì)控線上出現(xiàn)紅線。因此，質(zhì)控線出現(xiàn)紅色線說明試紙條可用，而檢測線出現(xiàn)與否是樣品陰性和陽性的標(biāo)準(zhǔn)。整個(gè)檢測過程只需要10分鐘左右。本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明通過在硝酸纖維素膜上包被大分子蛋白偶聯(lián) α-fordin蛋白的表位多肽、抗重組蛋白G抗體，分別形成質(zhì)控線和檢測線；結(jié)合膠體金標(biāo)記的重組蛋白G，應(yīng)用免疫色譜層析技術(shù)，檢測干燥綜合癥α-fordin蛋白抗體。本發(fā)明所述的膠體金檢測卡克服了現(xiàn)有技術(shù)操作復(fù)雜、耗時(shí)長、須要特殊儀器和專業(yè)人員的不足，能檢測α -胞襯蛋白的自身抗體，檢測迅速快捷，不需特殊儀器設(shè)備，不需專業(yè)培訓(xùn)，結(jié)果清晰易識別，適合基層檢測，對干燥綜合癥的早期和中晚期都能起到輔助檢測作用。


圖1為本發(fā)明所述的膠體金檢測卡的示意圖。圖2顯示試紙條檢測樣品結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一用于檢測干燥綜合癥α -胞襯蛋白抗體的膠體金檢測卡的制備1.大分子偶聯(lián)α -胞襯蛋白表位多肽的制備根據(jù)α -胞襯蛋白抗原表位區(qū)域研究的結(jié)果，并結(jié)合計(jì)算機(jī)軟件對α -胞襯蛋白抗原表位趨勢進(jìn)行預(yù)測，按抗原趨勢指數(shù)設(shè)計(jì)合成α -胞襯蛋白46-59氨基酸區(qū)域多肽，采用固相法人工合成，HPLC純化純度均> 95%，此多肽再通過EDC法與BSA，OVA, KLH等大分子進(jìn)行偶聯(lián)，HPLC純化純度均> 98%。2.納米金(膠體金)的制備在500ML的圓底燒瓶中加入IOOml 0. 01 %的HAuCL4溶液，磁力攪拌加熱至沸騰； 然后向上述溶液中加入anl 枸櫞酸鈉，溶液變?yōu)榫萍t色后，繼續(xù)煮沸l(wèi)Omin，停止加熱繼續(xù)攪拌15min ；膠體金溶液4°C避光保存，納米金通過520nm最大吸光度值鑒定。3.金標(biāo)重組蛋白G的制備移取20ml膠體金溶液至一干凈的燒杯中，快速攪拌下，加入0. lmol/LK2C03將PH 值調(diào)至7. 8，5分鐘后用去離子水溶解200 μ g組蛋白G(濃度為lmg/ml)200ul緩慢滴加到金液中(蛋白標(biāo)記量為lOug/ml)，室溫半小時(shí)；用終濃度為的牛血清白蛋白封閉30分鐘后，8400轉(zhuǎn)/分鐘離心25分鐘，棄上清，沉淀用IOOul含5% BSA和10%蔗糖的0. 01mol/L PBS重新懸浮，制成懸浮液。4.樣品墊的處理玻璃纖維浸泡0. 25% TritonX-100,0. 05M Tris_HCL、0. 15M NaCl 溶液后，37°C烘干備用。5.硝酸纖維素膜的處理將大分子蛋白偶聯(lián)α -fordin蛋白的表位多肽、抗重組蛋白G抗體分別用PBS稀釋為lmg/ml后按lyl/cm劃膜，分別形成T線(5)和C線，37°C烘干后4°C保存待用。 (見圖1)6.膠體金試紙條的組裝將固定有大分子蛋白偶聯(lián)α-fordin蛋白的表位多肽、抗重組蛋白G抗體的硝酸纖維素膜2、吸水紙1、結(jié)合納米金標(biāo)記重組蛋白G的玻璃纖維3、樣品墊6依次固定于PVC 膠板上，相鄰部分彼此重疊2mm，經(jīng)切割成寬4mm后即得到本發(fā)明所述的免疫層析膠體金檢測卡(見圖1)。7.血清樣品檢測取100 μ 1血清緩慢滴加到檢測卡滴樣孔中，IOmin內(nèi)觀測結(jié)果。通過對80例臨床確診的原發(fā)性干燥綜合征(PSQ患者和37例正常人血清中抗α-fordin蛋白抗體的檢測發(fā)現(xiàn)其陽性率為63. 75% (51/80)，明顯高于正常人的21. 67% (8/37) (P <0.01)，且各例正常人的陽性條帶均明顯淺于原發(fā)性干燥綜合征患者，圖2中A-C為原發(fā)性干燥綜合征 (pSS)患者血清檢測結(jié)果，檢測卡C線(4)和T線(5)都顯色，D為正常人血清檢測結(jié)果，只有C線(4)顯色。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，抗α-fordin蛋白抗體在原發(fā)性干燥綜合征(pSS) 患者血清中陽性率為70%左右，本檢測卡對其檢出率為63. 75%，本發(fā)明對原發(fā)性干燥綜合征的診斷有重要意義。相比傳統(tǒng)ELISA法，該方法更快速而靈敏度并無減少，適合自我早期診斷和大規(guī)模篩查。質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)(圖2)(I)C線(質(zhì)控線)出現(xiàn)紅色的線證明膠體金試紙條有效。線(檢測線)出現(xiàn)紅色的線與否，是陽性陰性判別的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)(I)C線出現(xiàn)紅色的線，同時(shí)T線出現(xiàn)紅色的線，說明被檢樣品為陽性；
(2) C線出現(xiàn)紅色的線，同時(shí)T線沒有出現(xiàn)紅色的線，說明被檢樣品為陰性；(3) C線沒有出現(xiàn)紅色的線，說明納米生物傳感器失效。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測干燥綜合癥α-胞襯蛋白自身抗體的膠體金檢測卡，其特征在于包括從左到右依次固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙；所述玻璃纖維上涂有納米膠體金標(biāo)記的重組蛋白G ；所述硝酸纖維素膜上固定有大分子蛋白偶聯(lián)α -胞襯蛋白表位多肽，該α -胞襯蛋白表位多肽序列如SEQ ID NO 1所示；以及抗重組蛋白G抗體；其中，固定于靠近吸水紙一端的抗重組蛋白G抗體形成質(zhì)控線，固定于靠近玻璃纖維一端的大分子蛋白偶聯(lián)α-胞襯蛋白的表位多肽形成檢測線。本發(fā)明所述檢測卡檢測的抗體為針對人α -胞襯蛋白N端46-59氨基酸位點(diǎn)的自身 IgG、IgA 抗體
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠體金檢測卡，其特征在于所述質(zhì)控線與檢測線相距 3-10mmo
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠體金檢測卡，其特征在于所述固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙的相鄰部分彼此重疊l_5mm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠體金檢測卡，其特征在于所述納米膠體金的粒徑為 8-100nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠體金檢測卡，其特征在于所述偶聯(lián)α-胞襯蛋白表位多肽的大分子蛋白選自牛血清白蛋白、卵清蛋白或鑰孔蟲戚血藍(lán)蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測干燥綜合癥α-胞襯蛋白自身抗體的膠體金檢測卡，包括從左到右依次固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙；玻璃纖維上涂有納米膠體金標(biāo)記的重組蛋白G；硝酸纖維素膜上固定有大分子蛋白偶聯(lián)α-胞襯蛋白表位多肽，該α-胞襯蛋白表位多肽序列如SEQ ID NO1所示；以及抗重組蛋白G抗體；其中，固定于靠近吸水紙一端的抗重組蛋白G抗體形成質(zhì)控線，固定于靠近玻璃纖維一端的大分子蛋白偶聯(lián)α-胞襯蛋白的表位多肽形成檢測線。本發(fā)明的膠體金檢測卡，制備簡便、檢測迅速，不需要專業(yè)的技術(shù)人員及昂貴的儀器設(shè)備，適合大批量檢測，適用于基層，對干燥綜合癥的早期和中晚期都能起到輔助診斷作用。
文檔編號G01N33/558GK102236016SQ20101015706
公開日2011年11月9日 申請日期2010年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月20日
發(fā)明者方志遠(yuǎn), 曾令文 申請人:中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院