專利名稱：一種改良的過碘酸雪夫氏反應(yīng)法快速染色試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種過碘酸雪夫氏反應(yīng)(PAQ法快速染色試劑盒，特別是一種改良的過碘酸雪夫氏反應(yīng)(PAQ法快速染色試劑盒
背景技術(shù)：
真菌是指具有真正細(xì)胞核、產(chǎn)生孢子、不含葉綠素，以寄生或腐生方式吸取養(yǎng)料， 能進(jìn)行有性和(或)無性繁殖，具有纖維素(或其他葡聚糖)或幾丁質(zhì)的微纖維或兩者兼有的細(xì)胞壁的有機(jī)體。真菌侵犯人體常繼發(fā)于其他疾患，如惡性腫瘤、TB、糖尿病等慢性消耗性疾?。淮髣埩縓線照射；免疫抑制劑等導(dǎo)致免疫功能和抵抗力低下；大量應(yīng)用腎上腺皮質(zhì)激素的病人，其炎癥反應(yīng)多受抑制，也容易感染真菌；另外器官移植、導(dǎo)管插管、放療等應(yīng)用引起局部組織損傷，為真菌的入侵提供了條件。近年來由于免疫缺陷病毒感染者的不斷出現(xiàn)，使原來不致病的真菌轉(zhuǎn)為致病真菌。因此，真菌感染已經(jīng)成為一個日益嚴(yán)峻的問題。目前真菌檢測方法主要有形態(tài)學(xué)檢查、培養(yǎng)法及新興的的血清學(xué)檢測抗原/抗體、分子生物學(xué)檢測其靶DNA等。真菌培養(yǎng)法需時間較長，而新興的多種非培養(yǎng)法的敏感性和特異性仍不能滿足臨床診斷的需要，更不能指導(dǎo)抗真菌治療的啟動和終止，故真菌染色鏡檢仍然是真菌實驗室常規(guī)檢測的最重要手段。真菌用H-E染色一般著色不良，因此需用特殊的染色方法來顯色，六胺銀法(GMQ用鉻酸氧化真菌壁的多糖而暴露出醛基，醛基還原六胺銀內(nèi)的銀離子為黑色的金屬銀而顯色。六胺銀染色能顯示大多數(shù)真菌，并且能很好的將真菌特點顯示出來，是顯示真菌效果最佳的一種方法，但此方法操作繁瑣，技術(shù)要求較多，不易控制溫度，效果不穩(wěn)定、不易獲得菌體及背景清晰的染色效果等。過碘酸雪夫氏反應(yīng)(Periodic Acid Schiff，PAS)法用高碘酸氧化真菌菌壁的多糖游離出醛基，后者與無色品紅結(jié)合生成新的品紅色復(fù)合物而被顯色。若用孔雀綠復(fù)染，真菌更易區(qū)別，PAS染色能特異性著染真菌胞壁，優(yōu)點是操作簡單，不容易過染，并且能較好的顯示大多數(shù)真菌，包括單細(xì)胞型和多細(xì)胞型真菌，這兩種方法可顯示大多數(shù)真菌，是最廣泛最常用的染色方法。但在臨床實驗室工作中，這兩種方法均不可避免的有需要特殊且危險的化學(xué)試劑、操作繁瑣、技術(shù)要點要求較多不易掌握、效果不穩(wěn)定、不易區(qū)分菌體與背景等缺點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種改良的過碘酸雪夫氏反應(yīng)(PAS)法快速染色試劑盒，使用本試劑盒，可使檢測流程縮短到10秒鐘左右，非常適合大規(guī)模臨床操作。為達(dá)到上述的發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案這種改良的過碘酸雪夫氏反應(yīng)法快速染色試劑盒，它包括染色液、防脫膠片、蓋物片，所述的染色液是活性品紅液與固綠工作液的混合液，并用95%乙醇和0. 5%亞硫酸氫鈉液稀釋制成。所述的活性品紅液與固綠工作液按2 1體積比混合，再加入活性品紅液兩倍體積的95%乙醇以及與活性品紅等體積的0. 5%亞硫酸氫鈉液，其各成份的體積比為活性品紅液固綠工作液95%乙醇0.5%亞硫酸氫鈉液=2 1 4 2。加入焦亞硫酸鈉的用量與堿性品紅用量的重量比為2. 3 2. 5 1。固綠原粉與磷鎢酸的重量比為4 3 1。本實驗的基理是凡細(xì)胞壁主要成分是多糖(80% -90% )的物質(zhì)，酸性條件下多糖分子內(nèi)的乙二醇基變?yōu)橐叶┗?，品紅可與醛基反應(yīng)，生成一種紫紅色的產(chǎn)物，固綠也可與醛基反應(yīng)生產(chǎn)綠色物質(zhì)，沉淀在多糖、糖蛋白等部位，從而顯示物質(zhì)的形態(tài)及結(jié)構(gòu)。本產(chǎn)品使用PAS改良法，即用高碘酸氧化細(xì)胞壁的多糖使之游離出醛基，后者與無色品紅和固綠結(jié)合，根據(jù)病原菌細(xì)胞壁多糖成分的不同生成新的復(fù)合物而被顯色成深綠色、紅色或藍(lán)色等。本發(fā)明的優(yōu)點1).首次將品紅與固綠共同制備成快速生物染色液；快速10秒左右；簡便直接觀察，免沖洗；2).避免了原有10% KOH法雖顯色快但查真菌不能顯色的弊端；3).解決了氨銀法帶來的生物安全差及環(huán)境污染的問題，使之無毒無害無環(huán)境污染；4).適用范圍廣適合皮屑、黏液、陰道分泌物等臨床上的大量標(biāo)本；5).將高碘酸附著在載玻片上，既節(jié)省了產(chǎn)品的包材，又簡化了操作流程，尤其符合臨床標(biāo)本量大的要求；6).高碘酸為易燃易爆產(chǎn)品，由于高碘酸附著在載玻片上，使之由液態(tài)變?yōu)楦稍餇顟B(tài)，大大降低了其危險性，也從而解決了其不適宜常規(guī)長途儲運的弊端；更易做到標(biāo)準(zhǔn)化操作，避免了因人為操作誤差造成的可重復(fù)性差。預(yù)期用途1).主要用于快速檢測黏液、小皮屑和小塊組織標(biāo)本中的真菌，也可用于檢測上述標(biāo)本中的寄生蟲、螺旋體、原蟲(如滴蟲、阿米巴原蟲)等。2).體液及分泌液的脫落細(xì)胞學(xué)檢查，特別適用于婦科白帶常規(guī)檢查。檢查步驟1).將待檢標(biāo)本涂置于防脫膠片上；2).滴加顯色液1-3滴于標(biāo)本上，加蓋蓋物片，室溫靜置lOs-lmin，顯微鏡下觀察。染色結(jié)果判斷染色效果真菌菌絲和孢子綠色或深綠色；原蟲、寄生蟲及螺旋體等顯紅色或藍(lán)色，其他細(xì)菌、細(xì)胞碎片程度不同程度的淺藍(lán)色，織物纖維無色或紅色。性能指標(biāo)1、靈敏度> 95%,特異度> 96% ；批內(nèi)差異< 2.5% ；批間差異< 3.0% ；


圖1 真菌菌絲及孢子(光鏡觀察40 X)圖2 真菌菌絲及孢子(光鏡觀察20 X)圖3 真菌孢子(光鏡觀察40 X)
圖4 真菌孢子(光鏡觀察20 X)圖5 陰道分泌物染色篩查(光鏡觀察40 X)圖6陰道分泌物染色篩查(光鏡觀察20 X)
具體實施例方式1、染色液的制備1-1活性品紅液制備1).堿性品紅4 4. 5g加入到1升的去離子水中，95 100°C水浴加熱10 15min，并在冷卻至48 50°C時，用孔徑為80 120微米的濾紙過濾；2).向上述過濾液中加入HCL (IMol/L) 90 100ml，pH值調(diào)至< 5，冷卻至室溫；3).其后加入焦亞硫酸鈉9. 5 10. 5g，攪拌5 lOmin，置暗處過夜，加入活性炭粉末，攪拌過濾得無色透明染液，室溫避光保存?zhèn)溆谩?-2固綠工作液制備1).取固綠原粉1. 8 2. 2g加入到蒸餾水10毫升中，攪拌30分鐘至完全溶解，得到濃度為180-220g/L的A液備用。2).取磷鎢酸0. 5 0. 6g加入上述IOmlA液中，攪拌30分鐘至溶得到B液備用。3).將B液用70%的乙醇20倍(20 X)稀釋，攪拌30分后過濾，即得固綠原液，可
長期室溫避光保存?zhèn)溆谩?).對固綠原液用47. 5%的乙醇進(jìn)行6倍(6X)稀釋后制成工作液后使用。1-3染色液各成分比例活性品紅液與固綠工作液按2 1的體積比混合，再加入活性品紅液兩倍體積的 95%乙醇和與活性品紅等體積的0. 5%亞硫酸氫鈉液。即各成份的體積比為活性品紅 固綠工作液95%乙醇0.5%亞硫酸氫鈉液=2 1 4 2。2、防脫膠片的制備2-1高碘酸膠液制備1).取高碘酸晶體5克，加去離子水50毫升(100g/L)，攪拌溶解，用孔徑為孔徑為 80 120微米的濾紙過濾得到A液，室溫保存?zhèn)溆茫?).取明膠10克，加入去離子水50毫升O00g/L)，65°C水浴加熱攪拌溶解(30分鐘)，用孔徑為80 120微米的濾紙過濾得到B液，室溫保存?zhèn)溆茫?).將上述A液和B液混合，攪拌均勻即制成高碘酸膠液，用于下一步制備防脫膠片。2-2膠片制備1).取清潔載物片浸入高碘酸膠液5 8分鐘，進(jìn)入控干缸A、B、C控干，各5 8 分鐘，55 60°C溫箱烤干1小時，恢復(fù)至室溫即制成防脫膠片，以用于本試劑盒(稱為真靈 I染色試劑盒)2).將涂片放入防潮袋中，室溫避光保存。實施例1 足癬患者實驗診斷過程如下1).取材采集自北京大學(xué)第三醫(yī)院皮膚科門診足癬患者，腳趾間不同部位小皮屑3塊；
2).分別將此3塊小皮屑涂置于防脫膠片上；3).滴加活性品紅濃度為4. 3g/L，固綠工作液濃度為1. 6g/L，并與95%乙醇和 0.5%亞硫酸氫鈉，按2 :1:4: 2的體積比配制而成的染色液，至完全浸潤標(biāo)本后加蓋玻片，10秒鐘后顯微鏡下觀察；4).染色結(jié)果如圖1和圖2所示，有大量菌絲和孢子存在，結(jié)合菌絲和孢子形態(tài)分析推測該患者系皮膚癬菌感染引起的足癬。5).染色效果評價孢子和菌絲染色清晰與背景細(xì)胞碎片或細(xì)菌區(qū)分明顯，菌絲形狀(如分支結(jié)構(gòu))得到了很好的保持，說明真菌的自然形態(tài)在染色過程中未遭到明顯改變，這有利于進(jìn)一步進(jìn)行具體的菌屬鑒定。實施例2:頭癬患者實驗診斷過程如下1).取材采集自北京大學(xué)第三醫(yī)院皮膚科門診頭癬患者，頭部不同部位小皮屑3 塊；2).分別將此3塊小皮屑涂置于防脫膠片上；3).滴加活性品紅濃度為4. 3g/L，固綠工作液濃度為1. 6g/L，并與95%乙醇和 0.5%亞硫酸氫鈉，按2 :1:4: 2的體積比配制而成的染色液，至完全浸潤標(biāo)本后加蓋玻片，10秒鐘后顯微鏡下觀察；4).染色結(jié)果如圖表3和圖表4所示，有大量孢子存在，結(jié)合孢子形態(tài)分析推測該患者系皮膚癬菌中的孢子菌屬感染引起的頭癬。5).染色效果評價孢子染色清晰與背景細(xì)胞碎片區(qū)分明顯，孢子形態(tài)得到了很好的保持說明真菌的自然形態(tài)在染色過程中未遭到明顯改變，有利于進(jìn)一步進(jìn)行具體的菌屬鑒定，結(jié)合該標(biāo)本染色后以孢子為主，少見菌絲推測其為皮膚癬菌中的孢子菌屬感染。實施例3 霉菌性陰道炎患者實驗診斷過程如下1).取材采集自北京大學(xué)第三醫(yī)院婦科門診陰道炎患者，清晨白帶標(biāo)本少許(注意無菌操作保留)；2).將少許白帶標(biāo)本涂置于防脫膠片上；3).滴加活性品紅濃度為4. 3g/L，固綠工作液濃度為1. 6g/L，并與95%乙醇和 0.5%亞硫酸氫鈉，按2 :1:4: 2的體積比配制而成的染色液，至完全浸潤標(biāo)本后加蓋玻片，10秒鐘后顯微鏡下觀察；4).染色結(jié)果如圖表5和圖表6所示，有大量孢子存在，結(jié)合孢子形態(tài)分析推測該患者系由霉菌(白色念球菌)感染引起的陰道炎5).染色效果評價孢子染色清晰與背景細(xì)胞碎片區(qū)分明顯，孢子形態(tài)得到了很好的保持說明真菌的自然形態(tài)在染色過程中未遭到明顯改變，有利于進(jìn)一步進(jìn)行具體的菌
屬鑒定。
權(quán)利要求
1.一種改良的過碘酸雪夫氏反應(yīng)法快速染色試劑盒，其特征在于它包括染色液、 防脫膠片、蓋物片，所述的染色液是活性品紅液與固綠工作液的混合液，并用95%乙醇和 0. 5%亞硫酸氫鈉液稀釋制成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種改良的過碘酸雪夫氏反應(yīng)法快速染色試劑盒，其特征在于活性品紅液與固綠工作液按2 1體積比混合，再加入活性品紅液兩倍體積的95%乙醇以及與活性品紅等體積的0.5%亞硫酸氫鈉液，其各成份的體積比為活性品紅液固綠工作液95%乙醇0.5%亞硫酸氫鈉液=2 1 4 2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種改良的過碘酸雪夫氏反應(yīng)法快速染色試劑盒，其特征在于所述的活性品紅液是通過以下工藝獲得的將堿性品紅加入到去離子水中，得到濃度在4. 0-4. 5g/L之間的溶液，95 100°C水浴加熱10 15分鐘，并在冷卻至48 50°C時用孔徑為80 120微米的濾紙過濾，向上述過濾液中加入濃度為lmol/L的HCL，pH 值調(diào)至< 5，冷卻至室溫，其后加入焦亞硫酸鈉，其用量與堿性品紅用量的重量比為2. 3 2.5 1，攪拌5-10分鐘置暗處過夜，加入活性炭粉末，攪拌過濾得無色透明染液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的一種改良的過碘酸雪夫氏反應(yīng)法快速染色試劑盒， 其特征在于所述的固綠工作液是通過以下工藝獲得的將固綠原粉加入到去離子水中， 攪拌溶解得到濃度在180 220g/L之間的A液；在A液中加入磷鎢酸，固綠原粉與磷鎢酸的重量比為4 3 1，攪拌至溶解得B液；將B液用70%的乙醇20倍稀釋，攪拌過濾即得固綠原液，對固綠原液用47. 5%的乙醇進(jìn)行6倍稀釋后制成工作液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的一種改良的過碘酸雪夫氏反應(yīng)法快速染色試劑盒，其特征在于所述的防脫膠片是通過下列方法獲得的取清潔載物片浸入高碘酸膠液中的時間為5-8分鐘，進(jìn)入控干缸A、B、C控干，各5-8分鐘，55-60°C溫箱烤干1小時，恢復(fù)到室溫即制成防脫膠片。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種改良的過碘酸雪夫氏反應(yīng)法快速染色試劑盒，其特征在于所述的高碘酸膠液制備方法是1)向高碘酸晶體加入去離子水，攪拌溶解，其其濃度為80-120g/L，用孔徑為80-120 微米的濾紙過濾，過濾得到A液；2).向明膠中加入去離子水，濃度為180-220g/L，65°C水浴加熱攪拌溶解，用孔徑為 80-120微米的濾紙過濾，得到B液，3).將上述A液和B液混合，攪拌均勻即制成高碘酸膠液。
全文摘要
一種改良的過碘酸雪夫氏反應(yīng)法快速染色試劑盒，它包括染色液、防脫膠片、蓋物片，所述的染色液是活性品紅液與活性固綠液的混合液，并用95％乙醇和0.5％亞硝酸氫鈉液稀釋制成。本發(fā)明的優(yōu)點首次將品紅與固綠共同制備成快速生物染色液；快速10秒左右；簡便直接觀察，免沖洗；適用范圍廣適合皮屑、黏液、陰道分泌物等臨床上的大量標(biāo)本；將高碘酸附著在載玻片上，既節(jié)省了產(chǎn)品的包材，又簡化了操作流程，尤其符合臨床標(biāo)本量大的要求；高碘酸為易燃易爆產(chǎn)品，由于高碘酸附著在載玻片上，使之由液態(tài)變?yōu)楦稍餇顟B(tài)，大大降低了其危險性，易做到標(biāo)準(zhǔn)化操作，避免了因人為操作誤差造成的可重復(fù)性差。
文檔編號G01N33/52GK102243226SQ20101016734
公開日2011年11月16日 申請日期2010年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月10日
發(fā)明者付紅偉, 張丹, 王雷明, 韓亞京 申請人:北京世濟(jì)合力生物科技有限公司